（食品科学专业论文）双水相系统提取γ聚谷氨酸的研究.pdf

摘要 本文以聚谷氨酸为目标提取物，分别利用p e g 硫酸铵、p e g 果糖二磷酸钠和p e g 磷 酸钾盐双水相体系，研究了从离心部分除菌后的发酵液和原发酵液中提取聚谷氨酸的工艺 条件和环境因素对提取率的影响，研究结果如下： 1 在2 0 9 的p e g 6 0 0 0 硫酸铵体系中，当相系统组成分别为1 5 和1 4 ，经离心部分除 菌后的发酵液的加入量为1 0 ( w w ) ，添加4 的n a c l ，室温条件下静置1 2 m i n 分相，系 统的相比、分配系数和下相收率分别为0 7 1 、0 3 9 和7 8 4 3 ：在2 0 9 的p e g l 0 0 0 和硫酸 铵体系中，当相系统组成分别为2 3 和1 4 ，原发酵液的加入量为1 0 时，添加2 5 的 n a c l ，室温条件下3 0 0 0 f f m i n 离心5 分钟分相，系统的相比、分配系数和下相收率分别为 1 1 0 、0 7 0 和5 6 4 3 。 2 在2 0 9 的p e g l 0 0 0 果糖二磷酸钠体系中，当相系统组成分别为2 3 和2 5 ，经离心 部分除菌后的发酵液的加入量为1 0 时，室温条件下静置1 5 分钟分相，系统的相比和分 配系数为1 2 0 和1 3 9 ，上相收率为6 2 6 0 ：在2 0 9 的p e g i5 0 0 果糖二磷酸钠体系中，当 相系统组成分别为2 5 和2 3 ，原发酵液的加入量为1 0 时，室温条件下3 0 0 0 r m i n 离心 5 m i n ，系统的相比、分配系数和上相收率分别为1 1 9 、1 4 2 和6 2 8 0 。 3 在2 0 9 的p e g 磷酸钾盐体系中，当相系统组成为2 4 ( w w ) p e g l 5 0 0 ，2 3 ( w w ) 磷 酸钾盐，磷酸盐缓冲液p h 值为8 o ，经离心部分除菌后的发酵液的加入量为1 0 ( w w ) 时， 室温条件下自然分相小于5 分钟，相比为0 9 6 ，聚谷氨酸的分配系数达到3 1 7 ，上相收率 为9 6 8 0 以上；当相系统组成为2 3 ( w w ) p e g l 0 0 0 ，2 3 ( w w ) 磷酸钾盐，磷酸盐缓冲液 p h 值为8 o ，原发酵液的加入量为l o ( w w ) 时，在3 0 0 0 r m i n 条件下离心5 分钟，聚谷氨 酸的分配系数达到3 7 0 5 ，上相收率达到9 7 8 0 以上，相比为1 0 6 。 以上实验结果表明：对于经过部分除菌的发酵液和原发酵液，无论采用自然分相还是 离心分相方式，聚谷氨酸在p e g 磷酸钾盐体系的分配效果均优于其它两种体系。 实验结果还表明：不同成相组分、相物质的分子量和浓度、发酵液的浓度和体系的p h 值对聚谷氨酸的分配系数和提取率都有不同程度的影响：其中体系的p h 值对提取率的影 响显著，在1 0 - - 5 0 环境温度范围内，温度变化对提取效果影响不明显。 关键字：双水相体系；聚谷氨酸；提取；分离 a b s t r a c t i n t h i s p a p e r ) , - p o l y g l u t a m i ca c i d ( 7 - p g a ) w a se x t r a c t e da st h ee x t r a c t i v et a r g e tf r o m o r i g i n a la n dc e n t r i f u g a t e db r o t hb yt h r e e k i n d so fa q u e o u st w o p h a s e s y s t e m s ( a t p s ) ， p e g p o t a s s i u mp h o s p h a t e ，p e g a m m o n i u ms u l p h a t ea n dp e g f r u c t o s ed i p h o s p h a t e t h ee f f e c t s o fp r o c e s sa n de n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n st ot h ee x t r a c t i o nr a t i oo f7 - p g aw e r es t u d i e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a ta sf o l l o x 、i n g i nt h et o t a lw e i g h tw a s2 0 9i na t p so fp e g a m m o n i u ms u l p h a t e w h e nt h ea t p sw e r e c o m p o s e do f15 ( w w ) p e g 6 0 0 0 ，14 ( w w ) a m m o n i u ms u l p h a t e ，10 ( w w ) c e n t r i f u g a t e d b r o t ha n d4 ( w w ) n a c 1 ，p u t 