（微生物学专业论文）产金黄色葡萄球菌肠毒素a工程菌构建及其发酵条件研究.pdf

i t l l l l l l l l l l l l l l lii l l l l l l l l l u l lu l l l l l l l l m y 18 0 5 2 0 9 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间年月 日 是否保密否 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：丁龟时间：巾年6 月 d 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方武在不同媒体上发表传播学 位论文的全部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有 限公司将本人学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并进行信息服务( 包括 但不限于汇编复制、发行、信息网络传播等) 同时本人保留在其他媒体发表论文 的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密商业秘密或申请专利等潜在铸要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 张j 乳 名：砀矾 签名日期： ：f o 年6 周) 日 签名日期：占b 【d 年f 多月c ) d 日 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 目录 摘要手1 a b s t r a c t 3 缩略语表5 第一章文献综述7 1 金葡菌及其肠毒素的检测方法的研究进展7 1 1 金葡菌检测的研究进展7 1 1 1 分子生物学方法8 1 2 金葡菌肠毒素检测的研究进展9 1 2 1 生物学检测。9 1 2 3 标记免疫分析法l o 1 2 4 生物传感器技术1 1 1 2 5 超抗原技术12 2 基因工程与发酵工程进展1 2 2 1 基因工程12 2 2 发酵工程13 3 生物优化方法在发酵过程中的应用1 3 3 1 非统计优化技术13 3 2 统计优化技术一1 4 3 2 1p l a c k e t b u r m a n 设计法14 3 2 2 部分因子设计法1 4 3 2 3 中心组合设计法15 3 2 4b o x b e h n k e n 设计法。15 4 本课题研究目的和意义1 5 第二章s e a 基因工程菌的构建与蛋白的表达纯化1 7 l 引言17 2 材料与方法1 7 2 1 材料17 2 1 1 菌株和质粒1 7 2 1 2 主要试剂1 7 2 1 3 主要仪器与设备18 2 2 实验方法18 2 2 1 金葡菌基因组d n a 的提取1 8 2 2 2s e a 基因引物设计与p c r 扩增1 9 产金黄色葡萄球菌肠毒素a 工程菌构建及其发酵条件研究 2 2 3 目的基因的亚克隆1 9 2 2 4 重组s e a 表达质粒的构建与鉴定2 0 2 2 5s e a 融合蛋白的表达和破碎2 0 2 2 6n i 亲和层析柱纯化r s e a 2 1 2 2 7s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳2 2 2 2 8 透析除盐2 3 3 结果与分析2 4 3 1s e a 基因的扩增2 4 3 2 重组表达质粒的构建及酶切验证2 4 3 3 测序结果2 5 3 4r s e a 的诱导表达2 5 3 5r s e a 的亲和层析纯化2 6 z i 讨论：1 6 第三章产金葡菌肠毒素a 工程菌的发酵条件研究2 8 1 引言2 8 2 材料与方法2 8 2 1 材料2 8 2 1 1 菌株和抗血清2 8 2 1 2 主要试剂2 9 2 1 3 主要仪器与设备2 9 2 2 实验方法2 9 2 2 1 培养条件2 9 2 2 2 间接竞争e l i s a 检测r s e a 方法的建立3 0 2 2 3 乳糖诱导最佳浓度的确定3 2 3 结果与分析- 3 2 3 1 间接非竞争e l i s a 法测定抗血清的效价3 2 3 2 抗s e a 抗血清的间接竞争e l i s a 灵敏度分析3 3 3 2 1 包被抗原和抗血清最佳工作浓度的选择3 3 3 2 2 间接竞争e l i s a 方法标准曲线的建立3 3 3 3 接种量的影响3 4 3 4p h 对目的蛋白产量的影响3 5 3 5 温度对目的蛋白产量的影响3 5 3 6 诱导时机影响3 6 3 7 诱导后培养时间对表达的影响3 7 3 8 乳糖诱导3 