（动物学专业论文）镉诱导细胞凋亡机理的研究.pdf

许锋 镉诱导细胞凋亡机理的研究 摘要 镉能诱导机体内多种细胞发生凋亡。进行镉诱导细胞凋亡的研究对治疗由锅 引起的各种疾病有重要意义。本文对镉诱导细胞凋亡发生的机制做了如下的研 究： l 镊引起s d 大鼠肾细胞的凋亡及钙稳态的失调 在3 7 、5 c 0 2 条件下，离体s d 大鼠肾细胞分别在含不同浓度氯化镉 和亚硒酸钠加氯化镉的f d 培养液中孵育3 h 后，用吖啶橙溴乙锭双荧光染色法 检测细胞的凋亡率，以f l u o 一3 a m 为探针研究胞内游离钙离子浓度的变化。结 果显示：不同浓度的镉离子能不同程度地诱导s d 大鼠肾细胞的凋亡，同时还 能引起不同程度的细胞内游离钙离子浓度增加，并呈现剂量效应正相关。低浓度 的亚硒酸钠有一定的降低镯离子诱导细胞凋亡的作用。提示：镉能引起离体s d 大鼠肾细胞的凋亡并引起胞内钙稳态的失调。 2 镉诱导h e k 2 9 3 细胞胞内钙稳态的失调引发细胞凋亡 通过吖啶橙溴乙锭双荧光染色法检测细胞凋亡，并通过m t t 法检测细胞生 长抑制；以f 1 u o 一3 a m 和f u r a - 2 a m 为探针检测胞浆内游离钙离子浓度 ( c a 2 + 。) 的变化：使用钙调磷酸酶试剂盒测定镉对钙调磷酸酶活性的影响。结 果显示：镊诱导h e k 2 9 3 细胞的凋亡和生长抑制呈浓度依赖性；锅通过引发胞内 钙库的释放后引起胞外钙离子的内流；钙信号的阻断剂能显著的抑制镉引起的细 胞凋亡；镉使胞内钙调磷酸酶的活性显著增加。提示：镉诱导胞内钙稳态的失调 可能在镉引发细胞凋亡过程中起重要作用。 3 镉诱导h e k 2 9 3 细胞线粒体细胞色素c 释放引起细胞凋亡 分别以罗丹明1 2 3 和d c f h d a 为探针检测细胞的线粒体膜电位水平和胞 内活性氧中间体水平：用免疫印迹技术检测细胞线粒体中细胞色素c 释放到胞质 的情况。结果显示：镉处理能诱导h e k 2 9 3 细胞线粒体膜电位水平下降；活性氧 中间体水平升高；并伴随细胞色素c 的释放。提示：镉可能通过某些途径引起 线粒体膜电位的下降，下降的膜电位伴随着线粒体膜通透性的变化，并将原本存 于线粒体中的r o s 和细胞色素c 释放到胞质中，从而触发了细胞凋亡。 关键词h e k 2 9 3 细胞，凋亡，钙稳态，细胞色素c 许锋 镉诱导细胞凋亡机理的研究 1 1 a b s t r a c t c a d m i u mc a ni n d u c ea p o p t o s i si nm a n yk i n d so f c e l l s s m d y i n gt h ea p o p t o s i s i n d u c e db yc a d m i u mi sn e c e s s a r yf o ru st oc u r el o t so fd i s e a s e sc a u s e db yc a d m i u m t h i sp a p e rs t u d i e ds o m e a s p e c t so f t h em e c h a n i s mo f a p o p t o s i si n d u c e db yc a d m i u m ： l d i s e q u i l i b r i u mo f c a l c i u mh o m e o s t a s i sa n d a p o p t o s i si n d u c e db yc a d m i u m i n s dr a t k i d n e yc e l l s u n d e rt h ec o n d i t i o no f3 7 a n d 5 c 0 2 s d r a tk i d n e yc e l l sw a si n c u b a t e di n f dm e d i u mw i t l ld i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fc a d m i u ma n ds o d i u ms e l e n i t e p l u s c a d m i u m ，t h e nt h ea p o p t o s i sw a sd e t e c t e db yu s i n ga c r i d i n eo r a n g e e t h i d i u mb r o m i d e d o u b l ef l u o r e s c e n t d y es t a i n i n g , a n dt h e f r e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o ni nc e l l sw a s d e t e c t e db y u s i n gf l u o r e s c e n ti n d i c a t o rf l u o 一3a st h ep r o b e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t t h ed i f f e