（分析化学专业论文）β环糊精整体柱的制备及其在色谱分析中的应用.pdf

b - 环糊精整体柱的制备及其在色谱分析中的应用 姓名：左娜娜 专业：分析化学 指导老师：马志玲副教授 摘要 整体杜是由单体、引发剂、致7 l 剂等混合物在柱管内通过原位聚合或固定化构成的连续 整体多孔结构。整体柱制备方法简单而且直接，通过对整体柱材料表面的衍生化以及控制聚 合条件可以得到理想孔径分布，因而这种制各柱子的方法具有良好的应用前景。与目前商品 化的色谱柱相比，整体柱具有制各方法简单、通透性好柱前压低、活性位点利用率高，峰 容量高等优点，是近几年来发展的一种极具应用潜力的新型色谱柱。因此，开展整体柱制各、 表征方法及应用的研究具有十分重要的理论意义和应用价值。 第一章 本章回顾了色谱整体柱的发展历史，着重介绍了整体柱的类型、其制备方法和性能评价， 慨述了整体柱的特点，在此基础上综述了整体柱在液相色谱分析中的应用片阐述了本课题 的研究背景和立题意义。 第二章 通过原位聚合制备以甲基丙烯酸缩水甘油酯( g i ”i d y im e t h a c r y l a t e g m a ) 为单体、二甲 基丙烯酸乙烯酯( e t h y l e n e d i m e t h a c r y l a t e e d m aj 为交联剂，环己醇( c y c l o h e x a n o ，c y o h ) 和正十二醇( d o d e c a n o l ，d o o h ) 的混合液为致孔剂，偶氮二异丁腈( a z o b i s i s o b u t r y o n i t d l e 。a i b n ) 为引发剂的色谱整体柱，通过扫描电子显微镜( s e m ) 、氮吸附，红外和压缩强度等测试，考 察了单体、交联剂、致孑l 剂等用量以及聚合温度等聚合条件对整体柱基质结构的影响，并成 功制各了具有良好渗透性和机械强度的基质，基质表面的活性环氧基团与d 环糊精 ( 1 3 一c y c l o d e x t r i n ，i b - c d ) 进行亲核反应，可以达到b 环糊精修饰整体柱的目的。本文在讨论了 环糊精浓度、键合时间、键合介质等反应条件对整体柱基质表面键合b 环糊精的影响基础上， 成功制备了岱环糊精修饰的h p l c 整体柱。并将其应用于缬沙坦对映体的分离，初步探讨了 b 环糊精整体柱的分离机理。 关键词：6 环颧精，整体柱，液相色谱，对映体分离 p r e p a r a t i o no f1 3 一c y c l o d e x t r i nm o n o l i t h i cf o rt h ea p p l i c a t i o ni n c h r o m a t o g r a p h y n a m e ：z u on a n a m a j o r ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o m az h i l i n g a b s t r a c t am o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s ei sac o n t i n u o u su n i t a r yp o r o u ss t r u c t u r e p r e p a r e db yi ns i t u p o l y m e r i z a t i o no rc o n s o l i d a t i o ni n s i d et h ec o l u m nt u b i n g b e c a u s et h ed e s i r e dc h r o m a t o g r a p h i c b i n d i n gp r o p e r t i e sc a l lb er e a l i z e db ys u r f a c e - f u n c t i o n a l i z e do ft h em o n o l i t h i c t h em o n o l i t h i ch a s p r o m i s i n ga p p l i c a t i o n si nt h ef i l e do fp r e p a r e dc h r o m a t o g r a p h y m o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e sh a v e a t t r a c t e dc o n s i d e r a b l ea t t e n t i o n si nt h ef i e l do f l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yd u et ot h e i rs i m p l e p r e p a r a t i o np r o c e d u r e ，u n i q u ep r o p e r t i e sa n de x c e l l e n tp e r t b r m a n c e si ne n a n t i o s e l e c t i v es e p a