第2章 细胞生物学研究方法.pdf

1 第二章 细胞生物学研究方法第二章 细胞生物学研究方法 一、显微成像技术 二、细胞化学技术 三、细胞分选技术 四、细胞工程技术 五、分离技术 六、分子生物学方法 一、显微成像技术 二、细胞化学技术 三、细胞分选技术 四、细胞工程技术 五、分离技术 六、分子生物学方法 2 第一节 显微成像技术第一节 显微成像技术 1、光学显微镜1、光学显微镜 1.1 普通复式光学显微镜技术1.1 普通复式光学显微镜技术(图)(图) 原理 原理 (图) (图) 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离分辨率是指区分开两个质点间的最小距离(图)(图) 分辨率 分辨率 r = 0.61/n sina 最大分辨率 最大分辨率 蓝光蓝光=450nm, sin70=0.94 r = 0.3 m(n=1), r = 0.2 m(n=1.5) 分辨极限与放大率分辨极限与放大率 光镜样本制作：样品固定、包埋、切片、染色 光镜样本制作：样品固定、包埋、切片、染色 (图)(图) 3 1.2 常用的光学显微镜1.2 常用的光学显微镜 体视显微镜体视显微镜(图)(图) 相差显微镜和录相增差显微镜 倒置显微镜 相差显微镜和录相增差显微镜 倒置显微镜(图)(图) 暗视野显微镜暗视野显微镜(图)(图) 荧光显微镜 激光共焦点扫描显微镜技术 荧光显微镜 激光共焦点扫描显微镜技术 4 2、电子显微镜2、电子显微镜(图)(图) 2.1电子显微镜的基本知识2.1电子显微镜的基本知识 ?电镜与光镜的比较?电镜与光镜的比较(图)(图) 电镜的分辨率0.2nm 超微结构(亚显微结构)电镜的分辨率0.2nm 超微结构(亚显微结构) ?电子显微镜的基本构造?电子显微镜的基本构造 (图)(图) 照明系统、成像系统、真空系统、记录系统照明系统、成像系统、真空系统、记录系统 2.2 透射电子显微镜(TEM)2.2 透射电子显微镜(TEM) ?超薄切片技术超薄切片技术 (图) (图) ：细胞超微结构的观察技术：细胞超微结构的观察技术 用于电镜观察的样本制备示意图 用于电镜观察的样本制备示意图 (图) (图) 固定、包埋、切片、染色固定、包埋、切片、染色 为什么电子显微镜需要真空系统为什么电子显微镜需要真空系统 与与LM相比相比,EM样 品组织固定有什 么特殊要求 样 品组织固定有什 么特殊要求? 5 ? 负染色技术 (? 负染色技术 (Negative staining)Negative staining)金属投影金属投影 (图)(图) 染色背景，衬托出样品（病毒等）的精细结构 （轮廓） 染色背景，衬托出样品（病毒等）的精细结构 （轮廓） ?冰冻蚀刻技术（Freeze etching）冰冻蚀刻技术（Freeze etching） （图）（图） 冰冻断裂、蚀刻、复型：冰冻断裂、蚀刻、复型： 作用：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面 结构。 作用：主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面 结构。 快速冷冻深度蚀刻技术 快速冷冻深度蚀刻技术 (图)(图) ? 电镜三维重构技术? 电镜三维重构技术 (图)(图) 膜蛋白、病毒以及蛋白质-核酸复合物等大的 复合体的三维结构。 膜蛋白、病毒以及蛋白质-核酸复合物等大的 复合体的三维结构。 6 2.3 扫描电镜（SEM）2.3 扫描电镜（SEM） ?原理与应用?原理与应用(图) (图) 样品表面或断面的形貌特征的观察技术 ?电子 样品表面或断面的形貌特征的观察技术 ?电子“探针探针”扫描，激发样品表面放出二次电子扫描，激发样品表面放出二次电子 (图)(图)， 探测器收集二次电子成象。 ? 样品制备:取材,清洗,固定,脱水,干燥,粘样,喷金 ? 环境扫描电镜 ， 探测器收集二次电子成象。 ? 样品制备:取材,清洗,固定,脱水,干燥,粘样,喷金 ? 环境扫描电镜 ?显示生物样品的真实面貌 ?观察常规扫描电镜较难处理的样品 ?生物样品的X射线元素分析 ?生物样品的活体观察 ?显示生物样品的真实面貌 ?观察常规扫描电镜较难处理的样品 ?生物样品的X射线元素分析 ?生物样品的活体观察 2.4 扫描遂道显微镜2.4 扫描遂道显微镜 7 第二节 细胞化学技术第二节 细胞化学技术 一、酶细胞化学技术一、酶细胞化学技术 酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学 反应来显示酶在细胞内的定位。 酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学 反应来显示酶在细胞内的定位。 二、 免疫细胞化学技术(图)二、 免疫细胞化学技术(图) 免疫荧光技术:对抗原进行细胞内定位 免疫荧光技术:对抗原进行细胞内定位 免疫电镜技术:进行亚细胞结构和分子定位. 免疫电镜技术:进行亚细胞结构和分子定位. 8 第三节 细胞分选技术第三节 细胞分选技术 一、流式细胞仪的基本原理一、流式细胞仪的基本原理(图)(图) 应用:对细胞或染色体进行分选,并对单个细 胞或其他生物微粒进行定量分析,包括测量 细胞的大小、形状、细胞DNA、RNA含量和 细胞总蛋白等。 应用:对细胞或染色体进行分选,并对单个细 胞或其他生物微粒进行定量分析,包括测量 细胞的大小、形状、细胞DNA、RNA含量和 细胞总蛋白等。 二、分选二、分选(图)(图) 9 第四节 细胞工程技术第四节 细胞工程技术 细胞工程(cell engineering)：利用细胞生物学的原 理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的 设计，有计划地改变或创造细胞遗传的技术。 细胞工程(cell engineering)：利用细胞生物学的原 理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的 设计，有计划地改变或创造细胞遗传的技术。 一、细胞培养一、细胞培养 细胞培养(cell culture)：在体外模拟体内的生理环 境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的 技术。 细胞培养(cell culture)：在体外模拟体内的生理环 境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的 技术。 1、动物细胞培养1、动物细胞培养(图)(图) 2、植物组织培养2、植物组织培养(图)(图) 10 二、细胞融合与单克隆抗体技术二、细胞融合与单克隆抗体技术 1、细胞融合1、细胞融合(图)(图) 2、单克隆抗体技术2、单克隆抗体技术(图)(图) 3、显微操作术3、显微操作术(图)(图) 三、动物细胞核移植克隆技术三、动物细胞核移植克隆技术(图)(图) 11 第五节 分离技术第五节 分离技术 1、离心分离技术1、离心分离技术 用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物 类型： 用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物 类型： ?差速离心：?差速离心：分离密度不同的细胞组分分离密度不同的细胞组分(图)(图) ?密度梯度离心：?密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离精细组分或生物大分子的分离(图)(图) 2、层析分离技术2、层析分离技术 凝胶过滤层析 亲和层析 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析 离子交换层析 离子交换层 析的原理是 什么 离子交换层 析的原理是 什么? 12 第六节 分子生物学方法第六节 分子生物学方法 1、基因工程技术1、基因工程技术(图)(图) 2、基因作图与人类基因组计划2、基因作图与人类基因组计划 3、PCR技术3、PCR技术 4、选择性基因剔除与转基因鼠4、选择性基因剔除与转基因鼠(图)(图) 5、乳腺生物反应器技术5、乳腺生物反应器技术(图)(图) 13 Compound Light Microscope 14 Parts of a Nikon compound microscope. 15 16 图3-1-1 显微镜成像原理图3-1-1 显微镜成像原理 AB：被检物体 ：被检物体 L1：物镜 ：物镜 A1 B1：倒立实像 ：倒立实像 L2：目镜 ：目镜 A2 B2：放大的倒立虚像 ：放大的倒立虚像 L3：眼球晶状体 ：眼球晶状体 A3 B3：视网 膜上正立像 ：视网 膜上正立像 F1，F2：分别是物镜和目镜的焦平面：分别是物镜和目镜的焦平面 17 18 19 20 相差显微镜技术 ?相差显微镜相差显微镜（phase-contrast microscope） 将光程差或相位差转换成振幅差，可用 于观察活细胞 (图) ?