（麻醉学专业论文）异丙酚对小鼠脑动脉血管平滑肌细胞bkca通道钙离子敏感性及通道动力学的作用机制研究.pdf

i i j i r l l f lf l li ifrlli r ff pipiflpif y 18 8 9 0 2 9 异丙酚对小鼠脑动脉血管平滑肌细胞b k c a 通道钙离子敏感 性及通道动力学的作用机制研究 目的：异丙酚是临床最常用的静脉麻醉药之一，该药具有明显的 心血管抑制作用，可引起剂量依赖性的血压下降。其降低血压的机制 主要包括抑制肾素血管紧张素系统，阻断交感神经末梢释放去甲肾上 腺素，抑制血管运动中枢，抑制心肌收缩力，降低心输出量以及对外 周血管的直接扩张作用等，其中血管的直接舒张作用占主要地位。 大电导钙激活钾通道( 1 a r g ec o n d u c t a n c e c a 2 + - s e n s i t i v ek + c h a n n e l s ，b k c a ) 广泛分布于血管平滑肌细胞，携带整个细胞约7 0 8 0 的外向电流。b k c a 通道的激活可使细胞膜超极化，抑制l 型电压依 赖性钙通道，抑制胞外钙离子内流，降低胞内钙离子浓度，导致平滑 肌舒张。b 比通道在血管平滑肌细胞的广泛分布加之大电导特性决 定了其在调节血管舒缩活动中的重要作用。既往研究表明，b k c a 通 道的激活可能参与了异丙酚导致的血管舒张；也有学者采用膜片钳技 术直接证实异丙酚对b k c a 通道有激活作用，但是其具体激活机制， 尤其是对b k c a 通道的门控动力学机制和作用靶点并不十分清楚。本 研究旨在从分子水平探讨异丙酚对b k c a 通道钙敏感性、电压依赖性 以及对通道动力学机制的影响。方法：取正常小鼠( 1 5 2 0 9 ，雌雄不 拘) 腹腔注射戊巴比妥钠6 0m g k g 麻醉后断头，取出大脑组织置于 冰预冷的生理盐溶液( p h y s i o l o g i c a ls a l i n es o l u t i o n ，p s s ) 中，小心分 离大脑底部动脉，经两步法酶消化得到单个平滑肌细胞，4 保存备 ： 用。采用全细胞穿孔膜片钳技术记录b k c a 通道宏观电流、瞬时外向 钾电流( s p o n t a n e o u st r a n s i e n to u t w a r dk + c u r r e n t s ，s t o c s ) 以及不同 浓度异丙酚对b k c a 通道电流的影响；采用内面向外式单通道膜片钳 技术，记录b k c a 通道的单通道电生理特性，以及不同浓度异丙酚对 通道钙敏感性、电压依赖性和通道动力学机制的影响。结果：小 鼠脑动脉平滑肌细胞b k c a 通道具有与人肠系膜平滑肌及其它组织 b k c a 通道相似的电生理特性，即大电导、钙敏感性、电压依赖性和 钾离子选择性，能被特异性阻断剂i b t x ( 2 0 0n m ) 阻断。异丙酚 能明显增加b k c a 通道宏观电流密度，s t o c s 的频率和幅度。在+ 6 0m v 膜电位时，5 6 州和1 1 2i i m 异丙酚增加b a 通道宏观电流密度1 4 4 倍和2 4 4 倍。在3 0m v 膜电位时，5 6 州异丙酚分别增加s t o c s 的 开放幅度和开放频率1 5 1 倍和1 6 9 倍。在内面向外膜片下，异丙 酚呈浓度依赖性的增加b k c a 通道开放概率( t o t a lo p e np r o b a b i l i t y ， n p o ) 。在+ 4 0m v 膜电位下，5 6 州和11 2 州分别使n p o 增加5 2 倍和1 9 3 倍，半数最大效应浓度( e c 5 0 ) 为7 5 9 3 州。2 8 州，5 6 山 和1 1 2 州能使钙离子量效曲线左移，钙离子解离常数( k ) 由o 8 8 7 p m 减小到0 6 9 4 州( 2 8 州异丙酚) ，o 5 9 9 州( 5 60 m 异丙酚) 和 o 1 7 6 州( 11 2 州异丙酚) 。通道动力学分析结果提示11 2 州异 丙酚能明显增加通道的开放驻留时间和减少关闭驻留时间，并且降低 通道的开放时间常数和增加关闭时间常数。结论：异丙酚呈剂量依赖 性的激活b k c a 通道可能是异丙酚舒张血管机制之一，其激活b k c a 通道主要是通过增加通道钙离子敏感性和电压依赖性，并且改变通道 的动力学参数，包括延长开放驻留时间和缩短关闭驻留时间，增加通 道开放时间常数和降低关闭时间常数。 