（食品科学与工程专业论文）泡菜中挥发性风味物质及其乳酸菌研究.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 泡菜中挥发性风味物质及其乳酸菌研究 摘要 泡菜属乳酸菌发酵蔬菜食品，在我国历史悠久，早在1 3 0 0 年前三 国时代泡菜传到了韩国，并结合韩民族的饮食文化，发展成为今日的 韩国泡菜。当前韩国泡菜是越来越流行的功能性食品，具有多种保健 功效。c o d e x ( 国际食品标准委员会) 以韩国白菜泡菜为主，于2 0 0 1 年， 制定了泡菜国际食品标准，使韩国泡菜成为国际性食品。韩国泡菜的 发酵主要由乳酸菌和酵母引起的。在过去的4 0 年里，对韩国泡菜的研 究主要集中在微生物的分离鉴定、储藏过程中的物质及营养变化、包 装材料对风味的影响以及不同加工方式对产品质量的影响等。 本研究采用项空固相微萃取方法结合气相色谱一质谱联用技术对 两种韩国泡菜a ( 宗家府) 、b ( 江原) 中的挥发性风味物质进行了分离 鉴定。采用顶空固相微萃取( s p m e ) 与气相色谱一质谱联用技术对韩国泡 菜a ( 宗家府) 在常温( 2 5 、4 ) 储藏过程中( o 一8 天) 的挥发性 风味成分变化进行了较为细致的研究，并利用平板计数的方法对其微 生物数量的变化也进行了初步研究。结合传统分离的培养方法以及变 性梯度凝胶电泳技术( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d e n a t u r i n g g r a d i e n tg e le 1 e c t r o p h o r e s i s ，p c r d g g e ) 对两知名品牌韩国泡菜a ( 宗家府) 、c ( 甫熙) 中乳酸菌多样性进行分析。采用顶空固相微萃 取( h s - s p m e ) 与气相色谱一质谱联用技术( g a sc h r o m a t g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y ，g c - m s ) 对韩国泡菜a 分离出来的两株乳酸菌( h z i 、h z 2 ) 在m r s 肉汤培养基中的挥发性风味成分进行了初步的研究。 通过对顶空固相微萃取的纤维头、毛细管柱、萃取时间和解吸时 间的选择来优化其实验条件。采用气相色谱一质谱联用技术从两种韩国 泡菜a ( 宗家府) 和b ( 江原) 中分别鉴别出6 5 和5 5 种挥发性风味物 质。两种韩国泡菜中含有3 4 种相同的挥发性风味物质，主要包括乙醇、 上海海洋大学硕士学位论文 乙酸、烯类和硫醚类等。本研究表明，结合顶空固相微萃取以及气相 色谱一质谱联用技术可以很好来分析泡菜中挥发性风味物质，并说明不 同品牌泡菜其挥发性风味物质存在一定差异。 采用顶空固相微萃取( s p m e ) 与气相色谱一质谱联用技术结合主成 份分析法( p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ，p c a ) 可以较好的区分韩 国泡菜a 在常温( 2 5 、4 c ) 储藏过程中( 0 - 8 天) 的挥发性风味成分 变化。2 5 储藏条件下，挥发性物质在第2 天达到最大值后下降。跟 踪了6 2 种挥发性物质的变化，其中二烯丙基二硫和二烯丙基三硫递减 变化趋势明显，乙酸递增变化明显。o c 储藏条件下，泡菜的总离子图 谱没有较大的变化。平板分离计数的方法显示在贮藏期间微生物数量 在第4 天达到1 3 1 0 9 后递减到5 7 1 0 8 。 利用传统的平板分离划线方法从韩国泡菜a 、c 分离的分别得到两 株乳酸菌，经1 6 sr d n a 同源性分析鉴定分别为l a c t o b a c i l l u s p a r a b r ev i s ，l a ct o b a c i l l u sp e nt o s u s 和l a c t o b a c l l l u ss a k e i 、 l a ct o b a c i l l u sc u r v e 3t u s 。 采用p c r - d g g e 技术对两种韩国泡菜a 、c 中乳酸菌多样性进行分 析，割胶测序结果表明：大部分条带代表的微生物是属于目前未培养的 种类。 采用顶空固相微萃取( s p m e ) 与气相色谱一质谱联用技术对韩国泡 菜a 分离出来的两株乳酸菌在m r s 培养基中的挥发性风味成分进行了 初步的研究，分别从空白m r s 肉汤培养基、含h z i 的m r s 肉汤培养基 和含h z 2 的m r s 肉汤培养基检测鉴定出2 6 、3 7 和4 2 种挥发性风味物 质，1 1 种为含有h z l 、h z 2m r s 肉汤培养基中共检出的物质。含h z l 的 m r s 肉汤培养基检出1 5 种独有的物质，含h z 2 的m r s 肉汤培养基中检 出1 1 种独有的物质。苯甲醛、辛醇、反式一2 一辛烯- 1 - 醇、b h t 、乙醇、 乙酸、甲氧基苯甲醛肟、正庚醇是含有h z l 、h z 2m r s 肉汤培养基主要 的挥发性物质。研究表明：在简单培养基中不同的乳酸菌产生的代谢 产物有很大的差异。 