（食品科学与工程专业论文）酸奶制品在贮存过程发生后酸化的机理及控制措施的研究.pdf

郭清泉摘 要2 0 0 1 年 5月摘要 本 研究 针对困 扰酸奶工 业发展的 后酸化问 题， 系 统 地研究了 酸奶 制品 ( 由 嗜热 链球菌和保加利亚乳杆菌发酵而成)在贮存过程中发生的各种理化指标变化和微生物指标变化、并确定了导致酸奶制品发生后酸化的主要发醉剂菌，同时对发酵剂菌体产生的糖代谢酶 -0 一 半乳糖普酶的活力、 性质及产生期进行了 研究，并依 据后酸化发生的机理，提出了 控制酸奶制品后酸化发生的措施 性1 2 条 件 下 ， 酸 奶 样 品 于 贮 存 第 二 天 发 生 后 酸 化( p h = 4 .1 0 ) ， 且 随 贮 存 天 数 的 增加，后酸化越来越严重。发酵剂的两种菌菌数也随贮存天数的延长而减少， 但嗜热链球菌减少 的 更多 ( 9 9 .9 6 %) ， 从而导致球菌与杆菌比例偏离 1 : 1 普通酸奶制品中没有葡萄糖存在，乳糖含量在贮存过程中仍继续 卜 降，但并没有完全消耗，在贮存第十五天仍有1 .3 8 % , 被消耗6 9 .3 %: 半乳糖含量是不断增加的， 白 贮存第一 天的0 . 8 % 上升为贮存第十五 天的 ! .0 5 %a凝固性酸奶的粘度变化受贮存时间影响不大，相比之一 搅拌型酸奶的粘度下降幅度更大一些。 将培 养 物中 保 加利亚乳 杆菌与嗜热链 球菌调整为 相同p h值 ( 4 .5 0 ) ， 起始相同 菌 数 ( 7 3 4 x 1 了 个 / m l- 7 .4 x 1 0 ， 个 /m l ) 后 分别 贮 存 2 5 c ) 、 在 贮 存第i i 天 嗜 热 链 球 菌 的p h为4 .5 7 ， 而 保加利亚 乳杆菌p h为3 .8 5 ,菌 数与酸 度并不- 一 对 应， 而是 菌体的 产酸能力决定了 介质酸度下降。 采用菌体细胞蛋白 质重量来测定0 一 半乳糖普酶比活力是比较精确的方法。0 一 半乳糖普酶为胞内酶，通过对溶菌酶破壁、超声波破壁、渗透压破壁、丙酮干粉四种破壁方法的比较， 确定超声波破壁法进行细胞破壁。 发酵剂菌体的0 - 半乳糖昔酶的活性在酸奶贮存过程中比活力下降，由最初的。 .9 7 0 7 下降到。 4 6 8 第 1 5天) 。 通过对粗酶液中0 一 半乳糖普酶性质的研究， 可知保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的0一 半乳糖普酶在 4 5 - 5 5 之间活性有最大值。当温度高于6 0 时，0 一 半乳糖普酶活性急剧 下降。 在p h = 7 .0 0 一 半乳 糖普酶活性有最大值， 在偏 酸性( p h 8 ,5 ) . 酶的 活 性几乎 全部 丧失。 但是 酸奶制品 在贮存 过程中p h可以下 降 到3 .5 , 推 测可能是菌体对0 半乳糖着酶活性起保护作用。 故设计在酸性条件下， 菌体经超声波处理前后，测定p 一 半乳糖昔酶活性的差异。 在p h = 4 .5 . 4 .0 , 3 .5 条 件下， 超声波处理菌 体前后， 嗜热 链球 菌的0 一 半 乳 糖昔酶活性卜半 乳糖普酶活性没有较大差异 ( p 0 .0 5 ， ，而保加利亚乳杆菌p 一 半乳糖普 酶活性差异较大( p 0 . 0 5 ) .添加n i s in 对于抑制后酸化效果明显，没有添加n i s i n 的酸奶组在第 天酸度为 1 1 6 . 9 5 0 t ，而添加n i s i n 组在贮存第5 天酸度为1 0 9 . 5 - 1 0 3 .6 2 0 t ， 将后酸化现象推迟5 天，并且不影响酸奶制品的感官质量， 甚至因没有乳清析出而更好添加溶菌酶效果并不理想，而添加牛胆盐当含量为 0巧%时，将后酸化推迟3 天， 添加0 . 3 %牛 胆盐的酸样品在经过7 天贮存p h仅下降。 1 7关键词:后酸化关键菌p 一 半乳糖昔酶控制措施郭清泉英文摘要2 0 01 年 5 月s t u d y o n t h e me c h a n i s m o f p o s t a c i d i f i c a t i o n o f t h e p l a i n y o g u r td u r i n g s t o r a g e a n d t h e me t h o d s t o c o n t r o l i tab s t r a c t p o s t a c i d i f i c a t i o n w o u l d o c c u r i n t h e s t o r a g e o f y o g u rt . c o n s u m e r s a r e d i s c o n t e n t w it h t h eh e a v y a c id t a s t e . i n o r d e r t o a v o i d i t , t h i s e x p e r i m e n t s y s t e m a t i c a l l y r e s e a r c h t h e m e c h a n i s m o fp o s t a c id i f i