（环境工程专业论文）表面活性剂对稻草酶解影响的研究.pdf

硕士学位论文 摘要 利用可再生的木质纤维素生产酒精，是替代石油的可再生能源的来源。木质 纤维素制取酒精包括水解生产还原糖和发酵还原糖产酒精，其中水解过程是关键 的一步。目前，利用纤维素酶促水解，提高酶的活性和水解率成为研究的热点。 本课题采用纤维素酶促水解的方法，以经稀酸预处理的稻草为底物，探讨了 添加化学表面活性剂t w e e n8 0 和生物表面活性剂鼠李糖脂对酶解过程的糖产率、 酶稳定性、纤维素转化率的作用以及对酶动力学特征和酶在纤维素上吸附的影响。 结果表明，不同浓度的t w e e n8 0 和鼠李糖脂对稻草酶解有不同程度的促进，添加 1 c m c 和3 c m ct w e e n8 0 使糖产率分别提高1 8 0 7 和1 1 9 8 ，而添加o 0 1 和o 0 3 鼠李糖脂使糖产率分别增加了2 3 0 1 和2 2 1 6 ，相比较鼠李糖脂的效果更好。表 面活性剂能有效增强酶的稳定性，添加高浓度表面活性剂的酶稳定性优于添加低 浓度表面活性剂，添加浓度为3 c m c 的t w e e n8 0 得到最高相对c m c a ( 羧甲基纤 维素酶活) 1 0 8 0 6 和最高相对f p a ( 滤纸酶活) 8 0 2 6 。表面活性剂能提高酶 解反应的纤维素转化率，而且添加鼠李糖脂的转化率明显高于t w e e n8 0 。表面活 性剂不仅能够提高最大反应速度并使米氏常数变大，而且显著地降低了纤维素酶 在纤维素上的吸附。 本实验还研究了更换稻草以及添换稻草和表面活性剂的酶解过程中还原糖产 量提高率和溶液中的蛋白质浓度，考察了t w e e n8 0 和鼠李糖脂的影响。研究结果 表明，更换稻草的酶解体系使还原糖产量和蛋白质浓度增加。添加鼠李糖脂比 t w e e n8 0 有更大的还原糖产量提高率，其中添加3 c m c 鼠李糖脂的效果最好。添 加表面活性剂的样品其蛋白质浓度随反应进行而不断增加，添加鼠李糖脂能最有 效地提高蛋白质浓度，添加1 c m c 和3 c m c 鼠李糖脂使蛋白质浓度提高了7 5 4 4 和7 7 3 3 。在同步添换稻草和表面活性剂的酶解体系中，添加3 c m ct w e e n8 0 使 还原糖产量提高率了2 2 7 1 ，而添加1 c m c 鼠李糖脂的还原糖产量提高率也达 1 1 9 6 。添加t w e e n8 0 和鼠李糖脂都能显著提高蛋白质的浓度，添加3 c m c 和l c m c t w e e n8 0 使蛋白质浓度增加了9 4 3 8 和7 6 0 7 ，而添加鼠李糖脂使蛋白质浓度 提高了超过8 0 。 关键词：酶水解；鼠李糖脂；t w e e n8 0 ；酶稳定性；纤维素 表面活性剂对稻草酶解影响的研究 a bs t r a c t m a k i n gu s eo fr e n e w a b l el i g n o c e l l u l o s et op r o d u c ea l c o h o li s as o u r c eo f a l t e r 彻t i v ee n e 玛yf o rf a s s i l f h e l s t r a i l s f o r m i n gl i g n o c e l l u l o s et oa l c o h o lc o n t a i l l s h y d r o l y s i s i l l gt op r o d u c er e d u c i n gs u g a ra n df e r r n e n t i n gr e d u c i n gs u g a rt op r o d u c c a l c o h o l ，a n dh y d r o l y s i s i n gi st h ek e ys t e p u s i n gc e l l u l a s et oa c c e l e r a t eh y d r o l y s i sa n d p r o m o t i n gt h ea c t i v i t yo fc e l l u l a s ea n dt h eh y d r o l y s i sy i e l dh a db e e nf o c u s e do n 、v i d e l y a tt h ep r e s e mt i m e t h em e t h o do fe n z ) r m a t i ch y d r o l y s i sw a sa d o p t e da n ds t r a wp r e t r e a t e db yd i l u t e d v i t r i o lw a su s e da ss u b s t r a t et o s t u d yt h ee 日e c t so fr e d u c i n gs u g a ry i e l d ，e n z y m e s t a b i l i