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 4 讨论3 9 第四章产金葡菌肠毒素a 工程菌的发酵培养基优化4 1 l 引言4 l 2 材料和方法4 1 2 1 实验材料4 1 2 1 1 菌种4 1 2 1 2 培养基4 2 2 1 3 主要仪器与设备4 2 2 2 实验方法4 2 2 2 1 培养条件4 2 2 2 2 间接竞争e l i s a 检测r s e a 方法4 2 2 2 3 培养基优化4 2 3 结果与分析一4 3 3 1p l a c k e r b u r m a n 设计法4 3 3 2 最陡爬坡试验设计法4 4 3 3b o x b e h n k e 试验设计筛选重要因素的最优水平4 5 3 4 响应面分析及最佳培养基成分确定4 7 第五章结论与展望4 9 1 结论4 9 1 1s e a 基因工程茵的构建与蛋白的表达纯化4 9 1 2 产金葡菌肠毒素a 工程茵的发酵条件研究4 9 1 3 产金葡菌肠毒素a 工程菌的发酵培养基优化4 9 2 展望5 0 2 1 对包涵体变性复性条件进行优化一5 0 2 2 对纯化后的r s e a 进行结构、功能分析及生物活性鉴定5 0 2 3 金葡菌多联融合毒素工程菌的构建5 0 参考文献5 1 至l 【谢6 1 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 摘要 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u p e u s ) 是引起食物中毒和医院化脓性感染的 一种重要致病菌。其致病力的大小主要取决于其所产肠毒素( s t a p h y l o c o c c a l e n t e r o t o x i n s ，s e s ) 的能力。s e s 是一组结构相关、毒力相近、抗原性不同、分子量 为2 4 3 2k d a 的单链，且具有超抗原活性的胞外蛋白，包括肠毒素a 、肠毒素b 、 肠毒素c 等近二十种血清型。其中，以a 型肠毒素( s e a ) 引起食物中毒的发生率 最高。 本研究首先构建了s e a 基因重组表达菌株( ec o l ib l 2 8 r s e a ) ，然后对其培养 与表达条件进行了优化，为后续大量制备s e a 标准品奠定了基础。主要研究结果如 下。 l 重组s e a 工程菌的构建与蛋白的表达、纯化 从野生型金葡菌a t c c1 3 5 6 5 中克隆s e a 基因插入含有h i s 标签的原核表达载 体p e t 2 8 a ( + ) 并转化大肠杆菌，成功构建能高效表达重组s e a 蛋白( r e c o m b i n a n t s t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i na ，r s e a ) 的工程茵ec o l ib l 2 8 r s e a 。采用n i n t ah i s b i n dr e s i n 的亲和层析方法对r s e a 进行分离纯化，s d s p a g e 电泳表明b l 2 8 r s e a 产生的r s e a 为2 8k d a 的融合蛋白，与相关文献报道一致。 2 重组s e a 工程菌的发酵条件研究 采用间接竞争酶联免疫吸附法( i n d i r e c tc o m p e t i t i v ee n z y m e 1 i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y , i c e l i s a ) 对r s e a 产量进行定量。研究了接种量、p h 、温度、 诱导时机、诱导时间、乳糖诱导浓度等对工程菌b l 2 8 r s e a 产r s e a 的影响。结果 表明，ec o l ib l 2 8 r s e a 在接种量2 、p h7 0 、温度为3 7 、对数生长期( o d 6 0 0 约为o 6 ) ，添加终浓度为0 6m m o u l 的乳糖诱导7h ，能获得1 0 6m e ；l 的r s e a 。 3r s e a 工程菌的发酵培养基优化 首先，采用p l a c k e t t b u r m a n 设计对产r s e a 的工程菌ec o l ib l 2 8 r s e a 培养基 主要成份葡萄糖、蛋白胨、甘油等进行评价，然后用最陡爬坡试验对培养基成份的 最适区域进行评估，最后采用b o x b e h n k e n 设计和响应面分析对被测因子的最佳浓 度进行优化。