（急诊医学专业论文）辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠凝血功能及肝脏c反应蛋白的影响.pdf

目录 中文摘要1 英文摘要5 研究论文辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠凝血功能及肝脏c 反应蛋白 的影响 前言一10 朗舂”lu 材料与方法“11 结果l7 附图2 0 附表2 5 讨论2 8 参考文献3 4 综述脓毒症引起凝血功能紊乱的监测及治疗进展3 7 致谢4 6 个人简历4 7 中文摘要 辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠 凝血功能及肝脏c 反应蛋白的影响 摘要 目的：脓毒症( s e p s i s ) 是感染病原体与宿主免疫系统、炎症反应、凝血 反应之间相互作用，造成机体器官功能损害的复杂临床综合征，是危重患 者的最主要死亡原因之一。在脓毒症时，同时启动的炎症反应与凝血级联 反应构成其主要病理生理机制，过度的炎症反应和失控的凝血瀑布效应最 终可导致器官功能障碍甚至死亡。脓毒症患者中凝血系统功能紊乱非常普 遍，包括促凝活性增强、抗凝活性减弱、纤溶系统受抑制等，凝血系统过 度激活最终引起凝血因子消耗和出血倾向，而发生弥散性血管内凝血 ( d i s s e m i n a t e di n t r a v a s c u l a rc o a g u l a t i o n ，d i c ) 。毛细血管内微血栓的形成是 脓毒症的重要特征之一。近年来国外研究发现他汀类药物作为脓毒症治疗 药物能够有效保护血管内皮细胞功能，具有抗炎、抗凝、减轻重要脏器损 伤等作用，并降低死亡率，为脓毒症的治疗提供了新的手段。本研究应用 盲肠结扎穿孔术( c e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e ，c l p ) 建立脓毒症大鼠模型， 观察辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠凝血功能及肝脏c 反应蛋白( c r e a c t i v e p r o t e i n ，c r p ) 的影响，通过多个观察时间点认识脓毒症病生理的发生与发 展及他汀类药物的保护作用机制，以期用新的干预方式治疗脓毒症，减少 并发症，降低病死率。 方法：清洁级健康雌性w i s t a r 大鼠8 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ( 河北医科 大学实验动物中心提供) 。随机分为4 组：正常对照组( i 组，n = 8 ) ：麻 醉后活杀动物；假手术组( i i 组，n = 2 4 ) ：麻醉后开腹翻动盲肠后关腹； 脓毒症模型组( i i i 组，n = 2 4 ) ：麻醉后开腹行盲肠结扎穿孔术：辛伐他汀 预处理组( i v 组，n = 2 4 ) ：盲肠结扎穿孔术前给予辛伐他汀2 0 r a g k g 1 d a y ， 溶于l m l 灭菌注射用水，灌胃连续两周，其余各组给予等量的生理盐水灌 胃。各实验组按时间点( 6 h 、2 4 h 、4 8 h ) 处死大鼠留取标本，每个时间点 活杀8 只大鼠，留取血液及肝组织标本。 监测并记录各组大鼠一般表现如：被毛、精神状态、肛温及存活率； 应用全自动血液分析仪对各组大鼠全血白细胞及血小板计数进行测定；留 l 中文摘要 取的血清标本进行组织因子( t i s s u ef a c t o r ，t f ) 、纤溶酶原激活物抑制物 ( p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r - 1 ，p a i 1 ) 检测；留取肝组织标本应用免疫 组化法检测c i 冲水平。 全部数据采用s p s s12 0 统计软件进行统计学分析，计量资料数据以 均数4 - 标准差( 工s ) 表示，组间比较采用单因素方差分析( o n ew a y a n o v a ) ，计数资料采用x2 检验( 确切概率法) ，p 0 0 5 ) 。 3 白细胞计数 脓毒症模型组大鼠6 h 、2 4 h 、4 8 h 白细胞计数较假手术组比较均值下 降5 0 ，脓毒症模型符合动物s i r s 诊断标准。 4 肛温比较 电子体温计监测各组大鼠直肠温度。脓毒症模型组大鼠6 h 、2 4 h 、4 8 h 肛温较假手术组比较下降超过l ，脓毒症模型符合动物s i r s 诊断标准。 