（食品科学与工程专业论文）几种泡菜的安全性研究与优良乳酸菌的分离、鉴定.pdf

摘要 对市售的2 0 种泡菜样品进行了与安全性有关的化学和微生物学指标的分析。结果表明泡菜 产品的孤硝酸盐与挥发性亚硝胺含量因产品种类的不同而存在较大差异，三类产品中白菜类产品 的亚硝酸盐及挥发性亚硝胺含量显著高于箩i - 类和黄瓜类产品，且萝i - 类产晶的挥发性皿硝胺含 量显著高于黄瓜类产品。微生物学分析表明产品中的乳酸苗数量较高，所有样品中都检出了芽孢 菌，部分样品检出了一定数量的真菌，所有样品均来检出肠道菌。总体而言，所检泡菜样品具有 较好的微生物学安全性。 食盐用量对泡菜发酵过程中的微生物变化及有害物质含量具有显著影响，较低浓度食盐( 4 ) 能缩短异型乳酸菌的发酵时间，较大程度的抑制肠道菌和芽孢菌的生长，但对真菌的抑制作用不 明显。较高浓度的食盐( 1 0 ) 则能延长异型乳酸菌的发酵时间，较大程度的抑审4 肠道菌和真菌 的生长但对芽孢菌的影响不显著，而且高浓度食盐能显著减少发酵过程中亚硝酸盐含量和终产 品中亚硝胺含量。添加一定量的大蒜、生姜、丁香等香辛料能显著影响泡菜发酵初期各种微生物 的变化，降低亚硝酸盐含量，有利于提高泡菜产品的安全性。 从食品安全的角度出发，以产酸速度、亚硝酸盐降解能力、是否产生物胺、是否产广谱高效 抑菌物质为筛选指标，对自新鲜泡菜汁中分离得到的5 0 余株乳酸菡菌株进行了筛选，结果得到2 株性能优良、适合泡菜发酵的乳酸菌菌株。采用a p i5 0 细菌鉴定系统对所筛选的乳酸菌进行的 生理生化鉴定表明它们分别为植物乳杆菌和歧异肉食杆菌。 关键词：泡菜；安全性；乳酸菌 a b s t r a c t i nt h i sp a p er s a f e t yo fp i c k l e s ，w h i c hi sac h i n e s ei r a d i t i o n a l a c t i c f e r m e n t e df o o d ，w a sm a i n l y s t u d i e d t w e n t yc o m m e r c i a lp i c k l es a m p l e sw e r ec o l l e c t e df r o md i f f e r e n tc h i n e s er e g i o n sa n di n v e s t i g a t e d f o rc h e m i c a la n dm i c r o b i o l o g i c a la n a l y s e sf r o mf o o ds a f e t yp o i n to fv i e w t h er e s u l t ss h o w e dt h a t c o n t e n to fn i t r i t e sa n dv o l a t i l en i t r o s a m i n e sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n ta c c o r d i n gt ot h ev a r i e t i e so f p i c k l e s c o m p a r e dw i t ht h ev a r i e l i e so fr a d i s ha n dc u c u m b e rp i c k l e s c o n t e n to fn i 砸t e sa n dv o l a t i l e n i t r o s a m i n e si nt h ev a r i e t yo fc a b b a g ep i c k l e sw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h w h i l et h o s ej nr a d i s hp i c k l e s w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc u c u m b e rp i c k l e s m i c r o b i o l o g i c a la n a l y s e ss h o w e dt h a th i g hl e v e lo f l a b ( 1 a c t i ca c i db a c t e r i a ) o c c u r r e di nm o s ts a m p l e sa n dl o wl e v e lo ff u n g iw e r ef o u n di nap a r to f s a m p l e s ，w h i l ea l ls a m p l e sc o n t a i n e ds o m es u r v i v i n gb u ti n a c t i v eb a c t e r i a le n d o r s p o r e s a n dn o e n t e r o b a e t e r i a c e s e f r o mm i c r o b i o l o g i c a lp o i n to fv i e w , a l lp r o d u c t