结果表明，e c o l ib l 2 8 r s e a 产r s e a 的最佳培养基成份为( g l ) ：葡 萄糖2 o o ，蛋白胨2 3 0 0 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 02 1 0 0 ，n a i l 2 p 0 4 2 h 2 04 0 0 ，酵母浸膏2 6 0 产金黄色葡萄球菌肠毒素a 工程菌构建及其发酵条件研究 在此条件下，诱导表达r s e a 的产量可达3 3 1 7m g l ，是未优化前 8 4 倍，是野生型金葡菌s e a 产量的近9 倍。 黄色葡萄球菌肠毒素a ；响应面方法：条件优化；间接竞争酶联免 2 o fs l n g l es t r a n dw i t hs i m i l a l ys 仃u c n 鹏a n dv i r u l e n c e t h e yh a v ed i f f e r e n t a n t i g e n i c i t 、，a n d t h e i rt o o l e c u l a rm a s sa leb e t w e e n2 4 - 3 2k d a a m o n g t h e m ，s t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i na ( s e a ) i st h em o s tf r e q u e n ts e si m p l i c a t e di ns t a p h y l o c o c c a lf o o dp o i s o n i n g i nt h i sp a p e r , t h r o u g hg e n e t i ce n g i n e e r i n g t e c h n i q u e ，w ec o n s 仃1 j c t e dr e c o m b i n a n t e s c h e r i c h i ac o l i a 互c o l i ) s t r a i ne x p r e s s i n gs e a t h e nf e n n e n t a t i o nc o n d i t i o n s a n d m e d i u mo fr e c o m b i n a n tec o l is t r a i nw e r eo p t i m i z e d t h er e s u l t s l a yaf o u n d a t i o nw i t h l a r g e 。s c a l eb a t c hf e r m e n t a t i o nf o rp r o d u c t i o no fr s e af r o mt h i ss t r a i n a n dm a i nr e s u i t s w e r ea sf o l l o w e d 1c o n s t r u c t i o no fr e c o m b i n a n te c o l is t r a i ne x p r e s s i n gs e a a n dp u r i f i c a t i o no f r s e a s e ag e n ew a sc l o n e df r o mw i l ds t a p h y l o c o c c a la u r e u $ s t r a i n ( a t c c13 5 6 5 ) h a t o 也ep r o k a r y o t i ce x p r e s s e dv e c t o rp e t 2 8 a ( + ) p o s s e s s i n gh i s t i d i n g 砌g t h e nr e c o m b i n 锄 、e c t o rt r a n s l a t i o ni n t oe c o bb l 2 1 ( d e 3 ) t h es t r a i nw e r en a m e de c o l ib l 2 8 s e a w h l c nc a ne x p r e s sr s e a r s e aw a s p u r i f i e db yn i n t ah i sb i n dr e s i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yp u r i f i c a t i o nc o l u m na n ds d s - p a g es h o w e di t sm o l e c u l a rm a s sw 硒 a b o u t2 8k d a 2o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n