c a t i o n a n d p u t f o r w a r d s o m e m e t h o d s t o c o n t r o l i t t h e y o g u rt s a m p l e o c c u r r e d p o s t a c i d i f i c a t i o n a t t h e s e c o n d d a y w h e n t h e s t o r a g et e m p e r a t u r e i s 1 2 c .t h e a c i d i ty i s m o r e i n t e n s i v e w i t h t h e s t o r a g e t i m e . t h e c o u n t o f s .t a n dl . b o f y o g u rt s a m p l e d e c r e a s e d w i t h t h e s t o r a g e t i m e , b e s i d e s , t h e l o s s c o u n t o f s .t i s m o r et h a n l 七 ( 9 9 .9 6 %) . i n t h e s a m p l e , t h e r e i s n o g l u c o s e b u t g a l a c t o s e a n d l a c t o s e . t h e c o n t e n t o fl a c t o s e i s 1 .4 8 % a t t h e f i f t e e n t h d a y a n d h a s b e e n u s e d 6 9 .3 % . t h e c o n t e n t o f g a l a c t o s ei n c r e a s e d f r o m 0 .8 % i n t h e f i r s t d a y o f s t o r a g e t o 1 .0 5 % i n t h e f i f t e e n t h d a y . t h e v i s c o s i ty o ft h e s t i r r e d y o g u rt d e c r e a s e d m o r e t h a n t h e s e t y o g u rt . i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e m a i n o r g a n i s m t h a t c a u s e s p o s t a c i d i f i c a t i o n , s .t a n d l . b w e r ei n c u b a t e d r e s p e c t i v e l y i n t h e s t o r a g e t e m p e r a t u r e 2 5 c . t h e c u lt u r e o f s . t a n d l . b i s i n t h es a m e c o n d it io n ( th e c o u n t o f l a b is 7 .4 x 1 0 c f u / m l o r s o、 p h v a lu e is 4 .5 0 ) .a t t h e e l e v e n t hd a y o f s t o r a g e , t h e c u l t u r e p h v a l u e o f s .t i s 4 . 5 7 .o t h e r w i s e , l .b i s 3 .8 5 .t h e i n fl u e n c e o f l .b i ss t r o n g e r t h a n t h a t o f s .t t o t h e p h v a l u e o f t h e y o g u rt . i n o r d e r t o s t u d y t h e c h a r a c t e r i s t i c o f p - g a l a c t o s i d a s e , s u p e r s o n i c w a y t o d e s tr o y t h ec e l l w a l l w a s c o m p a r e d w i t h t h e w a y o f l y s o z y m e , o s m o t i c p re s s u r e a n d a c e t o n e d ry p o w e r .t h e n i c h o o s e t h e s u p e r s o n i c w a y a s t h e o p t i m u m w a y t o d e s tr o y t h e c e l l w a l l . t h ec h a r a c t e r i s t i c o f p - g a l a c t o s