（轻工技术与工程专业论文）固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究.pdf

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，其中果胶酶添加量 为主要影响因素。酶解后香蕉菠萝复合果酒的得率和透光率均在9 0 以上。 4 、通过单因素和正交试验，对采用固定化酵母生产香蕉菠萝复合果酒 的发酵工艺进行了研究。结果表明，最佳的发酵工艺条件为：初始含糖量 3 0 、发酵温度2 5 。c 、亚硫酸氢钠用量8 0 m g l 、发酵p h 4 0 。其中初始含 糖量为主要影响因素。 关键词：香蕉菠萝复合果酒固定化酵母发酵 s t u d i e so nt h ep r o c e s so fb a n a n a - p i n e a p p l ec o m p o u n d w i n ef e r m e n t e db yi m m o b i l i z e dy e a s t a b s t r a c t i m m o b i l i z e dy e a s th a db e e na p p l i e de x t e n s i v e l yi nf e r m e n t a t i o ni n d u s t r y b e c a u s eo fi t s h i g hf e r m e n t a t i o ns p e e da n de f f i c i e n c y , s t r o n ga b i l i t y o f a n t i b a c t e r i ai n f e c t i o n ，e a s yt os e p a r a t i n ga n dr e u s i n gt h ep r o d u c t s i nt h i st h e s i s ， t h ep r o c e s so fc o m p o u n df r u i tw i n ef r o mb a n a n aa n dp i n e a p p l ef e r m e n t e dw i t h i m m o b i l i z e dy e a s tw a ss t u d i e d t h er e s e a r c he m p h a s i sw a sf o c u s e do i lt h e f e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h ei m m o b i l i z e dy e a s t ，t h ep r o c e s so fe n z y m a t i c h y d r o l y s i sa n dt h e f e r m e n t a t i o np r o c e s so ft h ec o m p o u n df r u i tw i n e t h e p u r p o s ew a s t og e tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n st oi m m o b i l i z ey e a s t ，t h ep r o c e s so f e n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n df e r m e n t a t i o n ，i no r d e rt op r o v i d ep r o c e s sp a r a m e t e r s f o rp r o d u c i n gt h eq u a l i t yc o m p o u n dw i n e t h em a j o rr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 c o m p a r i n gt h ef e r m e n t a t i o ns p e e d ，p r o d u c i n gr a t eo f f r u i tw i n ea n dt h e i n t e n s i t yo fp a r t i c l e so f d i f f e r e n tm a t e r i a l s ，t h ec a l c i u ma l g i n a t ew a sf o u n dt ob e s u i t a b l ec a r r i e rt oi m m o b i l i z et h ew i n ey e a s t 2 t h ew i n ey e a s tw a