sw e r es a f e c o n e e n l r a t i o no fe d i b l es a l th a dg r e a te f f e c t so nl h em i c r o b i o l o g i c a lc o m m u n i t ya n t ic o n t e n to f n o x i o u sc o m p o u n d sd u r i n gp i c k l e sf e r m e n t a t i o n h i g hc o n c e n t r a t i o no fb r i n e ( 1 0 ) m a d et h e h e t e r o f e r m e n t a t i o no fl a bp r o l o n g e da sw e l la sf u n g ia n de n t e r o b a c t e r i a c e a ei n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l y ， w h i l ei o wc o n c e n t r a t i o no fb r i n e ( 4 ) m a d et h eh e t e r o f e r m e n t a t i o no fl a bc o n d e n s e da n d e n t e r o b a c t e r i a c e a ea n db a c t e r i a le n d o s p o r e si n h i b i t e de f f e c t i v e l y i nt h es a m et i m e ，a d d i t i o no fg a r l i c ， g i n g e ra n dc l o v ei n f l u e n c e dm i c r o b i o l o g i c a lc o m p o s i t i o na n dd e c r e a s e dc o n t e n to fn f t r i t e st os o m e e x t e n ti nt h ei n i t i a lf e r m e n t e ds t a g e ，w h i c hw a sv e r ya d v a n t a g e o u st oe n h a n c es a f e t yo fp i c k l ep r o d u c t s t w op r e f e r a b l es t r a i n so fl a bw e r eo b t a i n e df r o mf r e s hp i c k l eb r i n e st h r o u g ht h es c r e e n i n g c r i t e r i o n sw h i c hi n c l u d e dv e l o c i t yo f a c i dp r o d u c t i o n ，a b i l i t yo fn i t r i t e sd e c o m p o s i t i o n ，a b i l i t yo f b i o g e n i ca m i n e sp r o d u c t i o na n da b i l i t yo fa n t i b a c t e r i a lm a t t e r sp r o d u c t i o n i d e n t i f i c a t i o no ft h et w o i a bs t r a i n sb ya p ic hp r o d u c t ss h o w e dt h a tt h e yw e r el a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u ma n dc a r n i b a c t e r i u m d i v e r g e n sr e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：p i c k l e s ；s a f e t y ；l a c t i ca c i db a c t e r i a 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：尹利端 尹痢旆 时间：2 0 0 5 年3 月2 1r 噼- ；日州日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文 的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，- q - 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传援学位论文的全部或部分 内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：尹利端 尹剥讳 导师签名： 旆圯易 时间：2 0 0 5 年3 月2 1 月 1 矿巧令；弓， a 时间：2 0 0 5 年3 月2 1 日 皇里垒些查兰堡当耋! 