（植物学专业论文）高粱大规模ssr标记的开发以及应用.pdf

( f d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r l a r g es c a l ed e v e l o p m e n to f ss rm a r k e r sa n d i t sa p p l i c a t i o ni ns o r g h u m u n d e rt h es u p e r v i s i o no f p r o f e s s o rt a o y u e z h i b y y uc h u a n z h a n g c o l l e g eo fc h e m i s t r ya n dl i f es c i e n c e z h e ji a n gn o r m a lu n i v e r s i t yj i n h u a ，32 10 0 4 ，z h e ji a n g ，c h i n a m a y ，2 0 1 0 高梁大规模s s r 标记的开发以及应用 摘要 高粱( s o r g h u mb i c o l o r ( l ) m o e n c h ) 是世界上最重要的作物之一，其产量仅 次于玉米、小麦、水稻和大麦，名列第五。高粱具有抗旱、耐涝和耐盐碱等强适 应性，广泛种植于干旱与半干旱地区，与玉米、甘蔗c 4 类禾本科作物亲缘较近， 且基因组小，被认为是禾本科作物基因组研究的又一重要模式植物，对其深入开 展遗传学研究具有重要的应用价值。 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 是建立在p c r 基础上的分子标记技术，与其 他标记相比，s s r 具有多态性高、重复性好和操作简便等特点。s s r 标记已经广 泛的应用于遗传育种的各个领域。本实验利用已公布的高粱全基因组序列，通过 高通量设计s s r 标记，并筛选出部分标记用于遗传连锁图的构建、紫色叶鞘基因 定位和高梁品种遗传多样性研究三个方面，结果如下： ( 1 ) 本实验采用s s rf i n d e r 软件在高粱全基因组上搜寻简单重复序列，再用 p r i m e r3 软件设计s s r 引物，共开发1 9 0 5 7 个标记。从中选取1 0 6 1 个标记用于品种 6 5 4 、l t r l 0 8 以及b t x 6 2 3 问多态检测。结果表明在三个品种间有接近5 6 7 的标 记呈现多态。1 0 条染色体上标记多态率各异，各条染色体多态s s r 标记有成簇分 布的现象。多态率与s s r 长度成正相关，与s s r 基序( m o t i f ) 类型无关。在三个 品种间，两两比较的多态率不同，其中6 5 4 和l t r l 0 8 间最高。 ( 2 ) 基于第一部分结果，选取2 5 9 个s s r 标记用于高梁遗传图谱的构建。以 籽粒高粱品种6 5 4 5 1 1 甜高粱品种l t r l 0 8 为亲本，构建含1 8 4 个单株的f 2 作图群体。 共将2 5 2 个标记定位在1 1 个连锁群上，总遗传距离为1 5 1 4 c m 。每个连锁群上都出 现距离不等的间隙( g a p ) ，并有标记成簇分布和偏分离现象。 ( 3 ) 在上述构图群体基础上继续扩大群体数目用于高粱紫色叶鞘基因 ( s b p l s , s o r g h u mb i c o l o rp u r p l el e a f s h e a t h ) 定位。亲本6 5 4 叶鞘为白色，l t r l 0 8 叶鞘为紫色。遗传分析表明该性状由单一孟德尔因子控制，紫色对白色显性。结 合第二部分遗传连锁图，分析发现s b p l s 立l 于s m 0 6 0 7 2 与s m 0 6 0 7 5 标记间。通过进 一步发展标记和扩大群体，将该基因初步定位在标记s b 3 6 6 0 矛i s b 3 6 7 5 之间，分 别距两个标记约0 2 c m 和1 7 c m 。 ( 4 ) 本研究通过表型检测结合s s r 标记基因型检测进行4 1 个高粱品种遗传 摘要 多样性分析。结果表明，各个品种间表型在株高、穗长、含糖量、穗型、籽粒颜 色以及叶鞘颜色存在差异。5 2 对s s r 弓i 物在3 琼脂糖凝胶上共检测出2 7 7 个等位 变异，平均每个位点有5 3 个等位变异，变异幅度为2 9 个。通过聚类分析可将4 1 个高梁品种分为两个类群。虽然多数籽粒高粱归在第1 类群，而甜高粱主要分在 第2 类群，但两类高粱无法清楚划分成组，揭示了甜高粱是由多元起源而成。 