r e n t d e g r e ea p o p t o s i s i ns dr a t k i d n e y c e l l sw a si n d u c e d b yd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fc a l c i u m t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ee l e v a t i o nt h ed o s e so fc a d m i u m c a u s ea l li n c r e a s ei nr a t eo fa p o p t o t i ca n di nc o n c e n t r a t i o no ft h ec a l c i u mi o n si n c y t o p l a s mi n ad o s e d e p e n d e n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o n t h er e s u l t sa l s os h o w e dt h a t s o d i u ms e l e n i t ei nl o wc o n c e n t r a t i o nc a nd e c r e a s et h er a t eo fa p o p t o s i si ns dr a t k i d n e yc e l l si n d u c e db yc a d m i u m i ti ss u g g e s t e dt h a tc a d m i u mm i g h t c a u s ea p o p t o s i s a n d d i s e q u i l i b r i u mo f c a l c i u mh o m e o s t a s i si ns d r a tk i d n e yc e i l s 2 a p o p t o s i st r i g g e r e db yd i s e q u i l i b r i u mo fi n t r a e e l l u l a rc a l c i u mh o m e o s t a s i s i n d u c e d b yc a d m i u m i nh e k 2 9 3c e l l s b yu t i l i z i n ga c r i d i n eo r a n g e e t h i d i u mb r o m i d e d o u b l ef l u o r e s c e n td y es t a i n i n gt o d e t e c tt h ea p o p t o s i sa n d b yu s i n gm t t t od e t e c tt h eg r o w t hi n h i b i t i o n ；f l u o r e s c e n td y e f l u o - 3 a ma n df u r a - 2 a mw a su s e dt ot e s tt h ec h a n g eo fi n t r a c e l l u l a rf r e ec a l c i u m ； t h ee f f e c to fc a l c i u mo nc a l c i n e u r i nw a sm e a s u r e db yac a l c i n e u r i nt e s tk i t t h er e s u l t s s h o w e dt h a tc a d m i u mc a u s ea p o p t o s i sa n dg r o w t hi n h i b i t i o ni nh e k 2 9 3c e l l si na d o s e d e p e n d e n tm a n n e ra n dt h a tc a d m i u mi n i t i a t ear a p i dr e l e a s eo fc a 2 + f o r mc a t + p o o lf o l l o w e db yt h ei n f l u xo ft h ee x t r a c e l l u l a rc a 2 + t h er e s u l ta l s or e v e a l e dt h a t s o m ei n h i b i t o r so ft h es i g n a lo fc a l c i u mp r e v e n t e dc d - i n d u c e dc e l l sf r o ma p o p t o s i s a n dt h a tt h ea c t i v i t yo fc a l c i n e u r i nw a se n h a n c e d b yc a d m i u m i ti ss u g g e s t e dt h a tt h e d i s