（食品科学专业论文）产黄曲霉毒素菌株的检测方法及产毒条件的研究.pdf

产黄曲霉毒素菌株的检测方法及其产毒条件的研究 摘要 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，具有致癌、致 畸、致细胞突变的“三致”作用，一直都受到各国的关注；其中寄生曲霉的所有菌 株都能产生黄曲霉毒素而黄曲霉只有部分菌株能产生黄曲霉毒素；据f a o 报道， 全球每年约有2 5 9 6 的农作物遭受霉菌及其毒素的污染，约有2 的农作物因污染严 重而失去营养和经济价值。但国内外研究的焦点主要集中在黄曲霉毒素的检测方 法，而对产黄曲霉毒素菌株检测的方法报道较少；传统的微生物检测方法费时、 费力而且容易出现假阴性结果，给检测带来误差。目前对于被黄曲霉毒素污染的 粮食只是被动地采用减毒化处理，并没有真正从产毒菌株这一源头上进行有效防 控，其主要原因在于对毒素产生菌的产毒机制、产毒条件和毒素积累规律缺乏深 度了解，缺少可用于指导防控实践的理论依据。 本文研究了3 种不同的方法检测产黄曲霉毒素的菌株，同时对产毒菌株的产 毒条件和毒素积累规律进行了摸索，实验模拟了粮食储藏环境，确定产毒的最优 条件和最低条件，通过对黄曲霉产毒条件和毒素积累规律的研究不仅可以确定影 响毒素产量的主要环境因素，而且还可以预测出在自然环境中菌株的产毒情况， 从而为揭示其产毒机制并进一步制定出相应的防控措施提供依据。主要研究结果 如下： 1 在毒素提取方法上参考中华人民共和国国家标准并加以改进，确定了发酵 液中黄曲霉毒素的提取方法，采用免疫亲和柱法进行纯化处理实现了黄曲霉毒素 的有效分离并减少了其它毒素的干扰；再经过柱后电化学衍生增大荧光强度进行 荧光检测，实现快速、准确检测黄曲霉毒素；因此可以定性、定量的检测产黄曲 霉毒素菌株。 2 利用环糊精可以增强黄曲霉毒素荧光强度这一特性，在普通霉菌培养基 中添加p 一环糊精和m p 一环糊精，在本实验条件下，通过对p 一环糊精和m b 一环糊 精作用效果、添加浓度的比较，确定了m 1 3 - 环糊精添加浓度为6 9 l 时对增强黄 曲霉毒素荧光效果较好；同时，对m p 一环糊精增强黄曲霉毒素荧光的特异性做了 分析，结果表明m b 一环糊精只能增强黄曲霉毒素的荧光性。该方法在普通霉菌培 养基上都适用，这与传统的检测方法相比要简单、快速，且节省人力、物力。 i v 3 通过对黄曲霉毒素合成过程中重要的几个结构基因的筛选，发现a f l o 、 a r i d 和a f l p 这三个基因是黄曲霉毒素合成过程中的关键基因，这三个基因同时表 达的菌株经h p l c 检测都是产黄曲霉毒素菌株，因此可以通过r t p c r 的方法检测 这三个基因是否同时表达可以推断出该菌株是否是产毒菌株或其是否具有产毒 的可能性。 4 通过正交试验确定了产毒菌株的最适产毒条件和最低条件；实验利用温 度、p h 、转速来模拟粮食的储藏环境，实验表明，通过控制改变储藏环境条件来 控制产毒菌的产毒是一个高效易行的方法；储藏环境中的通风条件，储藏环境温 度和储藏物的p h 对菌株的产毒影响重大，较低的温度和良好的通风，即一个凉 爽干燥的储藏环境，加上弱碱性的条件p h 值可以很好的降低毒素的产量。 5 本文同时还对黄曲霉菌株和寄生曲霉菌株的毒素积累规律做了研究，在 最优培养条件下，黄曲霉毒素的产生量在短时间内迅速增加；通过对黄曲霉产毒 条件的研究不仅可以预测出在自然环境中菌株的产毒情况，而且还可以确定影响 毒素产量的主要环境条件等，从而为揭示其产毒机制并进一步制定出相应的防控 措施提供依据。 关键词：产黄曲霉毒素菌株；h p l c ；甲基化b 一环糊精；r t - p c r ；毒素积累规律 v s t u d yo nt h ed e t e r m i n a t i o no fa f l a t o x i n - p r o d u c i n g a s p e r g i l l u ss t r a i n sa n d t h ec o n d i t i o n so f a f l a t o x i n s p r o d u c t i o n a b s t r a c t t h ea f l a t o x i n sa r es e c o n df u n g a lm e t a b o l i t e sw i t hh i g h l yt o x i ca n dc a r c i n o g e n i c p r o p e r t i e sp r o d u c e db ys o m es t r a i n so f a f l a v u sa n da p a r a t i c u sw h i c ha r ea ：t t e n t e db y a l lc o u n t r i e si nw o r l d h o w e v e rn o ta l ls t r a i n sa r ea b l et op r o d u c ea f l a t o x i n s ，a l l s t r a i n so fa p a r a t i c u sa n dp