r a t i o n s oi ti sp r a c t i c a la n dc o n d u c t i v et oh a v ea s t u d yo nt h ep r e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n da p p l i c a t i o n o f m o n o l i t h s t h i sp a p e rr e v i e w e dt h ed e v e l o p m e n t sa n dp r o p e r i t i e so fm o n o l i t h i c t h e p r e p a r a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n so fm o n o l i t h i cu s i n gi nh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) w e r ea l s o i n t r o d u c e d a n dt h ea p p l i c a t i o n so fm o n o l i t h i ci nc h r o m a t o g r a p h yw e r es u m m a r i z e d b a s e do nt h e r e s e a r c h e sm e t i o n e da b o v e ，t h i sw o r kh a df o c u s e do nt h ep r e p a r a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n d a p p l i c a t i o no f an o v e lm o n o l i t h i c a n dt h ed e t a i l so f t h i sp a p e r sw e r el i s t e da st b l l o w s ： 1 an o v e lm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s ew a sp r e p a r e d w i t h g l y e i d y lm e t h i a c r y l a t e ( g m a ) a s m o n o m e r , e t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ( e d m a ) a sl i n k i n gr e a g e n t ，t h em i x t u r eo fc y c l o h e x a n o l ( c y o h ) a n dd o d e c a n o ( d o o h ) a sp o r o g e na n da z o b i s i s o b u t r y o n i t r i l e ( a i b n ) a st h ei n i t i a t o r t h e i p o l y m e r i z i n gc o n d i t i o n sw h i c hi m p a c t e do nt h es t r u c t u r eo fm o n o l i t h i cw e r ed i s c u s s e d ，i n c l u d i n g t h eu s i n ga m o u n t so fm o n o m e ra n dp o r o g e nc o m p o s i t i o n ，t h et e m p e r a t u r ea n dt h ep e r i o do ft h e r e a c t i o n , e r e m e a n w h i l e ，s e m ，f t - i r , n i t r o g e na d s o r p t i o nw e r ei m p o r t e dt oe s t i m a t et h ep o r o u s d i s t r i b u t i o n 。i n t e n s i t y 2 1 3 - c y c l o d e x t r i n ( p - c d ) w a si m m o b i l i z e dt o t h em o n o l i t h i cs t a t i o r m r yp h a s ei nt h ep r e s e n c eo f e p o x y , a n d1 3 - c y c l o d e x t r i nm o n o l i t h i cw a sp r e p a r e d t h ei m m o b i l i z i n gc o n d i t i o n si n c l u d i n gt h e r e a c t i o nt i m e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fo - c da n ds oo nw e r ed i s c u s s e d u n d e rt h eo p t i m i z i n gc o n d i t i o n , t h ei m m o b i l i z i n gq u a n t i t yo f1 3 - c y c l o d e x t r i nw a su pt o3 8 8 吲g t h ea p p l i c a t i o no f3 - c y c l o d e x t r i n m o n o l i t h i ci nt h es e p a r a t i o no f e n a n t i o m e ro f v a l s a r t a nw a si n v e s t i g a t e d t h es e p a r a t i n gm e c h a n i s m a n dt h ef a c t o r si m p a c t i n go nt h es e p a r a t i n gp e r f o r m a n c eo ft h ef j - c y c l o d e x t r i nm o n o l i t h i cw e r e d i s c u s s e d k e y w o r d s ：1 3 - c y c l o d e x t r i n ，m o n o l i t h i c ，e n a n t i o m e rs e p a r a t i o n 中山大学硕士学位论文 1 引言 第一章整体柱的制备方法及应用 高效液相色谱( h p l c ) 具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应 用范围广泛等特点，特别适合于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物 的分离分析。因而广泛应用于生物化学、生物医学、药物临床、环境检测以及商 检、法检和质检等许多分析检验部门。高效液相色谱不仅仅是一种有效的分析工 具，而且日益成为高价位的生化工程产品，手性药物等分离制备和纯化的手段。 高效液相色谱作为一种有效的分离手段在对映体分离中发挥着十分重要的作用。 对于液相色谱而言，高的柱效和柱空间利用率一直是研究工作者们追求的目 标。对于传统的色谱填充柱，人们为了提高柱效而使用越来越小的填料。但是就 高效液相色谱而言，柱前压会随着填料粒径的减小而急剧上升。l 2 “m 的填料 虽已出现，但是采用如此小的颗粒介质，目前在技术上要受到很多限制，如填充 问题( 操作压力很大) 、死体积( 要求很小) 等，目前，广泛应用的仍为3 5 9 m 的填料。 近年来，围绕着提高色谱柱空间利用率及色谱效应，相继开发了单分散微粒 以及连续棒状填料的新技术，呈现出良好的色谱性能。但研究及应用实践结果表 明，前者存在着合成及装填过程复杂、不同批次合成的填料重现性差。装填的色 谱柱仍有至少2 6 的柱空间未得到充分利用的弊病。相比之下，后者卸有效克 服了这些缺点，并己成功地用于色谱分析中。 整体柱的最初模型可以追溯到2 0 世纪6 0 年代。1 9 6 7 年k u b i n 0 1 以高度溶 涨的聚2 一羟乙基甲基丙烯酸凝胶为色谱柱，以低压尺寸排阻色谱方式分离蛋白 质。之后，7 0 年代初聚亚胺酯泡沫材料曾被尝试用作固定相但因其溶胀剧烈而 使应用受限。 1 9 8 9 年瑞典u p p s a l a 大学生物化学系的s h j e r t e n 提出了连续床的概念【2 1 他通过在空柱管中加入单体、引发剂及致孔剂的混合溶液“原位”聚合后制得聚丙 中山大学硕士学位论文 烯酰胺凝胶连续床，并成功地用于蛋白质及多肽的分离。 1 9 9 2 年美国康乃尔大学化学系贝克实验室f r a n t i s e ks v e c 小组【3 i 用原位聚合 的方法合成了刚性大孔有机聚合物整体柱。这种新材料由于独特的多孔结构使传 质阻力减小，柱压降低，同时具有良好的机械强度，因而可以直接用于高效液相 色谱分离分析，成为实际应用的聚合物整体柱。 与此同时以硅胶为介质的整体柱材料也初露端倪。1 9 9 2 年，n a k a n s h i 等【4 1 报 道了多孔硅胶整体材料的溶胶凝胶制备技术并对制备机理和条件，孔径结构控 制等进行了探讨。1 9 9 6 年m i n a k u c h i 和t a n a k a 等1 5 i 首次将制备的连续硅胶整体柱用 作高效液相色谱固定相。 整体柱作为继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的第四代分离介质，正是应 复杂样品体系的快速、高效、高通量分析需要而发展起来的一种新型色谱柱。 整体柱1 6 1 ( m o n o l i t h i cc o l u m n ) ，又称棒柱( r o d ) 、连续床柱( c o n t i n u o u sb e d ) 、无 摩柱( f r i t l e s sc o l u m n ) ，它是由单体、引发剂、致孔剂等混合物用原位聚合的方法， 庄柱管内原位聚合或固定化的连续整体多孔结构。