t ya n dc o n v e n t i o nr a t eo fc e l l u l o s ed u r i n gt h ec o u r s eo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sa s w e l la st h ei m p a c t so fe l l z y m ek i n e t i cc h a r a c t e r i s t i c s 觚da d s o r p t i o no fc e l l u l a s eo n c e l l u l o s eb ya d d i t i o no fc h e m i c a l s u r f a c t a n tt 、e e n8 0a i l db i o s u r f a c t 锄tr h a m n o l i p i d t h er e s u h si n d i c a t e dt h a tt w e e n8 0a n dr h a m n o l i p i da t d i f f e r e mc o n c e n t r a t i o n s e l l l l a n c e dt h ep r o d u c t i o no fr e d u c i n gs u g a r t w e e n8 0a tlc m ca n d3 c m ci n c r e a s e d r e d u c i n gs u g a ry i e l db y18 0 7 a n dl1 9 8 ，w h i l er h a m n o l i p i da t1c m ca n d3 c m c i n c r e a s e dr e d u c i n gs u g a ry i e l db y2 3 o1 a n d2 2 16 ，r e s p e c t i v e l y i tc a nb es e e n 丘o mt h ee ) 【p e r i m e n t a lr e s u l t st h a ts u r f a c t a n t si m p r o v e de n z y m es t a b i l “ya v a i l a b l y s u r f a c t a m sa th i g hc o n c e n t r a t i o n sw e r es u p e r i o rt ot h o s ea tl o wc o n c e n t r a t i o n si n e n z y m es t a b i l i t y 7 i w e e n8 0a t 3 c m co b t a i n e dm a x i m a lr e l a t i v ec m c a ( s o d i u m c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s ea c t i v i t y ) 10 8 0 6 a n dm a x i m a lr e l a t i v ef p a ( f i l t e rp 印e r a c t i v i t y ) 8 0 2 6 s u r f a c t a n t sa l s oe i l l l a n c e dc o n v e r s i o nr a t eo fc e l l u l o s e ，a n dt h a ti n t h ep r e s e n to fr h a m n o l i p i d ，t h ep e r c e n tc o n v e r s i o no fc e i l u l o s ew a sh i g h e rt h a nt h o s e w i t ht w e e n8 0d i s t i n c t l y m o r e o v e r ，s u r f a c t a n t sn o to n l yp r o i n o t e dm a x i m a lv e l o c i t y o fe 1 1 z y m a t i cr e a c t i o na n dl a r g e n e dm i c h a e l i sc o l l s t a n tb u ta l s or e d u c e da d s o 印t i o no f c e l l u l a s eo nc e l l u l o s er e n l a r k a b l y t h i se x p e r i e n c ea l s os t u d i e dt h ei m p a c t so fr e d u c i n gs u g a ry i e l da n dp r o t e i n c o n c e n t r a t i o nb yr e