（食品科学专业论文）β半乳糖苷酶在液态奶中的应用技术研究.pdf

中文摘要 在我国有相当多的人喝奶后出现乳糖不耐症现象，这是由丁人体内缺乏乳糖酶所致。为了实 现人们“想喝奶和多喝奶”的愿望，进行低乳耱奶的生产和推广成为必然。 本课题总结了国内外的相关成果，对几种商业b 半乳糖苷酶的特性的进行研究，确定了乳糖 酶及其用量，最佳水解条件和工艺。并从超高温灭菌时出现美拉德反应的机理出发，以5 - h m f 为褐变程度的指示物，研究不同灭菌条件及添加抑制剂后对指示物的影响。完成了呼气h 2 实验 以确定其临床效果。 研究表明：( 1 ) 当热处理温度高于4 5 c 时，乳糖酶的水解能力会明显下降。牛乳的杀菌条件 可以使它们失活。对g 酶而言，p h 6 5 7 5 具有较高的酶解水平：酶用量为o 2 时， 8 - 1 0 作 用1 5 小时，或3 7 4 0 作用2 小时，乳糖的水解率达到7 0 以上。( 2 ) 采用h p l c 对5 - h m f 进行检测，回收率可达到9 1 7 。其中u h t 低乳糖奶中5 - h m f 含量为4 7 5ug m l ，分别是巴氏 杀菌奶、u i t t 保鲜奶和巴氏低乳糖奶的1 9 倍、l o 倍和7 3 倍。( 3 ) u h t 低乳糖奶中5 - h m f 含 量受乳糖水解率、灭菌温度和贮藏条件的影响。采用合适水解率( 如7 0 ) ，灭菌后，迅速冷却 并低温贮存，能较好地控制5 - h m f 和抑制褐变的程度。抑制剂c l 与b 2 配合使用时，对5 - h m f 的抑制率达5 0 阻上。( 4 ) 低乳糖奶的亮度值a l * 随5 - h m f 含量升高而降低红度值a a * 和黄 度值a b * 均随5 - h m f 含量升高而升高。( 5 ) 1 0 - 1 1 岁儿童中乳糖不耐症的发生率较高，约为8 0 2 ，饮用低乳糖奶可有效降低乳糖不耐受的发生率。 关键词；低乳糖奶，b 一半乳糖营酶，褐变，撺制 a b s t r a c t t h e r ea r em a n yp e o p l ei no u rc o u n t t yw h oa r eu n a b l et oc o m p l e t e l yd i g e s tl a c t o s e d u et ot h e d e c r e a s i n gi ni n t e s t i n a ll a c t a s ea c t i v i t y t op r o m o t et h ep r o d u c t i o na n dc o n s u m p t i o no fm i l k , i ti s n e c e s s a r yt op r o d u c ea n dp o p u l a r i z el o wl a c t o s em i l k i n1 1 1 ep a p e r , h y d r o l y s i sc h a r a c t e r i s t i c so f s e v e r a lc o m m e r c i a l 1 3 一g a l a c t o s i d a s e sw e f ei n v e s t i g a t e d ， a no p t i m u m1 3 g a l a c t o s i d a s eu s e di nt h es t u d yw a sd e t e r m i n e d ，a n dt h ed o s a g e ，h y d r o l y s i sc o n d i t i o n a n dp r o c e s st op r o d u c tl a c t o s em i l kw a sd e t e r m i n e d 5 - h m fi so n eo f t h ei n d i c t o r sf o rm a i l l a r dr e a c t i o n i tw a sa l s od i s c u s s e dt h ee f f e c t so ft h es t e r i l i z e dc o n d i t i o n sa n di n h i b i t u r so nt h ec o n c e n t r a t i o no f 5 - h m f t h eh y d r o g e nb r e a t ht e s to m t ) w a su s e di nt h es t u d yt oa n a l y z et h el a c t o s ei n t o l e r a n c ei n p r i m a r ys c h o o ls t u d e n t s ，a n dt h ee f f e c t sw e r ed e t e c t e da f t e ra b s o r p t i o no f l o wl a c t o s em i l k t h er e s u l 乜i n d i c