si m m o b i l i z e db yc a l c i u ma l g i n a t ea sac a r r i e r ，a n di t w a ss t u d i e dm a tt h eb e s ti m m o b i l i z e dc o n d i t i o no ft h ey e a s ta n dt h e f e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so fc o m p o u n db a n a n a - p i n e a p p l ew i n eb yt h e i m m o b i l i z e dy e a s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s ti m m o b i l i z e dc o n d i t i o n w a s2 o s o d i u ma l g i n a t ea n d4 o c a c l 2 c o m p a r e dw i t hf r e e y e a s t f e r m e n t a t i o n ，t h er e s i d u a ls u g a ro ft h ef r u i tw i n eb yt h ei m m o b i l i z e dy e a s t w a sl o w e r , a l c o h o ly i e l dw a sh i g h e ra n dt h ec l a r i f i c a t i o no ft h ew i n ew a s f a s t e r 3 s i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s tw e r ed e s i g n e dt os t u d yt h ee f f e c t so f p e c t i n a s et r e a t m e n to nt h ey i e l da n dc l a r i f i c a t i o no fac o m p o u n dw i n ef r o m b a n a n aa n dp i n e a p p l e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so f p e c t i n a s et r e a t m e n tw e r eo 2 p e c t i n a s e ，t e m p e r a t u r ea t4 5 c ，f o r2 5h o u r sa n d p hv a l u ea t3 5 ，a n dp e c t i n a s eq u a n t i t yw a st h em a i ni n f l u e n c i n gf a c t o r a f t e r t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sb yp e c t i n a s e ，a l lo ft h ey i e l da n dt r a n s m i t t a n c eo ft h e c o m p o u n dw i n ew e r e o v e r9 0 4 s i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a lt e s tw e r ed e s i g n e dt os t u d y t h ef e r m e n t a t i o n o fac o m p o u n dw i n ef r o mb a n a n aa n dp i n e a p p l e t h er e s u l t ss h o w e dt h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h ew i n ew e r ea sf o l l o w s ：t h ea m o u n to fi n i t i a l s u c r o s ew a s3 0 ，t h ef e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r ew a s2 5 。