l i 上海海洋大学硕士学位论文 关键词：韩国泡菜，挥发性物质，顶空固相微萃取，气相气相色谱一质 谱联用技术，变性梯度凝胶电泳技术 i l l 上海海洋大学硕士学位论文 a n aly siso ft h ev oia ti ie sa n dl a c tica cidb a c t e riain kim c hi a b s t r a c t a sat r a d i t i o n a lf e r m e n t e dv e g e t a b l ep r o d u c t ，p i c k e sm a y o r ig i nf r o ma n c i e n tc h i n a a se a r l ya s1 3 0 0d u r i n gt h ep e r i o do ft h et h r e ek i n g d o m so fk o r e a ，p i c k e sw e r ei n t r o d u c e dt ok o r e aa n dd e v e l o p e dt oam o d e r nk i m c h i n o wk i m c h iisg a i n i n g p o p u l a r i t ya saf u n c t i o n a lf o o dw i t ha n t i c a n c e ra n da n t i t u m e re f f e c t s c o d e xa li m e n t a r i u sc o m m i s s i o n ( 2 0 0 1 ) ，w h i c hs e t si n t e r n a t i o n a ls t a n d a r d sf o rf o o dp r o d u c t st os e t t l ea n yt r a d ei s s u e sa m o n gn a t i o n sr e c o g n i z e dk i m c h ia sa ni m p o r t a n ti n t e r n a t i o n a lf o o db ya d o p t i n gt h ed e f i n i t i o na n dc o m p o s i t i o no fs t a n d a r d i z e dk i m c h i k i m c h if e r m e n t a t i o ni sd u et om a i n l yl a c t i ca c i db a c t e r i aa n dy e a s t sn a t u r a l l yp r e s e n ti nr a wm a t e r i a 1 s k i m c h is t u d i e sh a v ef o c u s e do nt h ei s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm i c r o o r g a n i s m s ，t h ec h a n g e so fi n g r e d i e n t sa n dn u t r iti o n a lv a l u ed u r i n gs t o r a g e ，t h ei n f l u e n c eo fp a c k a g i n gm a t e r i a lso nt h ef l a v o rq u a li t y ，a n dt h ee f f e c t so fp r o c e s s i n g m e t h o d sf o rt h el a s t4 0y e a r s h e a ds p a c es o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o nc o u p l e dt og a sc h r o m a t g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ( h s s p m e g c - m s ) w e r eu s e dt oa n a l y z et w ok i n d so fk i m c h ia ( c h o n g a ) a n db ( j i a n g y u a n ) a n dt h e c h a n g e so fv o l a t il ef l a v o rc o m p o n e n t so fk i m c h ia ( c h o n g a ) d u r i n gs t o t a g ea t2 5 a n d0 ( 0 8d a y ) c h a n g e so ft h en u m b e ro fl a c t i ca c i db a c t e r i ai nk i m c h iaw a si n v e s t i g a t e db yp 1 a t ec o u n t i