5 组织因子( t f ) 中文摘要 假手术各时间点t f 含量与正常对照组比较差异无统计学意义( p 均 0 5 ) ；c l p 后6 h 、2 4 h 、4 8 h 血清t f 含量均明显高于假手术组( p 0 0 1 ) ， 6 h 血清t f 含量明显升高，2 4 h 达到高峰，4 8 h 有所下降；辛伐他汀预处 理组6 h 、2 4 h 、4 8 h 血清t f 含量与脓毒症模型组比较均明显下降( 1 8 0 4 5 6 1 2 0v s3 1 2 1 5 8 3 5 4 ；3 4 1 6 3 5 3 5 2v s4 4 8 1 8 5 4 1 9 ；2 0 3 1 3 5 2 6 4 v s3 1 0 3 7 3 9 7 5 ，p o 5 ) ； c l p 后6 h 、2 4 h 、4 8 h 血清p a i 1 含量均明显高于假手术组( p 0 0 1 ) ， 6 h 血清p a i 1 含量明显升高，2 4 h 达到高峰，4 8 h 有所下降：辛伐他汀预 处理组6 h 、2 4 h 、4 8 h 血清p a i 1 含量与脓毒症模型组比较均明显下降( 2 0 8 o 3 1v s2 7 1 0 3 9 ；2 0 6 0 3 7v s3 4 2 0 5 8 ；1 7 5 0 2 4v s2 3 2 0 2 5 p o 5 ) ：c l p 后6 h 、2 4 h 、4 8 hp l t 均低于假手术组( p 0 0 1 ) ，6 hp l t 与假手术组比较明显下降，随着时间的延长，p l t 呈逐渐降低趋势；辛伐 他汀预处理组6 h 、2 4 h 、4 8 hp l t 与脓毒症模型组比较均明显上升( 6 2 9 3 3 3 1 9 4v s5 2 4 0 0 + 6 5 7 4 ；5 7 1 6 7 2 2 0 1v s5 1 4 3 3 3 2 3 2 ；5 4 6 0 0 _ _ _ 3 4 0 4 v s4 5 2 0 0 3 2 0 0 ，p o 5 ) ，肝小叶中肝细胞排列 整齐，假手术组有少量阳性细胞表达；脓毒症模型组大鼠肝脏c r p 阳性 细胞表达各时问点较假手术组比较明显增多( p o 0 1 ) ，造模组2 4 h 阳性 细胞比例数较6 h 、4 8 h 增高，肝小叶中肝细胞排列紊乱；辛伐他汀预处理 组大鼠肝脏c r p 阳性细胞表达较脓毒症组各时间点减轻( 1 5 0 0 3 0 0v s 2 7 6 7 2 5 2 ；11 6 7 3 5 1v s2 4 0 0 8 1 9 ；1 8 0 0 + 3 0 0v s2 6 0 0 + 5 5 7 ，p 0 0 5 ) t h el e v e lo ft fi nc l p g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t h t h a ti ns h a mg r o u pa t 6 h ，2 4 h ，4 8 hp o i n ta f t e rc l p ( p 0 01 ) ，t h el e v e lo ft fi ns e r u mo b v i o u s l y i n c r e a s e da t6 h ，r e a c h e dt h ep e a ka t2 4 ha n dd e c r e a s e da t4 8 ht os o m e e x t e n t t h el e v e lo ft fo fs e r u mi np r e v e n t i o ng r o u pw a sl o w e rt h a nt h a ti n c l pg r o u pa t6 h ，2 4 h ，4 8 h p o i n ta f t e rc l p ( 1 8 0 4 5 6 1 2 0v s 3 1 2 1 5 8 3 5 4 ，3 4 1 6 3 5 3 5 2v s4 4 8 1 8 5 4 1 9 ，2 0 3 1 3 5 2 6 4v s3 1 0 3 7 3 9 7 5 ，p 0 0 5 ) t l l el e v e lo fp a i l i nc l p g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t h t h a t i ns h a mg r o u pa t 6 h ，2 4 h ，4 8 hp o i n ta f t e rc l p ( p 0 01 ) ，t h el e v e lo ft fi ns e r u mm a r k e d l y i n c r e a s e da t6 h ，r e a c h e dt h ep e a ka t2 4 ha n dd e c r e a s e da t4 8 ht os o m e e x t e n t t h el e v e lo fp a i - lo fs e r u mi np r e v e n t i o ng r o u pw a ss i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h a ti nc l pg r o u pa t6 h ，2 4 h ，4 8 hp o i n ta f t e rc l p ( 2 0 8 o 3 1v s2 7 l o 3 9 ，2 0 