a t e dt h a t ( 1 ) t h ea c t i v i t yo ft h eg a l a c t u s i d a s ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw h e n h e a tt r e a t m e n tt e m p e r a t u r ew a s a b o v e 4 5 t h e s t e r i l i z e d c o n d i t i o n s o f m i l k p r o d u c t i o nc a l l i n a c t i v e t h e b - g a l a c t o s i d a s e t ob - g a l a c t o s i d a s e t b eo p t l m u mp hv a l u ew a s6 ，5 - 7 5 w h e nm i l kw a st r e a t e dw i t hge n z y m ea t 8t o1 0 f o r1 5 h o o r s ，o r3 7t o4 0 4 c f o r2 h o u r s , w i t hd o s a g eo f o 2 ，t h ed e g r e eo f h y d r o l y s i sf o r l a e t o c a nr e a c h e d7 0 ( 2 ) 5 - h m fc o n c e n t r a t i o nw a sm e a s u r e db yu s i n gh p l cw i t hu v d e t e c t i o na t2 8 0 r i m ，w i t hr e c o v e r yo f 9 1 7 m5 1 狮c o n c e n t r a t i o ni nu h tl o wl a c t o s em i l kr e a c h e dt o4 7 5ug m 1 w h i c hw e r e1 8 t i m e sh i g l l e rt h a nt h a ti np a s t e u r i z e dm i l k ，9t i m e sh i 曲e rt h a nt h a ti nu h tm i l ka n d6 3t i m e s h i g h e rt h a nt h a ti np a s t e u r i z e dl o wl a c t o s em i l k , r e s p e c t i v e l y ( 3 ) n l e5 - h m fc o n c e n t r a t i o ni nu h tl o wl a c t o s em i l kw a f f e c t e ds i g n i f i c a n t l yb ys e v e r a lf a c t o r s , s u c ha sh y d r o l y s i sd e g r e eo fl a c t o s e ，t h ec o m b i n a t i o no ft e m p e r a t u r ea n dt i m ew h e ns t e r i l i z a t i o n ， a n ds t o r e dc o n d i t i o n s i f o p t i m u mh y d r o l y s i sd e g r e ei su s e d ，c o o l i n gr a p i d l ya f t e rs t e r i l i z a t i o n ，a n d s t o r e da tal o w e rt e m p e r a t u r e ，5 - h m fc o n c e n t r a t i o na n db r o w n i n gc a l lb ec o n t r o l l e de f f e c t i v e l y w h e nu s i n gi n h i b i t o r sb o t hc ia n db 2 ，5 - h m fc o n c e n t r a t i o nw a sl o w e r e dm o r et h a n5 0 t h a n w i t h m ri n h i b i t o r s ( 4 ) t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e c o n c e n t r a t i o no f 5 - h m f a n dc o l o r c b nb ed e s c r i b e d b y a l + 、a a + a n d a b + w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no f5 - h m fr i s e 。