e q u i l i b r i u mo f c a l c i u mh o m e o s t a s i si n d u c e db yc a d m i u m p l a y sa ne s s e n t i a lr o l ei n 皇兰l 一 塑重量塑墼塑主壑里竺堑塞 ：坐： t h ep r o c e s so f c a d m i u m i n d u c e d a p o p t o s i s 3 a p o p t o s i sc a u s e db yt h er e l e a s eo fc y t o c h r o m eci n d u c e db yc a d m i u mi n h e k 2 9 3e e l i s t h ev a r i a t i o no fm i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e n t i a la n dr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s p r o d u c t i o nw e r ed e t e c t e db yf l u o r e s c e n ti n d i c a t o rr h o d a m i n e l 2 3a n dd c f h d a ， r e s p e c t i v e l y t h e r e l e a s eo f c y t o c h r o m ecf r o mm i t o c h o n d r i aw a st e s t e db v i m m u n b l o t t e c h n i q u e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tc a d m i u mr e d u c et h e l e v e lo f m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e m i a la n di m p r o v er e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sp r o d u c t i o ni n h e k 2 9 3c e l l s m e a n w h i l e ，c a d m i u mi n d u c e dt h e r e l e a s eo fc y t o c h r o m eci n t o c y t o p l a s m i ti ss u g g e s t e dt h a tc a d m i u mc a l li n d u c et h ed e c r e a s eo fm i 幻c h o n d 一甜 m e m b r a n ep o t e n t i a l ，w h i c hc a u s e dt h e r e l e a s eo fr e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s a n d c y t o c h r o m ec ，t h ep r o c e s st h a tc a u s e sa p o p t o s i si nh e k 2 9 3c e l l s k e y w o r d s ：h e k 2 9 3 t e n , a p o p t o s i s , c a l c i u mh o m e o s t a s i s ，c y t o c h r o m ec v6 4 2 6 8 5 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：j 砗牡 日期： 翟6 鞋聋点目 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅：有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：j 隆 日期：j 幽磷4 镉诱导细胞凋亡机理的研究 前言 镉( c a d m i u m ，c d ) 是一种具有潜在毒性的重金属，因其在工业上应用广泛， 己逐渐成为工业和环境中主要的污染物之一。镉在土壤和植物中有蓄积作用，而 在人体内的半衰期长达7 3 0 年，蓄积可达5 0 年，能对肾、睾丸、肺、肝、 脑、骨等多种人体器官和组织造成损伤。但是镉的毒作用机制尚未得到阐明，目 前大量体内及体外实验表明，镉能诱导许多组织和细胞的凋亡，凋亡对机体的生 长发育和维持体内稳态有很重要的作用，凋亡的失控会诱导多种疾病如癌症和自 身免疫功能的紊乱。这些结果表明：镉的毒性可能与其引起的细胞凋亡有关。进 行镉诱导细胞凋亡的研究对治疗由镉引起的各种疾病有重要意义。 细胞凋亡及其研究概况 细胞凋亡是机体生长发育，细胞分化和病理状态中细胞的自主性死亡过程， 是一种自发性的、由行将死亡的细胞内部特定的基因所操纵的过程，因此又被称 为程控性细胞死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ) 。