6 o 3 7v s3 4 2 0 5 8 ，1 7 5 o 2 4v s2 3 2 o 2 5 ，p o 0 5 ) t h el e v e ro fp l ti nc l p g r o u pw a sl o w e rt h a nt h a to fs h a mg r o u pa t6 h ，2 4 h ，4 8 hp o i n ta f t e rc l p ( p 0 01 ) 晰t ht h ep r o l o n g a t i o no ft i m e ，t h el e v e lo fp l td e c l i n e db yd e g r e e s t h e l e v e lo fp l ti np r e v e n t i o ng r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t h t h a ti nc l p g r o u p a t6 h ，2 4 h ，4 8 hp o i n ta f t e rc l p ( 6 2 9 3 3 31 9 4v s5 2 4 0 0 6 5 7 4 ，5 7 1 6 7 2 2 0 1v s5 1 4 3 3 3 2 3 2 ，5 4 6 0 0 _ _ + 3 4 0 4v s4 5 2 0 0 3 2 0 0 ，p 0 5 ) h e p a t o c y t e so fh e p a t i cl o b u l e w e r ea r r a y e di no r d e r t h e r ew e r eaf e w p o s i t i v ec e l l si ns h a mg r o u p t h ec r p p o s i t i v ec e l lr a t i oi nc l pg r o u pw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h a to fs h a mg r o u p a te a c ht i m ep o i n t ( p 0 01 ) t h ec i 心p o s i t i v ec e l lr a t i oo fc l p g r o u p a t2 4 h w a sm o r et h a nt h a ta t6 h ，4 8 hp o i n t h e p a t o c y t e so f h e p a t i cl o b u l ew e r ea r r a y e d d i s o r d e r l y t h el e v e lo f c r p p o s i t i v ec e l l si np r e v e n t i o ng r o u pw e r ed e c r e a s e d c o m p a r e dw i t ht h a ti nc l pg r o u pa te a c ht i m ep o i n t ( 1 5 0 0 + 3 0 0v s2 7 6 7 2 5 2 ，1 1 6 7 3 5 1 v s2 4 0 0 8 1 9 ，1 8 o o 3 0 0v s2 6 0 0 5 5 7 ，p 0 0 1 ) h e p a t o c y t e so fh e p a t i cl o b u l ew e r ea r r a y e di no r d e r c o n c l u s i o n s ： 1a s e p t i cm o d e lc a nb em a d es u c c e s s f u l l yb yc e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e 英文摘要 2s e p s i si n d u c e db yc e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r ec o u l di n c r e a s et h el e v e r o ft i s s u ef a c t o ra n dp l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r - 1i nt h es e r u m ，d e c r e a s e p l a t e l e tc o u n t 3p r e t r e a t m e n tw i t hs i m v a s t a t i nc o u l di n h i b i tt h ep r o d u c t i o no ft i s s u e f a c t o ra n d p l a s m i n o g e n a c t i v a t o ri n h i b i t o r - 1 i nt h e