si nr e c o m b i n a n te c o l is t r a i ne x p r e s s i n g r s e a a ni n d i r e c tc o m p e t i t i v ee n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a yu s e df o rq u a n t i t a t i v e a n a l y s i so fr s e ap r o d u c t i o nw a se s t a b l i s h e di n i t i a l l y t h ef e a s i b i l i t yo fe x p r e s s i o no f s t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i na i nec o bb l 2 8 r - s e ai n d u c e db yl a c t o s ew a s i n v e s t i g a t e d t h ei n f l u e n c e so fc u l t u r ec o n d i t i o n s ，i n c l u d i n gi n o c u l a t i o n ，p h ，t h ep o i n to f i n d u c t i o n ， d u r a t i o no fi n d u c t i o np h a s ea n dl a c t o s ec o n c e n t r a t i o nw e n a n a l y z e d r e s u l t ss h o w e dt h a t o p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gr s e aw e r ef o l l o w e da s ，2 i n o c u i a t i o n p h7 o ，3 7 ca n d0 6m m o l l ( r i t u a lc o n c e n t r a t i o n ) l a c t o s eb e i n ga d d e da tm i d p h a s eo f c e l lg r o w t h ( o d 6 0 0 2 0 6 ) r s e a y i e l di n d u c e db yl a c t o s ef o r7hw a sa b o u t10 6m g l 3o p t i m i z a t i o no fm e d i u mi nr e c o m b i n a n te e o l is t r a i ne x p r e s s i n gr s e a e f t e c t so fm e d i u mc o m p o n e n t ss u c ha sf o r p r o d u c i n gr s e aw e r ee v a l u a t e db v 3 4 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 缩略语表 5 产金黄色葡萄球菌肠毒素a 工程菌构建及其发酵条件研究 6 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 第一章文献综述 金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，简称金葡菌) 是引起食品污染和细菌 性食物中毒的一种重要细菌，广泛存在于空气、水以及人畜排泄物中( b a l a b a n & r a s o o l y , 2 0 0 9 ) 。在近年来对食源性疾病的分析中，约有2 0 2 5 的食源性疾病是由 金黄色葡萄球菌肠毒素( s t a p h y l o c o c c a le n t e r o t o x i n s ，s e s ) 所引起。其中，由美国疾 病控制中心统计，金葡菌引起的食物中毒占居第二位，占整个细菌性食物中毒的 3 3 ，加拿大更高，达4 5 。中国每年发生此类中毒事件也非常多( a b ee ta 1 ，2 0 0 0 ； l o i re ta 1 ，2 0 0 3 ) 。金葡菌的致病力主要取决于其产s e s 的能力，该菌能产生数种引 起急性胃肠炎的s e s 。s e s 是一组结构相关、毒力相近、抗原性不同、分子量为2 4 3 2 k o a 具有超抗原活性的胞外单链蛋白，有近二十多种血清型( b a l a b a n r a s o o l y , 2 0 0 9 ) 。