a r t ss t r a i n so fa j c a v sc a np r o d u c ea f l a t o x i n s i ti s r e p o r t e db yf a ot h a t2 5 c r o p sa r ec o n t a m i n a t e db ya f l a t o x i n sa n d2 c r o p sl o s t n u t r i t i o n a la n de c o n o m i c a lw o r t h i ti sp o i n t e do u tt h a tt h er e s e a r c ht o p i c si nt h i sf i e l d a r ef o c u s i n go nt h ed e t e r m i n a t i o nt e c h n o l o g yo fa f l a t o x i n sa tp r e s e n t ，h o w e v e r , t h e r e p o r t sa b o u tt h et e s t i n go fa f l a t o x i np r u d o u c i n gs t r a i n sa r ev e r yl i t t l e t r a d i t i o n a l m i c r o b i o l o g i cd e t e c t i o nm e t h o d sa r et i m ec o n s u m i n ga n de a s i l ya p p e a rf a l s en e g i t i v e r e s u l t s f o ra f l a t o x i nc o n t a m i n a t i o ng r a i n ，p e o p l eo n l yt r e a tb yc h e m i c a lm e a n st o r e d u c et h ea f l a t o x i n s m si sb e c a u s et h a tw el a c kt l l e o r e t i c a lf o u n d a t i o no fa f l a t o x i n b i o s y n t h e s i sm e c h a n i s m ，c o n d i t i o na n da c c u m u l a t i o nr u l e t h i sp a p e rs t u d i e so nt h r e em e t h o d st od i s t i n g u i s ha f l a t o x i n - p r o d u c i n ga n d n o n - p r o d u c i n ga s p e r g i l l u ss t r a i n sa n dt h e a c c u m u l a t i o nr u l eo fa f l a t o x i n t h e e x p e r i m e n ts i m u l a t e ss t o r a g ee n v i r o n m e n to fg r a i n st od e t e r m i n et h eo p t i m a la n d m i n i m u mc o n d i t i o no fa f l a t o x i n sp r o d u c t i o na n dt h ea c c u m u l a t i o no fa f l a t o x i n s s o w ec a nd e t e r m i n et h em a i ne n v i r o n m e n t a lf a c t o r sa f f e c t i n gt h ep r o d u c t i o no f a f l a t o x i n sa n dp r e d i c tt h a tt h es t r a i n sp r o d u c ea f l a t o x i n si nn a t u r a le n v i r o n m e n t t h i s s t u d yp r o v i d e st h ei n f o r m a t i o nf o rm e c h a n i s mo fa f l a t o x i n sp r o d u c t i o na n dg i v e n r e l e v a n tp r e v e n t i o nm e a s u r e s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h em e t h o do fe x t r a c t i n ga f l a t o x i n sf r o mf e r m e n t a t i o nl i q u i di si m p r o v e db a s e