关键词：高粱，s s r $ g k 2 ，遗传图谱，紫色叶鞘基因( 肠咒固，遗传多样性 i l l a r g es c a l ed e v e l o p n to fss rm a r k e r sa n d i t sa p p l i c a t i o ni ns o r g h u m a bs t r a c t s o r g h u mb i c o l o r ( l ) m o e n c hi sa ni m p o r t a n tg r a i na n df o r a g ec r o pg r o w n w o r l d w i d ei nt h es e m i - 撕da n da r i d t r o p i c s r a n k e da st h ew o r l d sf i f t hm o s t c o m m o n l yc u l t i v a t e dc e r e a lc r o pa f t e rw h e a t ，r i c e ，m a i z e ，a n db a r l e y s o r g h u mi sa l s o ag o o dm o d e lf o rp l a n tg e n o m i c ss t u d yd u et oi t sa d a p t a t i o nt oh a r s he n v i r o n m e n t s ， d i v e r s eg e r m p l a s m c o l l e c t i o n ，r e l a t i v e l y s m a l l g e n o m es i z e ，p o t e n t i a l b i o f u e l a p p l i c a t i o na n dc l o s er e l a t i o n s h i pw i t hm a i z e ，s u g a r c a n ea n do t h e rc e r e a lc r o p s c o m p a r e dw i t ho t h e rm o l e c u l a rm a r k e rt e c h n i q u e s ，s s rh a sa d d i t i o n a l a d v a n t a g e ss u c ha sh i 啦p o l y m o r p h i s m ，r e p r o d u c i b i l i t ya n dr e l i a b i l i t y t h eo b j e c t i v e s o ft h i ss t u d ya r ef i r s t l yt oe x p l o r es s rm a r k e r st h r o u g h o u tw h o l eg e n o m ea n dt h e n u t i l i z et h em a r k e r si nd i f f e r e n ta r e a si n v o l v e di np l a n tg e n e t i ci m p r o v e m e n t t h em a i n r e s u l t sf r o m4d i f f e r e n tp a r t s ：1 ) d e v e l o p m e n to fs s rm a k e r s ；2 ) c o n s t r u c t i o no fa g e n e t i cm a p ，3 ) g e n e t i cm a p p i n go fs b p l sa n d4 ) d i v e r s i t ys t u d ya r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ( 1 ) w eh a v ed e v e l o p e d19 0 5 7s s rm a r k e r st h r o u g hw h o l eg e n o m eb a s e do nt h e r e s u l to fw h o l es o r g h u mg e n o m es e q u e n c e w es e l e c t e d10 61 m a r k e r sf o r t h e p o l y m o