食品微生物检验技术第五章

第五章 食品卫生细菌学检验技术自然界广泛分布的微生物，在食品的生产、包装、运输、贮藏及销售过程中经常有机会污染食品，而食品本身含有丰富的营养物质，一旦条件适宜，污染的微生物便可在食品中生长繁殖，其后果不仅可使食品腐败变质而造成浪费，还可使食用的人畜致病，甚至引起暴发性食物中毒。防止食品污染，搞好食品卫生，是一个关系人民健康的大问题，也是一个关系到外贸和经济的重要问题。食品卫生细菌学检验是以细菌学的指标来检查食品是否合乎卫生要求，结合食品理化检验和卫生学调查，可以正确了解食品的卫生情况，给予确切的卫生评价，并为食品卫生管理等方面采取有效措施提供科学根据。第一节 食品卫生细菌学检验总则一、样品采集在食品检验中，所采集的样品必须具有代表性，即所取样品能够代表食品的所有部分。食品的卫生质量受到其加工批号、原料情况（原料的来源、种类、所在的地地区、季节等）、加工方法、保藏条件、运输、销售等环节的影响，要根据一小份样品的检验结果来说明一大批食品的卫生质量问题或一起食品中毒事件的性质，必须经过周密考虑，设计出一种科学的取样方法。采取什么样的取样方法主要取决于检验目的。目的不同，取样方法也不同。检验目的可以是判断一批食品的质量合格与否，还可以是查找食品中毒病原微生物，还可以是鉴定畜禽产品中是否存在人畜共患的病原体。目前国内外使用的取样方法多种多样，如按食品的危害程度抽样，按百分比抽样再混合一起检验等。（一）样品的分类样品可分为大样、中样、小样三种。大样指一整批，；中样指从样品各部分取的混合样国，一般为200g；小样既检样，一般以25g为准，用于检验分析用。（二）样品的采集采样必须在无菌条件下进行操作。采样的工具：如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪刀等，都必须是无菌的。不同种类的样品采样方法不同。1.液体食品的采样将样品充分混匀，用无菌操作开启包装，用100mL无菌注射器进行抽取，注入无菌盛样容器中。2.半固体食品的采样用无菌操作方式拆开样品包装，然后用无菌勺子从几个部位挖取样品，注入无菌盛样容器中。3.固体样品的采样如为大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取，割取时应注意样品的代表性，兼顾深度与广度，若检验目的是了解食品的污染情况，可只取表层样品；如为小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，注入无菌盛样容器中。如果样品是粉末状，应边取边混合。4.冷冻食品的采样大包装小块冷冻食品的采样按小块个体取样；大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冷冻块了锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎样品，注入无菌盛样容器中。冷冻食品采样后、样品应保持冷冻状态（放在冰内、冰箱的冰盒中或低温冰箱内保存），非冷冻食品只需在0-5中保存即可。另外，如样品是袋、瓶、罐装的，应取完整未开封的。5.生产工序监测采样（1） 车间用水自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部位用100mL无菌注射器抽取。（2） 车间台面、用具及加工人员等表面的卫生监测用板孔5cm2的无菌采样板及5支无菌棉签擦拭25 cm2 台面面积。若所采表面干燥，则用无菌稀释湿润棉签后擦拭；若表面有水，则用干棉签擦拭即可，擦拭后立即将棉签头用无菌剪刀剪入无菌盛样容器中。（3） 车间空气采样将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖上平皿送检。6.食品中毒微生物检验的取样当怀疑发生食物中毒时，应及时收集可疑中毒源食品或餐具等，同时收集病人的呕吐物、粪便或血液等。7.人畜共患病原体微生物检验的取样当怀疑某一动物产品可能携带人畜共患病原体时，应结合畜禽传染病学的基础知识，采取病原体最集中、最易检出的组织或体液送检。（三）样品的标签采样后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚样品名、来源、数量、采样地点、采样人、采样时间（年、月、日）等相关内容。.二、送检采样后样品送达食品卫生微生物检验室的时间越短越好，一般不宜超过3h。如因路途遥远等原因无法在3h内到达，应进行适当低温处理，非冷冻样品保持在0-5的环境中，冷冻食品的样品则需保存在泡沫塑料隔热箱中（内放冰块可维持0以下）。送检时，必须认真填写申请单，以供检验人员参考。三、样品处理食品样品种类多样、来源复杂，各类预检样品在进行检验之前，必须根据食品种类的不同性状特征，经过预处理后制备成稀释液才能进行相关各项检验。1.液体样品处理液体样品是指粘度不超过牛乳的非粘性食品的样品。液体样品的处理可将样品充分混合后，直接用无菌吸管准确吸取25mL样品加入225mL蒸馏水或生理盐水及有关检验的增菌液中，制成110稀释液。在开瓶、开罐等打开样品容器时，一定要注意表面消毒，无菌操作。具体方法是用点燃的酒精棉球灼烧瓶口无菌，用石碳酸纱布盖好，再用无菌开瓶器将盖打开。