关键词：异丙酚；平滑肌细胞；大电导钙激活钾通道；低血压 p r o p o f o ls h i f t sc a 2 + s e n s i t i v i t ya n d k i n e t i c so fb k c ai nm o u s e c e r e b r a la r t e r i a ls m o o t hm u s c l ec e l l s a b s t r a c t ：0 b j e e t i v e ：p r o p o f o li sw i d e l yu s e d f o ri n t r a v e n o u s a n e s t h e s i aw i t ht h es i d e e f f e c to fh y p o t e n s i o n m a n ym e c h a n i s m sa r e i n v o l v e di nt h eh y p o t e n s i o n ，i n c l u d i n g ：i n h i b i t i o no ft h er e n i na n g i o t e n s i n s y s t e m ，d e c r e a s i n gs y m p a t h e t i c n e r v e a c t i v i t y ,i n h i b i t i n g t h e n o r a d r e n a l i n er e l e a s ef r o mt h es y m p a t h e t i cn e r v e s ，i n h i b i t o r ye f f e c to ft h e v a s o m o t o rc e n t r e ，d e c r e a s i n gt h em y o c a r d i a lc o n t r a c t i l i t ya n dc a r d i a c o u t p u t ，i n d u c i n gt h ep e r i p h e r a lv a s c u l a rr e l a x a t i o nd i r e c t l y t h em o s t i m p o r t a n tm e c h a n i s mi st h ed i r e c te f f e c to np e r i p h e r a lv a s c u l a r l a r g e c o n d u c t a n c ec a 2 + _ s e n s i t i v ek + c h a n n e l s ( b a ) a r eb r o a d l ye x p r e s s e do n v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l sa n dt a k e7 0 8 0 o u t w a r dc u r r e n to ft h e w h o l ec e l l t h ea c t i v a t i o no f b k c a i n d u c e sc e l lm e m b r a n e h y p e r p o l a r z a t i o n w h i c hi n h i b i t slt y p e v o l t a g e d e p e n d e n t c a l c i u m e s p e c i a l l yt h ek i n e t i c sa n d i t st a r g e t ，r e m a i n su n k n o w n h e r e ，w ea i mt o i n v e s t i g a t et h ee f f e c to fp r o p o f o lo n k i n e t i c sa n dc a 2 + s e n s i t i v i t yo fb k c a m e t h o d s ：m i c e ( 1 5 2 0g ) w e r ed e c a p i t a t e da f t e rb e i n ga n e s t h e t i z e db y i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o nw i t h6 0m g k gn a p e n t a l b r a i n sw e r et a k e no u t a n dp u ti n t o i c e p r e t r e a t e dp h y s i o l o g i c a l s a l i n es o l u t i o n ( p ss ) a n d c e r e b r a la r t e r i e sw e r ei s o l a t e df r o mp a v i m e n t u mc e r e b r i s m o o t hm u s c l e c e l l sw e r ei s o l a t e df r o mm o u s ec e r e b r a la r t e r i e sw i t ht w os t e p so f e n z y m a t i cd i g e s t i o na n dt h e ns t o r e da t4 c b k c am a c r o c u r r e n t sa n d s p o n t a n