丝兰； 。；。鎏= 茎塑些 1 1 研究目的和意义 1 1 1 国内外的食品安全形式 第一章绪论 “民以食为天，食以安为先”目前，随着食品安全恶性事件的不断增长以及消费者对食品 安全问题的日盏关注，世界各国政府都在致力于改善食品鲍安全性。食品安全是关系到消费者健 康、国家经济发展、社会稳定及国家安全等一系列重大问题的大事。 国际上，食品安全恶性事件不断发生。二恶英( 欧洲) 、大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ( 日本、欧洲、 美国) 、牛海绵状脑病( 病牛病) 等影响食品安全的全球性恶性事件频频发生。其中有的引起众 多消费者急性发病乃至死亡，如大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 引起近万人食物中毒；有的引起的病例虽然不 多，但病死率高、社会影响大，如疯牛病引起人克雅氏病：也有的化学污染物造成广泛的食品污 染，对人体健康具有长期而严重的潜在危害，如二恶英、农药和兽药残留的污染等。食品安全事 件造成的经济损失十分可观，如美国每年约有7 2 0 0 万人发生食源性疾病，造成3 5 0 0 亿美元的损 失；英国自1 9 8 6 年公布发生疯牛病以来，仅禁止牛肉贸易一项，每年就损失5 2 亿美元，为彻底 杜绝“疯牛病”而不得以采取的宰杀行动损失3 0 0 亿美元：比利时发生的二恶英污染事件不仅造 成了比利时的动物性食品被禁止上市并大量销毁，而且导致世界各国禁l e 其动物性产晶的进口， 据估计其经济损失达1 3 亿欧元i l i 。 就我国的食品安全形势下下而言，我国在基本解决了食物量的安全( f o o ds e c u r i t y ) 之后，食 物质的安全( f o o ds a f e t y ) 正越来越引起全社会的关注。目前我国总体食品安全状况是好的，特 别是1 9 9 5 年食品卫生法实施以来，总的食品合格率不断上升；然而，随着市场经济的发展和食 物链中新的危害不断涌现存在着许多亟待解决的不安全因素以及潜在的食源性危害。目前我国 食品安全方面主要存在的问题包括：食源性污染造成的中毒问题，特别是微生物污染造成的食源 性疾病问题；农药、化肥、兽药、生长调节剂等农用化学品的大量使用不仅从源头上给食品安全 带来隐患，给消费者造成严重的危害，而且还严重影响我国的食品出口，如畜禽肉( 如冻鸡等) 长期因兽药残留问题而出口欧盟受阻，茶叶由于农药残留问题而出口多国受阻，输韩鸭肉因含有 禽流感病毒而受阻等等；应用新技术、新工艺、新原料带来的食品安全问题，如转基因技术、辐 照技术、益生菌和酶制剂等技术在食品中的应用，食品新资源的开发等；生产经营者由于法律意 识淡薄、缺乏良知等进行违法生产经营导致的问题等t 1 。 我国已经加入w t o ，我国的食品产业要参与国际竞争，减少技术性贸易壁垒对我国食品业 的限制，就必须构建与国际接轨的食品安全保障体系，就必须遵守世贸组织有关食品安全的分析 和采样方法以及卫生操作规范。因而我国构建强有力的食品安全保障体系刻不容缓1 1 1 2 发酵蔬菜产业现状 中国农业人学硪1 ：学位论文 第一章绪论 11 ，2 1 我国蔬菜产业现状 我国是蔬菜产业大国，蔬菜种植面积和产量均居世界第一pj 。1 9 9 9 年我国的蔬菜种植面积达 1 1 1 3 万公顷，设旌栽培面积达到1 2 0 万公顷，年蔬菜总产量3 - 2 亿吨，人均蔬菜占有量达i x j 2 5 3k g ； 2 0 0 1 年我国的蔬菜种植面积为1 5 2 3 7 万公顷，占世界蔬菜播种总面积的3 5 ，总产量为42 4 亿吨， 占世界总产量的4 0 左右，人均占有量大于3 1 0k g ”。从总产量上看，中国已成为世界头号蔬菜 生产大国，而且蔬菜总产量逐年上升，但是我国相应的蔬菜采后贮运加工能力却十分落后，采后 预处理、分级、包装设备严重不足流通领域冷链系统不健全。蔬菜损失高达总产量的3 0 ；我 国蔬菜的年加工量仅占蔬菜总产量的2 - 4 。7 】；我国目前出口的加工蔬菜产品不但数量少而| i 品种单一，大部分是粗加工产品，这些都严重影响了我国蔬菜产业的产值。 加入w t o 后。中国蔬菜产业将面对国际、国内两个市场，蔬菜产品将面临与发达国家在质 量和价格方面的双重竞争，要让中国的蔬菜产品走向世界，使中国的蔬菜产品在国际市场上有竞 争力。就应该搞好蔬菜产品的采后贮藏加工，以提高蔬菜产品的附加值，让农民既增产又增收。 1 1 2 2 韩国和日本的腌制蔬菜产业现状 统计资料显示，2 0 0 0 年全球腌制蔬菜贸易总额约为1 3 亿美元，在国际市场上日韩两国占据 了9 5 以上的份额【4 j 。韩国自1 9 7 4 年出现第一家工业化泡菜企业以来。至今日几乎已成为纯粹 的工业产品。韩国泡菜的不断更新在国际上也得到认可，1 9 9 7 年在国际食品规格委员会会议上， 将泡菜的国际标记定为韩国泡菜两字的发音即“k i m c h i ”。目前，韩国泡菜已经发展到很大规模， 1 9 9 9 年韩国国内泡菜市场产值约为1 6 。7 亿美元：2 0 0 2 年韩国泡菜销售额约为2 0 亿美元，出口总 额达7 9 3 1 万美元：2 0 0 3 年上半年韩国泡菜出口量达到1 5 8 8 3 吨，2 0 0 3 年1 1 1 月，泡菜出口额 达到了8 4 6 4 万美元。