c ，t h ec o n c e n t r a t i o no f n a h s 0 3w a s8 0 m g l ，a n df e r m e n t a t i o np h v a l u ew a s4 0 t h ea m o u n to fi n i t i a l s u c r o s ew a st h em a i ni n f l u e n c i n gf a c t o r k e yw o r d s ：b a n a n a ；p i n e a p p l e ；c o m p o u n dw i n e ；i m m o b i l i z e dy e a s t ； f e r m e n t a t i o n 目录 第一章前言 1 1 研究背景及意义l 1 2 果酒的研究现状1 1 2 1 果酒原料品种1 1 2 2 酵母细胞固定化技术。2 1 2 3 固定化酵母发酵生产果酒的研究现状5 1 3 研究目的及内容6 第二章材料与方法 2 1 实验材料8 2 2 实验仪器与试剂8 2 2 1 实验仪器8 2 2 2 实验试剂9 2 3 实验方法9 2 3 1 工艺流程9 2 3 2 操作要点1 0 2 3 3 检测项目与方法l l 第三章结果与分析 3 1 酵母固定化条件及发酵特性研究一1 4 3 1 1 酵母固定化载体的确定1 4 3 1 2 酵母最佳固化条件的确定1 5 3 1 2 1 固定化酵母机械强度的测定15 3 1 2 2 载体浓度对凝胶固定化效果的影响1 6 3 1 2 3 发酵过程中固定化酵母强度及发酵力的变化1 7 3 1 3 固定化酵母的发酵特性的研究1 8 3 1 3 1 发酵过程中残糖的变化18 3 1 3 2 发酵过程中p h 的变化1 9 3 1 3 3 固定化酵母发酵对香蕉菠萝复合果酒品质的影响1 9 3 2 酶解处理对香蕉菠萝复合果酒得率和澄清度的研究2 0 3 。2 1 果胶酶添加量对果酒得率和澄清度的影响2 l 3 2 2 酶解温度对果酒得率和澄清度的影响2 1 3 2 3 酶解时间对果酒得率和澄清度的影响2 2 3 2 4 酶解p h 对果酒得率和澄清度的影响2 3 3 2 5 香蕉菠萝复合果酒的最佳酶解工艺2 4 3 3 固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的工艺研究2 5 3 3 1 香蕉菠萝不同原料配比对复合果酒品质的影响2 5 3 3 2 初始含加糖量对香蕉菠萝复合果酒酒度生成的影响2 5 3 3 3 发酵温度对香蕉菠萝复合果酒酒度生成的影响2 6 3 3 4 发酵p h 对香蕉菠萝复合果酒酒度生成的影响2 8 3 3 5 亚硫酸氢钠用量对香蕉菠萝复合果酒酒度生成的影响2 9 3 3 6 香蕉菠萝复合果酒的最佳发酵工艺3 0 3 4 香蕉菠萝复合果酒的质量指标3 l 第四章讨论 4 1 固定酵母的方法和载体3 2 4 2 固定化酵母发酵和游离酵母发酵的比较3 2 4 3 香蕉菠萝成熟度的选择及原料配比的确定3 2 4 4 初始加糖量、分次加糖量对香蕉菠萝复合果酒发酵工艺的影响。3 2 4 5 酶解处理对香蕉菠萝复合果酒出酒率和澄清度的影响3 3 第五章结论 5 1 酵母的固定化载体3 4 5 2 酵母的最佳固化条件3 4 5 3 香蕉菠萝复合果酒的最佳酶解工艺3 4 5 4 香蕉菠萝复合果酒的最佳发酵工艺。3 4 翌贮谢3 5 参考文献3 6 在攻读硕士学位期间参与课题及发表论文情况3 9 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 第一章前言 1 1 研究背景及意义 香蕉是我国南方的重要热带水果之一，据统计，2 0 0 7 年全国香蕉年产总量达7 3 0 多 万t ，其中广西的香蕉年产总量达1 4 0 4 6 万t ，位于全国年产总量第三位。长期以来，香 蕉的销路较为单一，主要用于鲜食销售，但由于香蕉难以贮藏保鲜，旺季烂市，丰产不 丰收的现象时有发生，加上许多残次蕉尚未得到很好的加工利用，严重地影响了香蕉生 产的经济效益。因此，大力开发香蕉深加工产品，既能解决旺季水果过剩的难题，大大 提高香蕉的附加值，又可以创造出良好的社会效益，具有广阔的开拓前景。 发酵型果酒是一类以水果为主要原料发酵酿制的低度酒，其风味独特，富含醇类、 糖类、酯类、多种氨基酸与有机酸及丰富的维生素和矿物质，具有较高的营养价值，深 受消费者的欢迎。由于香蕉营养丰富、产量高、原料足且能周年供应，利用香蕉生产果 酒应有很大的市场潜力和良好的发展前景。目前单一利用香蕉为原料生产果酒已有研究 报道，然而由于单一的香蕉果酒色、香、味欠佳，在市场上并未见大量销售。因此，将 香蕉与其他水果进行复合发酵酿制色、香、昧与营养成分俱全的复合果酒是一个重要的 研究课题。 菠萝也是我国南方重要的热带水果，在广东、广西、福建和海南等地大面积种植， 菠萝果肉富含糖分、有机酸和多种维生素，且香味浓、颜色好、汁液多。若将菠萝与香 蕉原料一同进行发酵酿制复合果酒，有利于增强香蕉酒的香味，增加香蕉酒的营养，同 时还可以利用菠萝果肉中的有机酸抑制香蕉酒的酶促褐变，改善果酒的色泽，从而使研 制的复合果酒营养成分、香味、色泽达到互补。 