第08章 真核生物的遗传分析(____).ppt

1,第八章真核生物的遗传分析,2,本章要掌握的主要内容,第一节真核生物基因组及其复杂性真核生物基因组的特点重复序列的分类DNA序列分析方法与结构基因组学第二节基因家族基因家族的类型，基因家族的特点第三节遗传标记,3,第一节真核生物基因组及其复杂性,4,一、真核生物基因组的特点,真核生物基因组（EukaryoticGenome,EG）与原核生物基因组（ProkaryoticGenome,PG）相比有很大差异：（1）EG位于细胞核中，由数条具有多级空间结构的染色体组成；（2）具有多个复制起点，基因内有内含子；（3）存在着大量的非编码DNA序列；,5,（4）编码蛋白质的基因多位于单拷贝序列中，同时还有大量的重复序列；（5）具有基因家族和基因簇；（6）具有生命所必须的细胞器基因组,6,二、基因组序列的分类,（一）单一序列（Uniquesequence）又称非重复序列（nonrepetitivesequence），在基因组中只有一个或几个拷贝的DNA序列，大多数结构基因都属于这一类。,7,（二）重复序列,1、串联重复DNA序列只存在于真核基因组，由2200bp的重复单位组成,8,可变数目串联重复序列,Variablenumberoftandemrepeat,VNTR卫星DNA中，有一类重复单位在1160bp，总长度为几百到几千bp的重复序列，多位于近端粒处根据重复单位的大小又可分为：卫星DNA、小卫星DNA和微卫星DNA三类，这类DNA多不具备转录能力,9,（二）重复序列,1、串联重复DNA序列卫星DNA（SatelliteDNA）在进行密度梯度离心时，某些高度重复DNA序列由于碱基组成和浮力密度与主体DNA有区别，会形成一系列的卫星带主带：多由单拷贝序列组成，GC含量接近于基因组均值卫星DNA,10,卫星DNA,一般位于异染色质区，通常位于着丝粒在染色体中可能有某种结构功能长度为100kb数Mb,11,小卫星DNA,核心重复序列由1025bp组成总长度为0.130kb多位于靠近染色体末端的区域，也称端粒小卫星，,12,微卫星DNA,由16个核苷酸为核心序列分散于整个基因组总长度150bp,13,（二）重复序列,2、散布的重复DNA序列在高度分散的重复DNA家族中含有少量转座元件，根据大小不同，可分为短散布核元件（shortinterspersednuclearelement,SINE）长散布核元件（longinterspersednuclearelement,LINE）,14,三、DNA序列分析方法,DNA测序技术早在DNA双螺旋结构(WatsonandCrick,1953)发现后不久就有报导(Whitfeld,1954)，当时的测序的方法为降解法(sequencingbydegradation,SbD)，但由于操作复杂，并没有形成规模化的应用。,15,1965，Cornall大学以SWHolle为首的科学家小组，首次完成75个核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列测定。即利用各种RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。,16,1968年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（DrRayWu）独创性地设计出一种崭新的引物一延伸测序策略，并于1971年首次成功地测定了噬菌体两个COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采纳他的方法，完善了PCR扩增DNA的方法；MSmith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。,17,Sanger等(1977)：末端终止法，该技术引入了聚合酶和测序胶，使DNA测序走向了大规模实用化。经过Melamede,1985;Cheesman,1991;Metzkeretal.,1994等改良后成为迄今为止应用最为广泛的测序技术。随着技术的改进和创新(Juetal.,2000;Church,2002;Barnesetal.,2002;Mitraetal.,2003)，聚合酶测序法又有了新的发展。,18,另外，还有许多其他的测序策略：如连接酶测序法(sequencingbyligation,SbL)(Whiteleyetal.,1984;LandegrenandHood,1988;Drmanac,1992)、焦磷酸测序法(pyrosequencing)(Hyman,1988)杂交测序法(sequencingbyhybridization,SbH)(Drmanacetal.,1989;1998;2001),19,1、Sanger测序法双脱氧末端终止法,利用DNA聚合酶的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2，3双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。