e o u st r a n s i e n to u t w a r dk + c u r r e n t s ( s t o c s ) w e r er e c o r d e du n d e r d i f f e r e n tp r o p o f o lc o n c e n t r a t i o n si np e r f o r a t e dw h o l e c e l lc o n f i g u r a t i o n w er e c o r d e dc a 2 + s e n s i t i v i t y , v o l t a g ed e p e n d e n c ea n dk i n e t i c so fb k c a u n d e rd i f f e r e n tp r o p o f o lc o n c e n t r a t i o n si ni n s i d e o u t s i n g l e c h a n n e l c o n f i g u r a t i o n r e s u l t s ：t h ec h a r a c t e r i s t i cp r o p e r t i e s o fb k c ai n m o u s ec e r e b r a la r t e r i a ls m o o t hm u s c l ec e l l s ，i e 1 a r g ec o n d u c t a n c e ， v o l t a g ed e p e n d e n t a n dc a l c i u md e p e n d e n t - c h a r a c t e r i s t i c s ，a r ev e r y s i m i l a rt ot h o s ef o u n di no t h e rt i s s u e s p r o p o f o li n c r e a s e dt h eb k c a m a c r o c u r r e n t sa n ds p o n t a n e o u st r a n s i e n to u t w a r dk + c u r r e n t s ( s t o c s ) a tv m = + 6 0m v , 56p ma n d112p mp r o p o f o li n c r e a s e dt h em a c r o c u r r e n td e n s i t y1 4 4 一f o l da n d2 4 4 一f o l d ，r e s p e c t i v e l y a tv m = 一30m v , 56 p mp r o p o f o li n c r e a s e dt h ea m p l i t u d eo fs t o c s1 51 - f o l da n df r e q u e n c y 1 6 9 一f o l d p r o p o f o l i n c r e a s e dt h et o t a l o p e np r o b a b i l i t y ( n p o ) o f s i n g l eb k c ai nac o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n tm a n n e r 5 6p ma n d112 州 5 p r o p o f o li n c r e a s e dn p o5 2 - - f o l da n d19 3 f o l d w i t ht h eh a l fm a x i m a l e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n ( e c s 0 ) o f7 5 9 3 山p r o p o f o l s h i f t e dt h e n p o c a 2 + 】触ec u r v el e f tw i t ht h ee q u i l i b r i u md i s s o c i a t i o nc o n s t a n t ( k ) o f c a 2 + f r o m0 8 8 7 山( c o n t r 0 1 ) t o0 6 9 4 ( 2 8 州p r o p o f 0 1 ) ，0 5 9 9 出( 5 6 l x mp r o p o f 0 1 ) a n do 17 60 m ( 1 12p mp r o p o f 0 1 ) a n a l y s i so ft h e c h a n n e lk i n e t i c sr e v e a l e dt h a t112 州p r o p o f o li n c r e a s e dt h eo p e nd w e l l t i m ea n dd e c r e a s e dt