do n n a t i o n a ls t a n d a r du s i n gi m m u n o a f f i n i t yc o l u m n st or e d u c ei n t e r f e r e n c e so fo t h e r t o x i n s t h i sm e t h o du s e de n z y m el o a d e dp o s t c o l u m na n de l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t o r t oi n c r e a s ef l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y c a i l q u a l i t a t i v e l ya n dq u a n t i t a t i v e l y d e t e c t v i a f l a t o x i n p r o d u c i n gs t r a i n s 2 c y c l o d e x t r i nc a ne n h a n c et h en a t u r a lf l u o r e s c e n c eo fa f l a t o x i n s s t r a i n s a r e c u l t i v a t e do nc o m m o nm e d i au s e df o rt e s t i n gm y c o t o x i np r o d u c t i o na b i l i t yw h i c h 1 3 - c y c l o d e x t r i na n dm e t h y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i ni s a d d e d t h ea f l a t o x i n s - p r o d u c t i o n s t r a i n sa r er e a d i l yd e t e c t a b l eb yd i r e c tv i s u a l i z a t i o no fab r i g h tb l u eo rb l u e g r e e n f l u o r e s c e n ta r e as u r r o u n d i n gc o l o n i e sw h e no b s e r v e du n d e rl o n gw a v el e n g t h ( 3 6 5 一n n l ) u vl i g h ta f t e r5d a y so fi n c u b a t i o na t2 8 。c w ec o m p a r et h ee f f e c ta n d c o n c e n t r a t i o no f1 3 - c y c l o d e x t r i na n dm e t h y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i na n dp a ya t t e n t i o nt o t h e s p e c i f i c i t y o f 1 3 - c y c l o d e x t r i n a n d m e t h y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i n t oe n h a n c e f l u o r e s c e n c eo fa f l a t o x i n s w ef o u n dt h a tm e t h y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i nc a no n l ye n h a n c e t h ef l u o r e s c e n c eo fa f l a t o x i n sa n dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o ni s6 9 lt h ee f f e c ti sb e s t 3 t h ek e yg e n e sa f l o ，a f l da n da f l pa r es e l e c t e df r o ms e v e r a ls t r u c t a lg e n e si nt h e b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f a f l a t o x i nw h o s ec o n c u r r e n te x p r e s s i o nc a nb eu s e da sm a r k e r o ft h ea f l a t o x i g e n i cp o t e n t i a lo f a f a l v u sa