口丁根据需要肘整体材料的表面 作相应的衍生化。通过控制聚合条件来得到具有理想孑l 径分布的整体柱。这种简 单而直接地制备柱子的方法，已被证明有良好的应用莳景，整体柱实际上是吸收 了无孔填料和膜的快速分离能力，以及h p l c 多孔填料的高容量，又没有增加柱 阻力这两方面的优点而发展出的一个很有意义的新产物，具有以下几个特点7 1 ： ( 1 ) 制备方法简单，口丁以直接在柱管内原位聚合，省去了制备填料和装 柱等步骤。也可以制成聚合物颗粒后再装柱。柱子的长度和直径在一定程度上不 受限制。 ( 2 ) 通透性好。色谱整体柱的孔隙由高分子聚合物颗粒中的孔隙和颗粒 间的缝隙组成，通过控制聚合条件可以获得具有理想孔径分布的整体柱。 ( 3 ) 柱前压低，可以实现快速分离分析。 ( 4 ) 种类众多。单体可以灵活选择以得到不同性质的整体柱基质，进一 步固载修饰可以得到不同分离性能的色谱整体柱。 ( 5 ) 具有良好的化学稳定性，可以在广泛的d h 值范围内使用。 ( 6 ) 它们不易产生不可逆的吸附作用，特别对于生化物质的分离能够较 好的保存其生物活性。 中山大学硕士学位论文 由于整体柱具有以上优点，作为一种新型的分离介质，其必将在分离分析领 域中扮演着越来越重要的角色。 2 整体柱的制备方法 商品化整体柱的出现，标志着分离介质进入了整体柱发展的新时代。目前商 品化的聚合物整体柱有c i mi s 】。硅胶整体柱有s i l i c a r o d 【9 和p r e p r o d s f j 0 1 和 c h r o m o l i t h t m i l l 。 整体柱根据不同的制备方法，主要可分为三类，分别是聚合物整体柱、硅胶 整体柱和以填充柱为基础的整体柱。 2 1 聚合物整体柱 聚合物整体柱的制备是将单体、交联剂、致孔剂、引发剂混合物注入到柱管 中，经热引发或紫外光引发使得单体混合物在柱管内原位聚合，然后用合适的溶 刘除去柱体内的致孑l 剂和残留的单体。在聚合混合物中加入特定的单体或在聚合 后进行化学修饰可以改善整体柱的选择性。 聚合物整体柱取材较广，使用p h 范围宽，通过化学修饰，可以用作多种色 谱模式的固定相。在近几年得到了迅速的发展，已在反相色谱 1 2 - 1 5 l ，离子交换色 谱【1 6 - 2 ”、疏水作用色谱【2 2 之4 1 、亲和色谱盼2 引，体积排阻色斟2 9 。3 1 中获得了应用。 根据整体柱制备时选用的单体及交联剂的不同聚合物整体柱可分为以下几 类：聚苯乙烯类，聚丙烯酰胺类和聚甲基丙烯酸酯类， 2 1 i 聚苯乙烯类整体柱 陔类整体柱使用的单体种类较少，目前使用的单体仅为苯乙烯、氯甲基苯乙 烯、二乙烯基苯p 4 3 3 i ， 聚苯乙烯体系用于离子交换树脂的制备已经发展得相当成熟，优点是硬度高 中山大学硕士学位论文 且性质稳定。f r 6 c h e t 掣3 6 郴1 用所制的聚苯乙烯整体柱还发展了在柱的沉淀再溶 色谱( p r e c i p i t a t i o n r e d i s s o l u t i o nc h r o m a t o g r a p h y ) 并分离了苯乙烯的寡聚物和高 聚物。该方法也可用于共聚物的分离，其分离过程不但受共聚物分子量的影响， 也受共聚物的组成的影响。 制备聚苯乙烯整体柱的方法是【j 9 j ：单体( 苯乙烯：二乙烯基苯= 5 0 ：5 0 ) ：致 孔剂( 癸醇) = 4 0 ：6 0 ，a i b n ( i w w ) ，加入到混合物中通氮气除氧后将混合物 注入不锈钢柱子聚合反应在7 0 下反应2 4 h 。然后除去塞子，将柱子接至q h p l c 泵上，多孔聚合物中的致：l 齐u 和可溶性物质被t h f 洗出。他们使用苯乙烯基乙酸 酐( s t y r e n ea c e t i ca n h y d r i d e ) 替代苯乙烯：将二乙烯基苯、苯乙烯基乙酸酐、新型 引发剂( 2 ，2 ，5 - t r i m e t h l 一3 一( i - p h e n y l e t h o x y ) - 4 一p h e n y l 一3 - a z a h e x a n e ) 、致孑l 剂( 高 级脂肪醇和甲苯的混合物) 混合均匀并脱气灌入柱后油浴下聚合。反应结束后立 即用冰水浴冷却，用t h f 冲2 4 h 后。f 6 0 c 下真空干燥。他们还讨论了反应动力 学、孔性状和致孔剂的影响。 f r c h e t 等通过实验比较了聚苯乙烯整体柱与聚苯乙烯填充柱，在分离结果相 当的情况下整体柱的柱压低，流速柱压的线性范围约为填充柱的i o 倍：提高流 速整体柱的分离效果不会变差， 由于聚苯乙烯固定相由s 一碳联接的苯环构成，这种构象具有理想的疏水性。 可以直接用于反相色谱。经不同功能单体化学修饰的聚苯乙烯整体柱，可以扩大 其应用范围。因此聚苯乙烯整体柱有很好的发展前景。 2 1 2 聚丙烯酰胺类整体柱 目前对聚丙烯酰胺类整体柱的研究相对较少，采用的功能单体主要有丙烯酰 胺、n 异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸丁酯，n 一烯丙基二甲胺， 交联剂则为二丙烯酰哌嗪、亚甲基二丙烯酰胺( b t s ) 。 