固定化酵母由于发酵速度快、发酵效率高、抗杂菌感染能力强、产物易分离及可以 重复利用产物易分离等优点在发酵工业中的应用越来越广泛。 因此，充分利用香蕉、菠萝等热带水果资源优势，采用固定化酵母发酵等先进的工 艺生产香蕉、菠萝复合果酒，既符合我国酿酒业的发展方向，又可解决旺季水果滞销的 难题，对提高香蕉、菠萝的附加值及其残次果的利用率，推动香蕉种植业与加工产业的 发展具有十分重要的作用。 1 2 果酒的研究现状 1 2 1 果酒的原料品种 目前，在国内外市场上销售的果酒主要是葡萄酒，对于以其他水果如樱桃、黑莓、 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 木瓜、苹果、菠萝、荔枝、龙眼、香蕉、雪莲果等为原料的发酵酿制的果酒已有研究报 道。但由于以单一水果原料发酵酿制的许多果酒如猕猴桃酒、荔枝酒、龙眼酒、木瓜酒、 香蕉酒、苹果酒等存在色香味欠佳，营养成分不足等缺陷，如今不少研究者正致力于研 究复合发酵果酒，如以刺梨、草莓、猕猴桃、菠萝为原料生产的复合发酵果酒( 吴翔， 2 0 0 3 ) ，以哈密瓜、贡枣、山楂为原料生产的复合发酵果酒( 李运龙，2 0 0 3 ) ，以桑葚、 山楂为原料生产的复合发酵果酒( 宋喜云，2 0 0 7 ) ，以南瓜、枸杞、芦荟为原料生产的 复合发酵果酒( 吴龙英，2 0 0 5 ) 等。复合果酒充分利用了不同水果的特点相互配合，结 合优势，提高营养物质种类和含量，增添果酒风味，使果酒更加具营养保健价值和可口 性，更受消费者的欢迎。复合果汁发酵的研究开发时间不长，大多还处于实验试制阶段， 目前曾有利用香蕉苹果为原料生产具有香蕉苹果复合果香风格的新型发酵果酒的研究 报道( 刘长海，2 0 0 6 ) 。但迄今为止，利用香蕉、菠萝为原料生产具有香蕉菠萝复合果 香风格的复合发酵果酒尚未见研究报道。 1 2 2 酵母细胞固定化技术 传统的果酒生产多采用游离酵母细胞发酵，此方法需将活性干酵母活化或将酵母扩 大培养后再添加到果汁中发酵，操作相对繁琐，并且对环境条件非常敏感，酵母容易失 活，溶液中的酵母也很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本，反应后酵母还会混 在产物中，影响产品质量。因此，酵母细胞固定化技术便受到了生物工程领域科研工作 者的关注。所谓细胞固定化技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间 区域，并使其保持催化活性且可反复使用的方法( 余冬生，2 0 0 4 ) 。固定化酵母便是将 活酵母细胞高度密集于载体上，并不断进行生长繁殖，形成高浓度的生物催化剂。利用 固定化酵母进行发酵的生产方法与传统的游离细胞发酵方法相比具有以下优点： ( 1 ) 发酵器内固定化细胞密度高，细胞一直处于旺盛的发酵状态，发酵速度加快，生 产周期缩短，从而使生产能力得到大幅提高； ( 2 ) 固定化细胞可以重复使用，便于大罐管道化连续生产和自动控制，降低生产成 本； ( 3 ) 固定化细胞能在高稀释率的条件下进行连续操作而不产生流失现象； ( 4 ) 固定化细胞被包埋在载体内，可减少有害物质的抑制作用； ( 5 ) 设备简单，操作方便，投资费用低； 目前，用于酵母细胞固定化的方法较多，按照固定化载体与作用方式的不同，可分 为吸附法、包埋法、交联法、共价结合法等( 贺江，2 0 0 7 ) 。 2 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 1 2 2 1 吸附法 吸附法又叫载体结合法，是依据带电的酵母细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附 力的作用，而使酵母细胞固定在载体表面和内部形成生物膜的方法，可分为物理吸附法 和离子吸附法两种。 物理吸附法是使用具有高吸附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵 石、铅炭、硅藻土、多孔砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化的方法。程江峰 等( 2 0 0 1 ，2 0 0 4 ) 将陶瓷拉西环经清水浸泡、冲洗、干热灭菌后装入柱式反应器中，把 酵母菌悬液泵入反应器中，待满罐后，使陶瓷载体在1 4 。c 的条件下充分吸附酵母3 0 r a i n ， 然后放出菌悬液，在同样温度下使固定化酵母于反应器中连续培养2 h ，最后将吸附在陶 瓷上的固定化酵母用于啤酒的连续后发酵中。结果表明，固定化酵母细胞的后发酵时间 比传统的发酵缩短6 d ，发酵度比传统的发酵提高2 9 5 。 