n gm e t h o d t h ec o m p o s i t i o no fm i c r o o g a n i s m si nk i m c h i aa n dc ( f u x i ) w a si n v e s t i g a t e db yt r a d i t i o n a lc u l t u r em e t h o d sa n dd e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ( p c r d g g e ) t h ev o l a t il ec o m p o u n d si nm r sb r o t hc u l t u r em e d i u mp r o d u c e d b yt w os t r a i n s is o l a t e de a c h f r o mk i m c h iaw e r ea n a l y z e db y u s i n gh e a ds p a c es o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o nc o u p l e dt og a s c h r o m a t g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( h s s p m e - g c - m s ) t h ev o l a ti1ec o m p o u d si nk i m c h iaa n dba b s o r b e dw i t hs o 1 i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ( s p m e ) w e r ea n a l y z e db yu s i n gag a s i v 上海海洋大学硕士学位论文 c h r o m a t o g r a p h m a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) t h es o li d p h a s em i c r o e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ef u r t h e ro p t i m i z e db yc a r e f u l l ys e l e c t i o no ft h ef i b e r s ，t h ee x t r a c t i o nt i m ea n dt h ed e s o r p t i o nti m e t h ev o l a til ec o m p o u n d sw e r ee f f e c t i v e l ya b s o r b e di n s p m e s i x t yf i v ec o m p o u n d si nk i m c h iaa n df i f t yf i v ec o m p o u n d si nk i m c h ibw e r ei d e n t i f yb yg c - m s t h e r ew e r e3 4o ft h e s a m ec o m p o u n d si nt w ok i n d so fk i m c h is u c ha sd i a l l y ld i s u l p h i d e ，e t h a n o l ，a c e t i ca c i d ，z i n g i b e r e n e i tc a nb ec o n c l u d e df r o mt h ee x p e r i m e n t st h a tk i m c h ia n do t h e rf o o d sc o u l db ea n a l y z e db yh e a d s p a c es o li dp h a s em i c r o e x t r a c ti o n ( h s s p m e ) c o m b i n e dw i t hg c - m se f f e c t i v e l y 。t h e r ew e r ed i f f e r e n c e si nf l a v o rb e t w e e nt w ok i n d so fk i m c h i h e a ds p a c es o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o nc o u p l e dt og a sc h r o m a t g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( h s s p m e g c - m s ) a n dp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ( p c a ) w e r eu s e dt oa