n d a p a r a s i t i c u s s ot h et h r e ek e yg e n e sa r e t h ep r e r e q u i s i t ef o rd e v e l o p i n gd i a g n o s t i cr t - p c rb a s e do ng e n ee x p r e s s i o nb y c o n t r o l l i n gu pt ow h i c hp o i n tt h ea f l a t o x i nb i o s y n t h e s i sm a yo c c u i o rn o t 4 t h eo p t i m a la n dl o w e s tc o n d i t i o na r es e l e c t e db yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t t h i s e x p e r i m e n ts i m u l a t e sg r a i ns t o r a g ee n v i r o n m e n tb yt e m p e r a t u r e ，p ha n dr o t a t i o n a l s p e e d s ow ec a n s e et h a tc h a n g i n gs t o r a g ec o n d i t i o nt oc o n t r o la f l a t o x i np r o d u c i n gi s a ne f f i c i e n ta n de a s ym e t h o d t h ev e n t i l a t i o na n dt e m p e r a t u r eo fs t o r a g ec o n d i t i o n a n dt h ep ho fg r a i na r ee f f i c i e n tf o ra f l a t o x i np r o d u c t i o n 5 t h i sp a p e rs t u d i e so nt h ea c c u m u l a t i o no fa f l a t o x i n sw h i c hi n c r e a s e sr a p i d l yu n d e r t h ed e t e r m i n a t eo p t i m a lc o n d i t i o ni nas h o r tt i m e s ow ec a np r e d i c tt h em o d e lo f a f l a t o x i np r o d u c t i o na n dd e t e r m i n et h em a i nf a c t o r si n f l u e n c i n ga f l a t o x i nt oc o n t r o l t h ea f l a t o x i nc o n t a m i n a t i o np r o d u c e db ya s p e r g i l l u ss t r a i n sd u r i n gg r a i ns t o r a g e u s e f u lr e f e r e n c ew e r ep r o v i d e db yt h e s er e s u l t sf o r t h ec o n t r o lo fa f l a t o x i n c o n t a m i n a t i o n k e yw o r d s ：a f l a t o x i n - p r o d u c i n gs t r a i n s ；h p l c ；m p c y c l o d e x t r i n ；r t - p c r ； a f l a t o x i na c c u m u l a t i o nr u l e v i i 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 注；如没直墓丝盂要挂别直明鲍：奎拦亘窒) 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：懒签字日期：罗年占月6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：￥酗确 签字日期：d 宫年占月占日 i i i 导师签字：，砌 签字日期： 年月 日 产黄曲霉毒素菌株的检测及黄曲霉毒素积累规律的研究 1 月i j 吾 1 1 研究现状 1 1 1 黄曲霉毒素的简介 黄曲霉毒素( a f l a t o x i n s ，a f t ) 是真菌的次级代谢产物，主要是由黄曲霉 “f l a v u s ) 、寄生曲霉( a p a r a s i t i c u s ) 和集蜂曲霉0 n o n i u s ) 一些菌株产生的； 国外黄曲霉毒素污染主要是由寄生曲霉产生的，而国内主要是由黄蓝霉产生的， 黄曲霉的产毒能力由于菌株的不同而差异甚大；寄生曲霉的所有菌株都能产生黄 曲霉毒素但在我国寄生曲霉罕见圆。