聚丙烯酰胺体系是典型的水相聚合体系，也有在有机相聚合的报道【4 0 “i ，其 特点足：单体易溶于水：有良好的生物兼容性适合分离生物大分子；柱中的凝胶 颗粒上没有孔来增加传质，但其直径小、表面粗糙，所以表面积大、结合位点多： 凝胶颗粒间靠共价键结合流动阻力小：可通过压紧柱子降低孑l 体积来提高分离效 中山大学硕士学位论文 果：分离效果往往随流速的提高而提高，表明因e d d y 扩散造成的区带展宽减小了。 f u j i m o t o c 【4 2 1 将丙烯酰胺、b i s 、2 - 丙烯酰胺一2 甲基一l 一丙磺酸( a m p s ) 在毛细管柱内聚合。在c e c 模式下，乙酰苯的柱效达1 5 0 0 0 0 塔板数米。f u j i m o t o c 认为这种整体柱的主要分离机理为筛分而不是溶质与固定相之间的相互作用。 之后，f u j i m o t oc 1 4 3 1 采用疏水性较强的n 一异丙基丙烯酰胺替代丙烯酰胺，柱效 能有所改善。聚合物凝胶作为固定相分离疏水化合物显现出一些反相色谱的性 质，同最初的聚丙烯酰胺凝胶相比，体积排阻不再是唯一的分离模式。 h j e 聒n 等1 4 4 】报道了高度交联聚丙烯酰胺整体柱，但最初的制各方法复杂，其 中包括毛细管内壁的处理、两步聚合及表面键合。使用该柱在c e c 模式下分离芳 烃，分离时间长达2 0 m i n 。用二丙烯酰哌嗪替代b i s 可克服固定相的p h 值使用 范围窄和流速不能过大等弊端【4 5 1 ，一股可通过超声l 和选择合适的溶剂 4 7 , 4 8 1 等 方法，将疏水的甲基丙烯酸烷酯引入到反应体系中，以增加固定相的疏水性，从 床层的均匀性上讲，后者较前者更有优势。 h j e r t e n 4 9 1 在反应混合物中加入甲基丙烯酸十八烷酯或甲基丙烯酸丁酯，因二 者均不溶于水。经超声处理，形成乳液，再将乳液装入表面处理过的柱子中聚合 而成棒状整体，固定相与毛细管内壁共价键合，在c e c 模式下5 m i n 可分离5 种多 环芳烃。 n o v o t n y 5 0 l 使水相缓冲溶液与n 一甲基甲酰胺形成均一聚合物溶液聚合后 将疏水性官能团引入固定相中。缓冲液与n 一甲基甲酰胺的组成依所使用的甲基 丙烯酸烷酯的类型而定。向反应体系中加入聚环氧乙烷( p e o ) ，可改善柱效。 p e o 使丙烯酰胺链横向聚合，有助于形成孑l 结构。聚合结束后，p e o 及其他小分 子被洗脱出来。该制备方法具有较高的重复性。 f r 6 c h e t 等 4 7 - 4 8 将单体( 丙烯酰胺和b i s ) 溶解于二甲亚砜和醇的混合物中，无 须压柱即可一步制得坚硬的整体材料。当然水溶性的a p s , i z , 须以油溶性的自由基 引发剂偶氮二异丁腈( a t b n ) 代替。聚合产物干燥后利用压汞法测定孔径。实验证 明孑l 径在1 0 0 0 n m 左右，可以得到合适的流速，同时柱压较低。控制合适的聚合 条件如交联剂及致孔剂的比例、致孑l 剂的组成、反应速度( 由反应温度和引发剂 的浓度决定) 可以得到理想的孔径。实验中选用对丙烯酯胺和b i s 部有良好溶解能 力的二甲亚砜作为致孔剂之一，致孔剂的另一个组分则要求有长烷基链来促进相 中山大学硕士学位论文 分离。致孔剂的组成和各成分的比例决定了单体可能的浓度和相分离的时间。致 孔剂中用聚丙三醇时得到大于1 2 0 0 n m 的孔。其中b i s 的比例为3 0 时得到最大的 孔径。该疏水相互作用色谱柱可在3 m i n 内分离5 种蛋白质。 u e n o 副l 将烯丙基氨基甲酰化的b - - c d 与固定相键合制成手性固定相，在c e c 模式下分别拆分酸性和中性对映体。 该类柱由于紫外透明，可柱内检测，但水相聚合的聚丙烯酰胺质地软且孔径 分布范围较大。高流速的冲洗可以将柱子压紧( 柱的最终长度大约只有原来的十 分之一到十五分之一) ，部分提高机械强度并减小孔径分布从而提高柱效。聚合 物溶液中加入丙烯酸可以得到阳离子交换色谱柱：加入n 烯丙基二甲基胺可以得 到阴离子交换柱。3 5 m m 长的阴离子交换柱，可以在1 0 m i n 内分离5 种蛋白质并且 分离效果不受流速的影响。细内径阴离子交换柱( 7 0 r a m 0 3 m m ) 在3 0 m i n 内能完 全分离肌红蛋白、核糖核酸酶a 、卵白蛋白、a 糜蛋白酶原a 、r 一藻红蛋白5 种蛋 白质：加入丙烯酸丁酯，则可得到疏水相互作用色谱( n i c ) 柱。 2 1 3 聚甲基丙烯酸酯类整体柱 该类整体柱功能单体主要有甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 、甲基丙烯酸丁酯 ( b m a ) 、2 - 丙烯酰胺2 甲基丙烷i 磺酸( a m p s ) 等，交联剂为乙二醇二甲基丙烯 酸酯( e d m a ) 、亚甲基双甲基丙烯酸酯，引发剂通常为偶氮二异t 腈( a i b n ) ，致 孔剂为正丙醇、i ，4 一丁二醇、甲醇、环己醇、十二醇等中的一种或几种混合醇 【5 2 6 5 1 ，该类柱在p h 2 1 2 范围内均具有较好的稳定性。 聚甲基丙烯酸酯类整体柱的性质因酯基部分的变化而不同。若酯基部分是烷 基，疏水程度可由甲基丙烯酸酯的比例和烷基链的长度来调整。