h ec l o s e dd w e l lt i m es i g n i f i c a n t l y i td e c r e a s e dt h e o p e nt i m ec o n s t a n ta n di n c r e a s e dt h ec l o s e dt i m ec o n s t a n t c o n c l u s i o n ： p r o p o f o la c t i v a t e sb k c at h r o u g hi n c r e a s i n gt h ec a l c i u ms e n s i t i v i t ya n d v o l t a g ed e p e n d e n c eo ft h ec h a n n e l s f u r t h e rm o r e ，p r o p o f o lm o d u l a t e s b k c ak i n e t i c si n c l u d i n go p e n a n dc l o s e d s t a t e s ，a n d i n h i b i t st h e t r a n s m i t t i n gf r o mt h eo p e ns t a t et oc l o s es t a t ea n df a s t e n st h et r a n s m i t t i n g f r o mt h ec l o s es t a t et oo p e ns t a t e k e y w o r d s ：p r o p o f o l ；b k c a ；c e r e b r a la r t e r i a lv a s c u l a rs m o o t hm u s c l e ； h y p o t e n s i o n 6 _ - l 上- j i - - 刖吾 异丙酚因为起效快，作用时间短，长期使用无蓄积以及苏醒过程 平稳等优点被广泛用于临床麻醉和i c u 镇静，然而其明显的心血管抑 制作用也一直备受关注。近二十年来，在异丙酚降压作用机制的研究 中，多数学者认为直接舒张血管平滑肌作用是其主要的降压机制。其 机制主要有：抑制电压或受体门控的钙离子( c a 2 + ) 通道，减少细胞 内钙离子浓度；抑隹i l j l ，4 ，5 - - - 磷酸肌醇( i p 3 ) 的合成，而减少胞内钙 库释放钙；增加细胞i 为c g m p 含量等而松弛血管平滑肌l 2 】。此外，异 丙酚还通过抑制平滑肌细胞膜容量敏感的氯通道，激活钾离子通道 。 ( 包括钙激活钾通道、电压依赖性钾通道、a t p 敏感钾通道) ，使细 胞膜超极化而致使平滑肌舒张。 b k c a 通道广泛分布在血管平滑肌细胞膜，加之大电导的特性，较 少的通道激活即可对膜电位的变化产生较大的影响，因此b k c a 通道的 激活在调控血管平滑肌舒缩中起着举足轻重的作用。有学者认为b a - 通道是众多血管活性物质作用的最后靶点之一。自发性瞬时外向钾电 流( s p o n t a n e o u s t r a n s i e n to u t w a r dk + c u r r e n t s ，s t o c s ) 是胞内钙事件 触发的b k c a 通道电流，是b k c a 通道钙敏感性指标之一，也是平滑肌 舒张的重要机制之一【3 】o 离体血管环实验发现b k c a 通道特异性阻断剂i b t x 能抑制异丙酚 导致的血管舒张，提示b k c a 通道的开放是异丙酚降压作用的重要机制 之一【4 1 。近年来也有研究采用膜片钳技术直接证实异丙酚能激活血管 平滑肌细胞b k c a 通道，并发现这种激活作用在盐敏感大鼠中更为显 著i 然而，异丙酚究竟通过何种机制激活b k c a 通道，以及异丙酚对血 管平滑肌细胞s t o c s 的作用，目前少有相关方面的报道。钙离子作为 细胞信息传递的胞内第二信使，在各种生命活动中起着至关重要的作 用，更是引起平滑肌收缩的决定因子。研究显示自发性高血压病人 b k c a 通道p 1 亚单位表达下调，提示高血压b k c a 通道钙敏感性降低， 而荧光免疫技术证实高血压状态下血管平滑肌细胞胞内存在钙超载 1 5 , 6 。结合临床发现异丙酚在高血压病人降压作用更为显著，我们推 测引起这种差异的原因之一是异丙酚增加了b k c a 通道的胞内钙敏感 性。因此，本课题采用全细胞和内面向外单通道膜片钳技术从分子水 平研究异丙酚对小鼠脑动脉血管平滑肌细胞b a 通道及s t o c s 的作 用，探讨异丙酚对该通道钙敏感性和通道动力学的作用，以进一步揭 示异丙酚舒张血管平滑肌的机制。 材料与方法 1 研究对象 实验动物：正常小鼠，1 5 2 0g ，雌雄不拘，取于泸州医学院动物 房。 2 实验试剂 异丙酚购置于英国a s t r a z e n e c a 公司( 批号：g f 3 5 7 ) 。