离子吸附法是利用微生物在解离状态下离子键作用而固定于带有相反电荷的离子 交换剂上的方法，常见的离子交换剂有d e a e 纤维素、c m 纤维素等。纤维素吸附法是 将纤维素载体用p h 7 0 磷酸缓冲液浸泡、洗涤后，高压灭菌3 0 m i n ，在4 c 的条件下保存； 接种时，将处理好的纤维素与细胞悬液按所需接种密度加入搅拌瓶中培养，扩大培养后 用于循环分批培养生产酒精。l o m m i ( 1 9 9 0 ) 采用d e a e 纤维素固定酵母细胞，并将其 用于生产乙醇和酒精饮料。结果表明，此方法固定的酵母细胞可以承受一定的压力，并 可以重复利用。 吸附法亦可与其他方法结合使用，如与包埋法、交联法等。b a k o y i a n i s ( 1 9 9 8 ) 采用海 藻酸钙凝胶、y 氧化铝和一种多孔火山岩材料为载体固定酿酒酵母，用于室温和低温连 续发酵葡萄酒。结果表明，固定酵母的产酒能力在室温和7 的条件下分别可比游离酵 母发酵提高4 倍和1 0 倍。 1 2 2 2 包埋法 包埋法是将细胞包裹在凝胶的网格结构中或者包裹在半透性聚合薄膜内，小分子的 底物和产物可以自由扩散，而细胞却不会扩散到周围介质中去，其根据载体不同包埋法 又可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法两种方法。凝胶包埋法是将酵母细胞包埋在各种凝 胶内部的微孔中而使细胞固定的方法，常用的载体有：卡拉胶、明胶、海藻酸盐、k - 角叉菜聚糖、琼脂、三醋酸纤维素、聚丙烯酰胺凝胶和聚乙烯醇( p v a ) 等；微胶囊包埋 法是将酵母细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的半透膜内而使细胞固定的方法，此方 法可以防止细胞与微胶囊外环境直接接触，同时，小分子底物能通过膜与细胞作用，产 3 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 物经扩散作用而输出。由于凝胶包埋法对细胞活性影响小，因此是固定化细胞常用的方 法，常见的凝胶包埋酵母细胞的方法有以下几种( 肖美燕，2 0 0 3 ) ： ( 1 ) 海藻酸钙包埋法：将菌悬液加入海藻酸钠溶液中充分混匀，然后用注射器或 胶头滴管将其滴入一定浓度的c a c l 2 溶液中固化1 2 h 后用无菌水清洗，于4 冰箱内过 夜固化，滤出珠体，无菌水清洗备用。 ( 2 ) k - 角叉菜聚糖包埋法：将菌悬液加入k 角叉菜聚糖溶液中充分混匀，以一定 的速度滴入k c l 溶液中，经过固化后制成凝胶珠，浸泡3 0 r a i n 后，用无菌去离子水洗涤数 次后，置3 0 恒温箱培养7 2 h ，然后放4 冰箱保存。 ( 3 ) 聚丙烯酰胺包埋法：先配制一定浓度的甲叉双丙稀酰胺和丙烯酰胺溶液，与 一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，然后加入一定量的四甲基乙二胺和过硫酸铵，混合后 等待数分钟让其静置聚合，然后用手术刀将凝胶块切块，最终获得所需形状的固定化细 胞胶粒。 ( 4 ) 聚乙烯醇( p v a ) 包埋法( 吕跃钢，2 0 0 7 ) ：将一定量的菌悬液与p v a 混匀， 倒平板后，加入饱和硼酸溶液，放置在冰箱内静置过夜。然后用手术刀切成小块状，再 用无菌水洗净备用。 江俊明( 1 9 9 8 ) 采用以各种凝胶为载体包埋的酵母进行酒精发酵的试验。研究表明， 杂豆粉和琼脂的包埋颗粒经6 次发酵后机械强度很差不能继续发酵；明胶包埋的固定化 酵母细胞机械强度很好，但酒精转化率低；海藻酸钙与褐藻酸钙所包埋的固定化酵母， 经8 次发酵后机械强度仍然很好，酒精转化率较高，可达9 0 ，是较好的包埋剂。严复 ( 1 9 8 1 ) 比较了海藻酸钙、琼脂、明胶三种凝胶作包埋剂包埋不同的酵母并进行啤酒和 酒精发酵。结果表明，海藻酸钙的酒精转化率、机械强度和凝胶稳定性都比其他两种凝 胶好，并可用于固定化各种酵母及其他微生物菌体。谭峰( 1 9 9 6 ) 利用海藻酸钙和琼脂 为载体对啤酒酵母进行包埋。结果表明，利用海藻酸钙包埋的酵母在发酵性能、机械强 度和固定的效果上都比琼脂包埋的酵母好。许多研究者探讨了以海藻酸钙为载体制作的 固定化酵母发酵生产猕猴桃酒( 朱建华，2 0 0 6 ) 、香蕉酒( 周世水，2 0 0 2 ) 、杨梅酒( 刘 锋，2 0 0 5 ) 、菠萝酒( 叶日英，2 0 0 0 ) 的固定化条件，其研究结果表明：用1 5 3 的海藻酸钠与2 6 的氯化钙制作的固定化酵母效果最好，乙醇生产率比游离酵母高 1 1 1 8 倍。 1 2 2 3 交联法 交联法是利用双功能或多功能试剂，直接与酵母细胞表面的基团( 如氨基酸、羟基、 4 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 硫基、咪唑基) 发生反应形成共价键，使其菌体相互连接成网状结构而达到固定化的目 的，常用的交联剂有戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双偶氮联苯等。