例如，利用增加 b m a b t 例可获得较强的疏水性，可在反相色谱模式下用来分离蛋白质【”l 或苯的 同系物1 5 4 i 。若酯部分含有环氧基团，那么这种整体柱易于衍生化。例如以g m a 为单体的聚合物可通过水解、胺解反应等较容易地引入新的功能基团。从而获得 离子交换型整体色谱柱陋5 8 1 和亲和型整体色谱柱【5 8 - 6 0 l 等， 在聚合过程中所加致孑l 剂的种类和比例，以及反应单体的种类和比例，对整 体柱的性能有很大影响，多数研究都是在固定的反应单体比例下进行，p a v e lc 6 中山大学硕士学位论文 等【叫i 考察不加a m p s 时不同比例的甲基丙烯酸丁酯( b m a ) 和e d m a ，以及不同 比例单体混合物和致孔剂下整体柱的性能并找出了最佳条件。 c o u f a l p 等 6 2 1 分别用自由基引发和热引发两种方法制备了聚甲基丙烯酸酯 类整体柱，并得出两种方法制备的整体柱在选择性和柱效方面相当。但运过自由 基引发聚合反应制备是在常温下进行，所以制备更简单易行。 部分聚丙烯酸酯类整体柱表面具有环氧结构，可以进一步修饰使具有不同选 择性，而且可以在p h 2 1 2 范围内使用从而扩大应用范围。例如以甲基丙烯酸缩水 甘油酯为单体的聚合物，可容易地引入离子基团而制备离子交换色谱柱，并且衍 生化试剂的选择范围也可大大扩展。目前有关这一体系的报道主要涉及利用氨基 化合物( 如乙二胺【6 3 侧，肽1 6 5 1 ，甚至是蛋白质惭1 ) 与环氧基团反应以及酸性条件下 环氧开环成为二醇等。 聚( 甲基丙烯酸缩水甘油酯亚乙基二甲基丙烯酸酯) 体系研究最早是s v e c 等 嘟j 报道的。该体系的典型制备方法是：单体( 甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) ：亚 甲基二甲基丙烯酸酯( e d m a ) = 6 0 ：4 0 ( v v ) ) 与致孔剂( 环己醇：十二醇= 9 0 ：l o ( v v ) ) 以4 0 ：6 0 ( v v ) f g 合后。加入引发剂a i b n ，通氮除氧后注入不锈钢柱，在 5 5 聚合1 2 h 。反应完成后将柱子接至q h p l c 泵上，在4 5 用t h f 将聚合物中的残 余试剂洗出。利用聚合物中的环氧基团采用两种衍化方式：( 1 ) 泵入 0 5 m o l m l h 2 s 0 4 ，水浴6 0 反应3 h ，这样得到含二醇官能团的多孑l 聚合物：( 2 ) 注入2 m l - - - - 乙胺，加热反应得到含1 ( | v 一二乙基胺) 一2 羟基丙基官能团的离子交 换色谱柱，可分离蛋白。在胺化制备的3 根柱中柱l 于5 5 下反应3 h ，聚合物的氮 含量最高( 1 2 6 m m o l g ) ；柱2 于5 5 。c 下反应i h 氮含量是0 6 7 m m o l g ：柱3 在2 0 。c 下反应5 5 h 。氮含量只有0 2 7 m m o 瞻。柱l 官能团含量高，保留时间长，要用更强 的离子强度的流动相才能分开；柱3 上的官能团过少分离不好：柱2 用离子强度相 对较小的流动相就可以分离。 整体材料如果发生溶胀，不会影响材料的外观尺寸，但会降低孔径使柱压升 高。s v e c 等1 6 3 l 通过测定苯和聚苯乙烯的保留时间分别为0 6 3 和0 6 0 m i n 。且峰形很 锐，说明柱子中没有明显的分子排阻现象，咩且几乎不含, l , f k 。利用所得的弱阴 离子交换色谱柱可以分蛋白质科i ，聚脱氧腺苷酸( 1 2 1 8 个重复单位) 和聚胸腺 嘧啶核苷酸( 1 2 2 4 个重复单位) 6 6 1 ，h a h n 掣“1 先用十肽与g m a 反应再将产物作 中山大学硕士学位论文 为单体之一。与甲基丙烯酸缩水甘油酯和亚乙基二甲基丙烯酸共聚制得亲和色谱 整体柱。 罗权舟等1 6 5 l 将蛋白质a 用两种方式连到聚合物上：( 1 ) 将制好的基质分别与己 二胺、戊二醛反应，再与蛋白质a 反应得到含有11 个碳原予臂的蛋白a 高效亲和 色谱柱：( 2 ) 将制好的基质直接水解再用新配的高碘酸钠氧化，最后与蛋白a 作用 制得不含臂的蛋白a 高效亲和色谱柱。实验证明聚合物基质的疏水作用很弱，无 臂柱子的非特异性吸附很低。连接臂有一定的非特异性吸附，在流动相中加入 1 5 的乙腈后可以消除疏水作用的影响。合成的蛋白a 高效亲和色谱柱的稳定性 良好，使用半年后性能基本来发生改变。卫引茂等【6 7 l 提高了g m e d m a 的比值 ( 7 5 2 5 ) 用乙二胺打开环氧基团后再接上氯乙酸得到弱阳离子交换柱。 2 2 硅胶整体柱 硅胶整体柱的制备方法通常采用溶胶一；疑胶法。 溶胶一凝胶整体柱是以四烷氧基硅烷为主要原料在催化剞、致孔剂存在下， 通过水解、缩聚反应实现溶胶凝胶化，经干燥、老化而形成的具有双孔结构的整 体床层，其可直接作为固定相或再迸行衍生化。陔方法制成的色谱填料具有两种 孔结构，分别为微米级的通孔( t h r o u g h p o r e ) 和纳米级的中孔( m e s o p o r e ) 。改 变反应物组成的比例，可独立地控制通孑l 和中孔的孔径，通孔的存在使得硅胶整 体柱具有优异的渗透性。