a l o fl o w - l a c t o s em i l kr e d u c e ，a n da a + a n da b + r i s e ( 5 ) t h e r ew a sa b o u t8 0 2 o c c u r r e n c eo fl a c t o s ei n t o l e r a n c ei nc h i l d r e no fa g e1 0t o1ly e a r s t h e a b s o r p t i o no f l o wl a c t o s em i l kc a nl o w e rt h eo c c m l r e n c ee f f e c t i v e l y k e y w o r d ：l o wl a c t o s em i l k ，8 - g a l a c t o s i d a s e ，b r o w n i n g ，b r o w n i n g ，i n h i b i t i o n i i 独创性声明 y83 g 二3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：鸯l 帆姗广年f f 月毕日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 碱燧孙捉 跏魏始旭 时间：土对年t 月毕日 洲：& 年l 月矿 1 1 研究目的和意义 第一章绪论 随着我国经济不断发展，生活水平逐步提高，人们开始注重健康的饮食习惯，表现之一就是 乳及乳制品的消费量开始增加。据统计，牛乳的年人均消费量从8 0 年代的3 - - 4 k g 上升到2 0 0 1 年的8 s k g 。国务院办公厅关于“十五”营养发展纲要提出了中国乳品消费的目标：到2 0 0 5 年， 人均年消费量达到1 0 k g ；到2 0 1 0 年，人均消费量达到1 6 k g ；到2 0 1 5 年，人均消费量达到2 3 k g 。 根据新奶业周刊第2 9 期数据版报道：2 0 0 4 年，鲜奶消费前1 0 名城市的消费量为4 0k g 至3 1k g ， 主要城市鲜奶消费量也达1 5k g 左右。尽管发展如此之快，但我国乳业的发展仍与世界平均水平 以及发达国家存在巨大的差距。可见，我国的乳品市场还具有广阔的发展前景。 牛乳中乳糖含量约4 8 ，占其中总糖量的9 9 咀上。正常生理条件下乳糖经小肠内乳糖 酶作用后，水解为葡萄糖和半乳糖才能被人体吸收，但是当人体内缺少乳糖酶，摄入牛乳后，就 会出现腹泻、肠胃胀气等不良反应，即乳糖不耐症。调查发现，有色人种，尤其是东方人中有乳 糖不耐症的人较多，3 - 5 岁时为2 2 1 ，7 - 8 岁时为3 9 o ，1 1 - 1 3 岁时为3 6 8 ，成人时更多。 我国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达8 6 7 ，不耐受指数为0 9 ，而且我国南方地 区比北方地区的人不适宜症更多些。 因此，就中国乳品业来说，一方面牛乳是人类最佳韵饮食，需大力普及全民营养知识，让广 大消费者自觉饮用牛乳，以更好地增加国民体质；另一方面，由于乳糖不耐症，有很多人无法充 分利用牛乳，这对牛乳的生产及消费的增长具有较大的阻碍作用。降低牛乳中乳糖含量，对于满 足乳糖不耐症患者的乳品消费需求，以及促进我国乳品工业的发展具有十分重要的意义。 这在加工中就产生了一个问题，大量还原糖使低乳糖奶在u h t 处理时发生美拉德反应，引 起非酶褐变，丽巴氏杀菌条件下低乳糖奶的褐变程度很轻，色泽几乎没有变化。因此，如何控制 褐变是生产u h t 低乳糖奶过程中需要解决的闯题。 本课题以b 一半乳糖苷酶及其酶解的液态奶产品作为研究对象，通过对两种不同来源的p 半乳 糖苷酶特性的研究，并结合实际的生产条件，确定了较理想并具有实际应用价值的水解条件和加 工工艺。同时，对争半乳糖苷酶及其酶解的液态奶的超高温产品在加工过程中产生的美拉德反应 进行研究，并从不同的角度探讨了其超高温产品的褐变抑制技术。采用高压液相色谱测量h m f 作为褐变的指示物，并用色差测定来反映褐变的程度，分析了不同情况下及抑制条件下它们的变 化，旨在寻找安全有效的褐变抑制方法，其意义在于减少其超高温产品的营养损失，并改善其感 官特性。 1 2 文献综述 1 2 1 乳中主要构成成分 乳是哺乳动物产犊后由乳腺分泌的一种具有胶体特性的生物学液体，包含幼畜生长发育所需 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 的各种营养成分和保护幼畜免受感染的抗体。乳是哺乳动物最理想的天然食物，富含优质蛋白质、 乳脂、乳糖等营养成分和钙、磷、钾等矿物质以及多种维生素，还含有多种免疫物质、酶、激素 等具有生理活性调节功能的生物活性物质，因此乳及乳制品有“近乎完善的食物”的美称，是人类 改善营养，增强体质不可缺少的理想食品( 高亚滨，1 9 9 7 ；黄桂英，1 9 9 9 ) 。在发达国家中，乳 与乳制品已经成为人们饮食的重要组成内容；我国新修订的中国居民膳食指南中明确强调了 人一天一杯奶( 2 5 0 m 1 ) ”，而且w h o 也把人均乳品消费量列为衡量一个国家人们生活水平的 主要指标。