1 9 7 2 年k e r r 首先意识到了细 胞凋亡在个体发育和组织分化中的作用。此后，随着分子生物学和细胞生物学的 研究不断的深入，人们对细胞凋亡的机理的认识有了极大的突破。当前细胞凋亡 信号转导途径研究认为，细胞凋亡受细胞内源性基因、酶类和信号转导途径调控 的瀑布式激活过程。当前的研究工作基本在三个阶段进行：( 1 ) 各种凋亡刺激信 号启动凋亡( 2 ) 由p 5 3 基因、c a s p a s e s 蛋白酶、f 。相关死亡蛋白及t n f r 一1 相关死亡蛋白等介导的死亡信号转导( 3 ) 由b c l 一2 蛋白家族、细胞色素c 及 c a s p a s e s 蛋白酶三个效应器参与的调控执行阶段，最后导致由内源性核酸酶激 活和细胞骨架重新组合所致的细胞结构的解体。 许锋镉诱导细胞蠲亡机理的研究 2 1 1 引起细胞凋亡的信号 1 。1 1 死亡受体f a s 、t n f r 1 配体 某些细胞表面的特异性受体和配体的相互作用可诱导细胞凋亡，如f a s 及 t n f r - 1 是细胞膜蛋白，具有一次性跨膜结构，c 末端位于细胞外，具有3 个富 含半胱氨酸结构域；在胞内存在一诱导细胞凋亡的特殊结构域，约由8 0 个氨基 酸组成，称为凋亡结构域( d e a t hd o m a i n ，d d ) 。f a s 属于t n f n g f 受体超家族 成员，与其配体f a s l 或f a s 单克隆抗体结合、可诱导细胞的凋亡，因为f a s 可将死亡信号从细胞膜外转移至膜内，故又称死亡受体。t n f r i 也是t n f n g f 受体超家族成员，它也是利用其胞浆内的8 0 个左右的氨基酸区域( d e a t h d o m a i n ，d d ) 与其他的蛋白相互作用，从而介导了细胞凋亡。 j 1 2 细胞因子 有些生存因子( v i a b i l i t yf a c t o r s ) 为细胞的存活所必须，如果从培养基 质中除去这些细胞因子就会诱发细胞凋亡。例如，培养基中去除白介素3 后，鼠 造血细胞株b a f 3 发生凋亡。 1 1 3 脂溶性激素 类固醇激素能直接进入细胞，与核内受体结合，调节有关基因转录，对细胞 凋亡起调控作用。性激素参与性腺细胞及性附属器官的生理性生长和凋亡。现已 知类固醇类激素可以引起淋巴细胞的凋亡，甲状腺激素也可促使蝌蚪细胞的凋 亡，在蝌蚪到青蛙的变态过程中起重要作用。 1 。1 4 病原微生物 如鸡贫血病病毒能引起胸腺组织的破坏，造成免疫抑制和贫血。又如鸡传染 性法氏囊病病毒也可引起胸腺细胞凋亡，此外象人的细小病毒、流感病毒、免疫 缺陷综合症病毒均能诱导细胞凋亡。 镐诱导细胞凋亡机理的研究 - 3 - 1 1 5 多种理化因素 物理因素有紫外线辐射、电离辐射、热体克等；生化因素有代谢产生的活性 氧中间体，他们都能诱导细胞凋亡。神经递质( 谷氨酸、多巴胺等) 也可诱发细 胞凋亡。而一些抗氧化剂如胡萝 素类，生育酚、维生素c 可防止细胞凋亡。 1 1 6 多种金属离子 许多金属离子可以诱导细胞凋亡，如钙、镉、汞、铅、镁、铜、镍，甚至钠、 钾离子都能在一定条件下诱导细胞发生凋亡。而锌离子则比较复杂，随着锌离子 浓度的不同，对细胞的效果也不同。 1 2 凋亡信号的转导 各种因素启动了细胞凋亡的信号后，通过各种蛋白、酶类等将凋亡的信号向 下游传递，从而介导了细胞的凋亡。关于凋亡信号的转导通路十分复杂，目前还 没有研究透彻，下述的是几条核心的通路： 1 2 1f a s ，c d 9 5 信号转导 f a s c d 9 5 是典型的死亡受体。在胞质内有一段约8 0 个氨基酸组成的肽链， 称为“死亡结构域”( d e a t hd o m a i n ，d d ) 。f a s 的配体( f a s l ) 以同源三聚体形 式存在。f a s 和f a s l 结合后形成三聚体，并使胞内的三个死亡结构域相聚，从 而为一种叫f a s 相关死亡蛋白( f a sa s s o c i a t e dd e a t hd o m a i np r o t e i n ，f a d d ) 的蛋白提供了高亲和力位点。f a d d 是一种胞质内蛋白，包含一个n 末端的死亡 效应域( d e a t he f f e c td o m a i n ，d e d ) 和一个c 末端的d d ，f a d d 通过c 末端 的d d 与f a s 和f a s l 形成的三聚体的胞内d d 相连。这个过程可以激活f a d d ， 从而使f a d d 通过自身的d e d 与c a s p a s e s 一8 的d e d 相连接。此结合扰乱了 c a s p a s e s 一8 的d e d 的自我联系，使c a s p a s e s 一8 构象发生变化，从而激活 c a s p a s e s 一8 ，激活的c a s p a s e s 一8 从上述的蛋白质复合物中释放出来，并依次激 活其他的i c e c e d 一3 家族的蛋白，从而使死亡信号进入一个裂解激活阶段。 