如是含有二氧化碳的液体饮料则需先倒入无菌的小瓶中，覆盖无菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部退出后再进行检验；如是酸性食品则需用100g/L无菌过的碳酸钠调节pH至中性后再进行检验。2.固体或粘性液体食品处理固体食品或粘性液体食品无法使用吸管进行吸取，其处理方法是用无菌容器准确称取待检样品25g，加入至预温45的无菌生理盐水或蒸馏水中，使用振荡器或手动摇荡致其溶化，尽快检验。一般从样品稀释到接种培养最好不超过15min。（1）固体食品处理固体食品的处理相对比较复杂，主要处理方法有以下几种：捣碎均质法：称取 100g或以上的样品剪碎混匀，从中准确称取25g放入内含225mL无菌稀释液的无菌均质杯中，以800010000r/min均质12min。此法对大部分固体样品适用。剪碎振摇法：称取 100g或以上的样品剪碎混匀，从中准确称取25g进一步剪碎，装入内含225mL无菌稀释液及适量直径为5mm左右的玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅不小于40cm。研磨法：称取 100g或以上的样品剪碎混匀，从中准确称取25g放入无菌乳钵中充分研磨后再的稀释瓶中，盖紧后，充分摇匀。整粒振摇法：有完整自然保护膜的颗粒状样品（如蒜瓣、青豆等）可直接称取25g整粒样品放入内含225mL无菌稀释液及适量直径为5mm左右的玻璃珠的稀释瓶中，盖紧后，用力快速振摇50次，振幅不小于40cm。（2）冷冻样品处理冷冻样品在检验前首先要进行解冻，解冻方法有两种：一种是解冻温度控制在0-4之间，时间不超过18h；另一种是温度在45以下，时间不超过15min。样品解冻后，无菌操作方式称取25g，放入225mL无菌稀释液中，制成均匀的110混悬液。（3）粉末状或颗粒状样品处理用无菌勺或其他适用工具将样品搅拌均匀后，无菌操作方式称取待检样品25g，放入225mL无菌的生理盐水中，充分振摇混匀，制成110稀释液。四、检验与报告（一）检验食品卫生微生物检验室接到送检申请单，应立即登记，填写实验序号，并按检验要求，立即将样品放在冰箱或冰盒中，积极准备条件进行检验。按不同的检验项目及时进行检验。按国家标准检验方法规定，食品微生物检验主要检验项目包括菌落总数、大肠菌群和致病菌的检验，其中致病菌的检验包括肠道致病菌检验与致病性球菌检验等。（二）报告按检验项目完成各类检验后，检验人员应及时填写检验报告单，签字后送主管人员核实签字，加盖单位印章，以示生效，后立即送交食品卫生监督人员处理。 检验报告发出后，阴性样品可即时处理；阳性样品要待报告发出3d后（特殊情况可适当延长）方可处理；进口食品的阳性样品，需保存6个月方能处理。第二节 食品卫生微生物检验中常见检样的制备一、肉与肉制品检样的制备健康畜禽的肉、血液及内脏器官组织一般是无菌的。但畜禽的疲劳、饥饿等机体原因会降低个体的抵抗力，造成细菌由肠道侵入血液和组织；在畜禽屠宰加工过程中，会沾染到环境中的各种微生物，而且越一到后面的工序，微生物污染越严重；另外肉类的运输与保藏也会继续受到污染。在空气污浊、环境温度较高的条件下，微生物会迅速繁殖，有时肉表面上的微生物可达亿万个。肉制品虽然大多经过浓盐或高温等处理，肉上不耐浓盐或高温的微生物都会死亡。但形成的芽孢孢子却不受高盐或高温的影响而存活下来，如肉毒杆菌的芽孢体可以在腊肉、火腿、香肠中存活。因此，为保证食品卫生，防止疾病传播，有必要对肉及肉制品进行严格的微生物检验。而微生物检验的第一步就是进行检样制备。（一）检样制备一般所需材料用品：1现场采样用具：采集箱、无菌塑料袋、有盖搪瓷盘；无菌刀、剪子、镊子；无菌具塞广口瓶；无菌棉签；温度计；编号牌（可现场用蜡笔、纸制作）。2.样品处理一般材料用品：无菌刀、剪子、镊子；无菌乳钵；无菌海砂或玻璃砂；酒精灯；无菌水、量筒等（二）生肉及脏器检样的制备一般在屠宰前先进行兽医卫生学检查，这些检查一般是以临床及病理解剖为主。动物患病毒性疾病、外伤但没有化脓的，一般不需作细菌学检查，但如有下列情况则应进行卫生细菌学检查：（1）动物在宰杀两小时后才取出肠子者。（2）放血不充分者。（3）根据基本情况不能断定能否食用者。（4）宰杀前动物有患病状态的如有胃肠疾患、动物瘦弱或体温降低者。（5）疑似患传染病、化脓性疾病、肠道疾病及其他原因而急需屠宰的动物。（6）卫生监督机关或兽医卫生监督机关认为有必要进行细菌学检查时。1.样品的采取（取样）如需进行细菌学检验，生肉及内脏样品的采取，应遵循以下几点要求：（1）屠宰场屠宰后的畜肉，可于开腔后，立即用无菌刀采取两腿内侧肌肉50 g，或者劈半后采取两侧背部最长肌肉各50 g送检。（2）冷藏或销售中的生肉，可用无菌刀采取腿肉或其他部位的肌肉100 g。（3）作病原菌的检测时，应以无菌刀采取脾、全部肾脏，肝门部带淋巴结部位的肝脏。（4）如取胆囊，则应注意勿使胆汁流出。（5）采取肠淋巴结时应将肠系膜一起取出。样品采取后，应立即放入无菌玻璃容器或无菌后的其它容器内，样品中不得加入任何防腐剂，立即送检。最长时间不超过3h。送检时注意冷藏，检样送达化验室应立即检验或放置冰箱暂存。2.检样的处理先将检样进行表面消毒（用沸水烫3-5s或表面灼烧消毒）。