由此可见，乳与乳制品在人们饮食生活中占有重要的地位。 乳中各种营养成分的含量存在种间差异，表1 1 列出了常见哺乳动物主要乳成分的含量。 表1 - 1 常见晡乳动物主要乳成分的含量( ) 目前用于生产乳制品的主要是牛乳，占整个乳品原料的9 5 以上。正常牛乳的各种成分基本 恒定，但受乳牛的品种、个体差异、泌乳期、年龄、饲料、季节、气温、挤奶状况及健康等因素 影响有所不同，其中变化最大的是膳肪，其次是蛋白质，乳糖和灰分的含量相对稳定。 1 ) 乳脂肪 不同种类哺乳动物乳中脂肪含量不同乳脂肪最重要的功能是为幼膏提供能量，同时，某 种哺乳动物的乳中脂肪含量也反映了该种动物的幼畜对能量的需求，例如，陆生哺乳动物的脂肪 含量就远低于海洋哺乳动物的乳脂肪含量( 见表1 - 1 ) 。 牛乳中脂肪含量为2 5 6 0 ( 乳品加工手册) 。乳脂肪的重要功能性质主要表现在以下几方 面： ( 1 ) 作为必需脂肪酸的来源。有些脂肪酸不能由动物进行自身合成，如亚油酸( c 1 8 ：2 ) ； ( 2 ) 脂溶性维生素的载体。脂溶性维生素有a 、d 、e 和k 。 ( 3 ) 是芳香物质的主要来源。赋予乳和乳制品特有的芳香和流变学特性。 2 ) 乳蛋白质 乳中蛋白质种类繁多，根据蛋白质的理化性质和生理功能可将其分为；酪蛋白这部分蛋 白的等电点为p h 4 6 ，即将牛乳蛋白溶液在3 0 c 2 e 右，调节p h 至4 6 沉淀下来的这部分蛋白质 2 中国农业大学硕士学位论文第一章结论 就是酪蛋白；而在p h 4 6 时保持溶解状态的这部分蛋白质叫做乳清蛋白。 乳中酪蛋白和乳清蛋白的比例与动物的种类有很大的关系。人乳中酪蛋白：乳清蛋白为4 0 ： 6 0 ，马乳中比例为5 0 = 5 0 ，牛乳、羊乳中的比例为8 0 ：2 0 。酪蛋自和乳清蛋白在理化性质和生 理功能方面有很大不同，归纳起来主要有以下几方面： 牛乳中蛋白质含量约3 5 左右。各部分蛋白的大致比例如图1 - 1 黼自 - 醋蟹白 t 。一罄置自 口一謦置白” t 一糊囱 睹藩自慧避 靴 i 孽氆自耍 “乳白臻i ：| g 瑰蹲萤翻 鱼德囱澄自 擞痰萤白 懿它( 趣援脸，厦砖 巍藕蛋白厨总溉 蔫中辩嘲黥 谶废增 脂肪豫臻鹫翻 碍4 赞白翁总董3 z 7勰7 ”) 夸后；髓国t 。一精蛋自 ”) 戗舾t 一黪蛋白 爨耪寒撩：w 幽n 鲻m i e 田1 - t 乳中蛩白质的浓度 占胬自赣 总教的尉静 敬盼哪 牛乳中的蛋白质组分在加热过程中极易受到影响，其中一些蛋自组分的变化不是独立的 包括了盐类和糖类的参与。 升乳糖 乳糖是哺乳动物乳汁中特有的糖类。牛乳中乳糖含量约为4 8 ，占总糖的9 9 8 ，它是牛乳 甜味的来源，其甜味约为蔗糖的1 ，5 。乳糖是乳腺上皮细胞以葡萄耱为前体，在一系列酶的作用 下合成的。乳糖是由一分子m 葡萄糖和一分子d 半乳糖以阻l ，4 - 糖苷键结合而成的双糖，其合成 步骤：以葡萄糖为前体物质一部分葡萄糖先转化为半乳糖，然后经乳糖合成酶催化，半乳糖与 葡萄糖结合，形成乳糖。哺乳动物乳汁中乳糖含量因种类而异，人乳中乳糖含量为6 7 。牛乳中 6 日1 基 3 蕈|籼n|萋 ”蝴心妣姒 n l b剐蛐m 剐 m 姒驰 中国农业大学硬士学位论文第一章绪论 乳糖平均含量为4 8 ( 顾瑞霞，2 0 0 0 ) 。人体摄入乳糖后，在消化过程中经乳糖酶催化，分解 为葡萄糖和半乳糖( 图1 2 ) 。 o h l a c t o s e1 0 a l - b e t a ( 1 - 4 ) g l c ) 乳糖 雄 乳糖酶 o h o h 田肆 g a l a c t o s e 囤1 - 2 乳糖经乳糖酶作用转化为葡萄糖和半乳糖 半乳糖 和其它糖类一样，乳糖是人体热能的来源，l g 乳糖可产能约1 6 7 5 k j ，牛奶中总热能的2 5 来自乳糖。除供给人体能源外，乳糖还具有与其它糖类不同的生理功能( 陈洪兴，2 0 0 2 ) 。 ( 1 ) 调节乳及泌乳过程的渗透压。 ( 2 ) 促进肠道蠕动。乳糖在胃中并不被消化吸收，而是直接进入肠道，在小肠末端乳糖 转化为乳酸，形成酸性环境，在结肠内促进乳酸菌和双歧杆菌生长，而抑制其它有害细菌的繁殖， 因此对于维持肠道内微生态平衡、防治婴儿下痢有很大作用。 ( 3 ) 促进钙的吸收。由于肠道微生物分解乳糖产生乳酸，降低肠道p h ，提高了钙盐的溶解 性，且乳酸可促进胃肠蠕动，促进钙的运输和吸收、以及促进钙进入骨骼的速度，提高骨骼质量， 防止佝偻病的发生。因此，婴儿食品中常强化乳糖。 ( 4 ) 促进智力发育。乳糖水解后生成的半乳糖是构成脑及神经组织的糖脂质的一种成分， 它能促进脑苷和粘多糖的生成对婴儿的智力发育十分重要。 ( 5 ) 作为糖尿病患者的碳水化合物来源。糖尿病患者摄入5 0g 葡萄糖后，最大可提高血糖 浓度至1 4 0 r r i g 1 0 0 m l ，而摄入5 0g 乳糖仅提高7 4m g 1 0 0 r o t 。乳糖吸收速度比葡萄糖慢，但对胰 岛素的合成来说是必要的。 