n a l y z et h ec h a n g e so fv o l a t il ef l a v o rc o m p o n e n t so fk i m c h ia ( c h o n g a ) d u r i n gs t o r a g e a t2 5 a n d4 ( o 一8d a y ) t o t a lp e a ka r e a si ne l e c t r o n i cc o u n t sd e c r e a s e df r o m2d t h ec h a n g so fs i x t yt w ov o l a t i l ec o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e da n dt r a c k d ei nk i m c h i d i a l l y ld i s u l f i d ea n dd i a l l y lt r i s u l f i d ed e c r e a s eo b v i o u s l ya n da c e t i ca c i d i n c r e a s e do b v i o u s l y l a c t i ca c i db a c t e r i ai nk i m c h ii n c r e a s e df r o m1 8t o1 3 8 ( 1x i 0 8 c f u g ) o v e ra4dp e r i o da n dd e c r e a s e db y5 8 f r o m4t o8d 2s t r a i n so fb a c t e r i aw h i c hw e r eis o l a t e de a c hf r o mk i m c h i aa n dbw e r ei d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u sp a r a b r e v i s v , l a c t o b a c i l l u sp e nt o s u sa n dl a ct o b a c i l l u ss a k e ll a ct o b a c i l l u sc u r v a t u s t h ed g g ep r o f il ed e m o n s t r a t e st h a tm o s to ft h em i c o o r g a n i s m sr e p r e n t e db yt h ed g g eb a n d sw e r eu n c u l t u r e do ru n c u l t i v a b l eb a c t e r i a t h ev o l a t il ec o m p o u n d si nm r sb r o t hc u l t u r em e d i u mp r o d u c e d b yt w os t r a i n si s o l a t e de a c hf r o mk i m c h iaw e r ea n a l y z e db yu s i n g h e a d s p a c e s o li d p h a s em i c r o e x t r a c t i o nc o u p l e d t o g a s c h r o m a t g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ( h s s p m e - g c - m s ) t w e n t ys i x c o m p o u n d si nc o n t r o la n dt h i r t ys e v e nc o m p o u n d si nb r o t hc u l t u r e m e d i u mp r o d u c e db yh z is t r a i na n df o r t yt w oc o m p o u n d si nm r sb r o t h c u l t u r em e d i u mp r o d u c e db yh z 2s t r a i nw e r ei d e n t i f yb yg c - m s v 上海海洋大学硕士学位论文 t h e r ew e r e1lo ft h es a m ec o m p o u n d si nt w ok i n d so fm r sb r o t h c u l t u r em e d i u mp r o d u c e db yt w os t r a i n t h e r ew e r e1 5s p e c i a l v o l a t i l ef l a v o rc o m p o n e n t si nm r sb r o t hc u l t u r em e d i u mp r o d u c e d b yh z ls t r a i na n