白蛋白( 批 号：8 5 0 4 0 c ) ，液体木瓜蛋白酶( 批号：7 6 2 1 6 ) ，i i 型胶原酶( 批号： c 6 8 8 5 ) ，f 型胶原酶( 批号：c 7 9 2 6 ) ，d t t ( 批号：4 3 8 1 7 ) ，d t e ( 批 号：d 8 2 5 5 ) ，i b t x ( 批号：1 5 9 0 4 ) ，两性霉素b ( 批号：a 4 8 8 8 ) ，二 ：，女 甲亚砜( 批号：d 8 4 1 8 ) 均购自美i 亘s i g m a 公司，余为国产分析纯试 剂。异丙酚用二甲亚砜溶解( 浴液中的二甲亚砜终浓度 o 2 ，已证 实0 3 的d m s o 对通道电流无明显影响) 。 2 1 酶液的配制： 酶液i ( m g m 1 ) 木瓜蛋白酶0 3 ，d t e0 2 ，用低钙p s s 液( o 1 m m c a c l 2 ，下同) 稀释； 酶液i i ( m g m 1 ) - f 型胶原酶o 8 ，i i 型胶原酶1 0 ，d t t1 0 ，用 低钙p s s 液稀释。 2 2 溶液的配制： 无钙p s s 液( m m ) ： n a c l1 2 7 ，k c l5 9 ，m g c l 21 2 ，葡萄糖1 2 ，h e p e s1 0 ，用n a o h 调p h 值至7 4 左右。 葡萄糖1 2 ，h e p e s1 0 ， e g t ao 0 5 ，两性霉素 葡萄糖1 0 ，h e p e s1 0 e g t a 2 ( p h 7 2 ) 。 e g t a 1 ( p h7 2 ) 。其 ) ( 1 + c a 2 + x k 、) c a 2 + 】为加入的c a c l 2 与e g t a 整合后浴液中游离钙浓度， e g t a 为e g t a 的浓度，k 、为 钙和e g t a 的表面结合常数，k 、= 1 0 7 一( p h = 7 2 ，2 2 c ) 。当e g t a 浓 度为1m m ，浴液中a d d c a 2 + 浓度分别为0 、o 11 、0 5 5 、0 8 6 、0 9 2 和lm m 时，游离钙离子浓度( 【c a 2 + 】疗) 分别为0 、0 0 1 、o 1 、o 5 、 1 和1 0 “m 。 3 主要实验仪器 l d 。 、膜片钳放大器( a x o p a t c h2 0 0 b ，美国a x o ni n s t r u m e n t s 公司) ； 、微管电极拉制器( p c 一1 0 ，日本n a r i s h i g e 公司) ； 、微管电极抛光仪( m f 一8 3 ，日本n a r i s h i g e 公司) ； 、倒置相差显微镜( i x 7 1 ，日本o l y m p u s 公司) ； 、a d d a 转换器( d i g i d a t a 一1 3 2 2 a ，美国a x o ni n s t r u m e n t s 公 司) ； 、恒温水浴震荡器( g l d 一3 0 9 3 8 ，德国) ； 、微推进器( m h w - 3 ，日本n a r i s h i g e 公司) ； 、体视显微镜( s 8 a p o ，l e i c a ，德国) ； 、m i l l i p o r e 超纯水仪( e l i x 3 m i n i q b i c e l ，m i l l i p o r e ，美国) ； 、超低温冰箱( m d f 3 8 2 e ，s a n y o ，日本) 。 膜片钳系统连接示意图如图1 所示。 图1 膜片钳系统连接示意图。 f i g u r e1 t h eb l o c kd i a g r a mo fc o n n e c t i o no fe x p e r i m e n ti n s t r u m e n t s 4 实验方法 4 1 取材与脑动脉平滑肌细胞的分离 小鼠取自泸州医学院动物房，1 5 2 0g ，雌雄不拘。采用腹腔注射 戊巴比妥钠( 6 0m g k g ) 麻醉小鼠，迅速断头，小心分离取出大脑组 织置于冰的低钙p s s 液中，在体视显微镜下分离出大脑底部动脉，然 后在无钙p s s 液中剔除血管周围组织，注意操作轻柔，尽量减少对血 管的损伤。再将血管组织放于盛有酶液i 的e p 管中在恒温水浴震荡箱 ( 3 7 ，1 0 0 7 蚴) 消化7 9 分钟中。取出e p 管，吸出上清液，用酶液 i i 清洗2 至3 次，再将剩下的酶液i i 倒入血管组织中，于恒温水浴震荡 箱( 3 7 ，1 0 0 次分) 里消化7 9 分钟。取出e p 管，同样的方法用含 白蛋白( 1m g m 1 ) 的p s s 液清洗4 5 次，尽量洗去残余的酶液。轻轻 拍打e p 管底部，使细胞能均匀的分布于悬液中。吸出细胞悬液铺于事 先准备的小盖玻片上，静置8 分钟使细胞帖覆，再加入冰的含白蛋白 的p s s 液后置于4 。c 冰箱保存备用。以上所有操作均在2 0 2 5 室温条 件下进行。 