再用无菌剪子取检样深层肌肉25g，放入无菌乳钵内用无菌剪子剪碎后，加无菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入无菌水225mL，混匀后即配成110稀释液。（二）禽类检样的制备1取样新鲜或冷冻家禽采取整只，放入无菌容器中；带毛野禽可放在清洁容器中。立即送检。其他处理要求如同上述生肉。2.检样处理先将检样进行表面消毒，用无菌剪子或刀去皮后，剪取肌肉25g（一般可从胸部或腿部剪取）。其他处理要求同生肉。带毛野禽去毛后，同家禽检样相同处理。（三）各类熟肉制品1.取样各类熟肉制品，如酱卤肉、熏烤肉、熟灌肠、腊肉、肉松、肉脯、肉干等，一般采取200g，熟禽采取整只，均需放入无菌容器中，立即送检。其他处理要求如上述生肉。2.检样处理直接切取或称取25g，腊肠、香肠等生灌肠需先进行表面消毒，然后用无菌剪子剪取内容物25g，其他处理如生肉。不同检验目的检样的制备也有所不同，如是要通过检验肉及肉制品的细菌含量来判断其质量鲜度，采用上述方法进行检样制备；如需检验肉及肉制品受外界环境污染程度或需检验其是否带有某种致病菌，则应采用棉拭采样法。（四）棉拭采样法的检样制备一般可用板孔5cm2的金属制作规板压在样品上某一点上，将无菌过的棉拭稍蘸湿，在板孔5cm2的范围内揩抹多次，再将规板板孔移压另一点，用另一棉拭揩抹多次，以此类推，共移压揩抹10次，总面积50cm2，共用10支棉拭。每支棉拭揩抹完毕后立即剪断（或烧断），再分别投入盛有50mL无菌水的三角瓶或大试管中，然后立即送检。检验前必须先充分振摇，然后吸取三角瓶或大试管中的液体，作为原液，再按要求做10倍递增稀释。如果检验目的是检查是否带有致病菌，则可不用规板，在可疑部位用棉拭揩抹即可二、乳与乳制品检样的制备乳是营养价值最丰富的食品之一，也是微生物良好的培养基，是最便于微生物繁殖的食品。乳房表面、挤乳者的手和工具、容器以及饲养的卫生管理条件等，都能引起微生物污染。因此乳及乳制品的微生物检验也是必不可少的。（一）乳及乳制品乳检样的制备所需材料用品采样箱、搅拌棒、勺子、无菌具塞广口瓶、无菌塑料袋、温度计、75%酒精棉球、酒精灯和乙醇、编号用品等。（二）样品的采取1. 散装或大型包装乳品以无菌刀或无菌勺于不同部位取至少200g具代表性的样品，置无菌容器内，鲜乳一般需在4h内送至实验室。取样时应注意以下几点：（1）每件样品取样前刀、勺必须清洗无菌；（2）应注意取样部位、取样量等的代表性；（3）气温较高或路途较远的情况下应进行冷藏；（4）不得使用任何防腐剂。2. 小型包装乳品采取原包装品，直接送检。各种小型包装乳品的取量：生奶、消毒奶、酸奶、炼乳、奶粉1瓶或1包；奶油1块（113g）；奶酪（干酪）一个。3.成批产品按每批产品的千分之一采样，不足千件者抽一件。小包装按最小包装量采样。（三）样品的处理1鲜奶、酸奶以无菌操作方式去掉瓶口的纸罩纸盖，瓶口经火焰无菌后以无菌操作取样25mL,放入盛有225mL无菌生理盐水的三角瓶中，振摇均匀。酸奶若有水分析出于表层，应先去除水分后再做稀释。2炼乳先用温水洗净炼乳包装表面，再用点燃的乙醇棉球将瓶口或铁制包装表面消毒后，用无菌开罐器打开包装，以无菌操作称取10g检样，置一盛有90 mL无菌生理盐水（0.9%氯化钠）的三角瓶内，振摇混匀。3奶油用无菌操作打开奶油包装，取适量检样置无菌三角瓶内，于45水浴或恒温箱中加热，溶化后立即取出，以无菌吸管吸取25 mL加入装有225mL无菌生理盐水或奶油稀释液（瓶装稀释液应预置于45水浴中保温）的三角瓶内，振摇混匀。必要时作系列连续稀释。从检样溶化到接种完毕时间不应超过30min。奶油稀释液的配制：格林氏液（氯化钠9g，氯化钾0.12g，氟化钙0.24g，碳酸氢钠0.2g，蒸馏水1000mL）250mL，琼脂1g加蒸馏水750mL，加热溶解，分装每瓶225mL，再经121灭菌15min。 4奶粉罐装奶粉的开罐取样方法同炼乳，袋装奶粉先用75%酒精进行袋口消毒后，以无菌操作方式打开包装，称取25 g检样置入装有适量玻璃珠的无菌的三角瓶内，将225mL无菌生理盐水缓缓加入，振摇使其充分溶解和混匀。5.奶酪用无菌刀削去部分表面封腊，再点燃酒精棉球消毒表面，然后用无菌刀切开奶酪，无菌操作方式切取表面与深层检样各少许，放入无菌乳钵中切碎，加入少量生理盐水研成糊状。三、蛋与蛋制品检样的制备（一）所需材料用品采样箱、有盖搪瓷盘、无菌具塞广口瓶、无菌塑料袋、电钻与钻头、搅拌棒、金属制双层旋转式套管采样器、铝铲、勺子、玻璃漏斗、温度计、75%酒精棉球、酒精灯和乙醇、编号用品等。（二）样品的采取1鲜蛋采取完整的鲜蛋，先用流水冲洗外壳，再用75%酒精棉球涂擦表面消毒后，放入无菌容器中，加封做好标记后送检。2全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片、巴氏消毒全蛋粉将包装的开口处用75%酒精消毒，然后开盖用无菌采样器（如金属制双层旋转式套管采样器等）斜插入包装底部，使样品填满采样器后提出包装外，再用无菌小勺自上、中、下部采样，置无菌的广瓶中，一般每件样品采200g左右，不得少于100g。标记后送检。3冰全蛋、冰蛋黄、冰蛋白、巴氏消毒冰全蛋先将包装开口处用75%酒精消毒，然后开盖，用无菌电钻由顶部到底部斜角钻入，缓缓钻取，抽出电钻，从中取检样200g左右，装入无菌广口瓶中，标记后送检。