黄曲霉毒素是一种毒性很强的肝毒素，可引 起肝脏的急性或慢性损害，除损害机体的肝脏以外，黄曲霉毒素对肾脏等其他多 种组织器官也能造成严重损害，更为严重的是黄曲霉毒素已被证实具有致癌、致 畸、致细胞突变的“三致”作用口3 ；广泛存在于花生、玉米、麦类、稻谷等农产 品中，在通心粉、调味品、牛奶和食用油中也经常发现，严重危害人、畜、禽类 健康。黄曲霉毒素b 。被公认为是目前致癌力最强的天然物质，1 9 9 3 年黄曲霉毒素 被世界卫生组织( w h o ) 的癌症研究机构划定为i 类致癌物n 吲。 研究发现妒1 0 3 ，黄曲霉是粮食和食品中最常见的真菌，但并非所有黄曲霉菌 株都能产生毒素，根据m a t l e s 等人报道，从自然界中分离的黄曲霉菌株中，只有 1 0 能产毒素；产黄曲霉毒素的真菌能够侵染多种农作物并在其中生长，收获期 前农作物中黄曲霉毒素的污染主要由于在其生长后期出现炎热、干旱的气候条 件，这种条件能够刺激产黄曲霉毒素的真菌生长，因此当生产地大面积出现这种 气候时，就会导致农作物明显的感染黄曲霉毒素的现象；如果农作物在生长过程 中遭遇病虫危害、土壤贫瘠、早霜、倒伏以及潮湿多雨等对作物生长不利的条件， 也会促使黄曲霉毒素的产生；收获后黄曲霉毒素的污染主要是由于储存条件不当 造成的，如仓储温度高、湿度大、通风透气条件不良等。据f a o 报道n ，全球每 年约有2 5 的农作物遭受霉菌及其毒素的污染，约有2 的农作物因污染严重而失 去营养和经济价值。由此估计，全球每年因霉菌毒素污染而造成的直接或间接经 济损失达数百亿美元。中国是世界花生生产大国，花生总产量和出口量均占世界 第一，是我国为数不多的具有明显竞争优势的出口创汇农产品。近年来，由于花 生黄曲霉毒素问题，影响了我国花生的卫生质量，制约了我国花生的出口。 在天然污染的食品中以a f b l 最为多见，其毒性和致癌性也最强，联合国有 产黄曲霉毒素菌株的检测及黄曲霉毒素积累规律的研究 关组织( 如w h o 、f a o 、u n e p 等) 多次组织调查并提出了控制标准。1 9 9 5 年世界 卫生组织制定的食品d p a f b ，最高允许浓度为1 5 陷埏，婴儿食品中不得检出n2 l ； 美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的总黄曲霉毒素含量( 指 b l + b 2 + g 1 + g 2 的总量) 不能超过1 5 陷k g ；欧盟国家的规定更加严格，要求人类 生活消费品中的a f b l 的含量不超过2 “g k g ，总量不超过4 “g k g n 引。 随着各国政府对食品安全的高度重视，国际上对农产品安全卫生的要求也日 趋严格，黄曲霉毒素的危害和检测也受到了前所未有的广泛关注。因此，基于上 述种种危害，世界各国对真菌毒素的污染问题日益关注和重视；各国先后制订了 各种真菌毒素的限量标准，以保护国民的身体健康及农业、畜牧业的经济利益。 据世界粮农组织( f a o ) 的最新调查显示，截止1 9 9 5 年，全球已有7 7 个国家和地 区设立了针对真菌毒素的限量法令，在各国现有的真菌毒素法令中，黄曲霉毒素 限量倍受关注。事实上，在所有的7 7 个国家和地区所设立的限量法令中均包含 至少一种针对黄曲霉毒素的限量；尽管这些限量水平参差不齐，涉及的毒素类型 也不尽相同，但足以反映世界各国对黄曲霉毒素的重视程度。 随着全球经济自由化的进程，真菌毒素的限量标准被一些发达国家进一步利 用为技术性贸易壁垒的手段之一，美国和欧盟国家的有关法律对人类消费食品和 奶牛饲料中的黄曲霉毒素含量都作出了严格规定。食品检测中往往以a f b l 为指 标，我国的食品限量标准为5 2 0p p b n4 1 ；国际食品法典委员会( c a c ) 也将鲜牛奶 中黄曲霉毒素m 。的限量定为o 5p p b ；1 9 9 5 年世界卫生组织制订的食品中a f b 。最 高允许浓度为1 5p p b ，婴儿食品中不得检出 1 5 o 1 1 2 黄曲霉毒素性质及毒性 1 1 2 1 黄曲霉毒素的理化性质 从1 9 6 1 年发现黄曲霉毒素以来，黄曲霉毒素的种类越来越多，目前已分离 鉴定出十二种，分别是黄曲霉毒素b l 、b 2 、g l 、g 2 、m l 、m 2 、b 2 。、g 2 a 、g m l 、 凡和毒醇；从化学结构上看，各种黄曲霉的毒素的结构非常相似，都含有一个 双呋喃环和氧杂萘邻酮( 香豆素) ，前者为基本毒性结构，后者可能与致癌有 单 1 a - 1 7 3 大 。 黄曲霉毒素是一类在紫外光照射下能发出强烈的特殊荧光的物质n8 。2 1 1 ，各种 黄曲霉毒素中，以黄曲霉毒素b i ( a f b l ) 、黄曲霉毒素b 2 ( a f b 2 ) 、黄曲霉毒素 g l ( a f g l ) 和黄曲霉毒素g 2 ( a f g 2 ) 为主；黄曲霉各种毒素结构及物理化学性质详 2 产黄曲霉毒素菌株的检测及黄曲霉毒素积累规律的研究 见表卜1 和图卜l 陴删。 