许锋 镉诱导细胞凋亡机理的研究 1 2 2t n f r 1 信号转导 t n f r l 信号转导的途径与f a s 信号转导途径相似。t n f r 一1 也含有约8 0 个氨基酸的胞内d d ，三聚体的t n f 和t n f r l 作用，使t n f r l 构象改变从而 诱发t n f r 一1 发生低聚。低聚的t n f r 一1 引起胞内d d 发生聚合。这一过程为t n f r 相关死亡蛋白( t n f ra s s o c i a t e dd e a t hd o m a i np r o t e i n ，t r a d d ) c 端的叻提 供了高亲和力的位点，使低聚的t n f r 一1 与t r a d d 结合。t r a d d 不能直接耦联 c a s p a s e s 家族蛋白，它犹如一个平台，一方面通过d d 相互作用与f a d d 结合， 从而激活c a s p a s e s 家族蛋白介导细胞凋亡；另一方面还可以通过卜1 6 9 位氨 基酸与t r a f 2 ( t n f ra s s o c i a t e df a c t o r ，t n f r 相关因子) 相连。t r a f 2 信号 的激活导致核转录因子一kb ( n u c l e a rf a c t o r kb ，n f kb ) 激活，并进入核 内，活化编码存活因子的基因，从而抑制细胞的凋亡。这就解释了下面的实验现 象：在许多细胞系中f a s 不活化n f - kb ，但却比能活化n f - kb 的t n f r 一1 更 有效的介导凋亡。 1 。2 3 t r a i l 介导的凋亡信号通路 1 9 9 5 年w i l e y 小组克隆获得了肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体( t n f r e l a t e da p o p t o s i si n d u c i n gl i g a n d ，t r a i l ) ，t r a i l 是i i 型跨膜糖蛋白，在t n f 家族中它与f a s l 的同源性最高( 2 3 2 ) 。目前发现了五个能和t r a i l 结合的受 体：d r 4 、d r 5 、d c r l 、d c r 2 、o p g 。其中d r 4 和d r 5 被认为是转导t r a i l 凋亡 信号的受体，d c r l 、d c r 2 和o p g 自身聚合形成三聚体复合物，与t r a i l 结合 后阻止死亡信号的转导。t r a i l 诱导的凋亡与t n f 相似，它与相应的受体结合 后可以激活n f kb 、j n k 通路和c a s p a s e s 级联。但目前对t r a i l 受体诱导的 凋亡机制仍有许多争议。许多研究表明，d r 4 并不能结合f a d d 、t r a d d 等接头 分子，但c a s p a s e s 的抑制剂c r m a 、z - v a d f m k 和a c - d e v d c h o 均能有效的阻 止t r a i l 诱导的细胞凋亡，因此其诱导的凋亡机制涉及了c a s p a s e s 的激活。 与t n f r 一1 和f a s 不同，t r a i l 通常只能引起肿瘤细胞及转化细胞的凋亡， 而对正常细胞不敏感。其机制目前还不清楚。 上述的三种凋亡信号的转导途径都是通过存在于膜表面的死亡受体传导特 许锋镉诱导细胞凋亡机理的研究 5 一 定的死亡配体介导的凋亡信号，因此又统称为死亡受体的信号转导。 1 2 4m a p k 激酶与细胞凋亡 丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，m a p k s ) 是真 核细胞介导细胞反应的重要细胞信号系统。目前在哺乳动物已鉴定了4 个m a p k 亚族：细胞外信号调节激酶( e x t r a e e l l u l a r s i g n a lr e g u l a t e dk i n a s e ，e r k ) 、 c j u n 氨基末端激酶( c - j u nn - t e r m i n a lk i n a s e ，j n k ) 应激激活蛋白激酶 ( s t r e s s a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ，s a p k ) 、e r k 5 大丝裂原活化蛋白激酶l ( b i g m a pk i n a s el ，b m k i ) 和p 3 8 m a p k 。最近研究表明多种刺激通过激活m a p k s 参与细胞凋亡过程的调控。 多种刺激如生长因子、理化因素和癌基因产物r a s 可以使细胞内m a p k k k 的水平升高。m a p k k k 的上游是r h o 相关的小g 蛋白和含有s h 2 和s h 3 结构 的一些接头分子如s h c 、v a v 、g r b 2 等，它们通过s h 2 和s h 3 结构直接联系r p t k 和m a p k 途径。