4.成批产品全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片、巴氏消毒全蛋粉等产品以一日或一班产量为一批，检验沙门氏菌按每批总量5%抽样，且每批最少不得少于3个检样。如是测定菌落总数或大肠杆菌，每批按装罐过程前、中、后取样3次，每次取样50g，混合为一个检样。冰全蛋、冰蛋黄、冰蛋白、巴氏消毒冰全蛋等产品按每500kg取样一件，如是测定菌落总数或大肠杆菌，每批按装罐过程前、中、后取样3次，每次取样50g，混合为一个检样。（三）检样的处理1鲜蛋（1）蛋壳用无菌生理盐水棉拭擦拭后，将棉拭直接置肉汤培养基内培养。或者将整只鲜蛋放入无菌小烧杯或平皿中，按检样要求加入定量无菌生理盐水或液体培养基，用无菌棉拭将蛋壳表面充分擦洗后，以擦洗液作为检样培养。（2）蛋内容物（蛋清及蛋黄）将蛋壳用洗涤剂刷洗及冲净后，将鸡蛋浸入0.1%升汞水溶液内10分钟后取出，用无菌棉花或纱布擦干，在鸡蛋上置消毒孔巾，再一次用酒精棉球消毒蛋壳，用无菌刀敲破蛋壳后取出蛋白、蛋黄或全蛋液置有玻璃珠的无菌容器内，充分摇匀后待检。2全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片、巴氏消毒全蛋粉将样品放入装有无菌玻璃珠的无菌瓶内，按比例加入无菌生理盐水充分摇匀后待检。3冰全蛋、冰蛋黄、冰蛋白、巴氏消毒冰全蛋将装有冰蛋样品的容器浸泡于流动冷水中，待样品融化后取出，再放入装有无菌玻璃珠的无菌瓶中，充分摇匀后待检。4蛋制品样品沙门氏菌增菌培养方法以无菌操作方式称取样品，接种于亚硒酸盐煌绿或煌绿肉汤等增菌培养基（装于有玻璃珠的无菌瓶内）中，盖紧盖子，充分摇匀，再放入36（1）恒温箱中培养20（2）h。如果是用亚硒酸盐煌绿进行增菌培养，各种蛋与蛋制品的样品接种量都为30g，培养基量为150mL。若是用煌绿肉汤进行增菌培养，不同的蛋与蛋制品接种量、培养基浓度与用量有所不同，见表5-1。表5-1 煌绿肉汤增菌培养时不同单及蛋制品检样接种量、培养基浓度与用量一览表检样种类检样接种量（g）培养基浓度（g.mL-1）培养基用量(mL)全蛋粉6（加24mL无菌水）1.72.510-4120蛋黄粉6（加24mL无菌水）1.72.510-4120蛋白片6（加24mL无菌水）110-6120冰全蛋301.72.510-4150冰蛋黄301.72.510-4150冰蛋白301.7210-5150四、水产品检样的制备（一）检样制备常用材料用品采样箱、有盖搪瓷盘、无菌具塞广口瓶、无菌塑料袋、无菌刀、镊子、无菌棉签、湿度计、编号用品等。（二）样品的采取水产品食品采样时，要按检验目的与水产品种类来确定采样量。一般除大型鱼类与海兽只割取其局部作为样品外，其他水产品大多采取完整个体。在以判断质量鲜度为目的时，鱼类与较大型贝壳类以个体为一件样品，单独采取，并且对成批水产品做质量判断时，须采取多个个体做多件检验以反映全面质量；对于小型鱼类和虾、小蟹等样品只进行混合采样，须采取更多个体，了般采样5001000g；鱼糜制品（如鱼丸、灌肠等）和熟制品一般采样250g，样品采取后放入无菌容器中。（三）样品的处理1鱼类一般采取检样部位为背肌。取鲜鱼310条，流水洗净去鳞，用75%酒精擦净并消毒鱼背，待干后用无菌解剖刀在其背部沿脊椎切开约5cm长的切口，再沿垂直于脊椎的方向切开两端使两块背肌分别向两侧翻开，然后用无菌刀或剪子剪取25g鱼肉，放入无菌乳钵中，用无菌剪子剪碎，加无菌海砂或玻璃砂研磨（也可用均质器），磨碎后加入225mL无菌生理盐水，混匀待检。剪取样品时应注意勿触破及粘上鱼皮；如果是鱼糜制品和熟制品应先在乳体中磨碎后再加生理盐水混匀待检。2虾类一般采取的部位是腹节内的肌肉。用流水将虾冲洗干净，摘去头胸节后，用无菌剪子剪去腹节与头胸节连接处的肌肉，然后将腹节内的肌肉挤入无菌乳钵内，去肠管后取25g，以后处理如同鱼类检样。3蟹类一般采取部位为胸部肌肉。以流水将蟹体冲洗干净，揭开壳盖及腹部，除去鳃条后，再置流水下冲洗干净，以75%酒精棉球擦试前后外壁以消毒，置于无菌搪瓷盘上，待干后用无菌剪刀剪开成为左右两半，将一半蟹体内的肉挤出（用手指从足根向剪开的一端挤压），称取25g置灭菌乳钵内，以后处理如同鱼类检样。4贝壳类一般采取部位为贝壳的内容物。以流水将贝壳刷洗干净，然后放在铺有无菌毛巾的搪瓷盘或工作台上，采样操作者双手用75%酒精棉球消毒后，用无菌钝刀缓缓打开贝壳，再用无菌镊子取出整个内容物，称取25g置无菌乳钵内，以后处理如同鱼类检样。 以上采样及处理方法是以检验水产品肌肉内细菌含量从而判断新鲜度为目的的。如果要检验水产品是否污染某种致病菌时，检验部位应为胃肠消化道及鳃等呼吸器官：鱼类采取肠管和鳃；虾类采取头胸节内的内脏和腹节外沿处的肠管；蟹类采取胃和鳃；贝壳类的螺类采取腹足肌肉以下的部分，双壳类采取覆盖在斧足外层的内脏和鳃。五、饮料、冷冻饮品检样的制备 （一）检样制备常用材料用品采样箱、有盖搪瓷盘、无菌具塞广口瓶、无菌塑料袋、无菌刀、镊子、无菌棉签、湿度计、编号用品等。（二）样品的采取1.碳酸饮料、瓶（桶）装饮用水、果汁（浆）及果汁饮料、含乳饮料、果子露、果汁水等采样时应以原包装为样品单位，小包装以4杯为一件，大包装者，以1桶或1瓶为一件，采取2瓶。散装饮料样品用无菌操作方式采取500mL置于无菌容器中。