i d a s e o f s .t i s s i m i l a r w i t h t h a t o f l .b . a t t h e t e m p e r a t u r e o f4 5 - 5 5 c ,t h e a c t i v i ty o f p - g a l a c t o s i d a s e i s t h e b i g g e r t h a n t h e o t h e r t e m p e r a t u r e . a t t h e s a m et i m e , t h e a c t i v i t y o f p - g a l a c t o s i d a s e i s t h e b i g g e s t w h e n p h v a l u e is 7 . 0 . b e f o r e a n d a ft e rs o n i c a t i o n , t h e s p e c i f i c a c t i v i ty o f p - g a l a c t o s i d a s e i s d i ff e r e n t e s p e c i a l ly f o r l . b i n t h e l o w p hv a l u e . t h e m i c r o b i a l c e l l m e m b r a n e , c e l l w a l l o r b o t h o f l .b m a y a i d i n p r o t e c t i n g t h e p- g a l a c t o s i d a s e f r o m a c i d d e n a t u r a t i o n . s t r e p t o m y c i n c a n k i l l t h e s t a rt e r b a c t e r i u m b u t d o e s n o ta ff e c t t h e a c t i v i ty o f j3 - g a l a c t o s i d a s e . t h e p h v a l u e d i ff e r e n c e o f a d d i n g s tr e p t o m y c i n i ny o g u rt a n d t h e p la i n y o g u rt i s 0 . 2 1 a t t h e s i x t h d a y o f s t o r a g e . i a d o p t e d s o m e m e t h o d s t o c o n t r o l t h e p o s t a c i d i f i c a t i o n b a s e d o n t h e m e c h a n i s m.硕士学位论文酸奶制品在贮存过程中发生后酸化的机理及控制措施的研究东北农业大学 f i r s t ly , i t r i e d t o m u t a g e n e s i s l . b w i t h u l t r a v i o l e t i n o r d e r t o m a k e i t s e n s i t i v e t o t h e h i g ha c i d , b u t t h e c h a r a c t e r i s t i c o f m u t a n t c o u l d n o t i n h e r i t s t e a d i l y . s e c o n d l y , i i n c r e a s e d t h ep r 叩o n i o n o f s .t t o l . b i n t h e y o g u rt c u l t u r e . t h e y o g u rt a c i d i ty o f t h e s e c o n d d a y i s l e s s t h a n1 1 0 0 t w h e n t h e p r o p o rt i o n o f s .t t o l . b i s l e s s t h a n 3 5 .3 2 % i n t h e y o g u rt c u lt u r e b y t h er e g r e s s i o n a n a l y s i s . t h e fl a v o r o f y o g u rt ( s .t t : l . b i s 3 5 : 6 5 ) d i d n o t c h a n g e m u c h a s t h et r a d i t io n a l y o g u rt ( s .t : l . b i s l : l )i n t h i s e x p e r i m e n t , t h e c h a n g e s o f m i l k d r y s o l id h a s n o tm u c h i n fl u e n c e t