该茵对营养要求不高，耐盐，在大多数种类的食品中均可存活，一遇适宜条 件就会大量繁殖并产生s e s ，引起食物中毒。据估计，进食者吃下约1 0 0n g 的s e s 即可出现食物中毒症状( j o r g e n s e n ，2 0 0 5 ) 。在我国的食品卫生国家标准中，对多数 食品及食品原料，如肉、乳、蛋制品、糖果等，均要求进行金葡菌及其肠毒素的检 测。 1 金葡菌及其肠毒素的检测方法的研究进展 1 1 金葡菌检测的研究进展 传统的金葡茵检测方法，主要是采用细菌分离和生化鉴定。首先将金葡菌转接 到不同的琼脂平板上培养一段时间，然后再观察结果，并参照葡萄球菌生化鉴别表。 在b a i r dp a r k e r 培养基中，亚碲酸盐会被还原成碲而形成圆形光滑的灰黑色茵落。而 在血琼脂平板上，会因溶血素的生成而形成圆形、光滑且周围有溶血圈的黄色或黄 白色菌落。另外，其它用于鉴别金葡菌的生化试验还有热稳定性核酸酶、葡萄糖及 甘露醇发酵，对溶葡萄球菌酶的敏感性试验等。目前国内外已有许多商品化的快速 鉴别培养基、小型的生理生化鉴别系统等。其中，鉴别培养基主要是利用葡萄球菌 的部分生化特性，来用于食品的快速检测。其特点是简便、快速，适用于大量食物 样品的快速检测，但准确度不高，通常只作为推测性实验。而小型的生理生化简便 7 杂交试验。其原理是将待检测的d n a 样品固定在固相支持物上，与放射性标记的 核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相d n a 的位置上将会显示出杂交信 号。早先，r a n e l l i 等( 1 9 8 5 ) 曾采用了核酸分子杂交法检测了s e b 基因的存在。访 方法的特点是可以判断被检测的d n a 样品中是否有与探针同源的片段以及该片段 的长度，准确性较好。 1 1 1 2 聚合酶链反应技术 聚合酶链反应技术( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 的基本工作原理是以待检 测的d n a 样品为模板，采用通用上游引物和特异性下游引物并在d n a 聚合酶的作 用下，以4 种d n t p 为底物，按半保留复制的机制沿模板链延伸，从而扩增出相应 的目的基因片段。o m o e 等( 2 0 0 2 ) 从食物中毒的呕吐物及污染的牛奶中提取金葡 菌样本，利用多重p c r 进行肠毒素基因分布试验，分离出了不止一种肠毒素基因。 l e t e r t r e 等( 2 0 0 3 ) 则利用实时荧光p c r 成功检测出了肠毒素s e a s e j 共9 种基因。 近些年，多重p c r 又有了进一步的发展，能快速同时测定1 8 种肠毒素基因，且耗 时不过3h ( f i s c h e r , 2 0 0 9 ) 。总之，p c r 法具有高灵敏性、强特异性、重复性好，能 准确、及时的提供病原学诊断等优点，其缺点是不能定量，另外有些菌株有产毒基 因却不表达，不产毒素。因而，用p c r 法检测的结果不能完全的反应体内的生物学 效应( l e t e r e ，2 0 0 3 ) 。 8 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 1 2 金葡菌肠毒素检测的研究进展 1 2 1 生物学检测 起初对于s e s 的生物学检测( b i o l o g yd e t e c t i o n ) 主要是以幼猫、猴等动物作为 研究对象，通过观察其出现的各种异常的生理变化，来判断待测物中是否存在s e s 。 此法灵敏度低、特异性不强、操作繁琐且动物来源困难。 1 2 2 传统免疫分析法 1 2 2 1 免疫琼脂扩散法 免疫琼脂扩散法( a g a ri m m u n o d i f f u s i o nm e t h o d ) 主要是利用可溶性抗原与抗体 在半固体琼脂内进行扩散，若抗原与抗体对应，并且比例适当，就会出现白色沉淀 线，即阳性反应。琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。此 法的特点是操作简便、特异性强、准确性好，但灵敏度不高，最低检测限仅能达到 3 0 0 5 0 0n g m l ( 王小红等，2 0 0 3 ) 。并且大多情况下需要浓缩或提纯毒素浸出液， 耗时较长。尽管后期有人在此方法的基础上进行了相应的改进，如适宜灵敏度法 ( s u i t a b l e s e n s i t i v i t ym e t h o d ) ( r o b b i n s ，1 9 7 4 ) ，电泳免疫扩散法 ( e l e c t r o i m m u n o d i f f u s i o nm e t h o d ) 、微量玻片法( m i c r o a m o u n ts l i d em e t h o d ) 等，但 灵敏度仍然不高。 