2.冰淇淋、冰棍等冷冻食品采原包装样品单位2个单位，如为散装则用无菌勺采样200克、食品冰块以500g为一件，采后置于无菌容器内。冰棍如果班次产量在2万支以下，一班为一批；班产量在2万支以上的，以工作台为一批。采样方法是一批取3件，一件取3支。此类样品采取后应放在隔热容器内。以上所有样品采取后，立即送检。最长不超过3h。（三）样品的处理1.瓶（罐）装饮料用点燃的酒精棉球灼烧包装开口处灭菌，再用石炭酸纱布盖好，如果是塑料瓶，瓶口可用75%酒精棉球擦拭灭菌。然后用无菌开瓶器将盖启开。含二氧化碳的饮料可倒入另一无菌容器中，勿盖紧，覆盖一层无菌纱布，轻轻摇荡，使气体全部逸出后待检2.冰棍用无菌镊子除去包装，将冰棍部分放入无菌磨口瓶中，木签留在外面，盖上瓶盖，用力抽出木棒，或用无菌剪子剪去木签，然后置于45的水浴中30min，溶化后检验。3.冰淇淋置于无菌容器内，待其溶化后检验。六、调味品检样的制备调味品包括酱油、酱类和醋等，是以豆类、谷类为原料发酵而成的食品。（一）样品的采取1.酱油与食醋具包装者采取原包装，散装的样品用无菌吸管采取适量。2.酱类用无菌勺子采取适量，放入无菌磨口瓶中。（二）样品的处理1.瓶装样品用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，再用石炭酸纱布盖好，然后用无菌开瓶器启开检验。2.酱类用无菌操作方式称取25g，放入无菌容器中，加入蒸馏水225mL，制成混悬液待检。3.食醋用200300g/L的无菌碳酸钠溶液调节pH至中性。七、冷食菜、豆制品检样的制备冷食菜多为蔬菜和熟肉制品不经加热而直接食用的凉拌菜；豆制品是以大豆为原料制成的含大量蛋白质的食品。这两类食品加工后，在盛装、运输及销售过程中易受到微生物的污染，如不加强卫生管理，极易造成食物中毒及肠道疾病的传播。（一)样品的采取1. 冷食菜将样品混匀后，采取200g放入无菌容器中。2.豆制品采取接触盛装容器边缘、底部、及上部等不同部位的样品共200g，放入无菌容器中。（二）样品的处理以无菌操作方式称取检样25g，放入装有225mL蒸馏水中，制成混悬液待检。八、糖果、糕点和蜜饯检样的制备糖果、糕点和蜜饯等食品大多是由糖、牛奶、鸡蛋、水果等原料制成甜食。营养丰富，易于细菌繁殖。造成食品变质。对于这类食品进行微生物检验也是很有必要的。其检样制备方法如下。（一）样品的采取糖果采取原包装样品。 糕点和蜜饯用无菌镊子夹取不同部位样品，放入无菌容器中。（二）样品的处理1.糖果 用无菌镊子夹取包装纸，称取样品25g，放入已预温至45的225mL无菌生理盐水中，制成110稀释液，待溶化后即可检验。2.糕点如有包装，用无菌镊子夹取下包装纸，采取外层及中心部位；如为带馅糕点，用无菌操作称取糕点外皮及内馅25g，如为奶花糕点，采取奶花与糕点部分共25g（两者比例11），采后置于无菌乳钵内，先加入25 mL无菌生理盐水研磨成乳液，然后加入200mL灭菌生理盐水混匀制成110的稀释液。3.蜜饯 无菌操作方式采取不同部位共25g，置于无菌乳钵内，先加入25 mL无菌生理盐水研磨成乳液，然后加入200mL灭菌生理盐水混匀制成110的稀释液。九、酒类检样的制备酒类因含酒精，一般不进行微生物学检验，需检验的主要是酒精度低的发酵酒，特别是散装生啤酒，因不加热常生存大量细菌。酒类的检样制备方法如下。（一）样品的采取若是瓶装酒类采取原包装样品2瓶；若是散装的酒类则用无菌容器采取500mL，放入无菌磨口瓶中。（二）样品的处理1.瓶装酒类用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，然后用无菌石炭酸纱布盖好，再用无菌开瓶器启开盖子；含二氧化碳的酒类可倒入一无菌容器中，口勿盖紧，覆盖一无菌纱布，轻轻摇荡，待气体完全逸出后即可检验。2.散装酒类可直接吸取进行检验。十、方便面检样的制备方便面类食品以小麦粉、荞麦粉、绿豆粉、米粉等为主要原料，添加食盐或面质改良剂，加适量水调制、压延、成型、汽蒸后，经油炸或干燥处理，达到一定熟度的粮食制品。在加工、存放、销售过程中常会污染细菌，造成变质。其检样制备如下。（一）样品的采取袋装或碗装方便面类采取3袋（碗）；简易包装的采取200g.（二）样品的处理如果样品未配调味包，用无菌操作开封取样，称取25g样品，加入225mL无菌生理盐水制成110的稀释液；如为配有调味料的方便面类则需将面块与全部调料及配料一起称取25g，按11加入无菌生理盐水，制成检样匀质液，然后再称取10mL匀质液加入90mL无菌生理盐水中制成110的稀释液，待检。十一、罐藏食品检样的制备与检验罐藏食品是将食品原料经过预处理后装入容器，经杀菌、密封后制成的，通常称为罐头。罐藏食品是处于商业无菌状态。商业无菌指的是罐藏食品经过适度的热杀菌后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物的状态。并不是完全灭菌（完全不存在活菌）。因为完全灭菌，当温度达121以上时，会加速罐头的香味消散、色泽和坚实度的改变以及营养成分的损失。所以采用商业无菌的方法。其检验方法如下。（一） 审查生产操作记录工厂检验部门对送检产品的下述操作记录应认真进行审阅，并妥善保存至少3年备查。1. 