n e w a ls t r a wa l o n ea sw e ua sr e n e w e lb o t ho fs t r a wa n ds u r f a c t a m s d u r i n ge r 亿y m a t i ch y d r o l y s i sp r o c e s s t h er e s u h so ft h i sr e s e a r c hi n d i c a t e dt h a tt h e r e n e w a b l eo fs t r a wd u r i n ge n z y m a t i ch y d r o l y s i se i l l l a n c e db o t hr e d u c i n gs u g a ry i e l d a n dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n r h a 啪o l i p i dh a d h i g h e rr e d u c i n gs u g a ry i e l dt h a nt w e e n8 0 ， 孤l dr h a m n 0 1 i p i da t3 c r n ch a dt h eb e s te 丘i e c t t h ep r o t e i l lc o i l c e n t r a t i o na l s o i i l c r e a s e d i i i 硕士学位论文 a l o n gw i t he n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n dr l l a 舢1 0l i p i de n h a n c e dp f o t e i nc o n c e n t r a t i o nm o s t e v i d e n t l y r j l a 砌o l i p i da t1c m ca i l d3 c m cp r o m o t e dp r o t e i nc o n c e n t r a t i o nb y7 5 4 4 a n d7 7 3 3 r e s p e c t i v e l y i nr e n e w a b l eb o t ho fs t r a wa n ds u r f a c t a n t se i l z y m a t i cs y s t e i i l ， t 钾e e n8 0a t3 c m cp r o m o t e dr e d u c i n g s u g a ry i e l db y2 2 7 l ，w r h i l er h a 舳o l i p i da t l c n l ce n h a n c e dr e d u c i n gs u g a ry i e l db y11 9 6 1 、v e e n8 0a n dr h a l t m o l i p i de n h a n c e d p r o t e i nc o n c e m r a t i o nn o t a b e l y t w e e n8 0a t3 c m ca r l d1c m ci n c r e a s e d p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n b y 9 4 38 a n d 7 6 0 7 ，、】i 釉l er h a n m o l i p i dr a i s e dt h ep r o t e i l l c o n c e n t r a t i o nm o r et h a n8 0 k e yw o r d s ：e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；r h a i l l n 0 1 i p i d ；t w e e n8 0 ；e l l z y m es t a b i l i t y ；c e l l u l o s e 表面活性剂对稻草酶解影响的研究 插图索引 图1 1 纤维素的结构4 图1 2 木质素的前体化合物6 图1 3 协同降解模型9 图1 4 纤维素酶水解纤维素的可能途径1 0 图2 1 鼠李糖脂类化合物的四种常见类型1 8 图3 1 未处理稻草粉末x 射线衍射图谱2 8 图3 2 稀酸预处理稻草粉末x 射线衍射图谱2 8 图4 13 ，5 二硝基水杨酸比色法原理一3 1 图4 2d u n o u y 方法示意图3 2 图4 3 葡萄糖标准曲线4 0 图4 4 纤维素酶用量对还原糖产量的影响4 l 图4 5 表面活性剂对糖产率的影响4 l 图4 6 表面活性剂对c m c a 的影响4 2 图4 7 表面活性剂对f p a 的影响一4 3 图4 8 表面活性剂对表面张力的影响4 4 图4 9 表面活性剂对纤维素转化率的影响一4 4 图4 1 