h e y o g u rt p o s t a c i d i f i c a t i o n . t h e r e s u lt o f a d d i n g n i s i n t o y o g u rt i s g o o d , b u ta d d i n g l y s o z y m e t o t h e y o g u rt s a m p l e i s n t i d e a l . a t t h e s e v e n t h d a y o f s t o r a g e , t h e p h v a l u eo f y o g u rt ( i n c l u d i n g b i l e ) o n ly d e c r e a s e d b y 0 . 1 7 c o m p a r e d t o 0 .3 9 o f t h e p h v a l u e o f t h ep l a i n y o g u rt .ma s t e r c a n d i d a t e : q i n g q u a n g o o ma j o r : f e r me n t e d f o o d s u p e rvi s o r : p r o f . l a n w e i z h a n gk e y w o r d s : y o g u rt p o s t a c i d i f i c a t i o n 0 - g a l a c t o s i d a s e享 清泉前 言2 0 0 1年 5月1 前言1 . 1 研究的目的和意义 乳制品是人们普遍喜爱的食品，因其营养丰富、易于消化吸收、风味香甜而在人们的日 常膳食中占有重要的地位 “ 一杯奶强壮一个民 族旧 本战后提出的口号， 已使该民放的体质得到很大提高。我国政府最近对奶及奶制品的消费给子了极大关注，农业部提出2 0 0 0 年实现人均奶占有量8 千克/ 年， 中国食协、 消协等六部门联合提出学生奶计划，要实现这一愿望，增加乳制品品种及提高质量是关键。在众多乳制品中酸奶以其独有的风味，营养价值和对人体的特殊保健功能而日益受到重视，现已 证实发醉乳制品对人体有如下作用: ) 平衡肠道菌群和整肠 2 . 对肝、 便秘、糖尿病、癌症等疾病有疗效 3 . 清除血清中胆固醉 4 . 抗衰老、延长寿命 5 . 防止和降低乳糖不耐症 6 . 提高人体对钙、磷、铁的吸收 我国酸奶产量在 1 9 9 8 年己达到 5 0 0吨1 天，并已每年2 5 %增长率快速发展。而从世界范围 看， 英国 酸奶制品的销售额在1 9 9 4 年为4 .9 9 亿英镑， 1 9 9 5 年增长为5 .2 5 亿英 镑，在冷冻冷藏食品方面仅次于冰淇淋而居于第二 位; 美国 在 1 9 9 7 年人均消费酸奶 5 .2 磅酸奶制品的销售额为 1 7 亿美元。 在不断增加花色品种、营养价值的同时，酸奶保质期问题日益突出。对于污染微生物 ( 酵母、霉菌等) 造成的保质期短问题己通过设备的改进，卫生条件的控制而加以 解决， 但酸奶是含活菌 ( 发酵剂菌) 的乳制品， 在低温条件下 0 - 5 0 c ) 只能保质一周， 即使这样酸奶感官质量仍有较大变化。这是由于在贮存过程中 发生了 后酸化造成的。 酸奶的后酸化 也称为过酸化、 后发酵) 是指酸奶在正常发酵结束后， 在工厂贮存、产品 j & 输、 销售、 食用前这一过程中 菌体仍在生长繁殖、 并 存在0 一 半 乳糖昔酶， 要分解残 存的 乳 糖产生 乳酸， 使酸奶的p h值继续下降，以 至 出 现了 消费 者不 可接受的 过酸味及感官质量下降 高 质 量的 酸奶在消费时p h值应为4 .2 - 4 .3 ， 而 在酸奶 贮藏 过 程中， p h值可下降 到3 . 5，这样就导致酸奶酸味太重，乳清析出，感官质量下降。虽然各工厂、商店都采取了一定的措施 ( 例如低温冷藏) ， 但酸奶的保质期只有7 天左右， 而高品质风味仅保持3大左石 据美国 1 9 9 7 年作的一份调查，其中8 0 % 的消费 者对酸奶质量不满意的地方是酸味太重国标 g b 2 7 4 6 - 8 5对酸奶及其制品规定:酸度为 7 0 - 1 1 0 7 ( 乳酸度为0 .6 3 - 0 .9 9 %) o而在消费者消费前，酸奶制品的酸度往往在1 . 0 %以上。 本研究通过对酸奶制品 ( 由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵而成)在贮存过程中黑裂蜜舀一望丝理乏些鳖堑望理里丝发 生 的 各 种 变 化 的 测 定 ， 对 发 生 后 酸 化 现 象 的 机 理 进 行 探 讨 ， 对 乳 酸 菌 的 代 谢 调 控 机 制进 行 研 究 ， 以 期 从 根 本 上 解决 酸 奶的 后 酸 化问 题， 使 酸 奶 的 保 质 期 延 长， 感 官 品 质 稳 定 ，以利于酸奶产业的大发展。1 . 2 国内外研究动态和趋势 酸奶制品的后酸化问题严重影响了消费者对酸奶制品的接受性， 严重影响了酸奶制品的普及和发展，为此，国内外学者展开了积极研究 国内对延长酸奶保质期的研究集中在添加防腐剂、稳定剂:发酵后二次杀菌等方法上。 