不同的反应条件可使得硅胶整体柱具有两种形貌，分别 为颗粒聚集型结构6 s 6 9 i 和网络结构”1 ， m i n a k u c h i 等 7 0 1 首先将溶胶凝胶法应用于硅胶整体柱的制备，其步骤是：四 甲氧基硅烷的水解( 有酸水解和碱水解两种) ：水解的硅四面体结合，形成s i o s i 键：高温老化( 一般不小于6 0 0 c ) ，使聚合反应完全、骨架坚硬，利用溶胶凝胶 法制备硅整体柱的难点是整体材料在聚合过程中会收缩【”1 ，因此，在模具中先制 得的整体硅胶柱要截成适当长度装到聚四氟乙烯的柱管中，为了保证柱子准直， 通常内径小于 0 m m ，柱长不超过1 5 c m 。聚四氟乙烯包裹的柱子可以耐受高达 1 2 0 k g e m 二的压力。整体材料在模具中聚合时，因为同时存在整个网状结构收缩， 得到流通孑l 径，骨架尺寸比为1 2 1 5 ，而填充柱中该值为0 2 5 0 4 。 中山大学硕士学位论文 整体硅胶材料和有机整体材料一样，可通过化学修饰或改变原料( 使用不同 性质的聚合单体) 获得不同用途的整体柱。整体硅胶基质表面的硅羟基是化学修 饰的靶点。m i n a k u c h i 掣”】用十八烷基二甲基( ，n - - - - g _ _ , 基胺基) 硅烷与硅羟基反 应得到用于反相高效液相的c 1 8 整体硅柱。m ec a l l e y l 7 3 1 比较了传统的填充柱与 m e r c k 公司反相整体硅胶柱分离中性和碱性化合物的情况。实验显示，高流速分 离中性样品时，整体柱的理论塔板高度小于5 t a m 填料填充的色谱柱：酸性条件、 室温下高流速分离弱碱性和强碱性样品时，板高仍低于填充柱，但拖尾明显：整 体柱在流动相p h 为7 时，分离强碱性样品的峰形更差。柱温升高会提高溶质在流 动相中的扩散系数( d m ) 而提高柱效。m a s s o l i n 等 7 4 l 采用m e r c k 公司的整体硅胶氨 基柱，以，二琥珀酰亚胺碳酸酯为连接臂，制备了青霉素g 一酰基转移酶的酶 反应器，并用它研究了2 芳氧基脂肪酸甲酯及其类似物的在线酶催化不对称反应 和分离。 硅胶整体柱可直接作为固定相或再进行衍生化，在制备过程中通过改变反应 物配比，可独立地控制大孔和中孔孔径，但制成的连续床层在干燥和老化过程中 易开裂，严重影响柱效，并且制备过程较为复杂。同时，硅胶基质分离介质对极 性溶质，特别是对碱性溶质具有强非特异性吸附作用以及导致生物大分子变性、 失活、化学稳定性相对较差等问题一直困扰着广大的分析工作者，其主要原因来 源于硅胶中所含的杂质金属离子以及在化学修饰或键合时因位阻等原因而导致 的在硅胶表面上残存的、或新生的硅羟基。针对这一问题展歼的研究很多，马小 东等【l9 l 通过研究温度、p h 值等对凝胶化过程的影响，确定了最佳制备参数，采 用改进的溶胶凝胶工艺，在一定程度上解决了这些问题。 根据两性金属氧化物可以减弱碱性化合物与色谱柱内壁的作用力。研究者将焦 点集中在两性金属氧化物( 如二氧化钛、二氧化锆等1 包覆硅胶整体柱上陋7 刀以 期解决碱性化合物分离过程中的拖尾问题，s h i z g 等用二氧化锆包覆硅胶整体柱 然后用磷酸盐和十八烷基磷酸修饰，在c e c 模式下成功分离了对二氨基联苯的 碱性化合物。 溶胶凝胶整体柱的研究主要集中在避免干燥老化过程中的开裂及对碱性溶质 的非特异性吸附等问题，寻找最佳的制备条件提高柱效，延长使用寿命。作为有 机聚合整体柱的补充，硅胶整体柱在小分子分离方面会有更广阔的应用前景。由 中山大学硕士学位论文 于硅胶为紫外透明，因此，该类柱可以直接采用柱内检测。 2 3 以填充柱为基础的整体柱 以填充柱为基础的连续床层色谱柱是先将填料填充到毛细管柱中。再通过溶 胶凝胶技术i t s - s o l 、聚合技术洲或高温烧结m - 8 4 1 形成整体柱。 d u l a y 和r a t n a y a k e 等f 8 58 6 1 分别在聚乙氧硅烷、乙醇、盐酸等反应物中加入 5 1 a m 或3 1 a m 的o d s 超声后o d s 颗粒存在于连续床中可减少因内部压力差异 面引起的裂缝。使用3 m m o d s 的柱效比使用5 p m o d s 的柱效高。孩柱渗透性高， 但不易实现o d s 颗粒在连续床层内均匀分布。 r e m c h o t s 4 1 先采用匀浆法制成5 t t mo d s 毛细管填充柱，然后将该柱充满硅酸 盐溶胶，再经热处理。该制作过程耗时过长，并且该柱具有活性位点，使峰拖尾。 m a r i a t 等18 0 1 将十八烷基硅烷f o d s ) 微粒加入溶胶溶液中超声形成悬浮液，使 溶胶的凝胶化和o d s 的固定化一步完成。 t a n gq i n g l i n t 8 5 1 等首次应用超临界c 0 2 将o d s 硅胶微球填充到毛细管柱中 然后经溶胶一凝胶化，所得整体柱的大孔硅胶之间及其与毛细管柱内壁的交联状 况良好。并在c e c 系统上发现硫脲的传质阻力很小他们认为是硅胶微球中的 小孔和填充空隙被硅溶胶部分填充所致。 d a r i na 等 s 6 1 介绍并评价了两种连有氰功能基的亲水硅胶整体柱( c n 整体柱 和c n o h 整体柱) 的制备方法，由于后者强亲水性能而使得保留和选择性都优于 前者。 