0l b 双倒数图4 5 图4 1 1 表面活性剂对纤维素酶在纤维素上吸附的影响4 6 图5 1 更新稻草酶解体系对还原糖产量提高率的影响5 3 图5 2 表面活性剂对还原糖产量提高率的影响5 4 图5 3 表面活性剂对还原糖产量提高率的影响5 5 图5 4 表面活性剂对蛋白质浓度的影响5 6 图5 5 表面活性剂对蛋白质浓度的影响5 7 v 硕士学位论文 附表索引 表1 1 建立纤维素酶解综合机械动力学所需要考虑的关键因素1 2 表2 1 几种化学表面活性剂和生物表面活性剂的物理性质比较一1 6 表2 2 生物表面活性剂的种类及其微生物来源1 6 表2 3 纯鼠李糖脂的常见性质一1 8 表3 1 预处理前后稻草的成分变化对比2 6 表4 1 估测鼠李糖脂的临界胶束浓度3 4 表4 2 估测t w e e n8 0 的临界胶束浓度3 4 表4 3 种子培养基3 7 表4 4 发酵培养液配方3 8 v m 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 囊寸 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 保密口，在年解密后适用本授权书。 2 不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：蔓甘 导师签名 日期：a 汐年r 月f 阳 日期：护萨，月汐 表面活性剂对稻草酶解影响的研究 第1 章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 研究意义 随着世界人口的增长和工业化国家的大量出现，能源消耗从上世纪开始持续 增加，从长远看，液体燃料短缺将是困扰人类发展的一个大问题。在此背景下， 生物质作为唯一可转化为液体燃料的可再生资源，正日益受到重视。植物纤维素 是世界上最丰富的碳水化合物资源，利用纤维素生产酒精，是替代有限原油的令 人满意的可再生能源的来源，对缓解能源危机起着重要作用。 与此同时，农村主要的农业废物稻草秸秆未得到充分利用，大多数被用作燃 料、工业造纸原料或还田肥料，不但利用效率低，而且还对环境造成了污染。因 此，对稻草秸秆进行开发利用，扩大其使用范围和增加其附加值的研究，吸引了 众多研究者的注意。在这些研究中，应用最广泛的就是把稻草秸秆转变成可发酵 的糖，然后通过微生物发酵成酒精和其他化学制品【l 】。如果能够很好地利用这些 资源，不仅能避免资源浪费，而且还能改善我们的生态环境。 木质纤维素制取酒精包括木质纤维素水解生产还原糖和发酵还原糖生产酒精 2 个过程，其成本在目前技术水平上相对较高，主要是由于水解过程的高消耗和 低产出【2 】。水解的方法有酶解、酸解、热解等方法，但酸解存在着腐蚀、酸难以 回收以及抑制发酵等弊端，热解法需要去除纤维素热解液中抑制微生物生长和发 酵的物质，提高了对技术的要求且增加了运行成本，因此酶水解是目前采用的比 较多的一种方法。该法是在较低温下利用高度专一的纤维素酶对纤维素进行水解， 通过酶将固体纤维转变为可溶性糖，成本低于酸解和热解。由于天然木质纤维素 结构的复杂性，进行生物转化的难点在于如何高效地将纤维素降解为可发酵糖。 然而，高的纤维素转化率要求较高的酶负荷，使得生产过程不够经济【3 】。为了降 低生产成本，需要对纤维素酶水解法作深入研究。 1 1 2 木质纤维素水解研究难点 植物来源的木质纤维素均含有丰富的纤维素、半纤维素和木质素【4 5 1 ，纤维素 和半纤维素可作为乙醇发酵的原料【6 】。天然木质纤维含有三种成分：木质素、半 纤维素和纤维素。 在酶水解过程中，由于纤维素的微小构成单元周围被半纤维素和木质素层的 鞘所包围，木质素虽然对纤维素酶反应没有阻碍作用，但它阻止了纤维素酶对纤 硕士学位论文 维素的作用，而且纤维素本身存在的晶体结构也会阻止酶接近纤维素表面。木质 素和含纤维素的半纤维素的复杂结构限制了稻草有效地转化为可发酵的糖【7 j 。因 此，需要借助各种化学的和物理的方法进行预处理，破坏木质纤维素的结构，降 低它的结晶度，并除去木质素或半纤维素，增大酶与纤维素的可接触面积，提高 水解产率。同时，添加辅助的药剂可以促进酶水解。 在酶解过程中，作为反应催化剂的纤维素酶是影响水解反应的关键因素。由 于纤维素酶的生产成本较高，占纤维素酶解工艺的4 0 以上，因此在水解过程中 提高纤维素的酶活从而促进水解是重要的途径。 目前纤维素酶水解法有2 个重要的研究热点：提高酶的活性及水解率【3 】。同 时结合预处理方法，消除木质素的阻碍作用，是提高纤维素被纤维素酶水解的有 效步骤。 1 2 天然纤维素原料的组成与性质 1 2 1 天然纤维素原料的主要成分 所有植物来源的木质纤维素均含有丰富的纤维素、半纤维素和木质素【6 ，7 l ，共 同构成了植物细胞壁的主要成分，也即天然纤维素原料的主要成分。纤维素的分 子排列规则、聚集成束，由此决定了细胞的构架。在纤丝构架之间充满了半纤维 素和木质素。植物细胞壁的结构非常紧密，在纤维素、半纤维素和木质素分子之 间存在着不同的结合力。