1 2 2 乳糖不耐症及解决措施 尽管乳及乳制品具有“近乎完美的食物”的美誉，在我国，乳制品的发展仍处于初级阶段，其 中乳糖不耐症是最主要的原因之一。 由于乳糖需经位于小肠拈膜上皮细胞刷状缘的b 半乳糖苷酶水解成半乳糖和葡萄糖后才能 被人体吸收利用。乳糖不耐症( d u r i n gc t a l ，1 9 9 8 ；s a h i ，1 9 9 4 ) 是由于小肠粘膜上乳糖酶活力较低所 致，乳糖得不到水解。小肠内乳糖浓度提高，使渗透压增高，从而导致进入肠腔内水分含量提高， 其产生的症状是腹部压力增高、气胀、腹痛和腹泻。绝大多数哺乳动物出生之后小肠粘膜乳糖酶 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 活性较高，可以消化吸收来自母乳或其它乳制品的乳糖，断乳之后，乳糖酶活性随年龄增长逐渐 r 降，到成人之后其酶活性仅为正常婴儿水平的5 1 0 ，并发展成为乳糖不耐症。 人体乳糖酶缺乏通常有以下几种情况。 ( 1 ) 先天性乳糖酶缺乏。该情况很少见，这是一种常染色质隐性遗传性疾病，这种人在刚 出生时乳糖酶活性就低下或缺乏，这会导致严重的肠胃功能失调，若不及时供给无乳糖食品，会 有生命危险。 ( 2 ) 原发性乳糖酶缺乏，这是晟常见的一种。婴儿出生时乳糖酶活性最高，一年以后，多 数人的乳糖酶活性会迅速下降，至成年期几乎完全消失，其原因一般认为与世代形成的饮食习惯 所造成的乳糖酶基因突变而不可逆关闭有关。 ( 3 ) 继发性乳糖酶缺乏。当小肠上皮细胞破损时会导致暂时性乳糖酶活性低下，例如，由 于肠道手术，乳糖酶活性会在一定时期内暂时消失。 此外，营养不良、蛋白质缺乏时也可导致乳糖酶活性在一定时期内丧失，这种情况下乳糖酶 活性可随营养加强而逐渐恢复。 乳糖不耐症可以通过以下几种方式进行诊断( f o x e ta i ，1 9 9 2 ) ，( 1 ) 通过活体组织切片检验， 分析p 半乳糖苷酶活性。( 2 ) 口服乳糖，然后检验血液中葡萄糖含量。将5 0 9 乳糖溶于水中( 乳 糖含量相当于l 升牛乳中的乳糖含量) ，然后分别给禁食病人和摄食后的正常人口服，结果发现 摄入含有乳糖的产品后，正常人血液中葡萄糖含量升高迅速上升，而缺乏争半乳糖菅酶活性的乳 糖不耐症患者血液中葡萄糖含量不升高。( 3 ) 呼气h 2 实验( 黄辉德等，1 9 9 8 ；c a s e l l a s na 】，2 0 0 3 ) 。 在乳糖不耐症患者体内，乳糖缀胃和小肠进入大肠后，被肠道细菌分解。产生多种气体，h 2 是其 中之一。h 2 通过肠道内壁，经血液，传送到肺，然后从呼吸道捧出。( 4 ) 此外，可测定粪便的酸 度，其原理是：未经消化的乳糖，在大肠中经细菌发酵产酸，根据酸液上升或p h 下降情况，确 定乳糖不耐受的程度。此法适用于婴幼儿。 乳糖不耐症人群的分布与种族有密切的关系( 见表1 - 2 ) 衰1 2 乳不耐症人群的分布( 李玉强等，2 0 0 0 ) 种族比率( ) 北欧 中欧人( 英国人、俄罗斯人) 地中海沿岸居民( 希腊人、犹太人) 大多数非洲人和美国黑人 本土美国人 墨西哥人 东方人 l 5 1 0 2 0 6 0 9 0 7 0 1 0 0 8 0 l 5 0 8 0 8 0 l o o 中国预防医学院营养与食品卫生研究所调查发现，有色人种尤其是东方人中有乳糖不耐症 的人较多，3 = 5 岁时为2 2 1 ，7 _ 8 岁时为3 9 0 1 1 1 3 岁时为3 6 8 ，成人时更多( 张丹凤等， 2 0 0 1 ) 。我国成年人饮用牛乳后乳糖吸收不良的发病率高达8 6 7 ，不耐受指数为0 9 ，而且我国 南方地区比北方地区的人不适宜症更多些。 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 因此。就中国乳品业来说，一方面牛乳是人类最佳的饮食，需大力普及全民营养知识，让广 大消费者自觉饮用牛乳，以更好地增加国民体质：另一方面，有多数人对牛乳因乳糖不耐症而无 法大量充分利用。开发低乳糖牛乳，对于满足乳糖不耐症患者的乳品消费需求和促进我国乳品工 业的发展均有重要意义。相当一部分人群患有此症，当然要影响牛奶的消费。e l 本学者认为机体 不是一点乳糖酶都不分泌，只要适当降低牛奶中乳糖含量就可适应。因而，生产提供低乳糖制品 是解决巍糖不耐症问题的最佳途径。 为了消除乳糖对乳糖不耐症患者产生的影响，提高人们对乳制品的摄入量。多年来国内外的 研究者针对牛乳中乳糖做了大量的工作，通过对牛乳进行处理，除去或破坏其中的乳糖，主要措 施如下： ( 1 ) 用超滤法处理牛乳。超滤是2 0 世纪7 0 年代兴起的一种新的分离技术，操作简单，成本 低，可除去乳中大部分乳糖，避免饮用后出现不适症状。这种方法同时也除去了多种矿物质和维 生素，因此建议不用该法。 ( 2 ) 向牛乳中添加外源乳糖酶，生产低乳糖奶，这是目前克服乳糖不耐症韵最好方法。将新 鲜牛乳经巴氏灭菌后，冷却至4 0 4 5 ，加入乳糖酶并保温，使乳糖水解。研究发现乳糖水解率 为7 0 8 0 时，既能解决乳糖不耐症问题，又能生产出风味良好的产品( 高亚滨，1 9 9 7 ) 。