杀菌记录杀菌记录包括自动记录仪和相应的手记记录，记录纸上要标明产品品名、规格、生产日期和杀菌锅号。每一项图表记录都应由杀菌操作者亲自记录和签名，由车间专人审核签字，最后由工厂检验部门审定后签字。2. 杀菌后的冷却水有效氯含量测定的记录3. 罐头密封性检验记录罐头密封性的全部记录应包括空罐与实罐卷边封口质量和焊缝质量的常规检查记录，记录上应明确标记批号与罐数等，并由检验人员和主管人员签字。（二） 抽样方法可采用下列抽样方法之一。1. 按杀菌锅抽样低酸性食品罐头在杀菌冷却完毕后每个杀菌锅抽样2罐，3kg以上的大罐每锅抽一罐，酸性食品罐头每锅抽1罐。一般一个班的产品组成一个检验批，将各锅的样罐组成一个检验批送检，每批每个品种取样基数不得少于3罐。产品应按锅划分堆放，这样在遇到由于杀菌操作不当引起问题时，也可按锅处理。2. 按生产班（批）次抽样（1）取样数为1/6000，尾数超过2000者增取1罐，每班（批）每个品种不得少于3罐。（2）某些产品班产量较大时，则以30000罐为基数，30000罐以内其取样数按1/6000；超过30000罐则按1/20000取样，尾数超过4000者增取1罐.（3）个别产品产量过小，同品种、同规格可合并班次为一批进行取样，但并班总数不超过5000罐，每个班次取样不得少于3罐。（三）称量用电子秤或天平称量，1kg及以下的罐头精确到1g，1kg以上的罐头精确到2g。各罐头的质量减去空罐的平均质量即为该罐头的净重。称量前对样品进行记录编号。（四）保温将全部样罐下述分类在规定温度下按规定时间进行保温（表5-2）。保温过程中应每天检查，如有胖听或泄漏等现象，立即剔出做开罐检查。表5-2 样罐保温温度及时间罐头种类温度/时间/天低酸性罐头食品36110酸性罐头食品30110预定要送往热带地区（40以上）的低酸性罐头食品55157（五）开罐（1）取保温过的全部罐头，冷却到常温后，按无菌操作方式开罐检验；（2）将样罐用温水和洗涤剂洗刷干净，用自来水冲洗后擦干。放入无菌室，以紫外光杀菌灯照射30min。（3）将样罐移置于超净工作台上，用75%酒精棉球擦拭无代号端，并点燃灭菌（胖听罐不能烧）。用无菌卫生开罐刀或罐头打孔器开启（带汤汁的罐头开罐前要适当振摇），开罐时不能伤及卷边结构。（六）留样开罐后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物1020mL（g），移入无菌容器中，保存于冰箱内。待该批罐头检验得出结论后方可弃去。（七）pH测定取样测定pH值，与同批中正常罐进行比较，看是否有显著差异。（八）感官检查在光线充足、空气清洁无异味的检验室中将罐头内容物倾入白色搪瓷盘内，由有经验的检验人员对产品的外观、色泽、状态和气味等进行观察和嗅闻，用餐具按压食品或戴薄指套以手指进行触感，鉴别食品变质的迹象。（九）涂片染色镜检1.涂片对感官或pH检查结果认为可疑的，以及腐败时pH反应不灵敏的（如肉、禽、鱼类等）罐头食品样品，均应进行涂片染色镜检。带汤汁的罐头样品可用接种环挑取汤汁涂于载玻片上。固态食品可以直接涂片或用少量灭菌生理盐水稀释后涂片。待干后用火焰固定。油脂性食品涂片自然干燥并火焰固定后，用二甲苯流洗，自然干燥。2.染色镜检用革兰染色法染色、镜检，至少观察5个视野，记录细菌的染色反应、形态特征及每个视野的菌数。与同批的正常样品进行对比，判断是否有明显的微生物增殖现象。（十）接种培养保温期间出现的胖听、泄漏或开罐检查发现pH、感官质量异常、腐败变质，进一步镜检发现有异常数量细菌的样罐。均应及时进行微生物接种培养。对需要接种培养的样罐（或留罐）用灭菌的适当工具移出约1mL（g）内容物，分别接种培养。接种培养约为培养基的1/10.要求在55温箱培养。在接种前培养基管应在55水浴中预热至该温度，接种后立即放入55温箱培养。1.低酸性罐头食品低酸性罐头食品（每罐）接种培养基、管数入培养条件见表5-3。表5-3 低酸性罐头食品的检验培养基管数培养条件/时间/天疱肉培养2361（厌氧）96120疱肉培养2551（厌氧）2472溴甲酚紫-葡萄糖肉汤（带倒管）2361（需氧）96120溴甲酚紫-葡萄糖肉汤（带倒管）2551（需氧）2472注：此表引自中华人民共和国国家标准GB/T4789.26-2003罐头食品商业无菌的检验2.酸性罐头食品酸性罐头食品（每罐）接种培养基、管数入培养条件见表5-4。表5-4 酸性罐头食品的检验培养基管数培养条件/时间/天酸性肉汤2551（需氧）48酸性肉汤2301（需氧）96麦芽浸膏汤2301（需氧）96注：此表引自中华人民共和国国家标准GB/T4789.26-2003罐头食品商业无菌的检验（十一）微生物培养检验程序及判定 1.检验程序将按表5-3或表5-4接种的培养基分别放入规定温度的恒温箱进行培养，每天观察培养生长情况，低酸性罐头食品培养检验程序如图5-1。2.判定（1）对在36培养有菌生长的溴甲酚紫-葡萄糖肉汤管，观察产酸产气情况，并涂片染色镜检。如果是含杆菌的混合培养物或球菌、酵母菌或霉菌的纯培养物，不再往下检验。如仅有芽孢杆菌则判为嗜温性需氧芽孢杆菌。如仅有杆菌无芽孢则为嗜温性需氧杆菌。如需进一步证实是否是芽孢杆菌，可转接于锰盐营养琼脂平板在36培养后再作判定。2.对于在55培养有菌生长的溴甲酚紫-葡萄糖肉汤管，观察产酸产气情况，并涂片染色镜检。如有芽孢杆菌，则判为嗜热性需氧芽孢杆菌。