r p h i s md e t e c t i o na m o n gt h r e es o r g h u mv a r i e t i e s ( 6 5 4 ，l t r l0 8a n db t x 6 2 3 ) a n df o u n dt h a tn e a r l y5 6 7 o fm a r k e r ss h o w e dp o l y m o r p h i s ma m o n gt h e m t h e p o l y m o r p h i s mr a t ei sd i f f i d e n ta m o n gt e nc h r o m o s o m e s s o m em a r k e r sa r ec l u s t e r i n g i ns o m er e g i o n sa m o n gt e nc h r o m o s o m e s p o l y m o r p h i s mr a t ew a s p o s i t i v e l y c o r r e l a t e dw i t hl e n g t ho fss rm a r k e r s ，b u tn o tm o t i ft y p e a m o n gt h r e ev a r i e t i e s t h e p o l y m o r p h i s mr a t ei sh i g h e s tb e t w e e n6 5 4a n dl t r l 0 8 ( 2 ) t w oh u n d r e da n df o r t y f i v em a r k e r sw e r es e l e c t e dt oc o n s t r u c tas o r g h u m l i n k a g em a pf o raf 2p o p u l a t i o nw i t h18 4i n d i v i d u a l sd e r i v e df r o mac r o s sb e t w e e n t h e6 5 4a n dl t r l0 8 at o t a lo f2 5 9s s rl o c iw e r ep o l y m o r p h i ca n d2 5 2 s s r sw e r e m a p p e dt o11l i n k a g eg r o u p s t h e s em a p p e dss rl o c iw e r ed i s t r i b u t e dt h r o u g h o u t10 c h r o m o s o m e sa n ds p a n n e dag e n e t i cd i s t a n c eo f1514c m t h e r ea r eaf e wg a p si n i i i a b s t r a c t s o m ep a r to fl i n k a g e sg r o u p sw h i l es o m em a r k e r sa r ec l u s t e r i n gi ns o m er e g i o n s a m o n gt e nl i n k a g e sg r o u p s s e g r e g a t i o nd i s t o r t i o n sw e r ef o u n di ns o m er e g i o n so ft h e m a p ( 3 ) t w od i f f e r e n c e sl e a fs h e a t hc o l o r ，p u r p l ea n dw h i t ew e r eo b s e r v e di nt h ef 2 p o p u l a t i o nu s e df o rm a pc o n s t r u c t i o n g e n e t i cm a p p i n go fs b p l s ( s o r g h u mb i c o l o r p u r p l el e a fs h e a t h ) w a sc o n d u c t e da n dt h es b p l sw a sl o c a t e do nc h r o m o s o m e6 b e t w e e ns s rm a r k e r ss m 0 6 0 7 2a n ds m 0 6 0 