纤维素和半纤维素或木质素分子之间的结合主要依赖于 氢键；半纤维素和木质素之间除氢键外，还存在着化学键的结合，致使从天然纤 维素中分离的木质素总含有少量的碳水化合物。半纤维素和木质素间的化学键结 合主要在半纤维素分子支链上的半乳糖基和阿拉伯糖基与木质素之间，主要是通 过分离的木质素碳水化合物复合体进行研究。 纤维素、半纤维素和木质素相互交织形成的细胞壁，任何一类成分的降解都 必然受到其他成分的制约。如木质素对纤维素酶和半纤维素酶降解天然纤维素原 料中的碳水化合物有空间阻碍作用，致使许多纤维素分解菌不能侵袭完整的天然 纤维素原料。天然纤维素原料的主要结构是化学性质很稳定的高分子化合物，不 溶于水，也不溶于一般的有机溶剂，在常温下，也不为稀酸和稀碱所水解。三类 主要成分纤维素、半纤维素和木质素的一般组成比例为4 ：3 ：3 ，但不同来源的 原料其比例存在差异，硬木、软木和草本会有所不同。 天然纤维素原料除含有上述三大类组分以外，尚含有少量的果胶、含氮化合 物和无机物成分等。其元素组成一般碳为5 0 ，氢为6 ，氧为4 4 ，氮为o 0 5 o 4 。 2 表面活性剂对稻草酶解影响的研究 1 2 2 纤维素的结构和性质 1 2 2 1 纤维素的物理结构 纤维素的物理结构分为结晶结构、纤丝结构、纤维素的氢键和纤维素的光谱 结构【3 1 0 ( 1 ) 结晶结构：纤维素的聚集状态，即纤维素的超分子结构，主要研究纤维 素分子如何排列组成结晶区与无定形区，再组成基元原纤维、原纤维、微原纤维 结构。主要包括结晶结构、取向结构和原纤维结构。 ( 2 ) 纤丝结构 按照纤丝聚集的大小不同，分为基元原纤维、微纤丝和大纤丝。一个纤维素 分子在微纤丝内，可以通过许多结晶区和无定形区。微纤丝由基元原纤维所构成， 尺寸比较固定。 ( 3 ) 纤维素的光谱结构 应用x 射线衍射技术可分析和测定纤维素超微结构、纤维素结晶度、细胞壁 微纤丝胶等，计算出纤维素的晶胞参数、结晶区大小、结晶度、取向因子等数据。 1 2 2 2 纤维素的化学结构 纤维素分子含有碳、氢、氧三种元素。其中碳含量为4 4 4 4 ，氢含量为6 1 7 ， 氧含量为4 9 3 9 ，其化学式为c 6 h l 0 0 5 ，化学结构的实验分子式为( c 6 h l 0 0 5 ) 。 纤维素由纯的脱水d 葡萄糖的重复单元所组成，是d 葡萄糖以b 1 ，4 糖苷 键联结成链状高分子化合物。纤维素大分子通过大量氢键联接在一起形成晶体结 构的纤维素束。这种结构使得纤维素的性质很稳定，不溶于水，无还原性，在常 温下不发生水解，在高温下水解也很慢，只有在催化剂存在下，纤维素水解才显 著地进行。常用的催化剂是无机酸和纤维素酶，由此分别形成了酸水解和酶水解 工艺f 8 1 0 一般认为纤维素分子约由8 0 0 0 1 2 0 0 0 个左右的葡萄糖残基所组成。用氢氧 化钠溶液在不同浓度和不同温度下处理，用以溶解不同聚合度的纤维素。利用特 定条件下不同的溶解度，将纤维素人为地划分为：a 纤维素，指在2 0 下不溶 于1 6 5 n a o h 溶液的纤维素部分；p 一纤维素，将萃取碱液用酸中和后所沉淀出 的部分；丫纤维素，残留在中和溶液中未沉淀出的部分。 1 2 2 3 纤维素的化学性质 纤维素链中的每个葡萄糖基环上有3 个活泼的羟基，因此，可以发生一系列 与羟基有关的化学反应。然而，这些羟基又可以综合成分子和分子间氢键。纤维 素的酸降解、微生物降解和碱降解主要是纤维素相邻的两个葡萄糖单体间的糖苷 键被打开。图1 1 是纤维素的结构。 硕士学位论文 2 图1 1 纤维素的结构 纤维素的化学反应主要分为两大类：纤维素的降解反应和纤维素羟基有关的 衍生化反应。前者包括纤维素的氧化、酸解、碱解、机械降解、光解、离子辐射 和生物降解等，后者包括纤维素的酯化、醚化、亲核取代、接枝共聚等化学反应。 纤维素的反应主要发生在羟基上，其羟基的酸性和解离倾向排列顺序是： c 2 一o h c 3 o h c 6 o h 。由此可以推断：在碱性介质中，主要进行纤维素仲羟基的 化学反应，而在酸性介质中则有利于伯羟基的反应【8 1 。 纤维素大分子中的d 1 ，4 糖苷键是一种缩醛键，对酸特别敏感，在适当的氢 离子浓度、温度和时间作用下，糖苷键断裂，聚合度下降，还原能力提高，这类 反应称为纤维素的酸性水解。纤维素酸水解得到的可溶性成分主要是糖( 如木糖、 葡萄糖、纤维二糖) ，糖醛类( 如糠醛、羟甲基糠醛) 和有机酸( 如乙酸、甲酸、乙酰 丙酸) 。 生物质在浓酸中的均相水解是纤维素晶体结构在酸中润胀或溶解后，通过形 成酸复合物再水解成低聚糖和葡萄糖： 纤维素+ 酸复合物低聚糖+ 葡萄糖 在稀酸中则经历多相水解。水解发生于固相纤维素和稀酸溶液之间，在高温 高压下，稀酸可将纤维素完全水解成葡萄糖： 纤维素水解纤维素可溶性多糖葡萄糖 1 2 3 半纤维素的结构和性质 1 2 3 1 半纤维素的物理结构 由于半纤维素在化学结构上具有支链，所以它的物理结构是无定形的。但是 某些半纤维素是有结晶结构的1 8 】。