如仅有杆菌无芽孢则为嗜热性需氧杆菌。如需进一步证实是否是芽孢杆菌，可转接于锰盐营养琼脂平板在55培养后再作判定。3.对于在36培养有菌生长的疱肉培养管，涂片染色观察。如为不含杆菌的混合菌相，不再往下进行。如有杆菌，带或不带芽孢，都要转接于两个血琼脂平板（或卵黄琼脂平板），在36分别进行需氧和厌氧培养。在需氧平板上有芽孢生长，则为嗜温性兼性厌氧芽孢杆菌。在厌氧平板上生长为一般芽孢则为嗜温性厌氧芽孢杆菌。如有梭状芽孢杆菌，应用疱肉培养基原培养液进行肉毒梭菌及肉毒毒素检验（按GB/T4789.12）。4.对于在55培养有菌生长的疱肉培养管，涂片染色镜检。如有芽孢，则有嗜热性厌氧芽孢杆菌或硫化腐败性芽孢杆菌。如无芽孢仅有杆菌，转接于锰盐营养琼脂平板，在55厌氧培养，如有芽孢则为嗜热性厌氧芽孢杆菌，如无芽孢则为嗜热性厌氧杆菌。同样，若是酸性罐头食品，则对有微生物生长的酸性肉汤和麦芽膏汤管进行观察，并涂片染色镜检，按所发现的微生物类型进行判定。（十二）罐头密封性检验对确定有微生物繁殖的样罐均应进行密封性检验以判定该罐是否泄漏。将已洗净的空罐，经35烘干，根据单位的设备条件进行减压或加压试漏。1.减压试漏往烘干的空罐内小心地注入清水至八九分满，将一带橡胶圈的有机玻璃板妥当安放罐头开启端的卷边上，使能保持密封。启动真空泵，关闭放气阀，用手按住盖板，控制抽气，使真空表从0Pa升至6.8104Pa（510mmHg）的时间在1min以上，并保持此真空度1min发上，倾侧空罐，仔细观察罐内底盖卷边及焊缝处有无气泡产生，凡有同一部位连续产生气泡的，就判断为泄漏。记录漏气的时间和真空度，并在漏气部位做上记号。2.加压试漏用橡皮塞将空罐的开孔塞紧，开动空气压缩机，慢慢开启阀门，使罐内压力逐渐加大，同时将空罐浸没在盛水玻璃缸中，仔细观察罐外底盖卷边及焊缝处有无气泡产生，直至压力升到0.7kgf/cm2（1kgf/cm2=98.0665kPa）并保持2min，凡有同一部位连续产生气泡的，应判断为泄漏。记录漏气的时间和真空度，并在漏气部位做上记号。（十三）结果判定 1.商业无菌的判定该批（锅）罐头食品经审查生产操作记录属于正常；抽取样品经保温试验未胖听或泄漏；保温后开罐，经感官检查、pH测定、涂片镜检和接种培养，确证无微生物增殖现象，则为商业无菌。2.商业有菌的判定该批（锅）罐头食品经审查生产操作记录，未发现问题国抽取样品经保温试验有1罐或1罐以上发生胖听或泄漏；或保温后开罐，经感官检查、pH测定、涂片镜检和接种培养，确证有微生物增殖现象，则为非商业无菌。附：罐头食品商业无菌检验专用培养基1.溴甲酚紫-葡萄糖肉汤 （1）成分蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，葡萄糖10g，氯化钠5g，溴甲酚紫0.04g（或1.6%酒精溶液2mL），蒸馏水1000mL。 （2）制法将上述成分（溴甲酚紫除外）加热搅拌溶解，调pH至6.87.2，加入溴甲酚紫，分装于带有小倒管的中号试管中，每管1mL0，121灭菌15min。2.酸性肉汤 （1）成分多价蛋白胨5g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾4g.蒸馏水1000mL。（2）制法将上述各成分加热搅拌溶解，调pH至4.85.2，121灭菌15min，切忌过分加热。3.麦芽浸膏汤 （1）成分麦芽浸膏15g，蒸馏水1000mL（2）制法将麦芽浸膏在蒸馏水充分溶解，滤纸过滤，调pH至4.54.9，分装，121灭菌15min。4.锰盐营养琼脂按GB/T4789.28-2003配制营养琼脂，每1000mL加入硫酸锰水溶液1mL（100mL蒸馏水溶解3.08g硫酸锰）。观察芽孢形成情况，最长不超过10d。第三节 菌落总数的检验技术菌落总数是指食品经过处理并在一定条件下培养后，所得1mL（g）检样所含细菌菌落的总数。菌落总数主要是用于判断食品被污染程度的标志，此外可用这种方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便为检样进行卫生学评价时提供依据。每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的培养条件（培养温度、培养时间 、pH、需氧性质等）来培养不同的细菌，因此菌落总数的检验有标准平板培养计数法、嗜冷菌计数、嗜热菌（芽孢）计数、厌氧菌计数、革兰阴性菌计数等方法。在实际工作中，细菌总数测定常用一种方法去做，就是国际标准规定的平板计数法。一、 菌落总数的标准平板培养计数法（一） 原理平板菌落计数法，是根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理设计的。取一定容量的菌悬液，作一系列的倍比稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，可算出培养物中的活菌数。此法灵敏度高，是一种检测污染活菌数的方法，也是目前国际上许多国家所采用的方法。使用该法应注意：一般选取菌落数在30300之间的平板进行计数，过多或过少均不准确；为了防止菌落蔓延，影响计数，可在培养基中加入0001的2，3，5一氯化三苯基四氮唑(TTC)；本法限用能形成菌落的微生物。