7 5 t h eg e n ew a sf u r t h e rf i n em a p p e di n t h er e g i o nb e t w e e nt h et w on e w l yd e v e l o p e ds s rm a r k e r ss b 3 6 6 0a n ds b 3 6 7 5 ，w i t h ag e n e t i cd i s t a n c eo f2 5c m ( 4 ) g e n e t i cd i v e r s i t yi n41s o r g h u mv a r i e t i e sw a si n v e s t i g a t e du s i n g5 2d e v e l o p e d s s rm a r k e r sa n d6p h e n o t y p e sc h a r a c t e r i s t i c si n c l u d i n gp l a n th e i g h t ，l e a fn u m b e r ， b r i x ，s p i k el e n g t h ，s p i k et y p ea n ds h e a t hc o l o r at o t a lo f2 7 7a l l e l e sw e r ed e t e c t e d f r o ms s rm a r k e r sa n dt h ea v e r a g ea l l e l eo fe a c hl o c u sw a s 5 3w i t har a n g eo f2 - 9 t h er e s u l tf r o mc l u s t e ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e41 s o r g h u mv a r i e t i e sw e r eg r o u p e d i n t ot w oc l u s t e r s t w ot y p e so f s o r g h u r l lc a nb es e p a r a t e dd i s t i n c t i v e l ya st h em a j o r i t y o fg r a i ns o r g h u mw a sg r o u p e di nt h ef i r s tc l u s t e rw h i l et h em o s ts w e e ts o r g h u m v a r i e t i e si nt h es e c o n dc l u s t e r t h i sr e s u l t s u g g e s t e dt h a ts w e e ts o r g h u mi so f p o l y p h y l e t i co r i g i nw i t h i n b i c o l o rs s p b i c o l o r k e yw o r d s ：s o r g h u mb i c o l o r ( l ) m o e n c h ，s s rm a r k e r ，l i n k a g em a p ，p u r p l e s h e a t hg e n e ( s b p l s ) ，g e n e t i cd i v e r s i t y i v 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 目录v 缩写说明v i i i 1 文献综述1 1 1 高粱概况1 1 1 1 高梁生物学特性1 1 1 2 高粱生产应用2 1 2s s r 分子标记3 1 2 1 分子标记3 1 2 2s s r 分子标记的原理及特点4 1 2 3s s r 标记的开发和应用。