随 着生物技术的发展利用固定化酶等生物技术生产低乳糖奶也将得到大力发展。 ( 3 ) 将牛乳制成发酵乳( 刁治民等，1 9 9 8 ) 或干酪等乳制品，也有利于缓解乳糖不耐症。鲜 牛乳经灭菌、冷却、接入乳酸菌发酵后，使其中2 0 ”3 0 的乳糖分解成葡萄糖和半乳糖，进而 转化为乳酸和其它有机酸，而且乳酸菌在发酵过程中也能产生昏半乳糖苷酶，能促进乳糖的消化。 研究表明。与只饮用普通牛乳的个体相比，饮用每m l 含2 5 x 1 0 5 c f u 嗜馥乳杆菌牛乳的个体，能 够明显改善乳糖的吸收。干酪制作过程中，由于排除了含有大量乳糖的绝大部分乳清，也有利于 乳糖不耐症患者食用。 ( 4 ) 食用含有双歧杆菌等益生菌的产品可提高乳糖不耐症患者对乳糖的利用率( 钟燕， 2 0 0 3 ) 。研究表明，所有双歧杆菌都含有a 、争半乳糖苷酶，且活性明显高于其它肠道菌，有助于 改善乳耱酶缺乏者的乳糖不耐症( h u l g h e se ta 1 ，1 9 9 5 ) ，但这类细菌不能在肠道长期定植，需要经 常摄入。因此，对于双歧杆菌等益生菡经过胃肠道后如何保持活性的研究具有重要意义。 ( 5 ) 此外，研究者也尝试了利用转基因技术改变牛乳成分，去除牛乳中的乳糖( k a r a t z a se t a l 1 9 9 7 ) 。 在以上解决因乳糖酶缺乏而产生的乳糖不耐症的措施中，利用外源乳糖酶生产低乳耱奶是目 前利用最多、技术最成熟的方法。 1 2 3 口- 半乳糖苷酶作用于乳糖的机理 乳糖酶广泛存在于各种动植物以及微生物中( m a h o n e y ，1 9 9 6 ) ，包括昏半乳糖苷酶( e c 3 2 1 2 3 ) 、酸性 半乳糖苷酶和异p 半乳糖苷酶，而后2 种酶很少对乳糖起作用( 骆承庠，1 9 9 1 ) 。 般说来，用于生产低乳糖奶的乳糖酶即是1 3 - 半乳糖苷酶，它能将乳糖分解为葡萄糖和半乳耱。 现在乳品工业上所有的b - 半乳糖苷酶都来源于微生物发酵，多为酵母和霉菌发酵获得。p - 半 乳糖苷酶主要来源集中在黑曲霉( 4 n i g e r ) 、米曲霉( 彳o r y z a e ) 、乳酸克鲁维酵母( k 1 a c t i s ) 、脆 6 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 壁克鲁维酵母( k f r a g i l e ) 和嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l i s ) 等，食品工业中用 得最广泛、而且安全性最高的是k , l a c t i s 、k f r a g i l e 、an i g e r 和a o r y z a e ( r o ye ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在众多来源的b 半乳糖苷酶中，特别要说明的是ec o l i 产生的p 半乳糖苷酶，由于其亚基结 构、一级结构及空间结构已经被确定，因此对b 半乳糖苷酶酶解机理的研究主要基于此酶( f o w l e r a n dz a b i n ，1 9 7 8 ；j a c o b s o n ，1 9 9 3 ：h u b e r ，1 9 9 4 ) 。p - 半乳糖苷酶的分子量为4 6 0 k d ，具有四聚 体结构，由4 个分子量各为l1 6 k d 的多肽链组成。 c u p p l e s ( 1 9 9 0 ) 提出b - 半乳糖苷酶对乳糖的作用机理如图1 - 3 所示。 眦7 8 8 卜呱 豳1 - 3b 半乳蔫苷蕊对乳糖的作用机理 围示说晴te b 半乳糖苷酶对乳糖：i 嘏。乳曩tg “半乳麓；o l c ，葡蕾簟 国i 排半翼t 基t ( - i w n hr o h t 富o h 的寨棱受体te g 矿碳正离子半乳糖基转移位点 如图1 - 3 中，阻半乳糖苷酶首先与乳糖中的半乳糖基结合在一起，在适当的条件下使葡萄糖 被酶解下来；b 半乳糖苷酶随即通过可逆反应将e - g a l + 转移至一个含有o h 的亲核受体，最终形 成g a i - o r ，同时剥落的酶又继续参与乳糖的酶解反应。若将e g a l + 转移至h 2 0 进行反应，则形 成半乳糖。可见在牛乳体系中，由于存在大量的水分e - o a l + 将直接与h 2 0 结合，必将产生半乳 糖。这一过程与人体摄入乳糖后结果一致，均在乳糖酶的作用下形成葡萄糖和半乳糖。 1 2 4 美拉德反应及对乳制品质量的影响 1 ) 美拉德反应的过程 美拉德反应( m a i l l a r dr e a c t i o n ) 是法国化学家m a i l l a r d 在1 9 1 2 年提出，这是广泛存在于食 品工业的一种非酶褐变( n o n e n z y m i cb r o w n i n g ) ，也称为羰氨反应( a m i n o - e a r b o n y lr e a c t i o n ) 。