d11s p e c i a lv o l a t i l ef l a v o rc o m p o n e n t si nm r s b r o t hc u lt u r em e d iu mp r o d u c e db yh z 2s t r a i n b e n z e n e c a r b o n a l 、 o c t y la l c o h o l 、( e ) 一2 - o c t e n 一1 一a l 、b h t 、e t h a n o l 、e t h a n o i ca c i d 、 o x i m e 一，m e t h o x y p h e n y l - _ w e r em a j o rv o l a t i l ec o m p o u n d s i tc a n b ec o n c l u d e df r o mt h ee x p e r i m e n t st h a tt h ed i f f e r e n ts t r a i n l a c t i ca i c db a c t e r i ac o u l dm a k eg r e a td i f f e r e n c ei nm e t a b o l i t e s i ns i m p l ec u l t u r em e d i u m k e y w o r d s ：k i m c h i ，v o l a t i l ec o m p o u n d s ，h e a d s p a c es o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，g c m s ，c o n v e n t i o n a lc u l t u r a lm e t h o d s ，d e n a t u r i n g g r a d ie n tg e le l e c t r o p h o r e s is ( d g g e ) v 1 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：军白乏 日期：加净2 月d 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密 口 学位论文作者签名：塞砖咪 日期：沙书2b o n 指导教师签名：参敝 日期：o q 年土月，口同 上海海洋大学硕士学位论文 引言 泡菜属乳酸菌发酵蔬菜食品，在我国历史悠久，早在1 3 0 0 年前三 国时代泡菜传到了韩国，并结合韩民族的饮食文化，发展成为今日的 韩国泡菜。当前韩国泡菜是越来越流行的功能性食品，具有多种保健 功效。c o d e x ( 国际食品标准委员会) 以韩国白菜泡菜为主，于2 0 0 1 年， 制定了c o d e x 泡菜国际食品标准，使韩国泡菜成为国际性食品。韩国 泡菜的发酵主要由乳酸菌和酵母引起的。在过去的4 0 年里，对韩国泡 菜的研究主要集中在微生物的分离鉴定、储藏过程中的物质及营养变 化、包装材料对风味的影响以及不同加工方式对产品质量的影响等乜1 。 1 1 韩国泡菜研究概况 在韩国泡菜的种类多达2 0 0 种，不同的泡菜有不同的风味，取决 于原料、加工方法、季节、地域和泡菜的功能性。韩国泡菜可以主要 分为两种：盐腌制和盐水腌制两种。一个简单的制作泡菜的配方包括： 卷心菜1 0 0g 、大蒜2g 、红辣椒粉2g 、洋葱2g 、姜0 5g ，最佳盐 浓度2 - 3 。在2 0 下，盐浓度为2 - 3 ，发酵2 - 3 天即可食。据统计， 在韩国成人夏季每天消费5 0 一i 0 0 克天，冬季每天消费1 5 0 2 0 0 克天 3 】 o 在过去的5 0 多年里，许多的微生物如细菌、酵母、霉菌被分离或 报道出来，其中与泡菜发酵有关的主要微生物是乳酸菌和酵母，它们 能软化泡菜的组织和产生特殊的风味物质。目前从韩国泡菜中分离和 鉴定出来的乳酸菌主要有：l e u c o n o s t o em e s e n t e r o y d e s , l e u c o n o s t o cd e x t r a n y c u m , l e u c o n o st o cc it r e u m , l a ct o b a ciiiu sb r ev i s , l a ct o b a c i l l u sf e r m e n t u r n , l a c t o b a c i n u sp l a n t a r u m , p e d i o c o c c u sp e n t o s a c e u s , a n ds t r e pt o c o c c u sf a e c u l i s 。 影响韩国泡菜发酵的因素主要有：微生物、温度、盐浓度、可发 1 上海海洋大学硕士学位论文 酵的糖类、以及其它可利用的营养因子、原料中抑制发酵因子、氧气 和p h ，对此有许多文献报道硌1 。 有研究表明1 ：在韩国泡菜发酵早期到中期成熟期属于异型发酵， 异型发酵的乳酸菌群如：l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s 是优势菌群。