此方法主要与其他方法 ( 如包埋法、吸附法等) 结合使用。 侯红萍( 2 0 0 5 ) 利用明胶、琼脂、海藻酸钠等凝胶和戊二醛交联制作的固定化酵母 用于白酒生产中，酵母的制作方法为：吸取一定的酵母菌悬液加入加凝胶溶液中，混合 均匀，倒入无菌平皿中，在0 - 5 c 冻结后，切成小块，再浸入1 5 的戊二醛溶液中，室 温下交联3 h ，用无菌去离子水洗涤即可。结果表明，明胶- 戊二醛包埋交联法比与其他 凝胶交联得到的固定化酵母机械强度高，产酒率也比游离酵母提高2 2 。 此外，还可以用甲壳素、壳聚糖等材料与交联剂交联( 李桂银，2 0 0 7 ；蒋挺大，1 9 9 8 ) ， 由于此法多用于白酒和酒精生产，本文在此不做过多介绍。 1 2 3 固定化酵母发酵生产果酒的研究现状 利用固定化酵母发酵生产果酒，可以缩短生产周期，改进生产工艺，降低生产成本， 改善果酒的风味。近几年来，随着果酒工业的发展，固定化酵母已经在越来越多果酒的 发酵工艺中得到成功的应用。 1 2 , 3 1 固定化酵母在提高发酵速度和酒精产率上的应用 固定化酵母由于细胞密度高，而且细胞一直处于旺盛的发酵状态，故发酵速度比传 统的游离酵母快，酒精生产能力也比游离酵母有大幅的提高。 许多研究者( 梁峙，2 0 0 2 ；武运，2 0 0 8 ；黄国清，2 0 0 6 ) 研究表明，固定化酵母发 酵比游离酵母发酵的速度快l - 2 d 。虽然在发酵初期，游离酵母发酵速度较快，但后期 游离酵母发酵速度明显降低且无法继续使残糖量降低，而固定化酵母仍可继续进行发酵 并使残糖量继续下降。在发酵后期，固定化酵母的酒精产率、降糖总量明显高于游离酵 母。 1 2 3 2 固定化酵母在重复利用与连续生产上的应用 固定化酵母因酵母细胞固定在载体内，容易与产物分离，便于回收再利用，故可节 约生产成本，简化果酒的工艺生产流程，适合果酒的大罐管道化连续生产和自动控制， 对于创新和改进传统发酵工艺具有引导和促进作用。 薛海燕等( 2 0 0 8 ) 采用一种丝状真菌和酵母共固的方法制作固定化酵母，将酵母用 于低醇葡萄酒的酿造中。结果发现，重复4 次发酵，固定化酵母细胞不破损、不衰退， 并且发现在4 个批次发酵中，后2 次发酵的口感更好。阚振荣等( 1 9 9 3 ) 以海藻酸钙为包 埋剂，再用明胶与戊二醛交联，提高了胶粒的机械强度，使细胞泄漏减少。重复使用5 次， s 广西大学硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 胶粒亦无开裂现象。 耿曙光( 2 0 0 6 ) 将a s l 3 0 8 菌悬液与复合p v a 溶液混合包埋制得p v a 凝胶固定化酵 母，探讨固定化酵母应用于酵母工序大生产的试验研究，结果表明，使用固定化酵母可 减少换种次数，节约换种时间，显著减少培菌工作量，强化了生产环节，适合连续生产。 周世水等( 2 0 0 2 ) 将海藻酸钙固定化酵母装填在1 l 的柱式反应器进行连续发酵香蕉酒的 工艺实验，结果表明，采用固定化酵母连续发酵在酒的品质和生产成本上都有显著地改 进和突破。 1 2 3 3 固定化酵母在改进果酒品质及风味上的应用 酵母细胞固定化后常常会伴随生理及发酵特性的改变，从而使果酒中各种挥发性副 产物的生成受到影响，造成风味和品质上的改变。 朱建华等( 2 0 0 6 ) 探讨了通过砧3 + 置换固化海藻酸钠固定化酵母菌种制备猕猴桃果 酒的发酵工艺。结果表明，酵母用海藻酸钠固定化后用胛+ 置换，于1 5 0 下发酵，测得 果酒的酒度和v c 保留率高，吸光度小，比传统发酵更具猕猴桃典型风味，色泽金黄透亮。 采用游离细胞活性干酵母发酵生产的杨梅酒表现为柔润感差，原香、风味不足，色泽较 淡。张卫国等( 2 0 0 6 ) 通过对比试验，研究了海藻酸钙固定化细胞发酵杨梅果酒的发酵 条件。试验表明，与传统发酵相比，固定化细胞发酵的果酒酒液不仅呈现杨梅特有的色 泽，更加诱人，而且澄清度更高。 薛海燕等( 2 0 0 8 ) 研究发现，固定化酿酒酵母进行发酵的葡萄酒的色泽比游离酵母 发酵的要好；在用固定化酿酒酵母进行发酵第2 批次及后续的发酵时，其口感也比游离 发酵的口感要好；固定化发酵还能增加葡萄酒的营养功能，减少葡萄酒中的多酚类物质 和单宁的含量，从而获得高质量的葡萄酒。 夏红等( 2 0 0 7 ) 以2 海藻酸钠和6 p v a 为载体4 c a c l 2 为载体交联剂，将s n s 0 7 菌 体细胞进行固定，考察固定化酵母对柿酒产品品质的影响。结果显示，与游离酵母相比 固定化酵母发酵柿酒的各项指标一致性更强，产品质量更稳定。 