s e r u m ，d e c r e a s e c o n s u m p t i o no fp l a t e l e t s 4p r e t r e a t m e n tw i t hs i m v a s t a t i nc o u l dd e s c e n dt h el e v e ro fc r e a c t i v e p r o t e i no fl i v e r , a l l e v i a t et h ed e g r e eo fl i v e ri n f l a m m a t i o na n dp r o t e c t l i v e r f u n c t i o n k e yw o r d s ：s e p s i s ；c e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e ；p l a t e l e tc o u n t ；t i s s u e f a c t o r ；p l a s m i n o g e na c t i v a t o ri n h i b i t o r 一1 ；c r e a c t i v ep r o t e i n 研究论文 辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠 凝血功能及肝脏c 反应蛋白的影响 _ 生_ 釜 翮罱 脓毒症( s e p s i s ) 是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，是 机体对感染的一种全身性炎症反应( s y s t e m i ci n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s y n d r o m e ，s i r s ) ，是严重感染、重度创伤、大手术后、急性重症胰腺炎 和休克等常见的并发症，进一步发展可以导致感染性休克、急性呼吸窘迫 综合征( a c u t er e s p i r a t o r yd i s t r e s ss y n d r o m e ，a r d s ) 和多器官功能障碍综合 征( m u l t i p l eo r g a nd y s f u n c t i o ns y n d r o m e ，m o d s ) 。患病率高、病死率高、 医治费用高是脓毒症的三大特点，它所产生的严峻形势，是目前医学领域 的攻关难题【。 近年研究证实，凝血系统异常在脓毒症发生、发展过程中具有重要作 用，在脓毒症时，同时启动的炎症与凝血级联反应是其主要病理生理机制， 过度炎症反应和失控的凝血瀑布效应最终可导致器官功能障碍甚至死亡。 微血管内微血栓的形成是脓毒症的重要特征之一。研究凝血系统在脓毒症 中的作用有助于揭示脓毒症复杂的发病机制，为探索脓毒症有效的治疗手 段及方法提供新思路。 辛伐他汀属于羟甲基戊二酰辅酶a 还原酶抑制剂，是目前应用较广泛 的调脂药物之一，近年来国外研究发现他汀类药物作为脓毒症治疗药物能 够有效保护血管内皮细胞功能，抑制炎症因子的释放及炎症细胞的粘附， 具有抗炎、抗凝、减轻重要脏器损伤等作用，并降低死亡率，为脓毒症的 治疗提供了新手段。目前国外研究对他汀类药物治疗脓毒症的用药时机、 用药剂量及疗程等问题需进行更深入的探索，国内相关研究极少。 本研究应用盲肠结扎穿孔术( c e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e ，c l p ) 建立脓 毒症大鼠模型，观察辛伐他汀预处理对脓毒症大鼠凝血功能及肝脏c 反 应蛋白( c r e a c t i v ep r o t e i n ，c r p ) 的影响，通过多个观察时间点认识脓毒症 病生理的发生与发展及他汀类药物的保护作用机制，着眼于用新途径来治 疗脓毒症，通过抑制凝血系统的活化来控制失控性炎性反应，以期减少并 发症，降低病死率。 研究论文 材料与方法 l 材料 1 1 主要仪器： 动物手术操作台、手术器械、离心试管、注射器( 1 m l 、5 m 1 ) 、2 4 撑静脉穿 刺套管针、动脉夹、纱布等。 