在 这段时期，异型发酵的乳酸菌群代谢产物包括：乳酸、乙酸、乙醇、 二氧化碳、甘露醇和右旋糖苷。在韩国泡菜发酵达到成熟期时，微生 物数量达到最高水平1x1 0 h 个m l ，l e u c o n o s t o cs p p 数量达到最大值。 在3 0 条件下发酵l 天，2 0 条件下发酵3 天，1 4 c 条件下发酵6 天， 5 条件下发酵2 7 天，微生物数量达到最高水平，其中 l e u m e s e n t e r o i d e s 数量也相应的达到最高水平。随后泡菜中的微生物 数量有所降低，后略有增加，此时l a c t o b a c f l l u s 和p e d i o c o c c u s 数 量达到最大值( 1 1 0 h 个m 1 ) 。随着泡菜的p h 降低到4 0 ，泡菜中的 l e u c o n o s t o c m e s e n t e r o i d e s 数量急剧降低。在发酵的后期，泡菜中的 像l a c p l a n t a r u m 的耐酸的同型发酵型乳酸菌数量不断增加。在相同 的发酵温度下，低盐浓度发酵的泡菜中的l e u h e s e n t e r o i d e s 总数量 高于高盐浓度发酵的泡菜中的l e u m e s e n t e r o i d e s 总数量。l a c b r e v i s 在较高的温度和低盐浓度条件下生长的更好。p e d c e r e v i s i a e 在较高 的盐浓度( 5 7 ) 条件下是优势菌，并出现在发酵的后期的过熟阶段 中。l a a p l a n t a r u m 在当l e u m e s e n t e r o i d e s 数量降低的时候出现，随 后l a c b r e v i s 和p e d c e r e v i s i a e 相继出现。l a c p l a n t a r u m 在泡菜的 过熟和酸化阶段是优势菌。但是在5 条件下所有的盐浓度实验中 l a c 。b r e v i s ，p e d c e r e v i s i a e 和l a c p l a n t a r u m 并没有检出。 s t r f a e c u l i s 在所有的温度和盐浓度实验中都有检出，但数量几乎可 以忽略。 尽管传统的生理生化鉴定方法费时费力，到目前为止仍然是主要 的基础的鉴定方法。9 0 年代以前从韩国泡菜分离出的微生物分类学研 究主绝大部分集中在生理方法，进入9 0 年代后多相技术包括生理、化 学分类学、分子生物学被应用于韩国泡菜中的微生物分类学中来。新 2 上海海洋大学硕士学位论文 的种如l e u c o n o st o ck i m c h i 劓，l a ct o b a c i l l u sk i m c h i 钉，w e i s s e l l a k o r e e n s i s e 6 3 和w e i s s e l l ak i m c h i 啪被分离鉴定并报道出来。 随着p c r 技术的成熟，基于p c r 技术的分子生物学方法近年来已 被广泛应用于微生物多样性的研究中，也越来越多地应用于食品中乳 酸菌的微生态研究中。 1 2 韩国泡菜中挥发性物质研究概况 韩国泡菜世界闻名，种类多达2 0 0 余种，以其多种多样的保健功 能、营养价值倍受世界人们的喜爱。韩国泡菜之所以受欢迎与它的独 特的风味不无关系。韩国泡菜发酵过程中挥发性风味物质产生比较复 杂，目前对韩国泡菜的挥发性风味物质研究较少，h a w e r 曲1 运用g c m s 方法对5 发酵的韩国泡菜进行了分析，结果表明：二甲基二硫，二甲 基三硫，二丙基二硫，卜丁烷- i - 异硫氰酸酯，二烯丙基二硫是主要的 风味物质，h a n 1 运用同时蒸馏萃取结合g c m s 对w o o u n g 泡菜进行了 分析，泡菜中主要的挥发性物质是乙醇，己醇，2 一己醇，二烯丙基二 硫，姜烯，和b 一倍半水芹烯，c h a n 们运用同时真空蒸馏萃取结合 g c m s 0 1 f a c t o m e t r y ( g c m s o ) 韩国泡菜进行了分析，6 4 种香气成分被 g c o 鉴定出来，二甲基三硫，二烯丙基二硫同分异构体，二烯丙基三 硫，甲基二硫是主要的香气成分，k i m n 妇运用动态项空进样结合g c m s 对d o n g c h i m i 进行了分析，二甲基二硫，乙醇，3 一甲硫基- 1 - 丙烯，乙 酸和二甲基三硫是主要的风味物质。h an 2 1 运用运用固相微萃取技术结 合g c m s 对韩国泡菜进行了分析，2 6 种化合物如二甲基二硫等被报道 出来。k a n g 倥1 运用固相微萃取技术( s p m e ) 结合g c m s 对冰箱保藏中的 韩国泡菜进行了分析，4 0 种挥发性成分其中包括1 8 种含硫化合物包括 甲硫醇，乙醇，烯丙基硫醇，硫氰酸甲酯，二甲基二硫，二烯丙基硫 醚，甲基丙基二硫，二甲基三硫，4 一异硫氰酸基一卜丁烯，_ - - - 2 一丙烯 基三硫，二甲基三硫，二丙基二硫等被鉴定出来。