4 1 3 高粱s s r 分子标记研究概况5 1 3 1 高粱s s r 分子标记的开发5 1 3 2 高粱s s r 分子标记的应用5 1 3 2 1 高粱基因组分子遗传图谱的构建5 1 3 2 2 利用s s r 标记高粱的q t l 和基因定位6 1 3 3 3 高粱遗传多样性的研究7 1 4 展望7 2 高粱s s r 标记的开发与分析9 2 1 试验材料9 2 2 试验方法9 2 2 1s s r 标记的开发9 2 2 2 高梁d n a 的提取10 2 2 3p c r 扩增与检测1 0 2 3 数据处理1o 2 4 结果与分析1 0 2 4 1p c r 检测结果1 0 2 4 - 2 多态性分析1 1 2 4 2 1 标记开发和多态性分析11 v 目录 2 4 2 2 多态标记在染色体上的分布1 3 2 4 2 3s s r 标记基序类型和多态率1 3 2 4 2 4 品种间多态标记比较1 4 2 4 2 5 多态率与s s r 基序长度的关系1 4 2 5 讨论1 5 2 5 1 开发的高粱s s r 标记的特点1 5 2 5 2 开发的高粱s s r 标记的应用前景1 6 3 高粱遗传图谱构建1 7 3 1 供试材料17 3 2 实验方法1 7 3 2 1 构图s s r 标记的选取1 7 3 2 2 高粱d n a 的提取、p c r 扩增及检测17 3 3 数据处理1 7 3 3 1 遗传图谱构建1 7 3 3 2 物理图谱构建1 8 3 4 结果与分析1 8 3 4 1f l 基因型鉴定1 8 3 4 2p c r 检测结果：1 8 3 4 3 遗传图谱和物理图谱比较分析1 9 3 4 4 标记分布分析2 5 3 4 5 偏分离现象分析2 6 3 5 讨论2 7 3 5 1 与已构建含s s r 分子标记的高粱连锁图比较分析2 7 3 5 2 连锁群标记成簇、间隙和顺序倒置现象的原因探讨2 8 3 5 3 偏分离现象2 9 4 高粱紫色叶鞘基因( 勋儿s ) 初定位3 0 4 1 材料和方法3 0 4 1 1 基因定位材料3 0 4 1 2 材料遗传分析3 0 4 1 3d n a 提取和p c r 扩增及其检测3 l 4 1 4s s r 标记的选取3 l 4 1 5 数据处理与连锁分析3 l 4 2 结果与分析31 目录 4 2 1 紫色叶鞘性状的遗传分析3 1 4 2 2 勋儿s 基因初步定位3 1 4 3 讨论3 2 4 3 1 紫色叶鞘性状的应用前景3 2 4 3 2 紫色吡鞘基因的研究方向3 3 5 高粱遗传多样性的研究3 4 5 1 实验材料3 4 5 2 实验材料种植与表型分析3 5 5 3s s r 标记对高梁遗传多样性分析3 5 5 3 1s s r 标记的选取3 5 5 3 2d n a 提取和p c r 扩增及其检测3 6 5 3 3 数据统计与分析3 6 5 4 结果与分析3 6 5 4 1 品种的表型差异分析3 6 5 4 2s s r 标记对高粱遗传多样性分析4 0 5 4 2 1s s r 检测4 0 5 4 2 2 聚类分析4 0 5 5 讨论4 2 5 5 1 形态标记与分子标记4 2 5 5 2 分子标记的有效利用4 2 参考文献4 4 附录1 5 2 致谢5 8 已经发表的学术论文5 9 浙江师范大学学位论文独创性声明6 0 学位论文使用授权声明6 0 v i i 英文简称英文全称 a f l p b p c m c 瑚 d n a e b e d t a e s t i s s r l o d m b p p c r q t l r a p d r f l p s n p s s r 缩写说明 a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m b a s ep a i r c e n t i m o r g a n c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e x p r e s s e ds e q u e n c et a g i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t l o g l0o ft h el i k e l i h o o do d d sr a t i o m i l l i o nb a s ep a i r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n q u a n t i t a t i v et r a i tl o c i r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s i m p l es e q u e n c er e p e a t s v l l i 中文全称 扩增片段长度多态性 碱基对 厘摩 十六烷基一三甲基一 溴化铵 脱氧核糖核酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 序列表达标签 简单重复序列区间d n a 似然比 百万碱基对 聚合酶链式反应 数量性状位点 随机扩增多态性d n a 限制性内切酶片段长 度多态性 单核苷酸多态性 简单重复序列 1 1 高梁概况 1 文献综述 高梁( s o r g h u mb i c o l o r ( l ) m o e n e h ) 是地球上最古老的作物之一，在人类农作 物栽培历史上，常常作为拓荒的先行作物，随着拓荒者的足迹而传播，广泛种植 于干旱、半干旱地区，是非洲和亚洲部分地区人们的主要食物来源，也是美国、 墨西哥、澳大利亚和南非等国家主要的饲料来源【1 】，同时也是我国主要粮食作物 和旱地作物。