1 2 2 2 凝集实验法 凝集实验法( a g g l u t i n a t i o nt e s t ) 是将可溶性抗原( 或抗体) 先吸附于适当大小 的颗粒载体表面，然后与相应抗体( 或抗原) 作用，在适宜电解质存在的条件下， 出现特异性凝集现象。用于s e s 检测中应用最多的还是反向间接血凝试验( r e v e r s e d p a s s i v eh e m a g g l u t i n a t i o nt e s t ，r p h a ) 和反向被动胶乳凝集试验( r e v e r s e dp a s s i v el a t e x a g g l u t i n a t i o nt e s t ，r p l a ) 。y a m a d a 等用改良的r p h a 法，用亲和层析法获得抗血清 检测各型s e s ，灵敏度达1 0n g m l ( y a m a d se ta 1 ，1 9 7 6 ) 。r p l a 较r p h a 更为方便， 是f d a 认可的s e s 常用检测方法之一。 9 发酵条件研究 性同位素、荧光素、酶、铁蛋 标记抗体或抗原以发生抗原抗 察或自动化测定的分析方法。 该技术在精确性、敏感性、特异性及应用范围等方面要都要优于传统免疫分析法。 1 2 3 1 放射免疫测定法 放射免疫测定法( r a d i a t i o ni m m u n ea s s a y , r i a ) 主要是将同位素测定的高灵敏 性和抗原抗体反应的强特异性结合起来。具有高灵敏度、强特异性等特点。用该方 法检测食品中的各型s e s 可达1 - 1 0n g m l ( 董邦金和雷祚荣，1 9 9 2 ) 。 1 2 3 2 酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , e l i s a ) 基本原理与r i a 相同。此法具有简便、特异、敏感等优点，可直接检测溶液中的s e s ，而无需提取、 浓缩等繁杂手段。s i m o n 于1 7 9 6 年首次使用该方法检测s e s 。目前该方法能检测到 的s e s 最低浓度已达到lr i g m e 左右。但e l i s a 法检测s e s 也有其不足之处：首先， 当前水平的e l i s a 法还无法对多种不同类型的s e s 进行一次性特异检测( e d w i n ， 1 9 8 9 ) 。其次，该法的检测结果易受微生物代谢物及相关物质干扰。最后，试剂标准 尚未能统一。当前用于e l i s a 法检测s e s 可选择的底物主要有o p d 、a b t s 、t m b 等。尽管e l i s a 法有不少的局限性，但在s e s 的检测方面仍应用最广。并且近几年 陆续有学者尝试着将e l i s a 与其它方法( 如化学发光法，p c r 等) 结合起来形成了 一些新的方法检测s e s ，以充分发挥各种方法的优点( g i l e t t o & f y f f e ，1 9 9 8 ；g i l l i g a n e ta 1 ，2 0 0 0 ；c h e r t ，2 0 0 7 ) 。 1 2 3 3 免疫荧光法 免疫荧光法( i m m n n o f l u o t e s e n ta s s a y , i f a ) 以荧光素标记的已知抗体( 或抗原) 作为探针，检测待测细胞、组织标本中的靶抗原( 或抗体) 。该方法是2 0 世纪4 0 年 代发展起来的，k h a n 等于2 0 0 3 年就建立了一种简单、快速的检测s e b 的免疫荧光 法。随后a l e f a n t i s 等又在2 0 0 4 年，开发出了一种免疫双抗体夹心荧光法用于快速 检测s e s 。该方法的创新之处在于使用磁性小珠作为一种抗体固定相，再用荧光染 1 0 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 料标记另一种抗体，然后采用双抗夹心免疫荧光法检测样品中s e b 的含量。该法较 传统免疫双抗夹心法而言，其检测时间能缩短至4 0 5 0m i n 。总之，i f a 具有灵敏度 高、检测时间短等优点，但因其标本不能永久保存，荧光有自然消退现象，且易受 非特异性荧光的干扰等缺点，限制了其在检测s e 中的广泛应用( l u o ，2 0 0 6 ) 。 