由次可见含硫化合 物如二甲基二硫是韩国泡菜的主要风味物质。 上海海洋大学硕士学位论文 1 3 微生物多样性的研究方法和发展趋势 对泡菜中发酵的微生物种类繁多、来源复杂。传统的，针对微生 物的研究，大都是采用微生物分类、鉴定方法，对保藏过程中微生物 进行分离，根据微生物数量和微生物的形态特征、生理生化反应特征、 生态学特征以及血清学反应等作为鉴定依据【m 1 4 】。传统的微生物学方 法为微生物的研究奠定了坚实的基础，然而这些方法同时存在许多缺 点，用于细菌分类鉴定不但耗时费力，对部分细菌的分类鉴定仍困难 重重，而且只有不到1 的微生物是可以在实验室条件下培养的，绝大 部分的微生物在目前条件下还未能培养( u n c u l t u r e d ) b 5 - 1 6 1 。所以传统 方法很难全面反映污染微生物多样性的全貌，具有一定的局限性和盲 目性，一定程度上阻碍了复杂微生物多样性的研究进程f 1 7 - 1 8 】。 1 3 1 分子生物学技术在微生物学研究中的应用 自1 9 8 5 年，由p a c e n 们及其同事开始用核酸测序技术来研究微生物 区系及分子系统发育关系以来，预示了一个现代微生物学时代的到来。 其基本理论基础就是，直接从样品中提取微生物d n a ，以基因( 组) 的 多样性反映物种多样性，从而可以比较全面客观地展现样品中微生物 组成和多样性。以p c r 扩增技术为基础的分子生物学技术的出现，为微 生物区系研究提供了从不同视角认识其多样性的可能啪1 。基于d n a 指纹 技术的分子生物学研究手段，例如核苷酸( 基因) 探针技术、竞争性 p c r 、1 6 sr r n a 基因序列分析等逐步被引入到微生物多样性的研究中， 主要包括两大类：( 1 ) 依赖于培养技术的指纹图谱技术，其中包括菌 落核酸杂交、各种p c r 技术、依赖限制性内切酶的指纹图谱技术( 脉冲 场凝胶电泳，核糖型及1 6 sr r n a 的限制性酶切图谱分析等) ，1 6 sr r n a 的限制性酶切图谱分析可以通过随机克隆的方法对细菌进行分类鉴 定；( 2 ) 不依赖于培养技术的指纹图谱技术，其中包括1 6 sr r n a 基因 的随机克隆、温度梯度凝胶电泳及变性梯度凝胶电泳。在这些技术中 变性梯度凝胶电泳技术( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ， d g g e ) 已经广泛用于土壤、污水、粪便等细菌多样性和种群结构研究 上海海洋大学硕士学位论文 2 1 - 2 2 ，并开始应用与食品有关的微生物多样性研究验3 ，主要应用于食 品中微生物的分离和鉴定、食品发酵过程中微生物群落的动态监测、 标准模型的建立、食品质量监测与控制。它在微生物多样性的研究方 面越来越受到青睐。 1 3 2d g g e 的发展和技术原理以及在食品微生物学研究中的应用 1 3 2 。1d g g e 的发展和技术原理 变性梯度凝胶电泳技术( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 是由f i s c h e r 和l e r m a n 于1 9 7 9 年最先提出的用于检测d n a 突变的一种电泳技术乜5 1 。1 9 8 5 年m y e r s 等乜6 3 首次在d g g e 中使用“g c 夹 子 ，使该技术趋于完善。1 9 9 3 年m u z y e r s 等首次将d g g e 技术应用于 分子微生态学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系 的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性，可以很好的反映微 生物的多样性乜卜2 训。该技术是一种可检测长度相同而碱基组成不同的d n a 序列在不同变性条件下的电泳方法，这些序列不同的d n a 片段在变性 梯度凝胶电泳上由于解链行为不同，导致的迁移速率不同，在胶片特 定位置上形成不同的泳带而得以分离。它的分辨率比琼脂糖电泳和聚 丙烯酰胺凝胶电泳更高，可以检测到一个核苷酸水平的差异。 d g g e 技术的工作原理是利用变性剂在聚丙烯酞胺凝胶中形成的浓 度梯度，相同长度的d n a 片段在各自相应的变性剂浓度下解链，导致d n a 。r。 盟国m邕oc厶obdo蚕 上海海洋大学硕士学位论文 图卜ld g g b 对d n a 片段的分离示意图 f i g 1 1p r o f i l eo f s e p a r a t i o no f d n af r a g m e n t sb yd g g e 空间构型发生变化，使电泳速度急剧下降，由于d n a 片段碱基组成有差 异，造成在其相应的变性剂梯度位置停滞，从而在凝胶上呈现不同的 条带，形成与序列特异性相关的特征性图谱( 图1 - 1 ) d 0 1 。目前通常使 用的变性剂为尿素。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片 段序列差异，可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性，以及p e r 扩 增d n a 片段的多态性。 