如4 o 甲基d 葡萄糖醛酸木聚糖的木聚糖主链 具有三向螺旋轴。 1 2 3 2 半纤维素的化学结构 半纤维素是生物质的另外一个主要成分，是由木糖、甘露糖、葡萄糖等构成 4 表面活性剂对稻草酶解影响的研究 的一类多糖物质【引。半纤维素与纤维素的区别主要在于：半纤维素由不同的糖单 元聚合而成，分子链短且带有支链，主链可以由一种糖单元构成，称为均聚糖， 如聚木糖类半纤维素；也可以由两种或两种以上的糖单元构成，称为非均聚糖， 如聚葡萄糖甘露糖类半纤维素。构成半纤维素的单体主要有：d 木糖( d x y l o ) ， l 阿拉伯糖( l - a r a b i n o s e ) ， d 甘露糖( d m a n n o s e ) ，d 葡萄糖( d - g l u c o s e ) ， d 半 乳糖( d - g a l a c t o s e ) ，d - 半乳糖醛酸( d g a l a c t u r o n e ca c i d ) ，4 o 甲基d 一葡萄糖醛酸， ( 4 一o m e t h y l - d g l u c u r o m c a c i d ) 和d 一葡萄糖醛酸( d - g l u c u r o n i ca c i d ) ，及少量的l 鼠 李糖( l r h a i 姐o s e ) 和l 岩藻糖( l m c o s e ) 。 不同植物中半纤维素的含量不同，结构亦不同。半纤维素的聚合物主链可以 由同一种糖单元构成，也可以由多种糖单元构成，糖与糖之间的连接方式也不同。 由于这种特点，半纤维素的结构不可能像纤维素那样表示。通常根据聚合物主链 的组成，将半纤维素大致分为三类：( 1 ) 聚木糖类半纤维素；( 2 ) 聚葡萄糖甘露 糖类半纤维素；( 3 ) 其它类型半纤维素。 1 2 3 3 半纤维素的化学性质 由于半纤维素是不同种类糖的共聚物，与纤维素类似，每个糖单元上还有羟 基、烷氧基等活性基团。因此，半纤维素具有与纤维素类似的化学反应【9 。1 。 半纤维素的水解产物包括两种五碳糖( 木糖和阿拉伯糖) 和三种六碳糖( 葡 萄糖、半乳糖和甘露糖) 。各种糖所占比例随原料而变化，一般木糖占一半以上， 以农作物秸秆和草为水解原料时还有相当量的阿拉伯糖生成( 可占五碳糖的 1 0 2 0 ) 。半纤维素的聚合度较低，也无晶体结构，故较易水解。半纤维素在 1 0 0 左右就能在稀酸里水解，也可在酶催化作用下完成水解。但因生物质里的半 纤维素和纤维素、木质素相互交织在一起，故只有当纤维素被水解时，半纤维素 才能水解完全【引。 1 2 4 木质素的结构和性质 木质素是植物界中仅次于纤维素的最丰富的有机高分子化合物，广泛分布于具 有维管束的半齿类植物以上的高等植物木质物中。木质素在木材中的含量为 2 0 4 0 ，禾本植物中木质素含量约为1 5 2 0 。 1 2 4 1 木质素的结构 木质素的基本结构是在苯丙烷间通过醚键和碳碳键联结而成的复杂的，无定 形的三维空间结构，依苯丙烷的侧链取代基的不同，它又分为松柏醇( i ) 、芥子醇 ( i i ) 和对香豆醇( i i i ) 三种不同形式，其结构如图1 2 所示。这三种醇是由葡萄糖经 过莽草酸途径和肉桂酸途径合成的，而木质素则是由这三者脱氢聚合而成的。 5 硕士学位论文 锶l o h i n 蕊 图1 2 木质素的前体化合物 1 2 4 2 木质素的化学性质 在纤维素、半纤维素中聚合物的形成主要是通过糖单元之间脱水生成糖苷键， 而木质素分子是由多羟基取代的苯丙烷单元通过醚键和c c 键连接而成的网状大 分子，含有的官能团包括：芳香烃、酚羟基、羰基和醚键。这就决定了木质素的 化学性质活泼，易于发生芳香环上的各种取代反应，同时在支链上发生反应。发 生在芳香环上的化学反应主要有卤化、硝化、酰基化、烃化等。 木质素难以被水解为单糖，并且在纤维素周围形成保护层，影响纤维素水解。 木质素中氧含量低，能量密度比纤维素高，水解后留下的木质素残渣常被用作燃 料【12 1 。 1 3 纤维素酶的组成、结构与功能 1 3 1 纤维素酶的组成 纤维素酶结构的复杂性，决定了任何一种单一的酶都难以高效地水解它，能 水解天然纤维素的纤维素酶是一个复杂的多酶体系。按底物特异性可将纤维素酶 分成以下组分【1 3 - 1 4 】： 1 ) 外切p 一1 ，4 葡聚糖酶( “d - p - 1 ，4 - g l u c a n a s e ) ，此酶主要为d - l ，4 - 葡聚糖纤 维二糖酶( p 一1 ，4 一g l u c a n a s ec e l l l o b i l h y d r o l a s e ，c b h ) ( e c3 2 1 9 1 ) ，相当于r e e s e 假 说中的c l 酶，它是从纤维素的非还原糖端水解p 1 ，4 葡聚糖苷键，产生纤维二糖。 另一类外切酶( p l ，4 - g l u c a ng l u c o h y d r o l a s e ，e x g ) ( e c3 2 1 7 4 ) 单独作用于天然纤 维素时，几乎检测不出还原糖的生成，对取代基纤维素如c m c 也只是微弱作用， 但与内切葡聚糖酶协同作用则可有效地分解天然纤维素。