12m i n u t e sa tr o o mt e m p e r a t u r e ，t h et w op h a s e sc h a n g e di n t o c l e a r t h ep h a s ev o l u m er a t i o ，p a r t i t i o nc o e f f i c i e n t sa n de x t r a c t i o nr a t i ow e r eo 71 ，o 3 9a n d 7 8 4 3 w h e no t h e ro n ew e r ec o m p o s e do f2 3 ( w w ) p e g10 0 0 ，14 ( w w ) a m m o n i u m s u l p h a t e ，10 ( w w ) o r i g i n a lb r o t ha n d2 5 n a c1 ，b yc e n t r i f u g a t ea t30 0 0 r m i n ，5m i n u t e si n r o o mt e m p e r a t u r e ，t h ep h a s ev o l u m er a t i o ，p a r t i t i o nc o e f f i c i e n t sa n de x t r a c t i o nr a t i ow e r e1 10 ， 0 7 0a n d5 6 4 3 i nt h et o t a lw e i g h tw a s2 0 9i na t p so fp e g f r u c t o s ed i p h o s p h a t e ，w h e nt h ea t p sw e r e c o m p o s e do f2 3 ( w w ) p e g10 0 0 ，2 5 ( w w ) f r u c t o s ed i p h o s p h a t e ，10 ( w w ) c e n t r i f u g a t e d b r o t h ，p u t 15m i n u t e s ，t h et w op h a s e sc h a n g e di n t oc l e a r t h ep h a s ev o l u m er a t i o ，p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t sa n de x t r a c t i o nr a t i ow e r e1 2 0 ，1 3 9a n d6 2 6 w h e no t h e ro n ew e r ec o m p o s e do f 2 5 ( w w ) p e g l 5 0 0 ，2 3 ( w w ) f r u c t o s ed i p h o s p h a t e ，1 0 ( w w ) o r i g i n a lb r o t ha n d2 5 n a c l ， b yc e n t r i f u g a t ea t3 0 0 0 r m i n ，5m i n u t e si nr o o mt e m p e r a t u r e ，t h ep h a s ev o l u m er a t i o ，p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t sa n de x t r a c t i o nr a t i ow e r e1 19 ，1 4 2a n d6 2 8 t h er e s u l t sf r o mo r t h o g o n a lt e s ts h o w e dt h a ti nt h et o t a lw e i g h tw a s 2 0 9i na t p so fp e g p o t a s s i u mp h o s p h a t e ，w h e nt h ea t p sw e r ec o m p o s e do f2 4 ( w w ) p e g15 0 0 ，2 3 ( w w ) p o t a s s i u mp h o s p h a t ea n d1o ( w w ) c e n t r i f u g a t e db r o t h ，p u tl e s st h a n5m i n u t e sa tp h = 8 0i n r o o mt e m p e r a t u r e ，t h et w op h a s e sc h a n g e di n t oc l e a r t h e p h a s ev o l u m er a t i o ，p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t sa n dt h ee x t r a c t i o nr a t i ow e r e0 9 6 ，31 7a n d9 6 8 a n dt h a tw h e no t h e ro n ew e r e c o m p o s e do f2 3 ( w w ) p e g 10 0 0 ，2 3 ( w w ) p o t a s s i u mp h o s p h a t ea n d10 ( w w ) o r i g i n a lb r o t h a tp h = 8 0 ，b yc e n t r i f u g a t ea t3 0 0 0 r r a i n ，5m i n u t e si nr o o mt e m p e r a t u r e ，t h ep h a s ev o l u m e r a t i o ， p a r t i t i o nc o e f f i c i e n t sa n dt h ee x t r a c t i o nr a t i ow e r e1 0 6 ，3 7 0 5a n d9 7 8 t h ea b o v er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee f f e c t so f p e g p o t a s s i u mp h o s p h a t ea t p sw a s t h eb e m ， n om a t t e ri nt h ec o n d i t i o no fn a t u r ep h a s es e p a t a t i o no rp h a s es e p a t a t i o nb yc e n t r i f u g a t e ，f o r o r i g i n a lb r o t ha n dc e n t r i f u g a t e db r o t h f u r t h e r m o r e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed i f f e r e n to fp h a s ef o r m i n gc o m p o n e n t ，t h e i r m o l e c u l a rw e i g h t ，b r o t hc o n c e n t r a t i o n ，p ha n dt e m p e r a t u r ei na t p sm o r eo rl e s si n f l u e n c e d p a r t i t i o nc o e f f i c i e n t ska n de x t r a c t i o nr a t i oy to f7 - p g a a m o n go ft h et o t a lt h ep hi na t p s m a k er e m a r k a b l ee f f e c t s b u t t h ee f f e c to f t h et e m p e r a t u r ei na t p sw a sal i t t l eb e t w e e n l 0 - 5 0 c k e yw o r d s ：a q u e o u st w o p h a s es y s t e m s ；7 - p g a ；e x t r a c t i o n ；s e p a r a t i o n 攻渎坝i j 学位期间发表论义、参d i t l - ：t l i j f 情况以及学位论文使用授+ 义说i 刿 攻读硕士学位期间发表论文、参加科研情况以及 学位论文使用授权说明 ( 1 ) 发表学术论文： 论文题目：双水相系统提取分离聚谷氨酸的研究 中文核心期刊食品研究与丌发2 0 0 8 年第l l 期 ( 2 ) 申请专利一项：一种双水相体系从发酵液中提取聚谷氨酸的方法，申请号： 2 0 0 9l0 0 6 8 0 5 3 6 参加科研情况： 2 0 0 7 1 0 5 - - 2 0 0 7 0 6 ：h p l c 法研究玉米秸秆中糖分的检测方法优化( 中国乳品检测中心 合作) 2 0 0 8 1 卜2 0 0 8 1 l ：h p l c 检测乳品中三聚氰胺的含量( 中国乳品检测中心合作) ( 3 ) 学位论文使用授权说明： 本人同意授权天津商业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 第一章前 高 第一章前言 1 1 双水相萃取技术 双水相萃取技术( a q u e o u st w o p h a s es y s t e m ，简称a t p s ) ，又称为水溶液两相分配技术 ( p a r t i t i o no ft w oa q u e o u ss y s t e m ) 是近年出现的、极有应用前途的新型生物化工分离技术。 双水相萃取系统是由两种化学结构不同的亲水性聚合物，或者一种亲水性聚合物和无机盐 在水中以适当的浓度配比i 酊形成互不相溶的两水相系统。利用组分在两水相间分配的差异 而进行组分的分离提纯的技术称为双水相萃取技术i l 】。 1 1 1 双水相萃取原理与成相物质 双水相萃取( a q u e o u st w o p h a s ep a r t i t i o n i n g ) 是l8 9 6 年当b e i j e r i n c k 把琼脂和可溶性淀粉 和明胶相混合时最早发现的【列。