1 2 3 4 免疫印迹技术 免疫印迹技术( i m m u n o b l o t t i n gt e c h n i q u e ，i b t ) 又称蛋白质印迹( w e s t e r n b l o t t i n g ) ，一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法，创于1 9 7 6 年。由于i b t 具有 s d s p a g e 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，且标本可长期保存、 结果便于比较，不少学者都采用该方法来检测s e s 。1 9 9 7 年，r a s o o l y 等人采用了 i b t 来检测加热后的食品中的s e a ，发现该方法可达到1 0 0p g m l 的检测灵敏度。 从总体来看，i b t 既保证了抗体和抗原的特异性反应不受干扰，又可以用来检测加 热后的样品中的s e s 。在这两点上，i b t 要优于e l i s a ( b e n n e t t 2 0 0 5 ) 。 1 2 3 5 胶体金标记技术 胶体金标记技术( i m m u n o g o l el a b e l l i n gt e c h n i q u e ) 是以胶体金作为示踪标记物， 应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。f a u l k 和t a y l o r ( 19 7 1 ) 首次将胶体 金与抗体结合，用于电镜水平的免疫细胞化学研究。g l a d 和g r u b b b ( 1 9 8 1 ) 则把金 标技术和层析技术结合起来，提出了一种新的免疫层析法。宋农等( 2 0 0 3 ) 是首次 将胶体金技术用于s e s 的检测。该方法具有操作简便、快速、稳定、准确性好、灵 敏度高等优点。 1 2 4 生物传感器技术 生物传感器技术( b i o s e n s o rt e c h n i q u e ) 原理是利用物理化学仪器将生物的生命 活动和生化反应，与换能器相接，以电的形式表现出来。它主要是将生物活性物质 专一识别功能产生的特异性和生物反应讯号放大的高度敏感性结合起来。具有检样 量少、分析速度快、生物功能膜可多次使用等优点，能用于多种物质的检测。h u e t 等( 1 9 9 0 ) 采用玻碳电极标记固相化二抗的e l i s a 法，对s e a 进行了定量检测，该 法灵敏度达1 0 。1 2 m o 儿。h o m l o a ( 2 0 0 8 ) 等采用表面质粒共振生物传感器( s u r f a c e p l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 检测牛奶样品中的肠毒素b 。高志贤等( 1 9 9 6 ；1 9 9 8 ) 研 制出了压电免疫传感器，能用于液体中s e s 的检则。杨明慧等( 2 0 0 8 ) 则在原有生 产金黄色葡萄球菌肠毒素a 丁程菌构建及其发酵条件研究 物传感器的基础，开创了基于光学的碳纳米管免疫传感器技术，并将其应用于各种 食物中s e b 的检测，结果发现其灵敏度较原来的基础上至少提高了6 倍，远低于s e b 的检测限。左佳则在电化学生物传感器的基础上引入了胶体金探针放大系统，研制 出了胶体金放大型s e b 电化学生物传感器。该技术灵敏度高，特异性强( 左佳，2 0 0 9 ) 。 1 2 5 超抗原技术 鉴于s e s 自身就是一种超抗原，具有强大的刺激能力，能激活大量的t 细胞增 殖等特点。有人就利用这一特性，采用流式细胞分析技术体外观察t 细胞受刺激后 的增殖反应以及细胞表面抗原和胞内细胞因子的表达，作为筛选s e s 的方法( s c h a d ， 1 9 9 5 ；k r a k a u e r , 1 9 9 9 ) 。此法可以直接检测s e s 的生物学活性，缺点是缺乏特异性， 不能准确判断s e s 的类型。 2 基因工程与发酵工程进展 2 1 基因工程 基因工程( g e n ee n g i n e e r i n g ) ，又名d n a 重组技术、遗传工程，是指在体外将 不同来源的d n a 进行剪切和重组，以形成杂合d n a 或嵌合d n a 分子，然后将其 导入特定的宿主细胞，进行大量扩增和表达，使得使宿主细胞获得新的遗传特性， 产生新的基因产物。该技术兴起于2 0 世纪7 0 年代。其中大肠杆菌是最早开发的功 能蛋白表达系统。目前对于大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究都相当彻底。