1 3 研究的目的与内容 综上所述，利用固定化酵母发酵生产果酒与传统的游离酵母发酵相比具有生长快、 反应迅速、生产效率高、抗杂菌感染能力强、可连续使用、产物易分离等优点，且在改 进果酒品质及风味上的有很大的应用。虽然其在生产技术上还存在着载体使用时间短、 重复使用一段时间后易染杂菌、占罐容积大和起动时间长等几个关键的问题。但固定化 酵母发酵作为一种新型的果酒发酵方式，已经引起国内外研究者的瞩目。随着各方面研 6 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 究的进一步深入和固定化细胞各项技术的日渐成熟，固定化细胞技术必将在果酒酿造工 业中得到愈来愈广泛的应用。 本研究通过开展固定 艺及风味调配等研究，找 旨在为生产上利用固定化 用途，提高香蕉、菠萝的 义。 广西大学硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 第二章材料与方法 2 材料与方法 2 1 实验材料 本试验所用材料为南宁市售的香蕉和菠萝，香蕉品种为威廉斯( 见图1 ) ，菠萝品种 为巴厘种( 见图2 ) 。 图1 本试验选用的威廉斯香蕉 f i g 1w i l l i a m sb a n a n ao ft h et e s ts e l e c t i o n 图2 本试验选用的巴厘种菠萝 f i g 2b a l ip i n e a p p l eo ft h et e s ts e l e c t i o n 2 2 实验仪器与试剂 2 2 1 实验仪器 本实验主要在广西农业职业技术学院食品基础实验室完成的，主要的实验仪器有： ( 1 ) 打浆机( 飞利浦有限公司) ( 2 ) 电子精密天平( 江苏常熟双杰测试仪器厂) 8 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文 固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 ( 3 ) 磁力搅拌器( 上海安亭科学仪器厂) ( 4 ) 酒精计( 河北省武强县同辉仪表厂) ( 5 ) m 型手持糖量计( 泉州中友光学仪器有限公司) ( 6 ) g y - i 型压力计( 牡丹江市机械研究所) ( 7 ) h h s 数显恒温水浴锅( 金坛市医疗仪器厂) ( 8 ) p h s j 3 f 型p h 计( 上海精密科学仪器有限公司) ( 9 ) 8 0 0 b 台式离心机( 上海安亭科学仪器厂) ( 1 0 ) 7 5 2 型紫外可见分光光度计( 上海恒平科学仪器有限公司) 2 2 2 实验试剂 葡萄酒用高活性干酵母( 湖北安琪酵母股份有限公司) 、活性为5 0 0 0 0 单位的果胶 酶( 武汉生发生物科技有限公司) 、海藻酸钠( a r ) 、无水氯化钙( a r ) 、琼脂( a r ) 、 卡拉胶( a r ) 、明胶( a r ) 、戊二醛( a r ) 、亚硫酸氢钠( a r ) 、氢氧化钠( a r ) 、酒 石酸钾钠( a r ) 、硫酸铜( a r ) 、次甲基蓝、亚铁氰化钾( a r ) 、冰醋酸( a r ) 、乙酸 锌( a r ) 、乙醇( a r ) 、甲醇( a r ) 、抗坏血酸( a r ) 。 2 3 实验方法 2 3 1 工艺流程 2 3 1 1 固定化酵母的制备 ( 1 ) 海藻酸钙包埋法：取一定量的干酵母一用2 蔗糖溶液活化一与海藻酸钠溶液 混合一滴入c a c l 2 溶液中凝胶一无菌水洗涤一平衡，在冰箱中固化2 4 h 一固定化酵母。 ( 2 ) 琼脂包埋法：取一定量的干酵母一用2 蔗糖溶液活化一与琼脂溶液混合一冷 却后切成小块一无菌水洗涤一平衡，在冰箱中固化2 4 h 一固定化酵母。 ( 3 ) 卡拉胶包埋法：取一定量的干酵母一用2 蔗糖溶液活化一与卡拉胶溶液混合 一冷却后切成小块一无菌水洗涤一平衡，在冰箱中固化2 4 h 一固定化酵母。 ( 4 ) 明胶戊二醛交联法：取定量的干酵母一用2 蔗糖溶液活化一与明胶溶液 混合一冷却后切成小块一浸入1 5 的戊二醛溶液一室温下交联3 h 一无菌水洗涤一固定 化酵母。 2 3 1 2 果胶酶处理工艺流程 香蕉、菠萝原料一去皮一切分一与酶液混合打浆( 9 0 0 9 香蕉、菠萝果肉加酶液 1 0 0 m 1 ) 一加热酶解一榨汁一离心( 4 0 0 0 i ：m i n ，1 0 r a i n ) 一测定出汁率一发酵一测定透光 率。 9 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 2 3 1 3 果酒发酵工艺流程 香蕉，菠萝原料一去皮，切分一香蕉，菠萝按一定比例混合一添加果胶酶液混合打 浆一果胶酶酶解一过滤混合果汁一杀菌( 9 0 ，1 5 m i n ) 一冷却一糖酸调配一硫处理一 添加固定化酵母( 或游离酵母) 一发酵一测定酒精度、糖度等指标一结果分析。 