1 9 5 5 年a l b e r t s o n 首先利用双水相技术来分离生物分子，他 主要研究聚乙二醇( p e g ) 葡聚糖( d e x ) 系统和p e g 无机盐系统在分离纯化中的应用。在随 后的几十年中，这项技术有了长足的发展。在双水相的分离模型研究中，主要提出了两类 模型：一个是e d m o n d 等人提出的渗透维里模型，1 1 1 e d m o n d o g s t o n 方程：另一个是f l o r y 和 h u g g i n s 根据热力学的基本原理提出的品格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的 分配上有较高的准确度，而后者在离子的能量概念上可以很好的拟合实验数据【3 1 。 现在普遍认为，形成双水相的原理是出于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子空间 的阻碍作用，使其无法相f t 渗透，不能形成均一相，从而产生相互分离的倾向，符合相似 相容性原则；而聚合物无机盐体系的相分离则可能与聚合物所带电荷有关，从微观结构看， 聚合物分子被周围的水分子强烈水化，这会诱导周围的水分子有一定的取向，由于两种聚 合物周围的水分子结构不相容，有较明显的排斥作用，从而形成界面：对非离子型表面活 性剂双水相体系具有代表性的理论是b l a n k s c h t e i n 排斥体积作用理论【4 1 ，显然各种理论的解 释不能统一，有待于进一步探索。 目前国内外已知的能很好分相的双水相体系有三种：即高分子双水相p j 、表面活性剂 双水相1 6 1 、普通有机物无机盐双水相【7 1 。 ( 1 ) 高分子双水相体系( a q u e o u sp o l y m e r t w o p h a s e ) 研究结果表明，两种高分子的水溶液在一定浓度下混合，或一定浓度的一种高分子与 一种无机盐的水溶液混合均可以形成双水相，常见的体系见表1 1 ： 第一章前亓。 表1 1 常见的高分子舣水相 t a b l ei 1t h ec o m m o np o l y m e ra q u e o u st w o p h a s es y s t e m s ( 2 ) 表面活性剂双水相体系( a q u e o u ss u r f a c t a n tt w o p h a s e ) 正负离子表面活性剂混合的水溶液在适当条件下能够形成两个互不相溶的水相系统 嫡】，这种系统称为表面活性剂双水相体系( a q u e o u st w o p h a s es y s t e m a t p s ) 。近几年此类 双水相体系在理论领域0 1 和应用领域【i l 】中被极大地关注。由于表面活性剂溶液中的胶束 结构在不同的条件下组成形式不同，这使得表面活性剂双水相系统对物质萃取的选择性具 有可调节性。利用该系统萃取生物大分子物质如牛血清蛋白、胰蛋白酶等的研究已有报道 1 1 2 1 常见的表面活性剂双水相体系为溴化十二烷基三乙胺( c 1 2 n e ) 和十二烷基硫酸钠( s d s ) 所 形成的双水相体系i 引。 ( 3 ) 普通有机物无机盐双水相 现有的研究表明，异丙醇、乙醇等低成本的普通有机物与无水盐和水以适当质量分数 混合时，也形成双水相体烈1 3 。4 1 。即所谓的有机溶剂无机盐双水相体系，这种新型双水相 体系的主要类型如表1 2 所示： 表1 2 普通有机物无机盐形成的舣水相类型 t a b l e 1 2t h ec o m m o no r g a n i c s i n o r g a n i cs a l t sa t p s 成相有机物成相无机盐 乙醇 异丙陴 正丙 享 丙醇 磷酸氢二钾、碳酸钠、硫酸铵、碳酸钾 磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁 氯化钠、氯化钾 氯化钠、硫酸铵、磷酸氢二钾 第一审前高 1 1 2 双水相萃取技术的特点 根据双水相萃取原理和实验操作表明双水相具有以下优点： ( 1 ) 生物相容性高，两相中的含水量在6 5 - - - 9 0 ，萃取在接近生物物质生理环境中的 条件下进行，故而不会引起生物活性物质失活或变性。双水相体系中成相物质( p e g 、d e x t r i n 等高聚物和磷酸盐、硫酸盐等无机物) 通常对酶或细胞没有毒性，体系中聚合物往往对生 物分子的结构不但没有破坏，反而有稳定作用，因此可在室温下操作，生物活性物质的强 亲水性避免了传统的水一有机溶剂两相萃取体系中的有机溶剂使生物活性物质变性或者 失活的缺点i 协l 。 ( 2 ) 单级分离提纯效率高；通过选择适当的双水相体系，一般可获得较大的分配系数， 也可调节被分离组分在两相中的分配系数。如果体系选择合适，提纯倍数可达2 - 2 0 倍， 目标产物回收率可达9 0 以上，在萃取同时，细胞或者细胞碎片，多糖、酯等杂质可与被 分离组分快速分离。 ( 3 ) x 2 水相系统之问的相间界面张力仅为1 0 击 - 1 0 4 n m ，大大低于传统有机萃取系统有 机溶剂与水相之间的界面张力约( 1 - - - 2 0 ) x 1 0 3 n i m ，因此，溶质分配过程温和，有利于保 持生物活性，使生物物质f i 易受到破坏，而且相间传质过程和平衡过程快速，相对于某些 分离过程来说能耗较小。 ( 4 ) 1 土1 于双水相系统的影响因素较多，聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、 p h 以及温度等均能影响两相的相比和溶质分配系数，从某种意义上来说可以采取多种手段 来提高选择性或提高收率，并且这些影响因素易于控制，易于达到所要求的最优控制条件。 此外，影响因素多使双水相萃取技术与其它技术间相互集成性增强。 ( 5 ) 从化学工程的角度看，双水相萃取技术在实际应用过程中能够容易、精确地运用传 统液液萃取的原理、设备、操作条件和成功经验，不要求特殊的处理就可与后续纯化工艺 相衔接，非常适合连续化生产，它可将过滤、离心、盐析等合为一步，省去l 2 个分离步 骤，使整个分离过程更经济，而且处理量大，适合工业应用。 ( 6 ) 能进行萃取性的生物转化【1 6 j 。在一些双水相体系中可将发酵生产过程中的生物转化 与下游处理相结合，即生物反应在其中某相中进行，同时生成的反应产物被连续萃取到另 一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在 缓冲液中更稳定，活性更大，因为生物反应和生物产物的提取同时进行，尤其适于连续生 产。 ( 7 ) 与提取酶等生物活性物质中常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶液量 第一帝前高 和较短的操作时i b j 内获得较高产量的产品，另外，操作能够容易、精确地按比例放大，非 常适合大规模应用，可进行连续生产，而亲和层析由于操作难于放大，应用受到限制。 ( 8 ) 从环境保护角度柬 兑，双水相的两相均不含有机溶剂，不会挥发有毒物质而造成环境 污染，而且，成相物质可i 川收利用节约了成本】。 目前，双水相萃取技术已被研究用于众多生物产品的分离提纯，并显示出众多其他分 离技术不具备的优点，是。种应用f j i 景广阔的新型生物分离技术。从双水相发现至今已有 一百多年的历史，但双水相技术在工业上尚未得到大规模的应用，表明这项技术在理论和 实践方面还有很多问题需要解决，主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 聚合物聚合物构成的双水相体系具有良好的分离性能，但用于构造双水相体系的成 相聚合物的价格都比较昂贵，对于一般的生物产品，分离成本过高，从经济上是不合理的 1 1 8 聚合物盐构成的双水相体系在一定程度上降低了分离的成本，但成相高聚物同样很难回 收利用，并且聚合物盐双水相体系中的盐析作用及较大的渗透压会破坏某些生物物质的活 性，应用范围受到限制【1 9 j 。 ( 2 ) 虽然通过选择适宜的双水相体系和操作条件，可获得被分离物质在两相间较大的分 配系数和较高的纯化倍数，但目标产物与成相物质的分离比较困难。如要获得较纯的目标 产物，并且还要依赖其他分离提纯技术。目前双水相萃取技术只能用在目标产物的初步分 离方面，限制了其技术优势的发挥。 ( 3 ) 双水相体系界面张力较小，虽有利于提高传质效率，但是较小的界面张力会易导致 乳化现象的产生，使相分离时间延长，分离效率降低【2 们。某些体系还必须在高速离心场条 件下彳。能使两相有效分离，增加设备投资和操作成本。 ( 4 ) 双水相体系中组分| h j 的作用非常复杂，目自i 还没有建立一套较为完整的理论和方法 解释和预测物质在双水相体系中的相行为和被分配物质在两相中的分配行为。在双水相体 系的研究中还缺乏相应的理论指导，相关基础数据较少1 2 。 ( 5 ) 缺乏对双水相过程的工程放大及设备方面的研究，在体系流体力学，相际间的传质， 传递过程方面研究很少。研究的方法基本上还是通过实验的方法，研究的结果只是建立在 实验的基础上，大部分情况下不能外延，缺乏对过程规律的认识。 ( 6 ) 对双水相萃取工艺整体的集成优化研究还不足，对分离过程中产生的大量含成相物 质的稀溶液，还没有找到一条科学合理的利用及处理途径，大量含盐或含成相组分的废水 溶液难于回收及处理。 虽然双水相萃取技术研究中还存在很多问题，但随着对双水相体系在理论和实践方面 4 第一章前言 研究的不断深入，性能优良的新型成相物质不断发现以及相关技术的不断发展，这些方面 的问题将会逐步获得解决。随着双水相萃取技术的不断完善，双水相萃取技术将成为一种 生物活性物质分离提纯的蓖要技术方法，并将逐步应用到工业当中。本实验就是在前人工 作的基础上，通过对已有的成相物质的筛选来确定适合本实验双水相系统，通过对萃取原 理的分析末建立双水相模j 鬯，并在原有的基础上力求发现新的、分离效果更好的双水相体 系为进一步的研究和实现舣水相分离技术的工业生产打下良好的基础。 1 1 3 双水相技术的研究现状及发展趋势 自从1 9 5 6 年瑞典l u n d 大学的学者利用双水相体系成功分离了叶绿体【2 2 】以来，由于双水 相在提取效率和操作工艺上的优点而得到很多科研工作者的青睐，国外学者在双水相萃取 系统的理论和应用方面做了大量研究工作。国外的研究主要集中在瑞典、德国、印度、美 国、法国、r 本等国家。