c b h 可降解纤维寡糖， 但其降解能力随寡糖链的缩短而下降专一性强。 2 ) 内切p - l ，4 - 葡聚糖酶( p ，z 如一p 1 ，4 g l u c a n a s e ，e g )( e c3 2 1 4 ) ，它是随机 内切纤维素分子内的d 1 ，4 葡聚糖苷键，产生纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖，由于 它并不是单一组分，而是包括多个组分，组分数又随菌株而异，又称c x 。又因大 6 表面活性剂对稻草酶解影响的研究 都用羧甲基纤维素( c m c ) 为底物测定其活力，故称c m c 酶。e g 可水解c m c 、 膨胀纤维素以及纤维降解中间产物一纤维糊精，对纤维素的降解能力随还原性末 端及键长度增加而下降。e g 专一性不强，对水溶性纤维素都有作用，取代基对酶 活性影响不大。e g 占酶制剂的蛋白质含量为2 0 3 0 。 3 ) p - 1 ，4 - 葡萄糖苷酶( p l ，4 - g l u c o s i d a s e ，b g )( e c3 2 1 2 1 ) 它可水解纤维二糖、纤维寡糖及其他b 葡萄糖苷，产生葡萄糖，故又称纤维 二糖酶( c e l l o b i a s e ，c b ) 。但由于该酶对其底物特异性并不是很高，特别是很多非 纤维素微生物也能产生大量这类组分的个数随菌种的不同而异。b g 在酶制剂中， 酶蛋白含量最少，只占1 左右。特别是木酶胞外b g 含量更低。随着基因工程技 术的发展，目前发现b g 还具有另一种作用，即转糖作用，使葡萄糖在水解过程后 保持d 构象。 4 ) 其他组分 除上述三大组分外，可能参与纤维素降解过程的酶还有纤维二糖脱氢酶、纤 维二糖醌氧化还原酶、磷酸化酶、纤维素酶小体。 1 3 2 纤维素酶的分子结构与功能 纤维素酶含有两个功能结构区域，较大的核心为催化结构域( c a t a 虮i c d o m a i n ，c d ) ，较小的为纤维素结合结构域( c e l l u l o s e - b i n d i n gd o m a i l l c b d ) ，这 两部分通过连接而连接在一起，成为蝌蚪状结构【8 】。 从化学反应来讲，对纤维素的酶解只涉及b 1 ，4 糖苷键的水解作用和氢键的断 裂，是一个简单的反应过程。但是作为植物细胞壁结构材料的纤维素是由纤维二 糖单元组成的螺旋形状的糖链，通过氢键相互作用定向平行排列而成的惰性高分 子化合物，它需在纤维素酶系的协同作用下才能完全降解为葡萄糖。与主要含玟1 ，4 糖苷键由麦芽糖单元组成的空间螺旋糖链聚集而成的溶粉相比，纤维素酶解效率 低至溶粉酶解效率的l l o o ，因此，如何提高其酶解效率成为纤维素利用的关键。 自t o m m e 在1 9 8 5 年用木瓜蛋白酶有限水解证明了c b h 具有催化和吸附纤维素 两个不同功能的结构域( c d 和c b d ) 以来，人们又通过基因克隆及d na j i 顷序分析 方法发现纤维素酶分子中普遍存在着两种结构域，一般是由较大球状的c d 通过一 个富含羟基氨基酸( s e r t 1 1 r p r o ) 的o 糖基化的连接区和较小的c b d 三部分组成。 ( 1 ) 连接区 木瓜蛋白酶的有限酶切c b h ，使c b h 酶分子断开成为两部分，即c d 和c b d 。 连接区的作用可能是保持c d 和c b d 之间的距离。对连接区内蛋白酶作用的研究发 现，蛋白酶的水解可能使纤维素酶失去c b d ，从而失去对结晶纤维素的水解，但 仍可水解可溶性纤维素。 7 硕士学位论文 ( 2 ) 纤维素结合结构域( c b d ) c b d 执行着调节纤维素酶对可溶性纤维素和不溶性纤维素专一性活力的作 用，具有分离纤维素的作用。 ( 3 ) 催化结构域( c d ) g l i k e s 等根据c d 的保守序列和疏水族分析，有的外切酶和内切酶是属同一族 的，就是说外切酶和内切酶的区分量来自三维结构中细微结构的差别而不是由整 体构象决定的。 ( 4 ) 纤维素酶活性中心 纤维素酶同溶菌酶、淀粉酶、糖化酶、木聚糖酶一样都是糖蛋白，属于糖苷 酶。2 0 世纪6 0 年代，b a l l l 【s 等证明糖苷酶的作用机制可能都遵循与溶菌酶相似的机 制，许多糖苷酶中t r p 位于底物结合部位，羟基氨基酸位于催化位点。 酶学特性设计酶的温度曲线、p h 曲线、温度稳定性、p h 稳定性、酶对不同 底物的作用等方面。在纤维素生物转化过程中，除纤维素酶的一般作用条件外， 还要考虑到具体使用条件对纤维素酶酶学特性的影响。此外，不同的纤维素生物 的生物转化，对纤维素酶组成的要求不一样。一般来说，纤维素内切酶、纤维素 外切酶、伊葡萄糖苷酶必须协同作用才能更有效将纤维素降解为葡萄糖，而单一 来源的纤维素酶其组成很难达到要求，需要将不同来源的纤维素酶配合使用以提 高纤维素酶的酶解效率。 