4 2 全细胞膜片钳电压钳制记录 4 2 1 电极的制备 ( 1 ) 微管电极拉制 选用内径lm m 、壁厚o 2 5r a i n 的软质玻璃毛细管( 美国 d r u m m o n ds c i e n t i f i c 公司) ，置于微管电极拉制器上，经两步拉制而 成，全细胞实验时充灌电极液后电极阻抗约为2 - - 4m q 。 ( 2 ) 电极抛光 将两步拉制后的微管电极置于抛光仪垂直推进架上，在低倍镜 ( 1 5 4 ) 下找到电极尖端和加热电阻丝，然后换成高倍镜( 1 5 x 3 3 ) ， 将加热电阻丝和电极尖端调整至一个平面内，进行瞬间加热，使电极 尖端表面变得更加光滑，有利于巨欧封接的形成。 。 。 、 4 2 2 高阻封接的形成 在室温条件( 2 0 2 5 。c ) 下进行。将贴有细胞的小盖玻片放入盛 有1m l 全细胞浴液的浴槽内，先于低倍镜下寻找平滑肌细胞。选取细 胞贴壁良好，立体感强，泽光性好，呈长梭形，大小适中的细胞进行 试验。采用新拉制的电极，用自制的细塑料管向电极内注入全细胞电 极液，液面于电极管1 3 至1 4 较为合适。然后敲弹电极尾端管壁，排 出气泡，使电极液充满电极尖端。将电极接于放大器探头上，注射器 给于1 2c m h 2 0 的正压，借助电极操纵器，将电极入水。调节放大器 上的p i p e t t eo f f s e t 旋钮，将液接电位补偿到零，同时由膜片钳放大器 向电极发放电压为5m v 、波宽4 0m s 的方波脉冲信号，用于监测封接 过程。在高倍镜下将电极尖端移至所选细胞上方，使用微调节处理器 是电极尖端接触细胞表面，撤去正压，给予1 0 2 0 c m h 2 0 的负压，此 时应答电流变小，观察计算机屏幕上的电极阻抗不断增加，直至大于 lg o ，应答电流降至零，则高阻封接形成，这时形成的即是细胞贴 附式膜片。 t 细l a l a - k 3 素 膜：夕b p l l 向外膜片 杪 ，凡、 叫x 一 图2 四种膜片钳构型形成示意图。 f i g u r e2 t h es k e t c hm a po ft h ec o n f i g u r a t i o n so fp a t c h - c l a m p 4 2 3b k c a 通道宏观电流幂h s t o c s 的记录 本实验采用穿孔膜片钳技术，在高阻封接形成后，等待穿孔电极 液破膜，若观察到膜电容产生，则全细胞膜片形成。保持电位为一6 0 m v ( 接近血管平滑肌细胞静息膜电位) ，给予去极化脉冲从- 6 0m v 到+ 6 0m v 的阶跃刺激，持续时间为4 0 0m s ，阶跃1 0m v ，刺激间隔 时间1 s 。斜坡刺激方案采用一8 0m v 到+ 7 0m v ，斜率0 3 7 5w s ，时程 4 0 0m s 。s t o c s 在持续稳定的去极化膜电位( 5 0 至0m v ) 下记录。 刺激脉冲通过p c l a m p1 0 0 软件控制的d a 转换器( d i g i d a t a1 3 2 2 a ， a x o ni n s t r u m e n t s ) 控制，记录的信号经数模转化器存入计算机硬盘， 滤波频率1k h z ，采样频率1 0k h z 。 4 3 单通道膜片钳电压钳制记录 4 3 1 电极的制备 1 4 ( 1 ) 微管电极拉制 选用内径l1 f l i r t 、壁厚o 2 5m m 的软质玻璃毛细管( 美国 - d r u m m o n ds c i e n t i f i c 公司) ，置于微管电极拉制器上，经两步拉制而 成，调整参数使单通道实验时电极阻抗约为1 0 1 5m q 。 ( 2 ) 电极抛光 同前。 4 3 2 内面向外式膜片的形成 在室温条件( 2 0 2 5 ) 下进行。如全细胞膜片的方法找到细胞， 电极入液，发放振幅1m v ，波宽4 0m s 的矩形脉冲作为参考脉冲，以 检测电极尖端阻抗。给予电极内1 2c m n 2 0 正压，并调节放大器 “v - c o m p 旋钮补偿液接电位为零。移动电极与细胞接触，撤去正压， 给予1 0 一2 0c m h 2 0 的负压抽吸，观察应答电流减为零，形成高阻封接。 用微电极将电极提出液面，- 静置数秒钟，再放入浴液中，则形成内面 向外式膜片。 4 3 3 单通道电流的记录 待内面向外膜片形成2 0 3 0m i n 后，或每次加入药物后5 1 0m i n 方才开始记录电流，电流信号经膜片钳放大器放大，lk h z 低通滤波， 经12 位a d 、d a 转换器在专用软件p c l a m p10 0 记录储存于计算机 硬盘内。采样频率为1 0k h z ，采样方式为c l a m p e x 下的g a pf r e e 方 式。采用细胞膜内面的电位作为膜电位值。 4 4 数据统计与分析 膜片钳实验数据采用c l a m p f i t1 0 0 进行分析。全细胞宏观电流用 电流密度( p a p f ) 表示和统计分析。s t o c s 采用m i n i a n a l y s i s 软件 ( s y n a p t o s o f is o f t w a r e ，l e o n i a ，n j ) 进行分析。