所得结果只包含一群能在营养琼脂上生长的嗜中温需氧菌的菌落总数，并不表示样品中实际存在的所有细菌菌落总数。这种方法广泛应用于水、牛奶、食物、药品等各种材料的细菌检验，是最常用的活菌计数法。（二） 培养基和试剂1. 培养基成分：蛋白胨10g，琼脂15-20g，牛肉膏3g，蒸馏水1000mL，氯化钠5g，pH7.2-7.4。制法：将除琼脂外的其他成分溶于蒸馏水中，用15%的NaOH调节pH，使之控制在7.2-7.4之间。再加入琼脂，加热使之溶解，再于121高压灭菌15min。2. 无菌生理盐水成分：氯化钠0.9 g，蒸馏水100mL。制法：根据需要按比例进行配制。一个检样一般需250mL。称取2.2g氯化钠加入250蒸馏水溶解后，取2支大试管，每支装9 mL的生理盐水，再量取225 mL生理盐水装入500 mL的含适量玻璃珠的广口瓶或三角瓶中；剩余的装入另一支试管中，全部包扎后于121高压灭菌15min。其他试剂还有75%乙醇、磷酸盐缓冲稀释液等。（三）仪器设备恒温培养箱：（361）；冰箱；恒温水浴箱：（461）；托盘天平、均质器；1 mL无菌吸管（具0.01mL 刻度）；10mL 无菌吸管（具o.lmL 刻度）或微量移液器及吸头；容量250 mL 、500 mL的无菌锥形瓶；无菌培养皿（直径90 mm）；pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸； 无菌刀、剪子、镊子；酒精灯；放大镜或（和）菌落计数器或PetrifilmTM1）自动判读仪。（四） 检验程序 菌落总数的标准平板培养计数法检验程序见图5-1（五） 操作步骤1.培养基的制备 根据检测样品量的大小，计算所需营养琼脂培养其和生理盐水的用量，然后按（二）中所述方法配制好备用。2. 样品稀释、分装与培养（1）以无菌操作取有代表性的样品盛于无菌容器内。如有包装，则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。以无菌操作取25g样品，放入装有225mL无菌生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min检样做几个适当倍数稀释度选择2-3个适宜稀释度，各取1mL加入无菌平皿内每皿加入适量琼脂培养361，482h菌落计数报 告图5-1 菌落总数的检验程序均质1-2min，制成1：10的样品稀释液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。（2） 用1mL无菌吸管准确吸取1：10的样品稀释液1mL，放入装有9mL无菌生理盐水的试管中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品稀释液。振摇时，幅度为30cm，7s内振摇25次。注意吸管尖不要碰着瓶口及管内稀释液。吸入的液体应先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端离开液面并贴在容器内壁将液体调至所要求的刻度。（3）另取一支1mL无菌吸管，按（2）的操作程序，做10倍递增样品稀释液（图5-2）。每递增1次，换用1支无菌1mL无菌吸管。10-110-810-710-310-210-610-510-4图5-2 样品10倍递增稀释示意图（4）根据食品卫生标准要求，或对检样污染情况的估计，选择23个适宜的样品稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，以吸取该样品稀释液的吸管移1mL样品稀释液到作了适宜标志的无菌平皿中，每个稀释度做两平皿。（5）样品稀释液移入平皿后，分别加12-15mL的营养琼脂培养基（约45左右）到平皿内。立即转动平皿使样品稀释液和琼脂培养基充分混合。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释剂的另一无菌平皿作空白对照。将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。（6） 培养待琼脂凝固后将平皿翻转，立即放进361的恒温培养箱培养482h。培养箱应保持一定的湿度，经48h培养的琼脂培养基的失重不得超过15%。（六）菌落总数的计数方法培养后，立即计数每个平板上的菌落数。如不能立即计数，应将平板存放于0-4，但不得超过24h。操作者对同一平板复核自己的计数结果，其差异应在5%之内，而其他人对这一平板重复计数，其差异应在10%这内。否则，应找出原因，加以校正。适宜稀释度的两个平板的菌落数平均值或两个稀释度的平板菌落数平均值乘以相应稀释度倍数计算出每克（毫升）样品中平板菌落数。1平皿菌落数的选择选取菌落数在30300的平皿作为菌落总数测定标准。做平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时可用放大镜检查，以防遗漏。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，如其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，以无片状菌落生长的平皿计算该稀释度的菌落数；若片状