1 4 纤维素酶解 1 4 1 酶解简介 酶解起步较晚，到2 0 世纪6 0 年代才开始了对木质纤维素生物降解的研究。该 法在较低的温度下加入纤维素酶，对纤维素进行专一的水解。酶解的成本低于酸 解和碱解，因为酶解是在温和的条件下( p h 4 8 ，温度4 5 5 0 0 c ) 进行的，能耗低， 且不会造成腐蚀【l5 1 。并且由于酶有很高的选择性，可生成单一产物，故糖产率很 高( 9 5 ) ，但纤维素降解酶的生产效率往往很低，纤维素酶生产成本高，且酶 解原料须经预处理，从而在一定程度上限制了这一技术的推广和应用。 纤维素的酶解具有反应条件温和、不生成有毒降解产物、糖化率高、设备投 资低等优点，但纤维素酶的酶解效率往往很低，与淀粉酶相比相差了2 个数量级 以上，并且生产成本很高，约占了纤维素糖化工艺的4 0 以上，从而严重阻碍了 这一技术的广泛应用。因此，需要加强对高产菌种的筛选和培育的研究。 8 表面活性剂对稻草酶解影响的研究 1 4 2 纤维素酶解机制 1 4 2 1 酶催化机制 不溶于水的纤维素和溶于水的纤维素酶决定了纤维素酶催化反应是一个异相 反应。纤维素类物质的结构特点和酶反应的模式影响着反应速度。由于自然界中 的纤维素具有对酶有高度抵制的结晶区结构，以及有限的酶活性结合位点数决定 了这个反应速度是比较慢的【1 6 2 2 j 。 纤维素是否易于酶解，在很大程度上取决于酶与结合位点接触的难易性，因 为这将决定酶吸附到固体底物的难易性。 关于纤维素转化成葡萄糖的机制，最初的概念由r c e s e 等提出，也就是( c 1 c x ) 学说，它基本的水解模式是： c l c x b 葡萄糖苷酶 结晶纤维素无定形纤维素纤维二糖啼葡萄糖 该学说认为，当纤维素酶作用时，c l 酶首先作用于结晶纤维素使其变成无定 形纤维素，再被c x 酶进一步水解成可溶性产物，即c l 酶的作用是c x 酶水解的先 决条件。后来w o o d 等分离鉴定c i 酶改变了c l 酶的非水解作用概念，认为c l 酶是一 种水解酶，它不易作用于羟甲基纤维素，却能作用于结晶纤维素、磷酸润涨甲基 纤维素等，主要产物是纤维二糖，由此证明c l 酶是一种p 1 ，4 葡聚糖纤维二糖水解 酶。而陈洪章【8 l 研究认为，c l 酶是c m c 酶、c b h 酶、c b 酶自组织的一个复合体， 作用于结晶区。 目前，普遍接受的酶解机制是协同降解模型。纤维素内切酶先内切无定形纤 维素产生新的末端( 还原端或非还原端) ，然后纤维素外切酶从还原端或非还原 端外切纤维素链，产生纤维二糖( 或葡萄糖) 。 不溶性纤维素c x 酶不溶性和可溶性 反馈 c b 酶 葡萄糖 图1 3 协同降解模型 另外一种是外切酶- 夕h 切酶协同作用，如图1 4 所示，纤维素外切酶i ( c b hi ) 外切纤维素链还原端，而纤维素外切酶i i ( c b hi i ) 外切纤维素链非还原端。这 9 硕士学位论文 两种协同作用仅在水解天然纤维素时发生，而在水解羟甲基纤维素( c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e ，c m c ) 和羟乙基纤维素( h y d r o x y le t h y lc e l l u l o s e ，h e c ) 时则不发生。 纤维素内切酶和纤维素外切酶的酶解反应为多项反应，而p 葡萄糖苷酶水解纤维 二糖的反应则属于均相反应。纤维素内切酶作用于c m c 时有很高的酶活性，但作 用于微晶纤维素( m c c ) 时的酶活性却很低；而纤维素外切酶对m c c 有较高的酶 活性，但对c m c 酶活性很低。 纤维素酶分子通常由催化结构域( c a l a y t i cd o m a 饥c d ) 、纤维结合结构域 ( c e l l u l o s eb i n d i n gd o 埘吼i n ，c b d ) 及连接它们的连接区( 1 i i l k e r ) 组成。纤维素酶分子 的c b d 通过芳香族氨基酸上的芳香环和葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，再由 c b d 上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链形成氢键将单个葡萄糖链从纤维素表 面疏解下来，以利于催化区的水解作用。而催化域中的g l u 位于细菌、真菌的内切 酶、外切酶、葡萄糖糖苷酶的活性位点，在异头碳原子位通过构型的保留或转化 完成催化作用，其中两个保守的羟基酸分别作为质子供体或亲核试剂，经水解双 置换反应脱去葡萄糖残基，通过对纤维素分解菌的分子结构和功能的研究，阐明 其水解机制。 c b hi 、c b 纤维素 i 、c b h i i 纤维糊精纤维二糖 e gi 、b 葡萄糖 图1 4 纤维素酶水解纤维素的可能途径 1 4 2 2 纤维素酶在固体底物表面的吸附和脱吸附 纤维素酶的吸附以及纤维素酶底物复合物的形成是纤维素酶解的关键步骤。 r ”等研究发现，纤维素内切酶和纤维