酶标仪( b i o t e ke l x 8 0 0 美国) 微量振荡器( w z s i i i a 型无锡县金城仪器厂) 全自动血液分析仪( s y s m e xx s 1 0 0 0 i 日本) 显微镜( o l y m p u s b x 5 1 t - p h d j 1 1日本) 切片机( 莱卡r m 2 0 1 5德国) 离心机( 北京离心机厂l d z 5 2 型) 电子天平( m e t t e ra e l 0 0 型瑞士) 移液器( e p p e n d o r f 德国) 干燥箱( 三洋m i r - 1 5 3 型日本) 低温冰箱( 三洋m d f 3 8 2 e 型日本) 恒温水浴箱( d s h z 3 0 0 型江苏太仓医用仪器厂) 医用微波炉( y w y 7 8 1 b 型浙江临安爱迪仪器厂) 电子体温计( 欧姆龙m c 1 4 0 ) 多功能真彩色细胞图象分析管理系统( m e d i ac y b e r n e t i c s 公司i m a g e p r o p l u s 美国) 1 2 主要药品及试剂： 水合氯醛( 天津市大茂化学试剂厂) 辛伐他汀( 默沙东，批号：国药准字h 1 9 9 9 0 3 6 6 ) 大鼠t fe l i s a 试剂盒( 上海西塘生物科技有限公司) 大鼠p a l 1e l i s a 试剂盒( i 收ds y s t e m s 美国) 切片石蜡( 天津市永大化学试剂开发中心) 无水乙醇( 天津市永大化学试剂开发中心) 9 5 乙醇( 天津市永大化学试剂开发中心) 氯化钠注射液( 石家庄四药有限公司) 免疫组化c 反应蛋白抗体( 美国s a n t ac r u z 公司) 研究论文 s p 9 0 0 1 ( 河北博海生物工程开发有限公司) d a b ( 二氨基联苯胺) ( 河北博海生物工程开发有限公司) 1 3 实验动物： 清洁级健康雌性w i s t a r 大鼠8 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ( 河北医科大学实 验动物中心提供，合格证号：9 0 9 0 3 7 ) 。饲养于恒温( 2 0 ) 清洁饲养室， 给予经高压灭菌处理的标准大鼠饲料喂养，给予充足水分，通风良好，温 度适宜，所有大鼠实验前均于饲养室适应性饲养一周。 2 实验方法： 2 1 实验动物与分组： 将健康清洁级雌性w i s t a r 大鼠8 0 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ，随机分为4 组： 即i 正常对照组( n = 8 ) ：麻醉后活杀动物；i i 假手术组( n = 2 4 ) - 麻醉后 开腹翻动盲肠后关腹；i i i 脓毒症模型组( n = 2 4 ) ：麻醉后行盲肠结扎穿孔 术；辛伐他汀预处理组( n = 2 4 ) ：盲肠结扎穿孔术前给予辛伐他汀 2 0 m g k 互1 d a y l ( 溶于l m l 灭菌注射用水) ，连续两周灌胃，其余各组给予 等量的生理盐水灌胃。第1 i i 、组分别于盲肠结扎穿孔术后6 h 、2 4 h 、4 8 h 后活杀动物8 只，留取血液及肝组织标本。 2 2c l p 法制造脓毒症模型： 2 2 1 麻醉：动物称重后1 0 水合氯醛3 5 0 m g k g 腹腔注射麻醉，腹腔注 射时将大鼠头部放低，尾部抬高，选择在下腹部靠外侧进针，针尖通过腹 肌后抵抗力消失回抽无回血后注药，注射麻药后仰卧位固定于手术台。 2 2 2 造模：依照c h a u d 司报道的方法行c l p 制造脓毒症模型，术前禁食 不禁水1 2 h ，麻醉后剪毛，无菌条件下沿腹部正中线作2 c m 切口，找到盲 肠并小心游离避免损伤血管，在回盲瓣远侧即盲肠根部用4 号缝合线结扎 盲肠，避免结扎回肠及盲肠系膜血管。用1 8 号针贯穿盲肠，挤出少许肠 内容物，并留置一条宽2 m m 的橡皮条，防止针孔闭合。之后，将盲肠还 纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。术毕在腹腔注射生理盐水3 m l 1 0 0 9 抗休克， 之后将动物放回饲养笼中，待麻醉清醒后可自由活动、进食、饮水。 监测大鼠被毛，精神状态，呼吸，体温等。在c l p 后2 3 h 大鼠可自 由饮水，随后出现精神倦怠、躁动、寒战、腹胀、眼角分泌物增多、竖毛 等表现，处死后剖腹可见腹腔有血性渗出液，盲肠肿胀变黑、发生粘连， 空肠肠管胀气等表现，视为制模成功【2 0 】。观察期间出现死亡的动物被排 研究论文 除并重新造模补充。 2 3 标本采集及处理： 正常组大鼠麻醉活杀后留取血液及肝脏标本。假手术组、脓毒症模型 组、辛伐他汀预处理组大鼠制模成功后分别于6 h 、2 4 h 、4 8 h 麻醉活杀大 鼠8 只并留取血液及肝脏标本。 2 3 1 血液标本：每组动物按时间点麻醉后常规消毒腹部皮肤，打开腹腔， 分离右侧颈动脉，由右颈动脉处穿刺缓慢采血3 - 5 m i ，取其中l m l 全血枸 橼酸钠抗凝试管留取做血常规，其余离心后( 离心机3 0 0 0 r p m ，2 0 m i n ) 留取 血清，7 0 冻存。 2 3 2 肝脏标本的收集：麻醉后用手术剪沿腹正中线将腹部皮肤剪开，暴 露肝脏，在无菌条件下，取下左肝内倾ud - t - 少许，用磷酸缓冲液( p b s ) 冲洗 肝组织表面血液及血凝块，滤纸轻拭吸干表面水分，立即浸泡在4 多聚 甲醛2 4 小时，做石蜡切片待检。 2 4 实验指标及方法： 观察大鼠一般情况，如：造模后被毛、精神状态、直肠温度、呼吸及 剖腹后血性渗出液、盲肠肿胀变黑、空肠肠管胀气等表现，记录大鼠生存 率。