c h i r i c a 等1 8 7 1 通过有机基质截留固定反相填料制备整体柱，首先填充填料然 后注入聚合混合物经聚合反应固定填料，可以得到柱效较高的整体柱。在此，有 机聚合物的引入减少了反相填料的次级作用。 q uq i s h u 掣8 8 1 采用干硅胶固定精细石英砂制各内径2 7 m n l 的整体柱，石英 砂的散热效应使得焦耳热有所降低，而且避免了烧结和柱填充两道工序。 以填充为基础的整体柱在机械强度和稳定性方面得到改善，但由于填充过程 而使制备过程相对复杂，而且固定相受到的影响，尤其是高温烧结可能会破坏已 踺合的cl 8 固定相，往往还需要进行二次键合。与溶胶一凝胶法相比，柱子制 备相对复杂，因此报道不多， 1 0 中山大学硕士学位论文 3 整体材料的性质评价及性状控制 3 1 整体柱结构的表征 整体柱结构表征主要有扫描电子显微镜( s e m ) 、压汞法和氮吸附法。 3 1 1 形貌观察 多孔整体材料中孔径分布可以由扫描电子显微镜( s e m ) 观察到。s e m 可直 观给出所观察床层截面的形貌和孔径情况，其缺点为智能给出断面的局部结构信 息。无法对整根柱子作出全面、综合的评价。 3 1 。2 孔结构的评价 孔结构对渗透性和传质过程均具有重要的影响，色谱柱的孔结构直接影响其 性能。测量孔径及其分布的标准方法为压汞法和氮吸附法，尽管这两种方法是在 材料干燥后测定的，并不能真实反映色谱运行中的孔径大小。但是柱子“干”时 和“湿”时的孔径存在着严格的对应关系。 通过逆体积排阻色谱( i s e c ) 可以测定整体柱于溶胀状态下的孔径分布。但 是， s e c 的有效应用范围受制于标准样品的尺寸，因为即使是数百万分子量的 样品也无法测定1 0 0 n m 以上的孔。比表面积可以用氮气吸附一解吸法来测定，也 是测定柱子“干”时的状态。化学结构可用红外光谱法测定，尤其是在合成好的 基质上接上衍生化基团后，可以方便地观察到特征峰的变化。可用元素分析来测 定衍生化基团的含量。如果采用先将单体衍生化再进行聚合反应的方法，可用 n m r 来分析官能团的变化。 中山大学硕士学位论文 3 2 孔径的控制 f r 6 c h e t 等8 9 1 i , ) k 为多孔聚合物的形成过程与致孑l 剂、单体和生成的聚合物三者 的极性有关：致孑l 剂与单体的极性接近，才能作为单体的良溶剂。致孔剂极性与 聚合物极性的差异越大，相分离越早出现，则聚合物孔径越小。但相分离出现得 过晚，孔径也小。孔径的大小由聚合反应混合物中交联剂和致孑l 剂的比例、组成 以及由反应温度和引发剂种类和浓度决定的反应速度等聚合反应的条件决定，由 于改变混合物中交联剂的比例会改变聚合物的化学组成，增加致孔剂的比例会增 加孔体积并降低硬度，结果只有致孔剂的组成和反应速度( 受温度、引发剂种类 和浓度的影响1 常被用来调整孔径。 使用致孔剂通常要遵循以下的原则： ( 1 ) 致孔剂体系要能在低于或等于聚合反应温度下完全溶解单体混合物： f 2 ) 致孑l 剂对于单体和柱子而言是惰性的，并易除去： ( 3 ) 致孔剂的比例应使聚合反应产生合适的相分离。 3 3 整体柱材料表面的修饰 整体柱表面化学和物理性质决定着其性能和应用。聚合物整体柱多用作反楣 色谱、疏水作用色谱、离子交换色谱和亲和色谱等固定相，表面修饰方法一般涉 及水解、缩合和氧化还原等一系列化学反应。近年来，新型的聚合物整体柱开始 采用表面接枝的方法来达到特定的制备目的。 整体柱材料的孔结构主要应满足两个条件：一是足够多的大孔使流动相传质 阻力减小，柱压降低：另一个是要有足够大的表面积和功能基团来满足后续的化 学修饰。s v e c 等3 6 1 和t a n a k a 掣2 9 + 3 0 1 通过改变和寻找合适的单体、交联剂、致 孔剂， 选择合适的比例与条件来改善材料的孔结构，得到了大的孔隙率以达到 降低柱压的目的，同时又有很大的表面积。但是，过大的表面积又引起了渗透性 能的降低。因此，人们希望能够通过在表面接枝聚合物长链来增加官能团的密度， 增大孔容量：而接枝的聚合物链在孔中会像“触角”一佯通过改变构象与溶质产生 1 2 中山大学顼士学位论文 最有效的作用，提高柱容量，但也不会影响渗透性。 这类接枝反应常用的引发方式主要有c e 即1 引发、光引发i ，氧化还原引 发【9 2 冉3 l 等。 s “i n a 等阱1 用k 5 c u ( h 1 0 6 ) 2 1 作为氧化还原引发荆在聚丙烯酰胺水凝胶 ( p a a m ) 上通过自由基聚合接枝甲基丙烯酸二甲氨基乙酯( d m a e m a1 构成阴离 子交换色谱柱，接枝率可以达到1 1 0 。进一步的实验表明，牛血清白蛋白( b s a ) 的键合容量与接枝过程有关，先用引发剂产生自由基而后接枝的两步反应 4 0 1 会 产生长链， 能够更有效地与b s a 结合。同样，应用这种类型的整体柱可快速地 从细菌的酶解液中捕获脱氧核糖核酸( d n a ) 质粒体 9 3 1 ，另外，他们9 4 1 还在p a a m 水凝胶上接枝丙烯酸构建成阳离子交换柱，接枝后的p a a m 疑胶对p h 敏感，而且 当接枝率从6 0 升高到7 0 的时候，溶菌酶的结合容量提高了3 倍。这可能是由 于蛋白质像触角一样与接枝后的凝胶相互结合，增加了可结合的位点数量。 v i k l u n d