氨 基酸与还原糖及还原糖的分解物反应，反应经过复杂的历程，最终生成棕色甚至是黑色的大分子 物质类黑精或称拟黑素( m e l a n o i d i n s ) 。 对于m a i l l a r d 反应过程的分类有多种方法，最常用的是将m a i h a r d 反应分为三个阶段 ( m a u r o n ，1 9 8 1 ) ，即初始阶段，发展阶段和结束阶段。这三个阶段依次连贯的发生，各阶段在 m a i l l a r d 反应过程中均起着重要的作用。 m a i l l a r d 反应起始阶段，乳糖中还原糖的羰基端和蛋白质中氮基( 主要是l y s 中的- 氨基) 7 结合形成s c h i f f s 碱，s c h i f f s 碱通过a m a d o r i 分子重捧反应，生成a m a d o r i 化合物，即n 取代_ l 氨基i 脱氧2 酮糖( v a n b o c k e l ，1 9 9 8 ) ( 图i - 4 ) 。根据m a u r o n ( 1 9 8 1 ) ，在乳制品中，只要加热 程度不太剧烈。或加热时间不长的话，该a m a d o r i 化台物相对稳定。这一阶段最大的变化就是引 起赖氨酸生物学价值的损失，但几乎没有颜色和风味的变化- h i o+ n h r c h d r rh 。丙l c h o _ r h z 9 n h q c h d 。r 寸“一”卜洲 r o 洲= 叫= ：洲j = 蛳，44 洲= i 叫 十o ”十洲一r 洲 m m+h 咖j 8 e h t t c , b 啼 巾d 村i o d u 日 乳糖赖氨酸 s c h i t p s 碱 o a c t u l o s y l | y s t n e ，m a m a d o r i 产物 圈1 - 4m a i l l a r d 反应初始阶段a m a d o d 化台物的产生 m a i l i a r d 反应发展阶段，a m a d o r i 化台物( n 取代一1 氨基- 1 一脱氧- 2 - 酮糖) 通过烯醇化的形式 发生分解。a m a d o f i 化合物的分解包括两种途径( f o xe t 峨1 9 9 2 ) ，一是通过i ，2 烯醇化的3 一 脱氧邻酮醛糖途径，主要发生在p h 7 的条件下；另一种是通过2 3 烯醇化的3 一脱氧邻酮醛糖 途径，主要发生中性和碱性环境中( 图1 5 ) 。这两种途径都产生了脱氧邻酮醛糖类物质，它是 m a i l i a t d 反应过程中极具活性的中间产物。 ：誉嚣 。“喾 么。争l o - 季嚣i 力 p 、一一 t一k 寸孓弋- 幺0 ，“童一“? 。”一如-点。”争* ；i ，； ： 戮馨。 l ：一。既8 一 一w *。”o “ 4 帆 ：! ，基 。 ，姆管麓? - 甓人11= 7 ”、 l ”、 掣、 ：。八川i j n ，l n “i 。一弋。 t 7 l l 二：。山。一e a h l i 7 ；一州l ： t 。 n m 圈i - 5m a i l l a r d 反应过程中两种逡径及其中问产物 如图1 - 5 所示，在m a i l l a r d 反应的结束阶段，脱氧邻酮醛糖类中间产物进一步反应，通过脱 * * m 茹 胖 、 ” 墨争r 茹 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 水或胺化作用，产生了多种m a i l t a r d 反应产物( m r p s ) ，同时参与m a i l l a r d 反应的蛋白质也发生 交联。在低p a ( p h _ 2 8 5 0 l a u g q 酶足a c t s 4 8 0 0 0 g u g n 酶置l a c t i s 4 3 0 0 0 u g z 酶 j i ：l a c t i s 8 , 0 0 0 t j g 注：寰中活力簟健由鲁索公司撮供检测方法鲁不檑罔因此，活力单位；f 麓统一 为研究其相对热稳定性，以d 酶、g 酶和h 酶为例： 将d 酶、g 酶和h 酶分别在3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 、5 5 条件下处理1 小时后，分别按照0 5 o ( v ) 、0 2 e ( v v ) 、0 5 ( v v ) 的酶用量，添加到乳糖禽量为4 6 的牛乳中进行酶解，作用 时间为1 小时。在不同温度处理后，三种酶残余活性对乳糖作用后水解率情况如图2 - 1 。 中国农业大学硕士学位论文第二章b 半乳糖苷酶对乳糖的酶解效果研究 塞 爵 羹 篓 7 0 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 温度 圈2 - 1 不同温度处理后的乳糖酶对牛乳中乳糖的水解情况 如图2 - 1 ，三种b 半乳糖营酶d 酶、g 酶和h 酶经3 0 - 4 5 处理后，对乳糖的水解率均在4 0 以上。当温度升高至5 0 0 时，对乳糖的水解程度减少了一半以上，而当处理温度升高至5 5 c 以 上时，因酶失活几乎不能水解乳糖。s a n t o s ( 1 9 9 8 ) 在研究来源于置p a a i t e s 的 半乳糖苷酶 的酶解动力学时，发现如果将酶解条件升高至4 5 c 以上。