2 3 2 操作要点 2 3 2 1 原料的选购和处理 选购的成熟度为八成的香蕉、菠萝，果实结实、表皮无损伤和缺陷、无烂心和病虫 害；香蕉、菠萝去皮后，将切分成1 2 c m 大小的果块，并尽量避免香蕉果肉与空气的 接触，以防止果肉的褐变。 2 3 2 2 酵母的活化 将干酵母从冰箱中取出让其温度恢复至室温，称量一定数量后，投入2 蔗糖溶液 中( 体积为l o 2 0 m 1 ) ，在3 0 4 0 的条件下活化3 0 m i n 。 2 3 2 2 海藻酸钙固定酵母粒子的制备 配制一定浓度的海藻酸钠溶液( 溶液总体积为待发酵果汁总体积的2 5 ) ，加热至 3 5 v ，完全溶解后与活化好的酵母混合，搅拌均匀，用已灭菌的胶头滴管滴入冷的c a c l 2 溶液( 总体积与海藻酸钠溶液相同) 中，制得4 5 m m 大小的球形颗粒，用无菌水洗涤 3 4 次，平衡，在冰箱中过夜固化2 4 h 。 2 3 2 3 打浆、酶解处理 香蕉、菠萝原料去皮、切分后，加入一定浓度的果胶酶溶液打浆( 9 0 0 9 香蕉、菠萝 果肉加酶液l o o m l ) ，果浆于一定温度的水浴中酶解至规定的时间。 2 3 2 4 榨汁 酶解处理后将果浆从水浴中取出，用4 层纱布进行过滤榨汁，混合果汁。 2 3 2 5 离心 将榨汁后的香蕉菠萝混合果汁以4 0 0 0r r a i n 的速度离心l o m i n ，以得到澄清度较高 的果汁。 2 3 2 6 杀菌 将混合果汁加热到9 0 保持1 5 m i n ，其目的是使果胶酶失活及杀灭其他有害的微生 物。 2 3 2 7 糖酸调配 果酒灭菌结束后，以2 0 的柠檬酸和4 0 的氢氧化钠将香蕉、菠萝复合果汁的p h 1 0 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 调至最佳发酵p h ，然后按以下的加糖公式调整糖度。 加糖量计算公式： 加糖量( g ) = 等 式中： v 一一果汁的体积( m l ) ； b 一一果汁初始的糖度( ) ： a 一一果汁所需的糖度( ) ； 2 3 2 8 发酵 将固定化好的酵母粒子投入调好糖酸比例的香蕉、菠萝果汁中在一定的温度下进行 酒精发酵，经数天后，发酵液中的残糖降到最低时停止发酵。 2 3 3 检测项目与方法 2 3 3 1 固定化酵母机械强度的测定 参照谭峰等( 1 9 9 6 ) 报道的固定化酵母机械强度测定方法：取3 0 个固定化酵母颗 粒，均匀放置在两块洁净的玻璃板中间，用压力计测定使其变形一半时所需的压力( 如 图3 ) 。 ， 以 f 暑 毛 ； 基 电 墒 图3 固定化酵母的机械强度测定示意图 f i g 3s k e t c hm a p o f t h em e c h a n i c a ls t r e n g t hd e t e r m i n a t i o no fi m m o b i l i z e dy e a s t 2 3 3 2 酒精度的测定 采用酒精计法( g b t 1 5 0 3 8 2 0 0 6 ) 测定：用一个洁净、干燥的容量瓶准确量取5 0 0 m l 的香蕉、菠萝复合果酒( 液温2 0 。c ) 于1 0 0 0 m l 蒸馏瓶中蒸馏，用5 0 m l 水分三次冲洗 翌一 ， 。t一 广西大掌硕士( 工程硕士) 掌位论文固定化酵母发酵生产香蕉菠萝复合果酒的研究 容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，再加几颗玻璃珠，连接冷凝器，收集馏出液到原容量瓶补 加水至刻度，混匀后倒入量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的 酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5 m i n ，水平观测， 读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，换算 成2 0 时酒精度。 2 3 3 3 残糖的测定 果酒的残糖含量按折光法测定( 王喜萍，2 0 0 6 ) ：取果酒1 - 2 滴，置于手持式折光 仪的棱镜面上，合上盖板，将仪器进光窗对向光源或明亮处，于视野中所见明暗分界线 相应之百分数，即为果酒残糖含量( ) 。 2 3 3 4 总糖( 以葡萄糖计) 的测定 采用直接滴定法( g b 仃1 5 0 3 8 2 0 0 6 ) 测定：利用费林溶液与还原糖共沸，生成氧化 亚铜沉淀的反应，以次甲基蓝为指示液，以h c l 水解处理后的果酒样液滴定煮沸的费林 溶液，达到终点时，稍微过量的糖将蓝色的次甲基蓝还原为无色，以示终点。根据样品 消耗量求得总糖含量。计算公式如下