随着科学技术的发展以及高梁栽培技术体系的日臻优化和完善，其 产量己仅次于玉米、小麦、水稻和大麦而名列第五，成为世界上重要的禾本科栽 培作物【l 】。 1 1 1 高梁生物学特性 高粱属禾本科，高粱属的一年生草本植物。它根系发达，植株茂盛，叶片宽 大，花序多样。由于高粱起源于炎热、干早、土壤贫瘠的非洲大陆，因此与其他 作物相比，高粱更为耐高温、抗旱、耐涝、耐赫碱，对土壤和环境具有极强的适 应能力【2 】。高粱属高光效c 4 植物，有着很高的光合效能，一般产鲜茎叶6 1 2 万k g h m z ，产粮食为3 0 0 0 6 0 0 0 k g h m 2 3 1 。尤其是高梁中的变种甜高粱有两个生物能量 贮藏库，在生产上不仅能通过生产籽粒储存能量，而且茎秆制造蔗糖能提供更多 能量，其产能效率大大高于一般粮食作物。 高粱种类繁多，形态结构多种多样。高粱栽培品种根据用途的不同，一般可 以分为三种类型：甜高梁、饲料高粱以及作为粮食的籽粒高粱。根据籽粒中直链 淀粉的含量，籽粒高粱中又可分出一个特殊类型，粘高粱或糯高梁，其直链淀粉 含量在0 5 之间，低于一般高粱。尽管由于自然变异和人工选择的原因，不同 类型高粱在形态上具有一定差异，但仍然同属于一个种，可以相互杂交，彼此不 存在生殖隔离”j 。 在众多的禾谷类作物中，高粱基因组较小，约7 5 0 m b p ，只稍大予的水稻基 因组( 约4 4 0 m b p ) ，远小于的玉米( 约2 5 0 0 m b p ) 、小麦( 1 6 6 9 5 1 7 4 2 3 m b p ) 、大麦( 约 4 6 0 0 m b p ) 和甘蔗( 9 3 0 7 4 4 0 m b p ) t5 | 。高粱与玉米、甘蔗等较大基因组的禾谷类作 物亲缘较近，且基凶组小，被认为是禾谷类作物基因组研究中的又一重要模式植 物f 6 1 。 1 文献综述 1 1 2 高梁生产应用 随着世界工业和交通运输业飞速发展，能源短缺问题以及随之而来的环境问 题已经阻碍着人类社会的可持续发展。生物质能是最有希望的替代能源之一。生 物质能中粮食乙醇的发展受到国家政策的限制，其中最主要的玉米乙醇已经停止 扩大产能，发展非粮食乙醇和纤维素产能已经成为了必然趋势。而甜高粱具有很 高的光合效能，为大豆、甜菜、小麦的2 n 3 倍【7 1 。甜高粱从拔节挑旗以后，平均 每天能够长高5 8 c m ，每天合成的糖分可产酒精4 8 l h m 2 ，而玉米仅约15 3 l 慨2 ， 小麦为9 l h m 2 ，甜高粱是玉米和小麦的3 2 倍和1 6 倍【引。欧共体对生物能源的研究 确定了两种生物质能源类型：一种是甜高粱，另外是速生轮作林，而一年生甜高 粱的生产力接近速生轮作林的2 倍，可见甜高粱是最有希望的再生能源作物之一 口j 。同时，利用甜高粱茎秆的单糖直接发酵酒精，可大大降低成本，这也正是目 前酒精企业对以甜高粱为原料生产燃料乙醇或乙烯等化工产品项目感兴趣的主 要原因。同时随着使用纤维素生产生物燃料技术的成熟，高粱作为新生物质能源 的潜在可能性很大，高粱由于具有快速生长从而大量积累纤维素等优点，可作为 生物燃料的理想原材料。 高粱是目前最耐旱的栽培作物之一，它有效的降低了农户的灌溉成本。国 际水管理研究所曾发出警告，到2 0 2 5 年地球上将约2 5 的人口面临严重缺水， 高粱等节水作物的载种，可提高灌溉和土地水利用率。甜高粱每生产千克干物 质仅约耗水2 5 0 3 5 0 k g ，为小麦、黄豆的一半【8 】，对干旱的调节适应性能优于小 麦、玉米、谷子等旱粮作物。相反在水淹条件下，甜高粱又比玉米等作物更耐 涝【9 j 。这些特性在畜牧业发展中有着极大的应用前景。近几年，有限的草场资 源已不能满足畜牧业的迅速发展和人们的需要。饲用高粱是具有可再生性，当 年可进行多次x , j n l l0 | ，而且具有产量高和抗逆性强等优点，弥补了饲用作物一 次播种一次收获、不耐干旱等缺点，大大延长了干旱、半干旱地区的反刍动物 青绿粗饲料的供应时限，这不仅丰富了粗饲料的利用类型，还有效地保护了草 场资源，具有极佳的环境效益。 