表1 - 1 黄曲霉毒素的理化性质 t a b l e l - 1t h ep h y s i e o c h e m i c a lp r o p e r t yo f a f l a t o x i n s 裂裂捌捌 b 。 勘瓿 岱 蒯战 i 缸 渊， 图1 - 1 各黄曲霉毒素结构图 f i g1 - 1s t r u c t r u a lf o r m u l ao fa f l a t o x i m 从图1 - 1 中可看出，a f b l 、a f b 2 类结构为甲氧基、二呋喃环、香豆素、环戊 烯酮的结合物，在紫外线下产生蓝紫色荧光；a f g l 、a f g 2 类结构为甲氧基、二 呋喃环、香豆素和环内酯，在紫外线下产生黄绿色荧光；黄曲霉毒素m l 是黄曲霉 h 砝 产黄曲霉毒素菌株的检测及黄曲霉毒素积累规律的研究 毒素b l 在体内经过羟化而衍生成的代谢产物乜钔。 黄曲霉毒素是迄今已发现的各种真菌毒素中最稳定的一种心引。结晶的a f b l 非常稳定，高温( 2 0 0 ) 、紫外线照射，都不能使之被破坏；加热至u a f b 。的熔 点2 6 8 - 2 6 9 ，它就开始分解。a f b l 在中性、酸性溶液中很稳定；在p h 卜3 的 强酸性溶液中稍有分解；在p h9 1 0 的强碱性溶液中，能迅速分解产生钠盐，荧 光也随之消失，但此反应是可逆的瞳6 | 。 1 1 2 2 黄曲霉毒素的毒性 众所周知，氰化物和砒霜是剧毒物质，但是黄曲霉毒素的毒性要比它们大很 多倍。目前已查明，黄曲霉毒素对人和很多种动物都表现出剧烈的毒性，而且具 有明显的致癌能力；其中a f b l 毒性最大，致癌能力最强，a f g l 、a f m l 其次， a f b 2 、a f g 2 和a f m 2 较弱。a f b l 除致癌外，还能引起突变和导致畸形乜7 1 。 表1 - 2 黄曲霉毒素和其它有毒物质的半致死剂量 t a b l e1 2l d 5 0o fa f l a t o x i n sa n do t h e r t o x i cs u b s t a n c e s l d 5 0 ( m g k g )毒性级别l d s o ( m g k g ) 毒性级别 从表卜2 和表卜3 中可以看出，a f b l 的l d 5 0 为0 2 4 9m g k g ， 2 1 ) 也没 有异硫氰酸胍污染( 0 d 。0 d ：加 2 0 ) 。 4 3 2p c r 和r t p c r 结果 p e r 和r t p c r 采用相同的引物，p c r 程序也一样，表4 - 2 总结了所以实验 菌株r t p c r 的结果。由表4 2 可以看出a f l g 、a f l s 、a f l o 、a f l k 、a f l h 基因 r t p e r 结果显示，这几个基因与菌株是否产毒没有太大的联系，其中，a f l k 和 a f l h 对于大多数实验菌株都没有产生阳性条带；而a f l d 、a f l p 和a f l o 这三个 基因的r t p c r 结果与菌株产毒有很大的相关性，这三个基因扩增后有条带的菌 株均为产毒菌株，而无条带的菌株均为不产毒菌株，这与h p l c 检测结果一致。 4 6 产黄曲霉毒素菌株的检测及黄曲霉毒素积累规律的研究 菌株 3 2 8 9 0 3 4 4 0 8 3 4 4 0 9 3 4 4 1 0 3 3 9 5 0 3 3 9 5 1 3 6 1 5 5 3 6 1 5 6 p l p 2 s 1 s 2 表4 2r t - p c r 基因表达电泳检测结果 t a b l e4 - 2e x p r e s s i o no fa f l a t o x i ng e n e sb ya l a v u sa n da p a r a s i f i c u s h p l c 结果 + + + + + + + r t p c r 基因表达结果 a f l d a f l ga f l oa f l sa f l ra f l p a n q a f l k a f l h t u b l + + j - + + + j- +一 + + + + + + + + + + + + + + + + + ：有扩增条带一：无扩增条带 +一+ l- + + 一 +一+ + 一一 黄曲霉毒素成过程为n 羽：乙酰c o a 一己酰c o a n o r s o l o r i n i ca c i d a v e r a n t i n 一奥弗尼红素一v e r s i c o n a lh e m i a c e t a la c e t a t e v e r s i c o n a l a f l d 基因编码一分子量为2 9 k d a 的n o r s o l o r i n i ca c i dk e t o r e d u c t a s e ，在 黄曲霉毒素的生物合成中的作用是将n o r s o l o r i n i ca c i d ( n a ) 催化为 a v e r a n t i n ( a v n ) 。