现在韩国的泡菜出口额正在以每年1 0 的速度增长，其出口对象也从以前 的主要面对日本到现在的面向全球i “”。韩国晟大的泡菜厂宗家泡菜厂，采用g m p 、h a c c p 体系进行管理，通过i s 0 9 0 0 0 认证，现代化水平非常商，年产值1 亿美元以上，产品7 0 出口日 本吼 日本既是一个腌制蔬菜消费大国，也是一个生产大国，拥有腌制菜生产企业2 2 0 0 多家。近 年由于受到居民高龄化、劳动人口下降、土地面积减少等因素的影鸭，蔬菜总产量从1 9 9 6 年的 1 4 3 亿吨下降到2 0 0 2 年的1 3 5 亿吨，自给率只有8 2 。但日本的“渍菜”并未受到影响，依靠 从中国、美国等蔬菜输出国进口生鲜蔬菜和腌制半成品，仍保持着上升的势头，其国内腌制菜产 量从1 9 9 6 年的1 0 8 万吨攀升到了2 0 0 2 年的1 1 8 万吨，占其加工蔬菜的3 2 6 ，总生产额为3 6 亿美元口。 f 1 2 3 我国发酵蔬菜行业的现状及存在的问题 我国是发酵蔬菜的起源国，其历史可追溯到2 0 0 0 多年以前。约在1 3 0 0 年前，我国的泡菜传 入韩国，1 7 世纪，欧洲从我国引进泡菜生产技术。我国发酵蔬菜产业的真正发展是在建国后，尤 其是近2 0 年。加0 0 年，我国泡菜工业的市场销售额约为1 0 亿元2 0 0 2 年我国的腌制菜企业共 有2 6 4 2 个，从业人员2 0 多万，年产量2 7 0 万吨左右，四川新繁泡菜是我国第一家把家庭作坊式 制作泡菜进行规模化大生产的腌制菜企业，年产值超过4 0 0 0 万元。浙江省已经有几家腌制菜生 2 中副农业大学倾：l 学位论文 第一章绪论 产企! 1 2 年产值超过亿元，生产设备和工艺都也比较现代化p 。 然而，由于我国的发酵蔬菜行业是在原来基础很薄弱的情况f 发展起来的，与日韩等腌制菜 业发达国家相比，还存在着很大的差距。我国发酵蔬菜行业很多仍采用传统的浸泡、盐浈等工艺 生产企业分散，层次不一，普遍存在劳动强度大、效率低一r 、品种单一、质量不稳定、企业规模 小、生产标准不统一等问题，严重制约了我国发酵蔬菜行业的发展。2 0 0 2 年，我国发酵蔬菜行业 产量最大的5 家企业的产量约占全国总产量的5 。中国泡菜的代表之一四川泡菜企业有3 0 多家， 其全部出口总额还不到5 0 0 万美元，而韩国河善贞综合食品有限公司每年的产值为2 0 0 0 万美元。 i 出口总额近1 0 0 0 万美元i 。 由此看来，我国的蔬菜产业还有巨大的发展空间，尤其是蔬菜的产后加工方面。作为蔬菜加 工的一条重要途径蔬菜腌制当然也具有巨大的发展空问。但是要把蔬菜产业的资源优势转变 为竞争优势需要一个过程，要把我国的发酵蔬菜产业作大作强需要我们作出多方面的努力。其中 很关键的一条就是深入研究发酵蔬菜的生产工艺，提高产品的安全性和质量，增加产品的附加值， 以使其在国际市场上占有一席之地。在当前形式下，对中国传统发酵食品泡菜的生产工艺与 安全性问题等进行深入研究，探究其有害物质的形成规律，以期改进其生产工艺、推进其规模化 生产、生产出优质安全的产品，不但有荦j 于改善国民健康，而且还能创造巨大的经济效益。搞好 蔬菜腌制等产后加工技术还是解决我国三农问题的一条重要途径，对于中国传统发酵食品走出国 门，走向世界也具有重大意义。 1 2 国内外研究现状 1 2 1 发酵蔬菜制品概述 从蔬菜保藏的机理出发，根据产品在加工过程中是否有显著的发酵过程，可将发酵蔬菜分为 发酵性蔬菜制品和非发酵性蔬菜制品两大类【“。非发酵性蔬菜制品的特点是腌剑过程中食盐用量 较大，微生物发酵作用不显著，产品的含酸量较低，含盐量较高。根据腌制过程用水量的多少， 非发酵性蔬菜制品又可划分为两个小类：( 1 ) 湿态威菜该类产品制成后，菜与腌渍液不分开， 如腌雪里蕻；( 2 ) 千态腌菜，该类产品制成后，菜与腌渍液分开，产品含水量相对较低，如榨菜 等。 发酵性蔬菜制品的特点是在腌制时用盐量较少，腌渍过程中有旺盛的乳酸发酵作用。利用乳 酸菌发酵所产生的乳酸与加入的食盐及调味料等的防腐作用使产品得以保藏。这类产品一般都具 有明显的酸味，主要包括泡菜私酸菜类等。 泡菜是以白菜、萝h 、黄瓜、甜椒等新鲜蔬菜为原料，添加水、食盐及香辛料等辅料，利用 蔬菜自身附着的微生物或添加人工培养的乳酸菌发酵剂，在厌氧环境下进行乳酸发酵而制成的酸 性食品降7 8 】。在中国，泡菜是一种具有悠久历史的大众化乳酸发酵蔬菜制品，其最早的制作方 法可以追溯到2 0 0 0 多年前。千百年来，泡菜产品以其鲜香嫩脆、清爽可口、解腻开胃的品质吸 引着国内外众多的消费者，它还是一种独特的发酵食品经常食用可摄入大量的活性乳酸菌及乳 酸菌代谢产物，它们具有调节肠道微生态平衡、降低胆同醇、提高机体免疫力等保健功能【) “l 。 3 尘里童些叁茎筌圭茎堡篁兰； 崔 ； 。；昌鎏= 茎彗注 而且发酵蔬菜娃一种冷加。i 一食品，因而蔬菜中的维生素、矿物质、膳食纤维等营募物质损火很少， 与新鲜蔬菜相比，它更具独特风味。 1 2 2 泡菜安全性概述 随着科技的进步和对食品安全问题的日益关注，人们开始对一些传统发酶食晶的安全性问题 重新审视，特别是一些家庭自制的腌制食品，如腌肉、腌鱼、腌菜等。