尽管高粱具有诸多利用价值，对推动农村经济发展具有重要意义，但是在 最近1 5 年内世界几种主要农作物尤其是玉米和大豆产量快速提高的情况下，高 粱的年产量仍然相对平稳，据美国农业部统计，主要在5 3 0 0 万吨和5 5 0 0 万吨 间波动【l 。总的来讲我国对高粱综合利用的研究尚存在不深、不透、不广，远 不及其他作物。因此，现阶段有必要深入开展高粱生理生化、遗传育种等方面 的研究，从而有效挖掘高粱潜在的应用价值。 2 i 文献综述 1 2s s r 分子标记 1 2 1 分子标记 d n a 分子技术的迅猛发展为植物遗传育种研究开辟了新天地。d n a 分子标 记( d n am o l e c u l a rm a r k e r ) 是指可遗传并可检测的d n a 序列或者等位基因，可在 个体间遗传物质核苷酸序列变异的基础之上直接反映d n a 水平遗传变异，不受 环境和发育时间阶段影响。同时分子标记技术发展至今，由于其数量丰富、多态 性高、遗传稳定等优势，已经在遗传育种各个方面得到了广泛应用【1 2 1 。从1 9 8 0 年b o t s t e i n 等首次提出d n a 的限制性片断长度多态可作为遗传标记的想法以及 1 9 8 5 年p c r 技术的诞生至今，已发展了1 0 多种基于d n a 多态性分子标记技术【1 3 】。 依据对d n a 多态性的检测手段，可将d n a 分子标记分为以下四类：基于d n a 与 d n a 杂交的d n a 标记，如r f l p ；基于p c r 的d n a 标记，如r a p d 、i s s r 、s s r 等；基于p c r 与限制性酶切技术结合的d n a 标记，女n a f l p ；基于单核苷酸多态 性的d n a 标记，妻i s n p 标记【1 4 】。 限制性片段长度多态性( r f l p ) 是出现最早的标记技术，该标记在应用中 非常稳定，是一种共显性标记能够提供标记位点完整遗传信息。但其分析过程所 需d n a 量较大，步骤较多，周期长，制备探针及检测中要用到放射性同位素， 成本高、成功率低从而影响其使用及推广【l5 1 。r a p d ( 随机扩增多态性) 是一种以 样品基因组d n a 为模板，通过随机引物p c r 非特异扩增d n a 片段，可反映整个 未知基因组序列多态性性的分子标记技术【14 1 。r a p d 具有技术简单、检测迅速灵 敏、d n a 样品用量少的特点，但r a p d 为显性遗传，存在共迁移和重复性较差问 题l l6 | 。i s s r 是一种原理与s s r 标记相似，是对s s r 之间的d n a 序列进行p c r 扩增 的一种标记技术。i s s r 在引物设计上不需知道d n a 序列即可用进行扩增，能比 r f l p 、r a p d 、s s r 等提供更多的遗传信息，但i s s r 同样是一种显性标记不能很 好的区分分离群体的纯合以及杂合状态【1 7 】。a f l p 本质上与r f l p 相一致，是一种 基于p c r 技术选择性扩增基因组d n a 限制性酶切片段的分子标记技术。它综合了 r f l p 和r a p d 的优点，既有r f l p 的稳定性s n p c r 反应快速、灵敏的特点，又有 r a p d 的方便性，同时还克服了i 江l p 和r a p d 的缺点【1 8 】，但整个过程较为繁琐且 成本较高。s n p ，即单核苷酸多态性，主要是由于基因组d n a 单碱基的转换、颠 换和单碱基的插入、缺失等变异引起的d n a 序列多态性，具有位点丰富，遗传 稳定、易实现分析的自动化等优点【l9 1 ，但是开发s n p 检测技术价格非常昂贵。 1 文献综述 1 2 2s s r 分子标记的原理及特点 简单序列重复( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，缩写s s r ) 是指基因组中存在的由2 到5 个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。h a m a d a 等【2 0 】 于1 9 8 2 年最早在人类基因组研究中发现，它极其丰富且分布在整个基因组中。 t a u t z 等【2 l 】的研究证明了s s r 在真核生物中存在的普遍性与广泛性。这种序列重复 次数的不同就产生了等位基因之间的多态性，由于s s r 两端多为相对保守的单拷 贝序列，通过设计引物便可以进行p c r 扩增，进行多态性检测【2 2 】。