乳糖酶对乳糖的水解能力大大降低。 w a l l e n f e l s ( 1 9 7 2 ) 也提出来源于酵母和大肠杆菌的乳糖酶不耐热，温度高于5 0 c 即受到破坏， 失去活力。仅有从耐热菌中分离的耐热乳糖酶，在6 0 时具有最大的水解活性( 蒋燕灵等，1 9 9 9 ) 甚至7 0 也具有较高活力，如来源于h y p e r t h e r m o p h i l i cs u l f o l o b u ss o l f a t a r i c u s 和p h y r o c o c c u s f u r i o s u s 的b - 半乳糖苷酶( p e t z e l b a u e re ta 1 ，1 9 9 9 ) 。可见，在低乳糖奶的生产过程中，温度控制 十分关键，利用乳酸克鲁维酵母( 尼l a c a s ) 和脆壁克鲁维酵母菌( 芷p a g i & s ) 来源的 半乳糖 苷酶，酶解温度需控制在4 5 以下，才能保证巍糖酶充分地发挥作用。 同时，乳糖酶的热稳定性结果也表明，不管是巴氏杀菌、还是超高温灭菌，其条件都足够使 乳糖酶的活性丧失，从而避免了终产品中乳糖的继续分解。 2 4 2 水解条件对乳糖水解率的影晌 1 1 不同酶对乳糖的水解 用六种不同厂家的乳糖酶对牛乳中的乳糖进行水解，比较其水解情况并综合考虐成本因 素，选出性能价格比均好的产品用于实验。六种酶的添加重为：d 酶、h 酶、z 酶、n 酶0 5 e ( v v ) ，g 酶、q 酶0 2 ( v v ) ，在3 8 - 4 0 c 酶解4 小时后的结果如图2 - 2 所示： o ( o 5 煳 h ( 0 5 ) n ( 0 5 ) q ( 0 2 煳 z ( 0 5 ) g ( o z o ) 酶解时阃( 小时) 固2 - 2 不屙广家乳糖酶对牛乳中乳辕的水解情况 1 6 xv甜肇*秘1盍 中国农业大学硕士学位论文第二章b 半乳糖苷酶对乳糖的酶解效果研究 如图2 - 2 ，在这六种酶中，对乳糖水解程度最低的是z 酶，酶解时间达4 小时后，乳糖的水 解率才到7 0 。h 酶、g 酶和d 酶对乳糖的水解最为显著，其中h 酶在该条件下的水解能力最 强，g 酶和d 酶几乎没有差异，这三种酶对乳糖作用2 小时时，乳糖水解率即选7 0 。其余的q 酶和n 酶介于之间。可见，生产中要达到较短的时间，可以考虑h 酶、g 酶和d 酶，综合考虑 成本因素，这三种酶中g 酶的性能价比最高，因此在后续的研究和生产中，如果没有特别说明， 提到乳糖酶的情况均指g 酶。 2 ) 不同温度下乳糖的水解 对乳糖酶相对热稳定性研究发现，一旦酶解温度超高4 5 1 2 ，乳糖酶对牛乳中乳糖的水解能力 急剧降低，甚至失去活性。本论文选用了5 、1 0 、2 0 c 、3 0 和4 0 五种温度，在两种不同 酶用量的情况下，分析了乳糖酶g 对牛乳中乳糖的永解情况结果如图2 - 3 ( 酶用量o 0 5 o ) 和 图2 4 ( 酶用量o 2 ) 所示： 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 _ 5 一1 0 一2 0 _ 卜3 0 * - 4 0 051 01 52 02 5 酶解时间( 小时) 围2 - 3 酶用量0 0 5 黼 t ，不f 可涅度下乳糖的水解率 如图2 - 3 所示，酶用量为0 0 5 0 的情况下，温度为5 1 2 和1 0 时即使将酶解时间延长到2 0 小时，乳糖的水解率也远远未及5 0 。当酶解温度为2 0 时，时间为2 0 小时乳糖水解率能达 6 0 以上。酶解温度为3 0 c ，需要约l o 小时乳糖水解率达到6 0 以上。而当采用4 0 。c ，则需要 5 小时，乳糖的水解率可达到6 0 以上。 1 0 0 墓8 0 哥6 0 羹4 0 襄2 0 0 p 5 一1 0 p 2 0 ”瓣r3 0 和4 0 o5l oi s2 0 2 5 酶解时间( 小时) 圈2 _ 4 酶用量0 2 o 时不同溢度下乳糖的水解率 如图2 - 4 所示，酶用量为0 2 的情况下，温度为5 和1 0 时，分别需要约2 0 小时和1 0 袋)噼链*姆酥 中国农业大学硕士学位论文第二章1 3 半乳糖苷酶对乳糖的酶解效果研究 小时，才能使乳糖的水解率超过6 0 。当酶解温度为2 0 c 时，需要消耗6 小时的时间，乳糖水解 率达到6 0 以上。酶解温度为3 0 ，需要约3 小时乳糖水解率才能达到6 0 以上。而当采用4 0 ， 仅用2 小时，就可以使乳糖的水解率达到7 0 以上。 综合上述研究结果，温度对牛乳中乳糖水解率的影响巨大，采用适合的温度能极大缩短低乳 糖奶的加工过程。 3 ) 不同p t l 值对乳糖水解率的影响 来源于k l u y v o r o m y c e sl a c t i s 的g 酶在不同p h 值条件下，对乳糖的水解率如图2 - 5 。酶用 量为0 2 o 。 1 0 0 ，、8 0 琶6 0 鐾4 0 苌2 0 0 4567891 0 p h 值 圈2 - 5 不同p h 值条件下，g