瑞典l u n d 大学在利用双水相系统提取蛋白质和酶方面都取得了很 好的效果，并且对双水相原理进行了研究，其中p e g 盐双水相体系已经在大规模工业生产 中得到应用1 2 3 1 。印度化学j 支革研究所已经成功地利用p e g 硫酸镁双水相体系，从制造皮革 的废水中提取出蛋白质，并且提取率达n 8 2 6 8 1 2 4 1 。此外，印度在利用双水相分离色素方 面，也取得了很好的效果口5 j ；在高分子双水相系统及其分离现象的理论研究方面，也取得 了一定进展1 2 6 1 。近几年，国外的研究人员对于双水相机理的研究较少，主要还是集中在双 水相体系的利用上，研究的重点依然是寻找萃取率高、成本低的新的双水相体系。 国内对双水相萃取技术的认识较晚，从8 0 年代术丌始对双水相体系进行研究。在诸 如抗生素、酶类、药物、氨基酸、多肽、核酸以及中草药有效成份提取、免疫分析、生物 分子间相互作用力的测定和细胞数的测定方面都有所涉及。特别是成功地应用在蛋白质的 大规模分离中，某些过程已工业化1 2 丌。例如利用聚7 _ , - - - 醇( p e g ) 羟丙基淀粉双水相体系从 黄豆中分离磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶【2 8 】；以p e g 硫酸铵双水相体系，从a 一 淀粉酶发酵液中分离提取q 一淀粉酶和蛋白酶1 2 9 1 ；利用乙醇磷酸氢二钾体系萃取甘草中的 有效成分【3 0 】；利用表面活性剂溴化十二烷基三乙铵与十二烷基硫钠混合体系形成双水相 萃取苯丙氨酣3 1 1 等，都得到了较好的效果，提取率达到8 0 - 9 9 。 但是双水相提取也存在诸多的问题导致该技术不能大规模的运用于生产，针对实际操 作中存在的问题，今后我们的研究应着重放在以下几个方面： ( 1 ) 开发廉价、性能好且无毒的成相聚合物和盐类，丌展成相聚合物和盐类的回收利 用研究。 ( 2 ) 开展双水相体系基本性质的研究，测定各种双水相体系的基本物性数据形成有关 5 第一章前高 数掘库。 ( 3 ) 丌展双水相体系4 1 1 平衡及被分离物在各双水相体系中分配模型等理论研究。 ( 4 ) 丌展双水相体系流体力学及相内相间传质问题、传递特性的研究。 ( 5 ) 丌展双水相体系分离过程的研究，着重进行过程的开发，模拟和放大的研究。 相信随着研究的深入，双水相体系分离技术极有可能成为生物化学物质分离中的一种 重要方法。 1 2 聚谷氨酸 1 2 1 聚谷氨酸的性质、用途和研究现状 y 聚谷氨酸【) ，巾d 心“幻m f ca c i d ，以下简称7 - p g a 是由微生物合成的一种胞外高分子氨 基酸聚合物，由l 一谷氨酸或d 一谷氨酸单体通过t - 酰胺键连接而成，y - p g a 的分子式如下： 八 o 微生物合成的7 - p g a 是一种水溶性的高分子，通常由5 0 0 0 个左右谷氨酸单体组成， 相对分子质量一般在1 0 万1 0 0 万之问【3 列。由于y - p g a 是一种对人体和环境无毒害的生 物相溶性新型天然高分子物质，具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性、 保湿性和可生物降解等独特的理化和生物学特性【3 3 1 ，因而7 - p g a 及其衍生物可广泛应用于 医药制造，生物医学，食品加工，蔬菜、水果、海产品的防冻、保鲜，化妆品工业，农业， 环保，烟草、皮革制造工业和植物种子保护等许多领域。 目前，国内外对丫p g a 的研究主要集中在菌种筛选、诱变和培养条件优化方面。国内 各大学和研究机构也对y p g a 的生物合成途径和机制，以及发酵生产条件进行了研究工作， 但仅限于实验室的小试水平【3 4 _ 3 5 1 。丫- p g a 的提取分离，目前采用有机溶剂沉淀法、化学沉 淀法和膜分离沉淀法。但是由于t p g a 发酵液的黏度高，造成菌体分离和产物提取相当困 难，采用以上几种提取分离方法，提取率仅有4 0 5 0 ，而且产品的纯度不高。由于提取 率低，造成生产成本过高，限制了产品应用范围的扩大。 2 0 0 3 年同本味之素公司和明治制果公司，此后台湾味丹公司都已经实现了商业化生 产，并开始出售t p g a 产品。但产品价格昂贵p 们，含量9 0 的丫p g a 钠盐每公斤售价为3 0 0 0 6 第一章前高 元人民币以上。 我国的发酵工业，存在着上游技术即发酵技术十分先进，而下游技术即后提取技术比 较落后的现状。目的产物提取率的低下，直接影响了生产效率的提高和成本的降低，也在 一定程度上造成了资源浪赞。究其主要原因是因为先进、高效的化工提取分离技术没能有 效的与微生物发酵生产相结合。在化学工程上看来很简单的单元操作，由于从业人员间知 识的不相容性，在发酵产物提取方面应用起来尚显困难。 1 2 2 聚谷氨酸的传统制备方法 传统方法有：有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离法。通常有机溶剂沉淀法和化学 沉淀法采用有机溶剂1 3 7 1 为甲醇或乙醇。 ( 1 ) 有机溶剂沉淀法和化学沉淀法 有机溶剂沉淀法操作步骤： 沉淀物，真空干燥 化学沉淀法和有机溶剂沉淀法操作步骤类似：操作步骤比较繁琐、提取率在4 0 5 0 、而且纯度不高，由于提取率低造成成本过高，限制了产品应用范围的扩大，不适宜 大规模的工业化生产。 ( 2 ) 膜分离法：为了节省有机溶剂如乙醇的用量，j i n h w a nd o t 3 8 1 发明了一种有效的手段 从高粘性的培养液中分离和提取聚谷氨酸的方法，这种方法分为两个步骤：第一步是从高 粘性的培养液中分离聚谷氨酸，第二步是通过超滤的办法浓缩溶液，这样可以减少沉降过 7 第一章前吉 程酒精的用量，通过调低培养液的p h 值至3 ，在3 5 c 进行酸化。培养液酸化后，离心分离， y - p g a 的能量消耗比未酸化时下降1 7 。同时，用中空纤维膜圆柱( m w c 0 5 0 0 ，o o o ) 在p h = 5 时把) ，p g a 从2 0 9 l 浓缩至l j 6 0 9 l ，酒精用量只有原来的l 4 。国内有人选用截留分子量为l 力。的有机膜，取超滤压力y j o 0 6 m p a 进行膜过滤，采取反复循环利用的方法取得了较好的 提取效果。但却存在着超滤时间短、膜容易堵塞、连续化程度低的缺点，致使成果不能运 用到工业化生产之中。 1 3 本文研究的目的和主要内容 由于聚谷氨酸的粘稠特性，通常的提取分离方法都不能收到理想的效果。本研究的目 的是通过选择合适的双水十目系统柬达到从发酵液中有效的分离提取聚谷氨酸。开展双水相 系统提取分离聚氨基酸的研究，不仅可以解决聚谷氨酸的提取分离问题，其成果还可推广 到同类产品的后处理工艺中，为诸如聚赖氨酸等一类极具市场前景的生物高分子的生产奠 定基础。同时，为发酵产品的后处理工艺探索新的途径，从而为提高发酵产品的收率、降 低发酵产品的生产成本、提高发酵产品的品质作出贡献。 本文的主要研究内容： ( 1 ) 选择适于提取分离聚谷氨酸的双水相系统： ( 2 ) 绘制相图： ( 3 ) 对检测方法的改进； ( 4 ) 研究相系统组成对聚谷氨酸分配系数和提取率的影响； ( 5 ) 研究相系统操作条件对聚谷氨酸分配系数和提取率影响： ( 6 ) 优化双水相相系统组成及操作条件，确定最佳工艺参数： ( 7 ) 对分离得到的聚谷氨酸进行相关分析。 8 第二章利用p e g 硫酸车j c f 双水相系统提取聚谷氩眩 第二章利用p e g 硫酸铵双水相系统提取聚谷氨酸 2 1 实验材料与设备 2 1 1 试验材料 ( 1 ) 聚谷氨酸发酵液 天津市百奥生物技术有限公司提供 原发酵液中一、- p g a 的含量：6 4 m g g ( w w ) 原发酵液5 0 0 0 转分、离心5 分钟后取上清液，7 - p g a 的含量为1 4 7 m g g ( w w ) 。 ( 2 ) 试剂： p e g ( 4 0 01 0 0 01 5 0 02 0 0 06 0 0 0 ) 分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司 p e g 4 0 0 0分析纯 天津市光复精细化工研究所 硫酸铵分析纯天滓市德思化学试剂有限公司 浓盐酸分析纯天津市化学试剂批发公司 甲醇分析纯天津市四通化工厂 氢氧化钠分析纯天津市北联精细化学品开发有限公司 碳酸氢钠 分析纯天津市北联精细化学品丌发有限公司 n ，n 二甲基甲酰胺分析纯天津市德恩化学试剂有限公司 乙腈 分析纯天津市光复精细化工研究所 醋酸钠分析纯天津市凯通化学试剂有限公司 s b a 系列分析仪专用缓冲剂山东省科学院生物研究所 s b a 谷氨酸葡萄糖标准液山东省科学院生物研究所 ( 3 ) 衍生剂： 2 ，4 二硝基氯苯分析纯天津市德恩化学试剂有限公司 2 1 2 仪器设备 高速离心机l g l0 2 4 a北京医用离心机厂 低速离心机l d 5 1 0北京医用离心机厂 循环水式多用真空泵 s h b b 9 5 a s h b i i i郑州长城科工贸有限公司 电子天平j a 4 1 0 3 a上海精天电子仪器有限公司 生物传感分析仪 s b a 4 0 c山东省科学院生物研究所 电热恒温干燥箱2 0 2 1 s上海跃进医疗器械厂 旋涡混合器g l 8 8 b江苏海门麒麟医用仪器厂 9 销_ 二章利用p e g 甜t 睃铵双水相系统提取聚符氩睃 微量连续可调移液器d r 0 1 0 3 5 电热恒温水浴锅h w s 2 4 k q 3 0 0 v d e 型双频数控超声波清洗器 高效液相色谱仪l c 10 a v p 型 d h g 9 1 4 0 a 电热恒温鼓风干燥箱 k q 2 2 0 0 b 超声波清洗器 s a g a 1 0 t 超纯水器 冷冻干燥机f d - 1 型 超滤装霄o e o s 一5 0 3 2 2 实验内容与方法 北京青云卓立精密设备有限公司 上海一恒科学仪器有限公司 昆山超声仪器有限公司 同本岛津制作所 上海一恒科技有限公司 昆山市超声仪器有限公司 南京易普易达科技发展有限公司 郑州长城科工贸有限公司 天津膜天膜工程技术有限公司 2 2 1 绘制p e g 硫酸铵双水相体系的相图 将不同分子量( 1 0 0 0 ，1 5 0 0 ，2 0 0 0 ，4 0 0 0 ，6 0 0 0 ) 的p e g 和硫酸铵固体分别配制成浓 度为5 0 ( w w ) 和3 0 w w ) 的溶液。