n o r s o l o r i n i ca c i d 是一个由乙酰基和9 个丙二酸单体在聚酮 合成酶催化下形成的在黄曲霉毒素生物合成过程中第一个被证明化学性质很稳 定的中间代谢产物n ；这个催化反应是黄曲霉毒素合成过程中的重要步骤。 a f l o 是从黄曲霉克隆出来的，编码一分子量为1 0 k d a 甲基转移酶， s a d e n o s y l m e t h i n o n i n e d e p e n d e n t0 - m e t h y l t r a n s f e r a s e ，即依赖s 一腺苷蛋氨 4 7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + g 屹 飓 毪 甜 舡 j a 素 一 霉 一宝、 雌 臻 鲱 撵 雒 曲 f 爿 j 搦 舱 鸭 躲 q 基 0 尸 叼 甲 素 沁 萄 复 邮 二 杂 。： 一 素 小 霉 霉 色 曲 杂 色 氢 杂 二 霉包杂 1 1 3 1 8 1 2 1 2 1 0 1 1 9 8 产黄曲霉毒素菌株的检测及黄曲霉毒素积累规律的研究 酸的0 一甲基转移酶活性。其作用在于催化脱甲基杂色曲霉毒素转变为杂色曲霉 素( o m s t ) n4 。；a f l p 的作用是将杂色曲霉素转化为0 甲基杂色曲霉素，这两步的 作用决定了黄曲霉毒素生物合成的最终产物，是通过编码细胞色素p 4 5 0 单氧化 酶的a f l q 基因催化0 一甲基杂色曲霉素转化实现的”5 i 。 s w e e n e y 等人n 。等艮道的根据a f l q 和a f l r 两个基因设计的引物，经过r t p c r 后的结果显示，这两个基因对于黄曲霉的一些菌株没有办法判断其是否产毒，这 可能是由于这两个基因设计时是针对寄生曲霉4 3 9 菌株黄曲霉毒素合成时基因 表达的情况，而并不适用于其它的曲霉菌属的菌株，同样，在本试验中这根据两 个基因设计的引物r t p c r 结果也没有出现适合的目的条带。 m32 8 9 03 4 4 0 8 3 4 4 0 9 3 4 4 1 0 ： 3 9 5 03 3 9 5 l36 1 5 云36 1 7 , 6p 1 p 25 ；1f , 2 a f t o a f t d a n p t u b 1 图4 2p c r ( 基因组d n a 作为模板，左) 、r t p c r ( a f l d ，a f l 0 ，a f l p ) 以及t u b l 电泳结果， 左侧是特异性条带的分子量火小 m ：d n a 分子量标准 f i g4 - 2t h er e s u l t s0f p c rr e a c t i o n ( g e n o m i cd n at e m p l a t e ，l e f tl a n e ) ，t r a n s c r i p t i o n ( r i g h tl a n e ) o fa f l d ，a f l o ，a f l p ，a n dt u b1d e t e c t e d t h em o l e c u l a rw e i g h t ( b p ) o fs p e c i f i ct r a n s c r i p t si s i n d i c a t e do nt h el e f tm a r g i n m ：d n ai a d d e r 4 8 产黄曲霉毒素菌株的检测及黄曲霉毒素积累规律的研究 图4 2 是a f l o 、a f l d 、a f l p 和t u b 1 四个基因p c r 和r t p c r 的电泳图，由图可以 看出对于胡o 、蛆d 和a f l p 这三个基因，当d n a 作为模板时，利用相同的引物， 所有实验菌株的p c r 结果都能够扩增出特异性条带；而c d n a 作为模板时，并不 是所有的菌株都有特异性条带，而且只有a f l o 、a f l d 、a f l p 这三个基因的表达与 菌株是否产毒有关；t u b 1 基因在d n a 和c d n a 为模板时都有扩增产物，这说明 p c r 反应程序中没影响扩增的抑制因素。 4 4 本章小结 总r n a 的提取是分子生物学基本技术之一，所得的总r n a 质量会直接影响到 后续实验的结果。在实验操作过程中，必须注意防止内源和外源r n a s e 的污染， 创造一个无r n a s e 的环境，才能获得完整、无降解的寄生曲霉总r n a 分子。 黄曲霉和寄生曲霉细胞壁厚很难彻底破碎，这必然造成总r n a 的损失，采用 液氮研磨，即可以彻底底破壁，又可产生极低的温度抑匍j r n a 酶的作用；另外， 黄曲霉和寄生曲霉中含有大量多糖，多糖具有与r n a 相似的理化性质，在提取总 r n a 时，容易与r n a 一起沉淀，因此在材料裂解的时候使多糖充分沉淀，避免多糖 的污染给后续实验带来的干扰。 除了r n a s e 的影响外，还应防止菌体基因组d n a 的污染，虽然它不会造成r n a 的降解，但它会对后续d n a 扩增的模板造成污染，产生错误的结果。本实验将r n a 提取方法改进，在提取r n a 的过程中用d n a s e i 处理了样品，彻底降解基因组d n a ， 得到了质量较高的r n a 样品。 