m a p k k k 的激活可以将它下游的m a p k k 磷酸化激活，进而使m a p k 磷酸化而激活，m a p k 将转录因子( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s ，t f s ) 如c m y c ， c j u n ，c f o s 等磷酸化，结合了这些转录因子的反应元件有力的促进转录活动， 启动一些引起细胞增殖或凋亡的基因的表达，从而对细胞产生调控作用。姒p k 信号途径激活宿启动细胞凋亡的详细机制，尤其是转录水平对相关基因的调控仍 未能够完全阐明。 1 2 5g 蛋白信号途径与细胞凋亡 g 蛋白( g t pb i n d i n gp r o t e i n ，g b p ) 即鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，其信号转 导的途径是由g b p 、g 蛋白耦联受体( g p c r ) 和腺苷酸环化酶( a c ) 三部分组成。 当各种信号与相应的受体结合后，通过膜内g 蛋白的转导作用，改变膜内侧的 靶酶a c 的活性，从而调节胞内第二信使c a m p 和c a ”的浓度，并以此来调节细 胞的生存状态。多项体外实验表明，c a m p 可以有效的诱导细胞的凋亡，它是由 c a m p 依赖性的蛋白激酶a 介导的，并需要c a 2 + 的存在。同时，c a 2 + 本身还是一 种诱导凋亡的信号，c a 2 + 的内流被认为是诱发凋亡所必须的，c a ”浓度的的升高 可以激活c a 2 + 依赖性的核酸内切酶、蛋白激酶c 、谷氨酰胺转移酶等，从而介导 许锋镉诱导细胞凋亡机理的研究6 一 细胞凋亡。 1 3 细胞凋亡的调控执行 1 3 1 c a s p a s e s 蛋白酶与凋亡的效应阶段 人们用美丽线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 作为动物模型研究细胞凋亡时 发现了三个与凋亡相关的基因c e d 一3 、c e d 一4 、c e d 一9 ，其中c e d 一3 和c e d 一4 可 促进细胞凋亡发生，c e d 一9 则阻止细胞捌亡发生。如今已发现这个蛋白家族的1 4 个成员，按所发现顺序，命名为c a s p a s e s 蛋白酶( c a s p a s e l 1 4 ) 。 c a s p a s e s 家族蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族，也称i c e c e d 一3 蛋白酶， 它可特异性的在特定的氨基酸序列中将肽链从天冬氨酸之后切断。根据 c a s p a s e s 在机体中的作用可分为凋亡启动亚类、凋亡效应亚类和i c e 亚类。 i c e 亚类中最主要的是c a s p a s e 一1 。c a s p a s e 一1 主要参与白细胞介素一1b ( i n t e r l e u k i n lb ，i l 1b ) 的成熟，其参与凋亡的作用可能是次要的。 习亡启动亚类以c a s p a s e - 8 为代表，它们大多具有特殊的结构域如d e d 、 c a r d 等，这些蛋白酶通过这些特殊的结构域接受凋亡信号，并向下启动凋亡效 应亚类的c a s p a s e s 蛋白酶。 凋亡效应亚类以c a s p a s e - 3 为代表。c a s p a s e 一3 又称c p p 3 2 ( c y s t e i n e p r o t e a s ep r o t e i n ) ，是凋亡过程中最主要的终末执行酶，它的底物包括：d n a 断 片因子( d n af r a g m e n t a t i o nf a c t o r ，d e f ) 、p a r p ( p o i ya d p r i b o s ep o l y m e r a s e ) 、 d n a 依赖性蛋白激酶催化亚基d n a - p k c s 等细胞中的功能蛋白质。这些蛋白参 与d n a 修复、m r n a 裂解、固醇生物合成、细胞结构蛋白的剪切和细胞骨架的重 建。 1 。3 2 线粒体与凋亡信号的调控 凋亡因素还可以多种方式通过线粒体引起细胞死亡。例如，y 射线、神经酰 胺等多种因素可影响线粒体内的电子传递链及能量代谢，从而导致细胞凋亡；也 可以释放细胞色素c 至胞质中。细胞色素c 在有a t p 存在的条件下可与凋亡 蛋白激活因子( a p o p t o s i sp r o t e i na c t i v a t i n gf a c t o rl ，a p a f - 1 ) 、c a s p a s e 一9 镉诱导细胞凋亡机理的研究 一7 一 形成凋亡体，凋亡体通过c a r d 的结合可以激活c a s p a s e - 9 ，并作用于下游的分 子，导致凋亡。有研究表明，腺苷酸激酶2 和细胞色素c 的共释放是细胞凋亡 的普遍现象。另外，线粒体还可以释放活性氧，对组织和细胞产生不可逆的损伤。 但由于氧自由基产生较晚，可能不是凋亡的诱导因素，而是其效应途径。 1 3 3 b c l 2 蛋白家族与凋亡信号的调控 b c l - 2 蛋白家族是与美丽线虫的抗凋亡基因c e d - 9 同源的蛋白质，它们在 结构上的同源性表现在有四个同源区：b h l 、b h 2 、b h 3 和b h 4 。