单通道实验数据分 析包括开放概率( n p o ) 、开放驻留时间( o p e nd w e l lt i m e ) 、关闭驻留 时间( c l o s ed w e l lt i m e ) 、开放时间常数( o p e nt i m ec o n s t a n t ) 、关闭时 间常数( c l o s et i m ec o n s t a n t ) 、开放速率常数( o p e nr a t ec o n s t a n t ) 、关 闭速率常数( c l o s er a t ec o n s t a n t ) ，量效曲线拟合采用h i l l 方程) ，= x b ( c w ) 进行，其中x 代表异丙酚或者胞内游离钙离子浓度 ( c a 2 + 】疗e e ) ，c 代表异丙酚的半数最大效应浓度( e c 5 0 ) 或者钙离子 解离常数( 磁) ，b 代表斜率因子( h i l l 常数，n h ) 。 所有计数资料采用均数4 - 标准差( m e a n + s e m ) 表示，采用配 对或成组单因素方差分析( a n o v a ) 进行统计学分析，p 0 0 5 ，“护代表p 0 0 5 ， “料”代表p 0 01 ，“木料 代表p 0 0 01 。 果 ， 1 小鼠脑动脉平滑肌细胞b k c a 通道的基本特性 1 1b a 通道全细胞宏观电流和s t o c s 特性 本实验采用全细胞穿孔膜片钳技术记录b a 通道宏观电流和 s t o c s ，保持电位为6 0m v ，接近平滑肌细胞的静息电位。结果显 示b k c a 通道激活呈明显的电压依赖性，随着去极化电压的增加， b a 通道宏观电流密度明显的增加( 图3 a ) 。通过i v 曲线可以看出， b a 通道电流表现为外向整流特性( 图4 c ) 。进一步分析宏观电流 特征可以看出，s t o c s 随机的叠加于b k c a 通道宏观电流之上，呈大 噪声样( 见图3 a ) 。而对于s t o c s 的记录则在持续稳定的膜电位下进 行长时程采样分析( 一5 0 0m v ，共6 个电位水平，持续时间3 0s ) 。 如图3 b 所示，、多个膜电位水平均可记录到s t o c s ，随着膜去极化电 位的增加，s t o c s 的频率和幅度均增加，表现出明显的电压依赖性。 b k a 通道宏观电流和s t o c s 都能被b a 通道的特异性阻断剂i b t x ( 2 0 0n m ) 抑制( 图3 a ，b ) ，表明s t o c s 电流主要为b a 通道所携 带。 1 2b a 通道的单通道电生理学特性 本实验还采用了内面向外单通道膜片钳技术对b k c a 通道进行研 究。在浴液和电极液呈对称性高钾( 1 4 0m m ) 状态下，钳制电位从 4 0m v 去极化至i j + 4 0 m v ，每次记录时间为3 0s ，所得电流如图3 c 所 示，可见随着钳制电位的增加，通道开放频率明显增加，在0m v 钳 7 “ 制电位下，无通道开放( 【c a 2 + 】舶。= o 5 州) ，这也显示b k c a j 置道表现 出明显的电压依赖性。 。 通过改变细胞膜内外钾离子浓度，即 k 1 。：【k + 】i = 14 0 ：1 4 0m m ， 【k q 。： k + 】j = 1 4 0 ：6m m ， 柚o ：【柚i = 6 ：1 4 0m m ，分别在以上几种情况 下记录不同钳制电位下的电流，然后做i v 曲线，经 g o l d m a n h o d g k i n k a t z 方程拟合，得到反转电位与伦斯特方程 e k = ( r t f ) l n k + o k + 】i 计算得到的理论值基本一致，在对称性高钾溶 液中，b i a 通道的反转电位为零，结果表明b k c 墒_ 道具有明显的钾 离子选择性。在对称性高钾溶液中，通过计算得到单个b a 通道电 导值为2 0 5 4 + 4 3 6p s ( n = 2 5 ) ，表明b a 通道具有大电导特性。 另外，改变浴液钙离子浓度，可见通道具有明显的钙离子依赖 性，开放概率随着浴液游离钙离子浓度的增加而增加，如图3 e 所示 在钙离子浓度为0 。5 州时，通道呈多个水平同时开放。在外面向外 式膜片下，b k c a 通道的特异性阻断剂i b t x ( 2 0 0n m ) 能明显抑制该 电流( i b t x 作用于通道外口) 。 以上实验所得的小鼠脑动脉平滑肌细胞b k c a 通道基本 性，即钙敏感性，电压依赖性，钾离子选择性，大电导特 特异性阻断剂i b t x 阻断等，具有与人肠系膜动脉平滑肌， 约肌，支气管平滑肌，猪冠脉平滑肌，大鼠主动脉平滑肌等 通道类似的电生理学特性【7 。1 2 1 。同时，与文献报告的小鼠脑 l i a b k c a 通道的基本电生理学特性一致1 3 1 。 b om v 1 0 m v 2 0m v ；d 。“矗。i “【l “j j li _ j 。上i i ki i l 厶i “i i i i l 。