通过对黄曲霉毒素合成过程中重要的几个结构基因的筛选，发现a f l o 、a f l d 和a f l p 这三个基因是黄曲霉毒素合成过程中的关键基因，这三个基因同时表达的 菌株经h p l c 检测都是产黄曲霉毒素菌株，因此可以通过r t - p c r 的方法检测这三个 基因是否同时表达可以推断出该菌株是否是产毒菌株或其是否具有产毒的可能 性。对黄曲霉毒素生物合成过程中重要基因表达的研究更进一步揭示了黄曲霉毒 素合成的关键点，同时为利用遗传学、基因工程等生物学手段来减少黄曲霉毒素 的污染提供了理论基础。 4 9 产黄曲霉毒素菌株的检测及黄曲霉毒素积累规律的研究 参考文献 【1 】焦杨，班克臣，曹骥等黄曲霉毒素b 1 诱发大鼠肝癌过程中b 连环蛋白的变化中华肝脏 病杂志，2 0 0 7 ，15 ( 10 ) ：7 8 3 7 8 4 【2 】y uj ，c h a n g ，p - k ，e h r l i c h ，k c ，e ta 1 c l u s t e r e dp a t h w a yg e n e si na f l a t o x i nb i o s y n t h e s i s a p p l i e da n de n v i r o n m e n t a lm i c r o b i o l o g y ，2 0 0 4 ，7 0 ：1 2 5 3 1 2 6 2 3 】h i c k s ，j k ，s h i m i z u , k ，k e l l e r ，n p g e n e t i c sa n db i o s y n t h e s i so fa f l a t o x i n sa n d s t e r i g m a t o c y s t i n i n ：k e m p k e n , f ( e d ) ，1 1 1 em y c o t axi a g r i c u l t u r a la p p l i c a t i o n s s p r i n g e r - v e r l a g ，b e r l i nh e i d e l b e r g ，2 0 0 2 ，9 9 ：5 5 6 9 【4 】p a y n e ，g a ，b r o w n ，m p g e n e t i c sa n dp h y s i o l o g yo fa f l a t o x i nb i o s y n t h e s i s a n n u a lr e v i e w o fp h y t o p a t h o l o g y ，19 9 8 ，3 6 ：3 2 9 - 3 6 2 【5 】c a r y ，j w ，d y e r , j m ，e h r l i e h ，k c ，e ta 1 m o l e c u l a ra n df u n c t i o n a lc h a r a c t e r i z a t i o no fa s e c o n dc o p yo ft h ea f l a t o x i nr e g u l a t o r yg e n ea f l r - 2 ，f r o ma s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s b i o c h i m i c ae t b i o p h y s i c aa c t a ，2 0 0 2 ，1 5 7 6 ：31 6 - 3 2 3 6 】e h r l i c h , k c ，m o n t a l b a n o ，b g ，c o t t y ，p j s e q u e n c ec o m p a r i s o no fa f l rf r o md i f f e r e n t a s p e r g i l l u ss p e c i e sp r o v i d e se v i d e n c ef o rv a r i a b i l i t yi nr e g u l a t i o no fa f l a t o x i np r o d u c t i o n f u n g a l g e n e t i c sa n db i o l o g y ，2 0 0 3 ，3 8 ：6 3 - 7 4 【7 】c h a n g ，p - k ，y u ，j ，b h a m a g a r , d ，c l e v e l a n d , t ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h ea s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u sm a j o rn i t r o g e nr e g u l a t o r yg e n e ，a r e a b i o c h i m i c ae tb i o p h y s i c aa c t a , 19 9 9 ， 1 4 9 1 ：2 6 3 - 2 6 6 【8 】c h i o