这些食品在过去是司空见 惯的家常食品，人们在食用时根本不考虑它们的安全性目题。然丽，正是这些传统发酵食晶茸l 暴 露出许多食品安全性问题( 如生物胺、微生物毒素等) ，给消费者造成严重的危害。泡菜作为我 国一种重要的传统发酵食品，在许多地方都具有一家一户自产自食的传统消费习惯，由于蔬菜自 身的原因及些人为因素，在泡菜加工过程中极易积累亚硝酸盐、生物胺及亚硝基化合物等有害 物质，导致在终产品中这些物质的含量较高：而且泡菜产品还极易被有害微生物污染，导致微生 物数量严重超标，有些微生物甚至会产生毒素，从而给产品带来潜在的安全性问题。泡菜安全性 包括微生物学安全性和化学安全性两个方面。 12 2 1 微生物学安全性 一般用来制作泡菜的新鲜蔬菜表面都附着有大量的附生微生物，这些微生物包括霉菌、酵母 菌、乳酸菌、肠杆菌科细菌及假单胞菌属细菌等。j 。蔬菜原料即使经过反复靖洗，附生微生物 也不能被彻底清除。在泡菜发酵初期，由于发酵环境中乳酸菌尚未成为优势菌，而且环境中有丰 富的营养成分、少量的氧气及适宜的p h 值，为肠杆菌科细菌、真菌等有害微生物的生长提供了 便利条件，所以在发酵初期这些微生物会大量繁殖【9 】。有害微生物的大量繁殖对产品质量是非常 有害的，一是它 f ：! 的代谢产物会严重影响泡菜终产品的风味，破坏产品的感观品质：二是它们能 还原硝酸盐为亚硝酸盐，并且能使氮基酸脱羧产生生物胺，使泡菜中间产品和终产品积累一定量 的亚硝酸盐和生物胺，亚硝酸盐和生物胺在泡菜发酵的酸性环境中极易生成强致癌性的亚硝基化 合物：有些微生物在代谢过程中甚至还产生霉素( 如肠毒素、真菌毒索等) ，严重影响产品的安 全性，因此在泡菜制作过程中有害杂菌的大量繁殖是非常有害的9 “1 1 ”】。在泡菜发酵初期有效 抑制有害微生物的生长对于生产优质安全泡菜产品是非常有利的。人为创造厌氧环境、增加食盐 浓度、添加一些抑菌性调味料、进行接种乳酸菌发酵等可以促进乳酸菌的生长【“1 “】，抑制有害 微生物的生长，减少其危害。 1 2 2 2 化学安全性 与泡菜化学安全性有关的物质包括硝酸盐、亚硝酸盐、生物胺和亚硝基化合物。 ( 1 ) 硝酸盐和亚硝酸盐。硝酸盐和亚硝酸盐是广泛存在于自然环境中的化学物质，特别是 在食物中，如粮食、蔬菜、肉类和鱼类等都含有一定量的硝酸盐和亚硝酸盐h ”。在食品工业中， 硝酸盐和亚硝酸盐是允许使用的食品添加剂，在肉制品工业中它们起到非常重要作用。硝酸盐和 亚硝酸盐控制在安全范围内下会对人体造成危害。但是，大荆量摄入硝酸盐和亚硝酸盐对人体是 有害的。大剂量的亚硝酸盐能够使人体血色素中二价铁氧化成为三价铁，产生高铁血红蛋白，从 而失去携氧及释氧自& 力，引起全身组织缺氧，产生亚硝酸盐中毒症状。当体内高铁血红蛋向达到 中国杠业人学坝j 学位论义第一章绪论 2 0 4 0 时就会出现缺氧症状，达到7 0 以上可导致死l ”“。世界_ _ j _ 生组织和联台国环境规 划署专家小组曾对环境中的砸硝酸盐进行了评价，指出亚硝酸盐能够透过胎盘进人胎儿体内胎 几和小于六个月的婴儿对亚硝酸盐类物质造成的组织缺氧特别敏感，因此建议禁j r 在婴儿食品中 添加。与亚硝酸盐相比，目前获得的毒理学和流行病学资料表明硝酸盐的毒性相对较低。但人 的唾液腺可以浓缩富积硝酸盐并分泌到口腔中，导致唾液中的硝酸盐水平相对较高，而唾液中的 硝酸盐可以被口腔细菌还原为弧硝酸盐。资料显示，尽管唾液中硝酸盐和亚硝酸盐含量的波动水 平个体差别较大，但2 4h 内唾液腙分泌的硝酸盐累积量占硝酸盐摄入量的2 8 左右，而唾液中产 生的亚硝酸盐可以占硝酸盐摄人量的5 - 8 ”j 。 欧共体建议亚硝酸盐不得用于婴儿食品，而硝酸盐也不得作为食品添加剂使用。2 0 0 2 年联合 国粮农组织和世界卫生组织的食品添加剂委员会建议硝酸盐和亚硝酸盐的每日允许摄入量( a d d 分剐为0 0 5m g ，k g 体重和0 0 0 7m 非g 体重。我国g b1 5 1 9 8 - 9 4 中规定了各类食品中关于亚硝 酸盐的卫生限量标准【1 6 j ： 袅卜1 食品中亚硝酸盐限量卫生标准 t a b l e1 - lt o l e r a n c el i m i to f n i t r i t e si nf o o d s 一般蔬菜中的硝酸盐含量比较高，含量水平在1 0 0 0m g k g 以上的蔬菜有生菜、菠菜、芹菜、 甜菜、茵香、韭菜、萝p 、芫婪等，其中生菜最高可以在5 8 0 0m g k g ，菠菜最高可在7 0 0 0m g k g ， 甜菜根可在6 5 0 0m g k g 。蔬菜中硝酸盐的含量与蔬菜的种类、田间种植条件、新鲜度等有关。就 蔬菜的种类面言，一般认为叶菜中硝酸盐含量最高，根菜次之。果菜最低；气候干旱、光照不充 分、氮肥施用量大或土壤缺钼时容易使蔬菜中的硝酸盐含量偏高；一般新鲜蔬菜中硝酸盐含量要 低于不新鲜蔬菜【l ”。近年来由于大量化肥的旌甩，蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的含量显著增加，给 蔬菜及其加工产品造成了严重的潜在危掣”1 ”。 