,20,反应：同时加入引物和模板、DNA聚合酶I、一种ddNTP、以及四种dNTP（有一种带放射性标记）。变性胶电泳分离反应混合物。放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。结果判读，从放射性X光底片上，直接读出DNA的核酸顺序。,21,GTACGTTGACGCC,ddATP,ddTTP,ddGTP,ddCTP,ddCTPddATPddGTPddTTP,AGTCAGGATCACC,22,在实际的DNA合成反应中，使用失去了53核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。适当地调整ddNTP和dNTP的比例，便能够获得良好的电泳谱带模式。dNTPddNTP=1：100时，谱带分离效果较佳，可读出多于200个以上的核苷酸顺序。,23,2、化学降解法,1977年由美国哈佛大学的AMMaxam和WGilbert发明，于1980年获得诺贝尔化学奖,24,原理,1、利用末端标记使待测DNA带放射性，2、利用不同化学药品使DNA分别在特定碱基处断裂，3、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组大小不同的DNA片段，根据特定的断裂位置读出DNA序列,25,26,第二节基因家族,真核基因组中来源相同，结构相似，功能相关的一组基因。可能由某一共同祖先基因(ancestralgene)经重复(duplication)和突变产生。家族成员可以分布于不同染色体上可集中于一条染色体上，串联排列在一起，形成基因簇(genecluster)有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene),27,根据分布形式分基因簇和散布的基因家族：,A基因簇（genecluster）基因家族的各个成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位，分布在某一条染色体的特殊区域；它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质。如组蛋白基因家族聚集在第7号染色体长臂3区内,28,Histonegenefamily,组蛋白基因家族,29,假基因（pseudogene）：具有与功能基因相似的序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，所以假基因是没有功能的基因，用表示。来源：一般认为是由mRNA反转录成cDNA，然后整合在基因组中，假基因不含内含子。,30,31,B散布的基因家族（interspersedgenefamily）,概念：一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，各成员在序列上有明显差异。这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因家族。,32,根据基因家族在基因组中的复杂程度分类,33,1）简单基因家族,特点：家族成员串联排列在一起组成一个转录单位代表:rRNA基因家族(重复单元28S、18S、5.8s-rRNA),34,2）复杂基因家族,特点：相关基因家族排列在一起，之间有间隔序列，独立的转录单位代表:组蛋白基因家族,间隔区,35,3）发育相关复杂基因家族,特点：分布在不同的染色体上独立的转录单位基因顺序与表达顺序相关代表:珠蛋白基因家族,36,根据基因家族成员序列的相似程度分类,A经典的基因家族，家族成员序列有高度的同源性，序列一致，拷贝数高，非转录间隔区短而一致。B基因家族各成员的编码产物保守（大段的高度保守氨基酸序列）；只是DNA序列的相似性低。C基因家族各成员的编码产物之间只有很短的保守氨基酸序列，DNA序列的相似性更低。D超基因家族，各基因序列之间无同源性，但其基因产物的功能相似。编码产物之间也无明显的保守氨基酸序列，但也有一些共同特征。,37,第三节遗传标记,一、遗传标记的发展二、分子遗传标记三、分子遗传标记的应用,38,一、遗传标记的发展,1、形态学标记2、细胞遗传标记3、生化与免疫遗传标记4、分子遗传标记5、理想的分子遗传标记应具备的特点,39,1、形态学标记,形态学标记(morphologicalmarker)能够用肉眼识别和观察、明确显示遗传多样性的外观性状。特点简单直观，但标记数目少，多态性低，易受外界条件的影响；依据它进行选择的准确性差，所需时间较长，选择效率也较低。,40,古代形态学标记,公元前4000年，伊拉克的古代巴比伦石刻上记载了马头部性状在个世代的遗传。,41,伯乐相马,按图索骥,42,2、细胞遗传标记,细胞遗传标记(cytologicalgeneticmarker)主要是指染色体核型（染色体数目、大小、随体、着丝粒位置、核仁组织区等）、带型（Q、G、C、R带型）和数量特征的变异等，它们分别反映了染色体在结构上和数量上的遗传多态性。