s s r 标记技术 具有以下特点：覆盖整个染色体组，数量丰富、多态性高；以共显性孟德尔方式 遗传；对d n a 数量及质量要求不高、实验程序简单、易于利用p c r 技术分析， 重复性好1 2 3 1 。 1 2 3s s r 标记的开发和应用 s s r 标记的开发是要搜索具有重复序列的d n a 片段，再根据其两端保守 序列设计引物，以此进行p c r 扩增用于研究检测，李明芳等【2 4 】曾把对s s r 引 物的开发方法总结为以下四种：( 1 ) 经典方法：首先建立一个基因组文库，然 后用微卫星序列的探针杂交筛选，再挑选阳性克隆进行测序，最后根据s s r 两 端的侧翼序列设计引物，这种方法所得到的d n a 片段容易测序，但s s r 阳性 克隆的效率则很低。( 2 ) 微卫星富集法：该方法就是在筛选小插入片段基因组 文库的基础上，再增加一次筛选。这种方法可以包括两种，一种是用含s s r 序 列引物进行p c r 富集，另一种就是用含微卫星序列的探针进行杂交富集。( 3 ) 省略筛库法：是在f i s h e r 等【2 5 】发明了5 锚定p c r 技术的基础上，根据氨基酸序 列设计两组带有一定简并性的引物库，从不同生物物种中扩增出未知的核苷酸 序列的基因。基于以上技术s t m p ( s e q u e n c e t a g g e dm i c r o s a t e l l i t ep r o f i l i n g ) 【2 6 】 和s a m ( s e l e c t i v e l ya m p l i f i e dm i c r o s a t e l l i t e ) 2 7 】两种新方法又相继被推出。( 4 ) 数据库搜寻法：它是用专门的s s r 分析软件搜索公共数据库里登录的序列信息， 以此发展s s r 标记的，这种方法较为简单有效。 过去开发s s r 引物要求经过建库、筛库、测序等复杂的程序，这个过程成 本极高，成为s s r 标记技术广泛应用的瓶颈。随着上述开发s s r 引物新方法的 问世，s s r 标记技术日益显示出广泛的应用前景。目前，s s r 标记技术已在水 稻、玉米、小麦、高粱和大豆等作物的遗传连锁图谱构建2 7 枷1 ，基因定位【3 l - 3 4 1 、 品种鉴定【3 5 】、种子纯度的检测口6 1 、和遗传差异和多样性研究【3 7 4 1 1 方面得到广泛 应用。同样s s r 分子标记在高梁的各个研究领域也得到了广泛的应用。 4 1 文献综述 1 3 高粱s s r 分子标记研究概况 1 3 1 高梁s s r 分子标记的开发 随着分子标记技术的日益成熟和完善，分子标记在高粱上的理论研究和实际 应用得到了长足的进展。其中高梁s s r 分子标记因其优点众多而得到了广泛的关 注，在过去的十几年里，关于高粱s s r 标记的开发和应用不断有文章报道。 关于高粱s s r 标记开发最早的报道见于1 9 9 6 年，b r o w n 等【4 2 1 通过在数据库寻 找，以及与玉米序列比对和高粱基因组文库筛选等方法，设计了4 9 个高粱s s r 标 记，这为以后高梁相关研究提供了很大的帮助。在这之后，t a r a m i n o 等【4 3 1 又重新 通过高粱基因组文库探针筛选的方法，发现1 3 个s s r 位点，并把7 个标记定位在 了他们用r f l p 标记构建的7 个连锁群中，填补了其中的部分间隙。而更多的关于 s s r 标记的开发是k o n g 等l 4 4 j 报道他们设计的p a , x t x p 开头命名的3 8 个s s r 标记，并 把其中的3 1 个标记定位在了他们构建的遗传图谱中。继其之后，b h a t t r a m a k k i 等 h 副又开发了3 1 3 + x t x p 型s s r 标记，x t x p 型标记的开发无疑对以后的高粱众多领域 的研究产生巨大的作用，在高粱遗传多样性研究及其q t l 定位和遗传图谱的构建 都可见到这些标记的使用。这之后s c h l o s s 等【4 6 】又通过设计r f l p 探针获取t 6 0 个 x c u p 型s s r 标记，他指出因缺乏双核苷酸简单重复的s s r 标记的开发，标记在品 种间多态性上显著较少，影响了其在后续研究中应用。s r i n i v a s 等【4 7 】通过干旱胁 迫相关的序列表达标签也发展了为数不多的s s r 标记，并将其整合到了富# x t x p 型s s r 标记的遗传图谱中。在高粱测序未完成之前，以上这些珍稀的s s r 标记的 开发给国内外众多课