分子间b h l 、b h 2 和b h 3 结构域的相互作用可以使b c l - 2 家族成员间形成多聚体。这种多聚体直 接影响了b c l 一2 家族蛋白对凋亡的调控。多数的b c l - 2 家族成员在c 末端具 有疏水序列，可以与细胞内的质膜结合，多定位于线粒体外膜、核膜、内质网膜 的胞质面。b c l 一2 家族目前已经发现1 5 个成员，分为b c l 一2 亚家族、b a x 亚 家族和b h 3 亚家族。 b c l - 2 亚家族可以抑制线粒体释放细胞色素c ，从而影响a p a f l 与 c a s p a s e 一9 前体的结合及c a s p a s e 一9 的活化，抑制细胞凋亡。 b h 3 亚家族的成员可以通过与b c l - 2 亚家族的同源区，竞争结合b c l 一2 ， 从而使a p a f 一1 与c a s p a s e - 9 前体结合，启动凋亡。 b a x 亚家族可以在线粒体膜上形成多聚体影响线粒体的完整性，从而促进细 胞凋亡。但是现在有最新研究表明：b a x 的多聚体在线粒体外膜形成通透性孔道， 造成外膜的通透性增加，但是这不足以引起线粒体的损坏，其促进凋亡的机制有 待进一步的研究。而b c l 一2 亚家族成员也可以通过b h l 和b h 2 的结构同源区 和b a x 亚家族成员形成多聚体，从而拮抗b a x 的促凋亡作用。 1 4 细胞的抗凋亡信号转导 在一个多细胞生物体正常发育的基本过程中，机体细胞不仅存在凋亡的过 程，还存在着抗凋亡的过程。两者协调作用保持机体的平衡。了解细胞的抗凋亡 的原理有利于我们更好的把握细胞凋亡的机制。 细胞抗凋亡作用的信号转导是在外界与内在生存因子刺激下，激活n f xb 信号耦联途径，诱导抗凋亡的生存基因表达。磷酸肌醇一3 激酶( p i ，k ) 和蛋白激 许锋镉诱导细胞凋亡机理的研究 8 一 酶b ( p k b a k t ) 在细胞抗凋亡信号传递起重要作用。 在多数细胞中，n f kb 与其抑制蛋白i kb ( i n h i b i t o r kb ) 家族的成员 结合，以复合物的形式存在与胞质中。在细胞受到各种刺激，n f kb 和i kb 解 离，并进入细胞核中，诱导不同的靶基因转录。n f xb 信号转导通路既可以诱 导促炎症基因，促进细胞凋亡，又能诱导生存基因的表达，起抗凋亡作用。 n f - kb 活化主要有两条途径：一是通过t n f r 相关因子一2 ( t n f r a s s o c i a t e d f a c t o r 一2 ，t r a f 一2 ) 激活n f kb 诱导激酶( n f kb i n d u c i n g k i n a s e n i k ) ，由n i k 活化n f kb 和i kb 的复合物，引起i kb 降解，释放有活性 的n f - kb ：二是生存因子激活受体酪氨酸激酶，进而活化m a p k 途径，其中m e k 通过受体相互作用蛋白( r e c e p t o r i n t e r a c t i n gp r o t e i n ，r i p ) 参与活化n i k ， 最后促进n f - kb 的活化。有研究表明n f - kb 可以能诱导i l 一6 的基因表达， 也可以激活b c l - 2 家族蛋白，还可以诱导t r a f 来抑制凋亡。 在抗凋亡的信号转导途径中，p 1 3 k 可以传导细胞生长和抗凋亡的信号。p 1 3 k 可被上游活化的r a s 分子( 一类小g 蛋白) 或其他信号分子激活，激活的p i 。k 可以磷酸化一些底物，产生相应的产物如：磷脂酰肌醇一3 一磷酸( p t d i n s 一3 一p ) 、 磷脂酰肌醇一3 ，4 - - - 磷酸( p t d l n s 一3 ，4 一p 2 ，p i p 。) 以及磷脂酰肌醇一3 ，4 ，5 三磷酸( p t d l n s - 3 ，4 ，5 - p 3 ，p i p 。) 。这些产物的增加可以进一步激活p k b 、p k c 等蛋白丝氨酸苏氨酸激酶，传导抗凋亡信号。 另外，在许多生长因子刺激细胞生长和生存的反应中均有蛋白激酶b 的高 表达和活化。蛋白激酶b 可以催化c a s p a s e s 一3 和c a s p a s e s 一9 磷酸化而失活， 通过抑制c a s p a s e s 家族蛋白来抑制凋亡，也可以活化b c l 一2 家族成员b a d ， 使其不能与b c l - 2 结合，通过b c l - 2 的抗凋亡作用来抑制凋亡，还可以通过阻 止线粒体释放细胞色素c 和凋亡诱导因子( a p o p t o s i s i n d u c i n gf a c t o r ，a i f ) 抑制凋亡等等。 1 5 信号转导中各种信号分子形成彼此联系的信号网络 在机体的生命活动中。细胞凋亡和抗凋亡是一种统一的动态平衡关系。其问 的各种信号转导途径和信号分子之间形成“跷跷板”( s e e s a w ) ，调控着细胞的生 存和死亡。或者说上述的凋亡信号转导途径和抗凋亡信号转导途径并不是绝对独 镉诱导细胞凋亡机理的研究- 9 立的，而是联系的构成信号网络，其间涉及许多信号分子，最终细胞是凋亡还是 生存取决于各种信号分子的协同作用。