大肠 杆菌具有个体较小，繁殖力强，适于大规模发酵，且外源基因在其体内的表达量可 达总菌体总蛋白的5 3 0 ，表达水平较真核系统要高等优点，所以常作为基因工 程中宿主菌的首选( m e e n a & h a r i s h ，2 0 0 1 ；j o n a s s o ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 目前，基因重组蛋白的高表达研究主要包括：宿主菌的选择、重组蛋白表达位 点的确定、重组基因的表达、细胞生长环境的变化、发酵条件的优化及后续处理过 程的优化等方面，其中后边三项归属于发酵工程所要研究的范畴( b a n e y x & h a r i s h ， 】9 9 9 ) 。 1 2 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 2 发酵工程 发酵工程主要是将生物化学、微生物学和化学工程学三者结合起来，研究微生 物的生长、代谢来进行各种有用物质的生产。自上世纪8 0 年代以来，随着基因重组 技术的发展，越来越多的异源基因在微生物中表达，而重组蛋白的生产水平，除了 取决于基因重组菌的构建外，还取决于发酵过程的工艺控制( w e i c k e r t 1 9 9 6 ) 。一般 来说，基因工程菌发酵的基本目的就是要以低成本获得高产率的外源蛋白。高密度 发酵是以提高外源蛋白的生产水平为目的，在相对较小的生物反应器中进行重组菌 的高密度培养，从而大幅度提高外源蛋白的产量。高密度发酵具有提高外源蛋白产 量、减少培养体积，利于产品的后续分离纯化，减少资本投入等优点( m a k r i d e s ，1 9 9 6 ； h a r m i n g & m a k r i d e ，1 9 9 8 ) 。 3 生物优化方法在发酵过程中的应用 生物过程是一个相对复杂的交互作用过程，涉及生理、生物化学、普通微生物 学、数学及计算机等方面的知识。生物过程的优化是指将过程中的各种影响因素最 佳化从而使发酵产率最大化。该优化通常包括以下几个步骤：确认所有的影响因子； 筛选相关的影响因子，以确定各因子的影响程度；根据影响因子和优化的要求，选 择优化的策略；对实验结果进行数学或统计分析，以确定最佳条件；验证最佳条件。 随着计算机技术的发展，国外已出现了一些新的优化方法( o b e r g & d e m i n g ， 2 0 0 0 ；k l e o n e n ，2 0 0 4 ) 。下面结合本实验室的工作，简要介绍下常见的优化方法及其 发展状况。 3 1 非统计优化技术 传统的优化方法多为单次单因子法( o n e f a c t o r - a t a t i m e ) ，即每次实验只改变一 个因子而其它因子保持不变。然而当考察因子较多时，则需要较多的实验次数和较 长的实验周期，而且还可能导致不可靠的甚至是错误的结论，尤其是对具有交互作 用的多因子实验。其优点是操作简单、结果能直观地用图表表示，因而仍是常见的 生物过程优化的方法之一。 产金黄色葡萄球菌肠毒素a 工程菌构建及其发酵条件研究 3 2 统计优化技术 为了弥补传统的单次单因子法的不足，统计优化法应运而生。该方法包括下面 几个步骤：实验设计；实验结果的数据分析，以得到合适的数学模型；数学模型的 检验，即方差分析；求解最优值及其检验。常见的优化技术包括响应面法( r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y , r s m ) 、最陡爬坡法( s t e e p e s ta s c e n t ) 、进化操作法( e v o l u t i o n a r y o p e r a t i o n ) 、典型分析法( c a n o n i c a la n a l y s i s ) 、g a u s s s e i d e l 法、n e l d e r - m e a d 单纯形 法等，其中r s m 是近年来应用较多的一种优化技术。r s m 是1 9 5 1 年b o x w i l s o n 开发的用于化学过程因子优化的种方法。该法试图用数学模型来描述实验的影响 因子与目标响应值之间的关系，并以此为根据，确定其最佳条件。其特点是能在设 计合理的有限次数实验下，评价各因子对生物过程的影响，以及各因子交互作用的 程度，最后求得其最优化条件。下面根据不同的实验设计技术来分别进行介绍。 3 2 1p l a c k e t b u r m a n 设计法 p l a c k e t b u r m a n 设计法( p l a c k e t b u r m a nd e s i g n ，p b d ) 是一种两水平的实验设计 法，主要采用h a d a m a r d 矩阵，对于k 个因子进行k + 1 次试验，每个因子各采用高低 两个水