按照1 0 9 系统中p e g 和硫酸铵的质量分数分别为 4 6 、3 0 、2 0 、1 0 、5 和5 、7 、1 5 、2 5 、3 0 的质量准确称量p e g 和硫酸铵 原液，加入试管中，配好一系列两相系统，然后计量加水，直到溶液变清成为单相系统， 计算达到单相系统时p e g 平i 硫酸铵在系统中的重量百分含量，则可以得出p e g 和硫酸铵的 双节线相图，如图2 1 ： 51 01 52 0 硫酸铵( w w ) 一1 0 0 0 一15 0 0 一2 0 0 0 * 一4 0 0 0 鼍6 0 0 0 图2 ip e g 硫酸铵双水相系统相图 f i g 2 1p h a s ed i a g r a mo fp e g a m m o n i u ：ns u l f a t e 1 0 2 5 一 o o 5 0 5 o 5 o 5 o 5 o 5 4 4 3 3 2 2 l 1 毒蕾一求o厶 德_ 二章利用p e g 硫眩铵双水车1 1 系统提取聚符氯睃 如上图所示，在相同温度下，不同分子量的p e g 和硫酸铵溶液构成的双水相体系，其 临界分相浓度有很大差别p e g 分子量越大，分相临界点越小，成相物质浓度较少时即可 分相，分相容易。任何在旧一系线上的组成，分相后两相的组成相同，但两相的量不同， 两相的量可按杆杠原理计锥。根据p e g 硫酸铵系统的相图，可以确定用于提取聚谷氨酸的 双水相体系中的p e g 百分含量和硫酸铵百分含量的大致范围。 2 2 2 双水相体系分离提取聚谷氨酸的分配行为描述 双水相萃取技术分离提纯生物物质是基于被分离组分在两相问的选择性分配，其分配 行为可由分配系数k 1 4 5 。6 l 水描述： k = c t c b ( 2 - 1 ) 式中：c 。、c b 分别为被分配物质在上相和下相中的浓度，单位为m g m l 。 一般来讲，分配系数主要是相物质和目标提取物的性质、p h 值以及温度的函数，而与 分配物质的浓度以及两相的体积比无关1 4 9 1 。被分配物质在双水相中的分配系数越大，越 易进行分离。在同一系线上的组成，由于分相后两相的组成相同，所以分配系数不变。这 时各相中被分离物质的总量取决于相的体积。双水相萃取操作中，目标产物的顶相相物质 的回收率可用下列公式计算： y t = r k ( 1 + r k )( 2 2 ) 式中y 为回收率( ) ；r 为上下相的体积比。 从上式可知，提高相l t r 和分配系数k ，都能提高提取率。所以在r 一定时，当r 值大 于1 时，体系的分配系数越高则上相收率越大；当r 值小于l 时，分配系数越低则下相收率 越大。因为双水相提取是一项将被分配物质浓缩的工艺，所以我们期待被分配物质所在相 的相体积越小、被分配物质浓度越大那么结果越好。在本文涉及的双水相体系分离提取聚 谷氨酸的实验研究中，可以通过两相中水解后和水解前单位体积单体谷氨酸含量差的比值 表示聚谷氨酸的分配系数1 5 i 】，即： k = c d c 2 式中c 卜c 2 分别为上相和下相中谷氨酸的浓度，单位m g m l 。 当聚谷氨酸主要分配在上相时，其理论提取率按下列公式计算： y t = v t c i ( v t c l + v b c 2 ) l l ( 2 - 3 ) ( 2 - 4 ) 讹- 二章利用p e g g j , c _ 腋铰双水相系统提取聚符氨眩 式中v 。、v b 分别为上十h 和下相的体积( m 1 ) 。 理论提取率：在理想情况下，双水相体系的上下相中聚谷氨酸的总和应该等于添加在 体系内发酵液中聚谷氨酸的含量，即v 。c l + v b c 2 = m 鬻抖缸艘，但由于实验过程中的损失和实际 操作的误差造成检测出的聚谷氨酸的数值小于实际聚谷氨酸的含量，所以我们用理论提取 率来阳j 接的表示双水相体系分配行为的一个指标。 当聚谷氨酸主要分配在下相时，其理论提取率按下列公式计算： y l v b c 2 ( v l ci - i - v b c 2 ) 聚谷氨酸的实际提取率按下列公式计算： y = v l cj m 聚芥虹膻 ( 2 - 5 ) ( 2 - 6 ) 式中y 为实际提取率( ) ，即双水相体系某一相中的检测值和添加的发酵液中的聚谷氨 酸质量的比值，m 聚符氮暇为发酵液中的聚谷氨酸含量( m g ) 。 2 2 3 双水相体系的制备方法 2 2 3 1 从离心部分除菌后的发酵液中提取y p g a 的双水相系统的制备5 2 ，5 3 1 。 ( 1 ) 将不同分子量的p e g 酉? , $ t j 成5 0 ( w w ) 的浓溶液，硫酸铵配制成3 0 ( w w ) 的浓溶液， 备用。 ( 2 ) 将原发酵液以5 0 0 0 f f m i n 的速度在低速离心机上离，6 , 5 m i n ，得到部分除菌的发酵液， 原发酵液中- r p g a 的含量为6 4 m g g ，离心后上清液中y p g a 的含量为1 4 7 m g g 。 ( 3 ) 构造不同组成的双水相体系，选取体系质量规模为2 0 9 ，其组分的加入量按组分质 量占整个体系质量的百分i ( w w ) 力l l a ，按事先计算的配制一定组成( 质量分数) 双水相体系 所需p e g 和硫酸铵的质量，依次将所需的储备液加入到带刻度的试管中，振荡混合，静置 分相。 2 2 3 2 从原发酵液中提取