比如t n f r 作为死亡受体可以介导细胞凋 亡，同时它还可以通过r i p 连接t r a f ，而t r a f 活化n f kb ，起抗凋亡作用。 同样，即使是上述凋亡或抗凋亡的几种信号转导途径之间也不是孤立的，他 们之间也是相互联系构成网络，其中一条途径的激活，可以将其相关的信号分子 激活，并以此激活其他的信号通路。例如，r i p 不但可以与f a s 结合，还可以 通过t r a d d 间接与t n f r l 结合，并通过r i p 相关死亡蛋白( r i pa s s o c i a t e d d e a t hd o m a i np r o t e i n ，r i a d d ) 与c a s p a s e - 2 相连诱导凋亡。同时，过表达 的r i p 还可以激活n f - kb 和, i n k 。又例如有研究表明，在m a p k 途径中，激活 的j n k 可以激活f a s l 的表达。这里可以进一步得出这样的结论，凋亡的信号 转导途径之间彼此联系，构成一个复杂的网络。而其中关键的信号元件如何在分 子水平相互作用有待于进一步的研究。 2 镉诱导细胞凋亡的研究进展 2 1 国内对镉引起细胞凋亡的研究进展 国内对镉引起细胞凋亡的研究尚处于起步阶段，研究的方向主要在于通过不 同的方法检测不同浓度的镉诱导离体或者在体各种细胞的凋亡和损伤。对镉诱导 细胞凋亡过程中涉及到的蛋白酶只有很少量的研究。 李积胜等通过腹腔注射电镜观察的方法研究了镉对大鼠睾丸生精细胞凋亡 的影响：刘杰等对小鼠注射不同浓度的镉，然后检测其尿、血中的各种指标并取 肾细胞做组织分析，比较了慢性和急性镉染所致的小鼠肾细胞的损伤；蔡颖等用 镉对人外周淋巴细胞进行染渡，并用单细胞凝胶电泳法测定了镉诱导的d n a 损 伤 董书芸等通过台盼蓝染色、t u n e l 流式细胞仪检测、d n a 含量细胞周期分 析、d n a 凝胶电泳等多种方法检测了镉诱导小鼠胸腺细胞的凋亡；姜谠等发现用 镉染离体肾小管上皮细胞损伤中出现了钙超载和氧自由基的启动；对镉引起细胞 凋亡的机理做了较深层次的研究。赵敏等用镉染豚鼠肾上腺皮质细胞并用免疫沉 淀一蛋白印记一化学发光的方法研究了细胞凋亡过程中s a p k 活性的变化，把镉引 起细胞凋亡的研究开拓到了分子的层次。 许锋 镉诱导细胞凋亡机理的研究 - 1 0 - 总体来看，国内的这方面研究仍停留在表面，主要还停留在用不同方面对镉 诱导细胞凋亡有现象进行析，涉及镉引起细胞凋亡的机理研究还太少太少，几乎 还未能涉及到分子层次的研究。因此目前国内这方面的研究尚停留在初级水平， 不足以阐明镉诱导细胞凋亡的机理。 2 2国外对镉引起细胞凋亡的研究进展 2 2 1国外对镉引起在体细胞的凋亡的研究进展 国外对镉引起的在体细胞的凋亡的研究主要集中在对肝、肾、睾丸、以及前 列腺组织中。 h a b e e b u 等给成年雄性小鼠注射氯化镉( 3 0p m o l l ) 分别在1 5 、3 、6 、9 、 1 4 、2 4 、4 8h 取肝脏进行观察，1 5h 可见肝细胞肿胀，3h 观察到凋亡的出 现，9 - 1 4 h 凋亡出现高峰，呈现出显著的时间一效应关系，此后坏死细胞增多， 凋亡细胞数量开始下降。同时，他还注射了不同浓度的氯化镉( 5 、1 0 、2 0 、3 0 、 4 0 、6 0p m o l 1 ) ，9h 后取肝脏进行研究，结果显示镉浓度为2 0 “m o l l 时凋 亡细胞开始增加，并呈现剂量一效应关系。 x u 等对大鼠注射2 5 、5 、i 0p m o l k g 氯化镉，在4 8 、7 2h 后取睾丸和前 列腺组织研究发现5 、1 0p m o l k g 两剂量组，睾丸组织中出现凋亡细胞。7 2h i 0 m o l k g 的两组织，d n a 片段数量增加显著。 h a m a d a 等给b e a g l e 狗长期注射镐，发现肾小管上皮细胞可出现凋亡。同 样，t a n i m o t o 等给大鼠皮下注射氯化镉，也可见近曲小管上皮细胞出现凋亡现 象，并且凋亡细胞中含有大量的的镉。 国外还有大量的研究工作证明了镉能诱导许多组织的细胞凋亡，其损伤能力 在睾丸组织和肾脏组织中尤其显著。 2 2 2 国外对镉引起离体培养细胞的凋亡及其机理的研究进展 国外在这方面的研究随着近年来分子生物学和细胞生物学的发展而不断深 入，并开始了镉引起细胞凋亡的机理的研究，尤其对镉诱导细胞凋亡过程中的信 号转导以及在此过程中涉及到的多种蛋白酶进行了广泛的研究，目前研究的比较 许锋镉诱导细胞凋亡机理的研究 多的蛋白酶有：c a s p a s e s 家族、b c l 一2 家族、眦p k 蛋白激酶家族、钙离子依赖 性的蛋白酶等。还有许多研究表明镉引起细胞凋亡过程中出现了胞内钙离子浓度 的升高、线粒体膜电位的下降、活性氧中间体的产生等多种生物学现象。 l im i n 等对u 9 3 7 细胞进行不同浓度的镉处理，发现镉引起细胞凋亡呈现 时间一效应关系和剂量一效应关系，在凋亡的过程中伴随有胞内钙离子浓度的升高 和由此引起的钙依赖性蛋白酶c a l p a i n 的激活以及线粒体膜电位的下降、 c a s p a s