对于泡菜亚硝酸盐的消长规律，国内外均有研究，一般认为亚硝酸盐含量的变化规律为：开 始时亚硝酸盐含量较低，但由于发酵初期杂菌( 肠杆菌科细菌和真菌等) 的硝酸盐还原作用，蔬 菜中大量硝酸盐被还原成亚硝酸盐，使亚硝酸盐含量急剧增加：然后由于乳酸菌代谢产生的乳酸 及乳酸菌自身的酶系统，使相当一部分亚硝酸盐被降解，且乳酸菌的生长也抑制了杂菌的生长， 消弱了其还原硝酸盐的能力：至发酵结束时。亚硝酸盐含量降至最低点。所以整体上看蔬菜发酵 过程亚硝酸盐含量变化会出现一个亚硝峰，这一亚硝蜂是不可消除的【1 3 ”1 8 。1 ”。关于盘f 碍减小 发酵过程中亚硝峰的峰值，赵云斌1 1 7 1 等认为大葱液对亚硝酸盐有较高的清除率，且大葱液对硝 酸盐的靖除率受多种因素的影响，这些因素包括p h 值、反应时间、浓度等。孟宪军i l9 j 等以大白 中国农业大学硕士学位论文 第币绪论 菜为原料进行实验，认为甄硝峰的形成主要是杂菌将硝酸盐还原为硝酸盐的作用，与人白菜自 身的硝酸还原酶无关，并且亚硝峰的消失原因一是酸性条件下的化学降解，二是乳酸菌体内的酶 对亚硝酸盐的降解作用。华南农业大学的段翰英等人【“】证明适宜的食盐浓度、发酵温度及添加适 当阻断物( 如大蒜、维生素c 等) 等可显著降低泡菜发酵过程中孤硝酸盐的含量。 ( 2 ) 生物胺。 生物胺是一类含氮的脂肪族或杂环类低分子化合物，通常分为单胺和多胺两大类【”l 。它们j 泛存在于各种微生物、植物及动物的细胞中，发挥着重要的生理作用。单胺化合物对血管和肌肉 有明显的舒张或收缩作用能抑制癫痫的发作，对精神活动和大脑皮层有重要的调节作1 ；i ；多胺 化合物在生物体的生长过程中，能促进d n a 、r n a 和蛋白质的台成，加速生物的生艮发育。但 是当人体摄入过量的外源性生物胺时。会引起头痛、呼吸紊乱、心悸、血压变化、腹部痉挛、腹 泻和呕吐等过敏性反应印2 ”，而且生物胺还是亚硝基化合物的前体物质。 生物胺除了存在于各种动植物的活组织外，还普遍存在于多种食品中，特别是不新鲜的食品 和各种发酵性食品中，如奶酪、发酵肉制品、啤酒、葡萄酒、发酵蔬菜、发酵豆制品等。食品中 的生物胺类物质一般是微生物的作用下，由蛋白质分解成氨基酸并脱去羧基而成。各类食品中分 离的微生物及其所产生的生物胺见表1 1 1 2 0 1 。目前在各类食品中发现含有氮基酸脱羧酶的微生物 有肠杆菌科、梭菌属、乳杆菌属、链球菌属、微球菌属、假单胞菌属中的某些种，在某些霉菌细 胞中也发现了氨基酸脱羧酶：甚至某些用来作为发酵剂的微生物也含有氨基酸脱羧酶，如常应用 丁二乳品工业或肉品工业的某些乳酸菌包括乳酸链球苗、粪链球菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、 干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌等也能产生生物胺例。 表卜2 从各娄食品中分离的微生物及其所产生的生物胺 t a b l e1 - 2m i c r o b ei s o l a t e da n db i o g o n i ca m i n e sf o u n di ns e v e r a t y p r so ff o o d 泡菜中主要存在的生物胺有酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺。泡菜 发酵过程涉及到的几类微生物包括肠杆菌科细菌、假单胞菌属、霉菌及乳酸菌等微生物均有产生 物胺的报道。进行乳酸菌接种发酵、增加食盐用量等措施能降低发酵蔬菜中生物胺的积累 2 2 8 卅。 ( 3 ) 亚硝基化合物。 1 ) 亚硝基化合物及其致癌性nn - 亚硝基化合物( n n i t r o s oc o m p o u n d ) 是一类对动物具有 强致癌作用的物质它是指具有如下结构的一类化合物： r n n o r 中网农业人学坝f 。学位论文 笫一茚绪论 ；i j ；i i i ；i ；e i i j j e i i ；i ；i ；i i j i i ；i ；i ；e ；j j 日；i ；_ i ；i i - i ；嗣i i j ；i i ；i 苗 根据r 利r 基是烃类缄取代烃类( 包括环状化合物) 的不同，n 一贬硝基化合物可分为n 一 硝胺( n n i t r o s a m i n e ) 和n 。亚梢酰胺( n n i t r o s y l a m i n e ) 丽类。亚硝胺的化学性质较弧硝酰胺 稳定。硝胺不易水解，在中性及碱性环境中都较稳定，但在酸性溶液及紫外线照射f 可缓慢分 解，证硝酰胺性质活泼，在酸性及碱性溶液中均不稳定。此外。棍据n 一距硝基化台物蒸气压大小 不同，还可分为挥发性亚硝基化合物和非挥发性亚硝基化合物”j 2 5 o n 亚硝基化舍物具有强烈的致癌性，己知可使多种动物、多种器官组织产生肿瘤；少量多次 陡期摄入或一次性冲击剂量摄入均可致癌。至今尚未发现有一种动物对n 一哑硝基化合物的致癌作 用有抵抗力p “。在n 一豫硝基化合物中亚硝酰胺系终端致癌物，能直接秘d n a 、r n a 等大分子作 用，使正常细胞变为癌细胞；而n 一亚硝胺则需代谢活化后才有致癌作用，弧硝胺在体内先进行a 位碳的羟基化，经中间代谢脱甲基使d n a 、r n a 等大分子中的鸟嘌吟在0 6 或n 7 烷基化，造 成d n a 或r n a 复制错误而使正常细胞发展为癌细胞陋2 6 1 。 2 ) n 亚硝基化合物在食品中的分布及其合成。