,43,家猪X、Y染色体G带示意图,44,细胞遗传标记的特点,不易受环境影响，呈孟德尔方式遗传。多态性集中表现在染色体高度重复DNA结构的异染色质所在的部位。细胞遗传标记经常伴有对生物有害的表型效应，难以获得相应的标记材料，或者观测和鉴定比较困难，从而限制了细胞遗传标记的应用。,45,3、生化与免疫遗传标记,免疫遗传学标记(immunogeneticalmarker)以动物的免疫学特性为标记，包括红细胞抗原多态性和白细胞抗原多态性。生化遗传标记(biochemicalgeneticmarker)主要是指在同一动物个体中具有相同功能的蛋白质存在两种以上的变异体。,46,生化与免疫遗传标记的特点,与形态学标识和细胞遗传标记相比，数量更丰富，受环境影响更小，检测手段简便，是一种较好的遗传标记。血液型和蛋白质型都是基因表达的产物，局限于反映基因组编码区的遗传信息，且标记的数量还比较有限，不能很好地覆盖整个基因组。,47,4、分子遗传标记,分子遗传标记(moleculargeneticmarker)是一种新的以DNA多态性为基础的遗传标记.随着分子生物学的发展，相继建立了RFLP、VNTR、RAPD、AFLP、SNP等多种分子遗传标记检测技术，开创了遗传标记研究的新阶段。,48,分子遗传标记的特点,无表型效应不受环境的限制和影响普遍存在于所有生物数量丰富,49,理想的分子遗传标记应具备的特点,遗传多态性高;检测手段简单快捷，易于实现自动化;遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基因的3种基因型。标记遍布整个基因组；准确性，能正确反映动物的真实遗传，即标记是经济性状基因，还是与影响重要性的性状连锁。实验重复性好（便于数据交换）；开发成本和使用成本尽量低廉；,50,二、分子遗传标记,1、RFLP：限制性片段长度多态性2、TRS：串联重复序列标记3、SNP：单核苷酸多态性,51,1、限制性片段长度多态性,RFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism最早应用于动植物遗传学研究的分子标记技术,52,RFLP的原理,利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小不等、数量不同的分子片段，经电泳分离，通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜(尼龙膜或硝酸纤维素膜)上，然后用放射性同位素(32P)或非同位素(如地高辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片段进行杂交。不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得RFLP谱带表现出不同程度的多态性.,53,RFLP示意图,限制性片段的制备,电泳,Southern印迹,与放射性探针杂交,放射性自显影,54,RFLP的特点,呈共显性遗传、无表型效应、不受年龄性别的影响等优点。分析一次只能检测1个位点，多态信息含量较低，而且操作复杂，耗时费力，成本高，并且对模板DNA需求量大。,55,PCRRFLP,将PCR技术用于RFLP分析，即PCR-RFLP。该技术先用1对引物特异性扩增基因组的某一高变区，然后用限制性内切酶消化PCR产物，电泳检测多态性。PCR-RFLP分析省去了探针的制备、分子杂交等繁琐的过程，DNA需求量也少，大大简化了传统的RFLP技术。,56,PCRRFLP的应用,CCTGAGGAG,CCTGTGGAG,Mst酶切位点,Mst酶切位点消失,57,2、串联重复序列标记,tandemrepeatedsequence,TRS真核生物基因组中的可变串联重复序列（variablenumbertandemrepeatedsequence,VNTR）有两类:小卫星和微卫星，两者具有高度的变异性。,58,(1)小卫星(minisatelliteDNA),小卫星重复单位的核心序列为15一76bp近缘物种和个体间的小卫星核心序列有着一定的同源性，在一定的条件下可以相互杂交。,59,DNA指纹图谱原理,选择在VNTR特异序列上没有酶切位点的限制性内切酶将动物总基因组DNA切成不同长度的片段以VNTR中特异序列作为探针，进行Southern杂交，由于不同个体的串联重复序列的数目和位置不同，形成的杂交谱带具有个体的特异性，人们称为DNA指纹图谱(DNAfingerprinting,DFP),60,VNTR示意图,123,VNTR变异的原理示意图,61,62,DFP的特点,多态性检测率高，位点呈共显性遗传个体具有高度特异性技术复杂、成本高，有时谱带过于复杂,63,微卫星（microsatelliteDNA,MS),又称简单序列重复(simplesequencerepeat,SSR)是高度重复序列，广泛存在于真核生物基因组，重复单位的核心序列为26bp。,6