i l i k j l 上 - 4 0 m v 。j j 。k 。、l 。 。l j l 。l 一 - 5 0m v 。k l 。 c + 4 0 m v 1 0 0p a i _ _ - 一 l 墨 o c + 3 0m vl 烈_ l l 理l 嚣孵rl | 1 1 旷甲可翻1l r 传i ；l | l - 1 1 i 豫! n 爪i l ，雕uo 。 + 2 0 m v 1 1 i i i i l i；眦l n i 自iu2 + 1 0m v _ ，、“唾n _ - 矗n u u - _ “- - u l _ j 船u u 越_ 2 0m v c 1 0m v ，_ - - n _ ，_ ，1 _ _ p 一s - 2 0m v 呷广1 1 广 一1 r r 。r 1 一一s - 3 0m v _ r 1 下1 ： - 4 0 m v c ，”l i o 5 0 0 m e 【c a 2 + 1 蠡c c = 0m c a 2 + f m - - 0 5 弘m 1 0 ”l ls 1 9 c o n t r o l 2 0 0n mi b t x d 2 0p a 5 0 0m s o c d l i 一夕 i c 。n2 1 5 i - c 0 1 i ， e | l r l ：f 1 1 1 4 0 r a m。“ l - - i kl ：弦l 。1 4 0 4 0 m m l t 1 j i k 卜1 4 0 ：6 r a m 一_ 。i 。5 南如i o ：，p 声”哪 庐 v m m v 一彳 - l e 。， f c o n t r o l l l ll _ u | i i瞩 一 2 0 0 n m i b t x 1 0p a l 2s 愀批 图3 小鼠脑动脉平滑肌细胞b l ( c 。通道的基本特性。a ，b k c 。通道全细胞宏观 电流图。s t o c s 叠加在宏观电流上，呈大噪声样。2 0 0n mi b t x ( b k c 。通道的特 异性阻断剂) 能明显抑$ o b k c 。通道电流。b ，s t o c s 的电压依赖性。电流的幅度 和频率随着去极化电压的增加而增加。2 0 0n mi b 能明显抑锋j i j s t o c s 。c ，内 面向外膜片下，b k c 。通道具有明显的电压依赖性。d ，不同钾离子浓度梯度下b k c 。 通道的i - v 曲线( 用n a + 替代k + ) ，【k + 】o 、【k q i 分别代表细胞膜两侧的钾离子浓度， 曲线经过g o l d m a n - h o d g k i n - k a t z 方程钾离子平衡电位拟合。e ，b k c 。通道钙离子 依赖性的典型电流记录图( 内面向外膜片下，+ 4 0m v 膜电位) 。f ，b k c 。通道i b t x 敏感性，外面向外构型下，b 。通道能够被2 0 0n mi b t x 阻断。 f i g u r e3 p r o p e r t i e so fb k c ai nm o u s ec e r e b r a la r t e r ys m o o t hm u s c l ec e l l s ( a ) at y p i c a lr e c o r d i n go fw h o l e - c e l lm a c r o c u r r e n t so fb k c a s t o c ss u p e r i m p o s e d s t o c h a s t i c a l l y o n t ow h o l e - c e l lc u r r e n t s ，a n db o t hc u r r e n t sw e r es i g n i f i c a n t l y s u p p r e s s e db y2 0 0n mi b t x ，as p e c i a lb l o c k e ro fb k c a ( b ) t h ep r o p e r t i e so f s t o c s t h ea m p l i t u d ea n df r e q u e n c yo fs t o c si n c r e a s e da st h em e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n ，w h i c hc a na l s ob eb l o c k e db y2 0 0n mi b t x ( c ) at y p i c a lr e c o r d i n g o fs i n g l ec h a n n e lc u r r e n t si na ni n s i d e o u tm e m b r a n ep a t c hc o n f i g u r a t i o n t h e u p w a r dd e f l e c t i o ni n d i c a t e so u t w a r dc u r r e n t s ( d ) a ne x a m p l eo