食品中的亚硝基化合物主要有二甲基亚硝胺、 亚硝基艟咯烷、亚硝基碾嗪、二乙硝亚硝胺、亚硝基吗噼等，它们普遍存在于各类食品中，尤其 是发酵性食品其含量较高，如发酵肉制品、酿造酒类、发腌性乳制品、腌制蔬菜及发酵豆制品等。 食品中n - 亚硝基他舍物多是由其前体物在适宜条件下生成的。食品中n 亚硝基化合物的前 体物有两类，即胺类和亚硝基化剂f 2 。( a ) 胺类：食品中的胺类物质主要是生物胺，关于生物胺 上文已有论述。( b ) 亚硝基化剂，主要有n 0 2 。、n 0 3 + 、n z 0 3 、n 0 2 、n o 等。其中n 0 2 。、n o ，+ 广泛存在于土壤、水及植物中，当大量施用含氮化肥、除草剂、土壤中缺钼或干早时均可使农 作物中大量蓄积n 0 3 + ；在某些硝酸盐还原性微生物的存在下n 0 3 + 很易于转变为n o ：。在适宜 条件下，生物胺类物质和亚硝基化剂即可合成n 硝基化合物，但其合成受许多因素影响，如胺 的神类、浓度、p h 值、温度以及某些微生物的存在等。伯胺、伸胺、叔胺均能亚硝化，但伯胺、 叔胺亚硝化速度较慢，仲胺的亚硝化速度较快。肠杆菌科韵某些细菌如大肠杆菌、酱通变形杆菌、 粘质沙雷氏菌等硝酸盐还原菌可将仲胺及硝酸盐合成强硝胺；某些霉菌如黄曲霉、黑曲霉、白地 霉也可促进亚硝胺的合成“2 ”。一些动物性食品在腌制时，如已含有大量胺、粗盐中又含有较多 亚硝酸盐、或人为添加亚硝酸盐或硝酸盐，均可能使腌制品中有较多的亚硝基化合物。一般咸肉 经油煎后约9 0 样品中可测出亚硝基吡咯烷。其含量与加热温度和时间有关，空气中气态氮氧 化物，特黝是n d 与n 0 2 的混合物。可提高亚硝基化的作用。在啤酒生产过程中，当烘烤大麦芽 时，气态氟氧化物作用于大麦芽中大麦碱，台成二甲基亚硝胺已引起许多国家重视。另外，亚 硝胺合成的适宜p h 值为 5 时，含有硝酸盐还原酶的细菌有高度代谢活性， 有利于将硝酸盐还原为亚硝酸盐，因此易于使亚硝胺在胃内合成。我屋关于食品中亚硝胺的卫生 标准g 1 39 6 6 7 - 1 9 9 8 规定了肉制品及海产品中的亚硝胺限量i 16 j ： 表1 食品中n 一亚硝胺限量卫生标准 t a b l e1 31 b l c 怕n c cl i m i ta f n n i t r o s a m i n e si nm e a tp r o d u c l s 种类指 标 海产品，, e , k g 肉制品，p 8 瓜g n - 二甲蓬吁硝胺 4 3 n 一二乙基亚硝睦 7 5 7 中周农业人学硕：卜学位论文第一节绪论 3 ) 泡菜中的弧硝基化合物。关于泡菜中砭稍基化台物的致癌作辩! | 。囤外均有研究但多 是从医学的角度出发。一般认为，消化道恶性肿瘤高发区的居民因较多食用硝基化合物含量高 的腌菜、腌肉等食品，导致恶性肿瘤的发病率较高【2 63 0 “3 ”。李玉民等f 3 1 j 对剖癌高发区甘肃武 威市地区家庭自制腌菜进行了皿硝酸盐、二甲基砸硝胺、二乙基弧硝胺等亚硝基化合物的测定， 发现皿硝基化合物含量较高，认为当地胃癌高发病率与进食腌菜密切相关。林昆，沈文英等【3 4 对南方食管癌高发区南澳县和低发区陆丰县居民对豫硝基化合物的接触水平分别进行了调查研 究，通过测定居民膳食和尿液中总n 一弧硝基化合物、非挥发性亚硝胺和挥发性亚硝胺的含量，发 现离发区居民的亚硝胺接触水平显著高于低发区居民，这与离发区培民偏爱食用咸鱼、鱼露、成 菜和热茶等亚硝胺含量较高的食品有关。 对于蔬菜发酵过程中亚硝基化合物及其前体物含量的变化规律，国外学者研究较多、一般认 为发酵初期细菌、真菌的大量繁殖，及发酵过程中操作不慎而污染大量外源性霉菌会使终产品中 的生物胺、亚硝基化台物含量偏高。s e e l d 】和k a w a t a t l 2 8 等对韩国两种普遍食用的家庭自制食 品腌白菜( k i m c h i ) 和腌鱼酱( c h u t - k a t ) 中的亚硝胺及其前体物进行了研究，该研究在模拟胃 液环境下，利用过量的亚硝酸盐对胺类物质进行亚硝化，发现亚硝基化台物含量比亚硝化前增加 很多。因而认为这两类食品存在很大的潜在安全性问题，并且对不同发酵阶段的亚硝胺及其前体 物进行了测定，结果表明亚硝胺含量与发酵体系的p h 变化值无明显关系。n r f s i n h aps 和s t e p h e n ws 等1 2 ”先对腌制成熟的日本腌萝h 在p h 为1 ，5 2 4 下进行- 砸硝化处理，然后测其总亚硝基化 合物含量，发现总亚硝基化台物的量明显高于来经亚硝化处理的样品，证实了腌菜存在潜在安全 性问题。 对于如何降低泡菜产品中亚硝基化合物的含量，减少其危害，国内外均有研究。一般认为选 择新鲜、无霉变、清洗干净的蔬菜原料制作泡菜有利于降低产品皿硝基化合物的含量；蔬菜发酵 过程中添加某些物质能抑制或阻断亚硝基化合物的生成，这些物质包括大蒜、洋葱、维生素c 、 维生素e 、糠酸及酚类化合物等。采取厌氧、较高的食盐浓度等可以抑制有害菌生长的措施、接 种乳酸菌及在制作过程中防止外源微生物的污染等均有利于降低亚硝基化舍物的含量f 2 7 ”i 。 1 2 3 泡菜乳酸菌概述 1 2 3 1 乳酸菌概述 乳酸菌是一群可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，这个名称就细菌分类学而言是 一非正式、非规范的名称p j 。