在d g g e 电泳技术中，用于d g g e 分析的多是p c r 产物，在电泳变性过 程中人们不希望所有的这些片段完全变性，因此在5 端引入g c 序列， 即“g c 夹子”( g c c l a m p ) ，将一段长度为3 0 5 0 b p 富含g 、c 的d n a 碱基 片段附加到双链的一端以形成一个人工高温解链区。由于d n a 分子中的 g 、c 碱基对要比a 、t 碱基对结合得牢固，因此g 、c 含量高的区域具 有较高的解链温度。这样，d n a 片段的原有部分就处在低温解链区从而 可以实现更好的分离。“g c 夹子 即保证了十分保守的双链d n a 片段 能解开，又保证双链在电泳过程中不能完全分离口1 。3 2 1 。常规的d g g e 电 泳技术对于长度超过5 0 0 b p 的d n a 片段的序列变化情况，只能有5 0 的检 出率。应用“g c 夹子 技术，可使检出率提高至u 1 0 0 。 d g g e 系统要求在制备好的高浓度变性剂中加入聚丙烯酰胺，使其 产生线性的变性梯度，对待测d n a 片段进行电泳，电泳的温度要低于待 测解链区域t m 值，一般为5 0 6 5 。变性剂梯度由胶板的顶端向底端 线性增加，电泳方向平行于变性剂梯度变化方向。 核酸染色最常用的是溴化乙锭染色法和银染法，银染法是通过银 离子( a g 十) 与核酸形成稳定的复合物，再使用还原剂如甲醛使银离子还 原成银颗粒，把核酸电泳带染成黑褐色，其灵敏度比髓高2 0 0 倍，是目 前最灵敏的方法。但银染法不易回收d n a ，无法进行后续的杂交分析。 近年来，相继出现了s y b rg o l d ，s y b rg r e e ni 和s y b rg r e e ni i 等新 一代荧光核酸凝胶染料，这类染料的背景极低，可以更好的观察微量 6 上海海洋大学硕士学位论文 的条带。致突变性远低于e b 数倍甚至数l o 倍，几乎具有银染的超高灵 敏度。由于该染料渗透入凝胶的速度极快，无需脱色，使染色过程更 加简便，节省时间。虽然这种染料的价格比较昂贵，但还是一类具有 良好应用前景的荧光染料。显色后，凝胶上的条带可以在回收后用于 测序，也可以直接进行凝胶的杂交分析。 可根据试验的需要进行选择。d g g e 技术主要包括以下几个步骤： 食品或其它环境样品的采集；样品中微生物总d n a 提取；核糖体 d n a 可变区p c r 扩增，得到相同大小不同序列的微生物d n a 扩增的混合 物；预实验( 主要是对扩增出的1 6 sr d n a 片段的解链性质及所需的化 学变性剂浓度范围进行分析) ，选择最佳的变性梯度；制备d g g e 凝胶； 得到样品的特异性指纹图谱，进行d g g e 分析；软件分析。如图1 - 2 所示d g g e 分析流程图。 1 4 本研究的内容及预期目标 样品 上 1 d n a 的提取二 l ，品微生物总d n a 可变区的p c r 扩增反应，+ ， 图i - 2d g g e 分析微生物种群结构流程图 f i g 1 - 2a n a l y s i sd i a g r a mo fm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r eb yd g g e 上海海洋大学硕士学位论文 1 4 1 研究内容 ( 1 ) 顶空固相微萃取方法的优化，以及采用项空固相微萃取方法提取 两知名品牌韩国泡菜a ( 宗家府) 、b ( 江原) 中的挥发性风味物质，然 后结合气相气相色谱一质谱联用技术对提取的挥发性风味物质进行分 离鉴定。 ( 2 ) 本文采用顶空固相微萃取( s p m e ) 与气相色谱一质谱联用技术对韩 国泡菜a ( 宗家府) 在常温( 2 5 、4 ) 储藏过程中( 0 - 8 天) 的挥发性 风味成分变化进行了较为细致的研究，并利用平板计数的方法对其微 生物数量的变化也进行了初步研究。 ( 3 ) 结合传统分离的培养方法及变性梯度凝胶电泳技术( p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le 1 e c t r o p h o r e s i s ， p c r - d g g e ) 对韩国泡菜a ( 宗家府) 、c ( 甫熙) 中乳酸菌多样性进行分 析。 ( 4 ) 本文采用项空固相微萃取与气相色谱一质谱联用技术对韩国泡菜 分离的乳酸菌在m r s 肉汤培养基中产生的挥发性物质进行初步了研究。 1 4 2 研究目标 通过对韩国泡菜挥发性风味物质以及在室温贮藏过程中的变化和 微生物数量的变化，微生物的组成研究，以及微生物在培养基中的产 生的挥发性风味物质，了解了韩国泡菜的主要的挥发性物质和在贮藏 过程中的变化情况，及其微生物的组成和贮藏过程中的变化，乳酸菌 对泡菜风味的影响，为泡菜的挥发性风味物质研究、开发功能性发酵 蔬菜和保健品提供参考，并通过这些数据的分析来提升我们国家泡菜 的制作水平。 上海海洋大学硕士学位论文 第二章两种韩国泡菜的挥发性风味物质分析 韩国泡菜世界闻名，种类多达2 0 0 余种，以其多种多样的保健功能、营养价值 倍受世界人