录像增差显微镜技术录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）(图) 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率 下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动 21 22 23 ? 相差聚光器：向显微镜提供环状光源相差聚光器：向显微镜提供环状光源 ? 相差物镜：物镜的后焦点平面处装有相板， 分为两部分，一部分可通过直射光，为半透 明的环状，叫共轭面，另一部分可通过衍射 光，叫补偿面。 相差物镜：物镜的后焦点平面处装有相板， 分为两部分，一部分可通过直射光，为半透 明的环状，叫共轭面，另一部分可通过衍射 光，叫补偿面。 ? 相板上通常有吸收膜和相位膜，吸收膜吸收 光线，降低光透过率；相位膜推迟相位。 相板上通常有吸收膜和相位膜，吸收膜吸收 光线，降低光透过率；相位膜推迟相位。 ? 相差滤色镜相差滤色镜 24 应用： 无色透明活体标本的细微结 构，检查 应用： 无色透明活体标本的细微结 构，检查,鉴定活体细胞鉴定活体细胞(培养细 胞 培养细 胞,分离细胞分离细胞) 25 26 倒 置 显 微 镜 倒 置 显 微 镜 主要应用： 集光器与载 物台之间工 作 距 离 较 高，可以放 置培养皿、 培养瓶等容 器，直接对 培养的细胞 进行照明和 观察。 主要应用： 集光器与载 物台之间工 作 距 离 较 高，可以放 置培养皿、 培养瓶等容 器，直接对 培养的细胞 进行照明和 观察。 27 28 主要应用： 主要观察的是物体的轮廓，分 辨不清内部的微细胞构造，适 合于观察活细胞内的细胞核、 线粒体、液体介质中的细菌和 霉菌等。 主要应用： 主要观察的是物体的轮廓，分 辨不清内部的微细胞构造，适 合于观察活细胞内的细胞核、 线粒体、液体介质中的细菌和 霉菌等。 原理：丁道尔现象，微粒 对斜射光反射或衍射，增 大了人眼可见性。 原理：丁道尔现象，微粒 对斜射光反射或衍射，增 大了人眼可见性。 29 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy) 原理(图） 应用 (图） ? 直接荧光标记技术 ? 间接免疫荧光标记技术 ? 主要应用：研究细胞内物质的吸收、运输以 及化学物质的分布及定位等。 30 宽谱线发射光 （汞灯） 宽谱线发射光 （汞灯） 滤掉其他光，透 过激发光 滤掉其他光，透 过激发光 滤掉激发光，透 过荧光 滤掉激发光，透 过荧光 标本受激发产生 荧光向四周发散 标本受激发产生 荧光向四周发散 激发光受反射、折 射或衍射向四周发 散 激发光受反射、折 射或衍射向四周发 散 31 32 33 激光共焦点扫描显微镜技术 (Laser Scanning Confocal Microscopy） 原理 (图) 应用： ? 排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差 和提高分辨率(1.4-1.7) ? 可重构样品的三维结构。 34 X Y Z 细胞标本 35 36 37 38 电子显微镜的基本构造电子显微镜的基本构造 39 40 41 Examples of negatively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negative staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b). 42 43 44 45 46 47 ?Scanning Probe Microscope,SPM 80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器, 包括：STM、AFM、 磁力显微镜、摩擦力显微镜等 ?原理： 扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产生彼此间相互作用力， 如 量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、 摩擦力等， 并在计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电 特性或磁特性等。(图) ?特点： (1) 可对晶体或非晶体成像，无需复杂计算，且分辨本领高。（侧分辨率 为0.10.2nm，纵分辨率可达0.01nm）； (2) 可实