乳酸菌在自然界分布广泛，在工业、农业和医药等与人类生活密切 相关的重要领域都有很高的应用价值，而且这类细菌中有些还是人畜的致病菌，因此受到人们的 极大重视1 3 3 j 。目前在自然界已发现的乳酸菌在细菌分类学上可划分出至少2 3 个属，涉及到的有 关属则更多，包括巍杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属等。乳酸菌特征包括革兰氏染色 阳性、无运动性或很少有运动性、厌氧或兼性厌氧、以乳酸作为发酵代谢中主要或唯一产物等， 其最适生氏温度一般在1 5 4 5 * ( 2 耐酸性较好，在p h 的生长；同时由于明串珠菌属细菌为异型发酵乳酸菌，在其代谢产物除了乳酸外 还有乙醇、乙醛、甘露醇等物质，这些物质与有机酸结合起来，形成风味物质，对产品特有风味 的形成起到决定性作用【1 “刈。有学者认为成品泡菜的质量在很大程度上取决于乳酸菌开始生长的 速度和发酵初期有害微生物被抑制的速度 3 s l 。随着发酵的进行耐酸性更强的片球菌属、乳杆菌 属细菌逐渐取代明串珠菌属而成为优势菌群，在乳杆菌属细菌的作用下，环境p h 进一步下降， 并产生细菌素等抑菌物质，从而进步抑制了杂菌的活动。至发酵末期，同型发酵乳酸菌植物乳 杆菌由于其较强的耐酸性而成为优势菌。 12 33 发酵过程涉及的乳酸菌及其特性 泡菜发酵过程中涉及到的乳酸菌主要有乳杆菌属、明串殊菌属、片球菌属等属的细菌。发酵 过程中所涉及的乳酸菌的种类因泡菜品种的不同也有所不同，如酸泡菜、碎片甘蓝在不同发酵阶 段的主要乳酸菌分别为阴沟肠杆菌、肠膜明串珠菌、植物乳杆菌等，而在泡菜黄瓜中主要乳酸菌 为肠膜明串珠菌、粪链球菌、啤酒片球菌、短乳杆菌、植物乳杆菌掣”“3 6 】。 ( 1 ) 乳杆菌属细菌】。乳杆菌属细菌的细胞形态多样，从长和细长状到弯曲形及短杆状， 也常有棒形球杆状，一般形成链；通常不运动，不产芽孢，革兰氏染色阳性。这类细菌一般都是 兼性厌氧菌，通常厌氧或减少氧分压能增加固体培养基上的表面生长物，最适生长温度为3 0 4 0 ，不还原硝酸盐，不液化明胶，不分解酪素，不产吲哚和h 2 s ，接触酶阴性、无细胞色素。乳 杆菌属细菌中既有同型发酵乳酸菌也有异型发酵乳酸菌。蔬菜发酵过程中常见的同型发酵乳酸菌 有德氏乳杆菌、植物乳杆菌，异型发酵乳酸菌有短乳杆菌等。 ( 2 ) 明串珠苗属细菌 3 3 j 。明串珠菌属细菌细胞为球形，通常呈豆状，常成对或链状排列。 革兰氏染色阳性，不运动，不产芽孢，兼性厌氧。最适生长温度2 帖3 0 。明串珠菌属细菌为异 型发酵乳酸菌，泡菜生产中常见的该属细菌有肠膜明串珠菌，该菌在发酵初期是优势菌，其主要 代谢产物除乳酸外还包括乙醇、甘露醇等风味物质，对泡菜特有风味的形成具有决定性作用。 ( 3 ) 片球菌属p ”。片球菌属细菌细胞呈凰球形，多成对或四联排列，单生者罕见，一般不 呈链状排列，革兰氏染色阳性、不运动、不产芽孢。兼性厌氧，最适生长温度2 5 4 0 。c 。发酵葡 萄糖产生d ，l 乳酸或l 乳酸、不产气，不分解蛋白、不还原硝酸盐。蔬菜发酵过程中涉及到的 该属细菌包括乳酸片球菌、戊糖片球菌等川。 泡菜发酵过程所涉及到的乳酸菌具有一些共同特点m “”3 6 ) ：( 1 ) 具有较强的抗酸能力。 在制作泡菜的过程中，在发酵初期虽然其他很多杂菌也能生长，但因乳酸菌不断地产生乳酸，使 中国农业人学坝 。学位论义 帮一荦绪论 得环境d h 下| j 昂而杀死多种不耐酸的细菌，而乳酸茁由于其较强的抗酸能力而存活f 来。( 2 ) 火 部分乳酸菌具有很强的耐盐性，一般都能耐5 以上的n a c 溶液。( 3 ) 泡菜中常见的乳酸苗一般 都不含硝酸盐还原酶，因而泡菜产品中网乳酸菌代谢产生亚硝酸盐的可能性极小，这对提高产品 的安全性是非常有利的。( 4 ) 乳酸菌的代谢产物中除了乳酸等有机酸能抑制其他杂菌生| ：( = 外，还 产生少量细菌素、过氧化氢、烈乙酰等抑菌性物质。虽然所产生的细菌素、过氧化氢、双乙酰的 量报少，但其抑菌效果却很好，特别是细菌素，在低浓度时仍能杀死敏感菌p “。 细菌素是细菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对同种的或亲缘关系较近的种有抑 制作用的杀菌蛋白或多肽物质。目前已发现了一些对食品腐败微生物和病甄微生物具有j “谱抑菌 活性的细菌素p 8 “j 。有些乳酸菌细菌素是天然防腐剂，可以添加到非发酵食品中起防腐作用，由 乳链球菌产生的细菌素n i s i n 已广泛地应用于食品中作为防腐剂抑制腐败微生物及病原微生物的 生长。目前普遍认为，由发酵剂产生的细菌素对于改善和提高各种发酵食品的质量和安全性具有 重要意义。因此筛选能产广谱高效细菌素的乳酸菌应用于泡菜生产非常有利于提高产品的安全 性。蔬菜发酵过程涉及到的所有乳酸菌几乎都有产细菌素的报道，如乳酸片球菌产生的p e d i o c i n a c h ，不但能抑制一些亲缘关系相近的乳酸菌，而且对一些致病菌也具有较强的抑制作用口”i 。 祝嫦巍等j 曾采用牛津杯定量扩散法对从酸菜汁中分离的戊耱片球菌所产细菌素进行研究认为 戊糖乳杆菌所产的细菌素不但对革兰氏阳性菌有抑制作用，而且对大肠杆菌、沙门氏菌等阴性菌 也有抑制作用。 123 4 接种发酵与乳酸菌