全自动血常规分析仪检测白细胞计数、血小板计数。留取的血清标本 进行组织因子( t i s s u ef a c t o r ，t f ) 及纤溶酶原激活物抑制物( p l a s m i n o g e n a c t i v a t o ri n h i b i t o r 1 , p a i 1 ) 的检测。应用免疫组化法对大鼠肝脏c r p 水平 进行检测。 2 4 1t f 检测原理及检测步骤： 原理：采用双抗夹心a b c e l i s a 法。用抗大鼠t f 单抗包被于酶标 板上，标准品和样品中的t f 与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠t f ，形 成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的s t r e p t a v i d i n 与生物素 结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在4 5 0 n m 处测o d 值，t f 浓度与o d 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中t f 浓度。 试剂盒组成： 酶标板：9 6 孔 1 0 x 标本稀释液：1 2 m l 标准品：1 0 n g 瓶，2 瓶 第一抗体工作液：1 2 m l 研究论文 酶标抗体工作液：1 2 m l 2 0 浓缩洗涤液：5 0 m l 底物工作液：1 2 m l 终止液：1 2 m l 检测步骤： 2 4 1 1 标准品液配制：使用前加入o 5 m l 蒸馏水混匀，配成2 0 n g m l 的溶 液。设标准管8 管，第一管加标本稀释液9 0 0 9 l ，第二至第八管加 入标本稀释液5 0 0 1 a l 。在第一管中加入2 0 n g m l 的标准品溶液1 0 0 9 l 混匀后用加样器吸出5 0 0 i - t l ，移至第二管。如此反复作对倍稀释， 从第七管中吸出5 0 0 9 l 弃去。第八管为空白对照。 2 4 1 2 加样：分别标记样品编号，每孔各加入标准品或待测样品1 0 0 9 l ， 将反应板充分混匀后置3 7 温育1 2 0 分钟。 2 4 1 3 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4 6 次，用滤纸印干。 2 4 1 4 每孔中加入第一抗体工作液1 0 0 p 1 ，将反应板充分混匀后置3 7 温 育6 0 分钟。 一 2 4 1 5 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4 6 次，用滤纸印干。 2 4 1 6 每孔加酶标抗体工作液1 0 0 9 l ，将反应板置3 7 。c 温育3 0 分钟。 2 4 1 7 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4 6 次，用滤纸印干。 2 4 1 8 每孔加入底物工作液l o o i ，t l ，将反应板置3 7 。c 温育1 5 分钟。每孔 加入1 0 0 1 t l 终止液混匀。 2 4 1 93 0 分钟内用酶标仪在4 5 0 n m 处测吸光值。 2 4 2p a l 1 检测原理及检测步骤： 原理：p a l 1 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验。已知p a l 1 浓 度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将p a i 1 和 生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的h r p 。再经 过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物a 、b ，和酶结合 物同时作用产生颜色。颜色的深浅和样品中p a l 1 的浓度呈比例关系。 试剂盒组成： 酶标板：9 6 孔 塑料模板盖：1 块 标准品：8 0 n g m l 研究论文 空白对照：l m l 标准品稀释缓冲液：8 m l 生物素标记的抗p a l 1 抗体：8 m l 亲和链酶素h r p ：1 2 m l 洗涤缓冲液：2 0 m l 底物a ：6 m l 底物b ：6 m l 终止液：6 m l 检测步骤： 2 4 2 1 标准品液配制：设标准管7 管，稀释后浓度分别为：8 0 n g m l 、 4 0 n g m l 、2 0 n g m l 、10 n g m l 、5 n g m l 、2 5 n g m l 、0 n g m l 。 2 4 2 2 加入稀释好的标准品5 0 1 a l 于反应孔、加入待测样品5 0 p 1 于反应孔 内。立即加入5 0 9 l 的生物素标记的抗体。盖上模板，轻轻振荡混 匀，3 7 。c 温