朱滨华等 ( 1 9 9 7 )通过酸奶制品在贮存过程中菌数、 酸度与贮存时间的变化关系，提出了 酸奶变质主要由乳酸菌后酵继续产酸所致:张瑞平 ( 1 9 9 8 ) 将苯甲酸钠、山梨酸钾添加到酸奶中， 制成的搅拌型酸奶在2 - 5 0 c下可以保质切天以上: 而赵谋明等( 1 9 9 3 )是通过向酸奶制品中添加c m c 和不同的 稳定剂来提高酸奶制品的稳定性 张兰威( 1 9 9 4 )对发 酵好的酸奶进行加热处理，并 添加不同稳定剂，使酸奶的保质期延长:侯文通等 ( 1 9 9 7 )人将添加防腐剂、稳定剂与发醉后二次杀菌相结合来使酸奶的保质期延长:李志诚、李广凌等 ( 1 9 9 4 )通过冻藏的方式使酸奶的保质期延长。 添加防腐剂、 稳定剂虽然在一定程度上防止了 微生物污染， 改善了酸奶的组织状态，但酸奶的过酸味没有解决， 发酵后二次杀菌虽然解决了 酸奶的后酸化问 题， 但得到是无活乳酸菌存在的酸奶制品， 这种酸奶制品 国外也称作巴氏杀菌酸奶或超高 温酸奶)因不含有活菌而达不到国际乳品联合会 ( i d f )对酸奶制品 的要求 ( 发酵乳制品中需含1 o c f u / m l 活菌数) ( f a o / w h o , 1 9 7 7 l 中 华人民 共和国行业标准乳酸菌饮料 付 及批 稿) 中规定: 乳 酸菌发 酵制成的 酸奶 饮料中， 乳 酸菌的 致量需为l 0 - 1 0 “ 个 /m l ， 这样才能达到乳酸菌在人体内的生理学保健功能 ( 1 9 9 2 ) . 国外学者对酸奶的后酸化问题是从乳酸菌细胞、荃因的水平上进行研究的，并己获得后酸化弱的乳酸菌菌株。目前， 对乳酸菌的乳糖代谢机理， 细胞对h 十 调控， 酶的基因调控进行了研究，已取得了某些共识。 对德氏 乳杆菌保加利亚亚种( 本文简称保加利亚乳杆菌) 、 唾液链球菌嗜热亚种( 本文简称 嗜热链球菌) 此二菌株研究表明， 此二菌株对乳搪的代谢方式为同型 乳酸发酵，乳糖经 透膜酶被转运到细胞内，经p 一 半 乳糖普酶催化， 产生葡萄糖和半乳糖， 葡萄糖经糖酵 解途径生成乳酸和能1t ; 而半乳糖不被利用， 被排除细胞外 ( 孟昭赫， 1 9 9 3 ) . 保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的乳糖代谢机制见图t o r o b e rt ( 1 9 9 1 ) 研究发现， 乳糖与半乳糖通过反向 转座子运输， 来维持乳酸菌的新陈 代谢平衡。 另外， 现有研究己 证实，乳酸菌 在 正 常 生长 条 件下， 菌 体 细 胞内p h 值 与周 围 环 境的p h 值不 同 ， 菌 体 细 胞 有 保 持 其细胞 质p h值在中 性条 件下的能力，以 利于菌 体 在各种 环境条 件下维 持正 常的 新陈代谢 和各种 酶反 应。 细 胞质的p h值对乳酸菌的 新陈 代谢有 直接的 影响， 而 环境介 质的p h 值对乳酸 菌的 新陈代谢 有间 接的影响 ( k a s h k e t , e .r . . 1 9 8 7 ) . k o n i n g s ( 1 9 8 9 ) 研究发 现，菌体内 经糖酵解生成的乳酸经细胞膜上载体蛋白 排除体外，而细胞 外的质 子、 乳酸盐分子却 不能 渗透到细胞膜内， 这样就形成了一个跨膜p h值梯度差 ( o p h ) , n p h为菌体郭清泉前言2 0 0 1年 5月提 供 质 子 驱 动 力。 来 维 持菌 体 能 量 平 衡。 m a lo n e y ( 1 9 8 2 ) 发 现， 乳 酸菌 的 这 一p h 动态平衡a t p 酶的活性有关， a t p 酶的作用类似于一质子泵， 将质子与乳酸盐分子按一定比例排除细胞， 其所需的能量来自a t p 的水解。 并且近年来b e n d e r ( 1 9 8 7 ) 研究发现不同菌 种具 有不同p h 值耐受力， 是与细胞膜上 a t p 酶的 数量 和活性有关， 在 胞内p h 值低于 中 性 或微 碱性) 时， a t p 酶的 活性要增加，当 胞内p h值 进一步 下降时， 其活性急剧下降，胞内p h值也急剧下降。 近年来出现的乳糖操纵子学说有助于更好的研究乳酸菌的乳糖代谢机制。目前，在基因调 控水平上，对大肠杆菌的乳糖操纵子研究的较为透彻。当外界环境出 现调节基因表达阻遏物蛋白，阻遏物蛋白与辅阻遏物结合，使操纵基因关闭，这样结构基因就不能表达， 即p 一 半 乳糖普酶不能转译生成。而当存在诱导物 ( 乳糖) 时， 诱导物与阻遏物蛋白与 辅阻遏物的复合物结合，使操纵基因开启，促使结构基因表达、即 转译生成p 一 半乳糖营酶分解乳糖。 另外酶催化底物生产的产物， 又可以作为辅阻遏物来抑制酶的表达 彭志英，1 9 9 9 ) . 酶的合成调节代谢见图2 。 近年来有研究表明， 嗜热链球菌、 保加利亚乳杆菌都存在类似乳糖操纵子的结构 ( k a i s e r . 1 9 8 9 : h e m a n，1 9 8 6 ) 而国内对这一领域的研究停留在i艺调整的水平上，没有从细胞、 基因的深度对乳酸菌的生长 代谢进行研究 糖酵解葡萄裂一 一 一 一 一 一 卜 乳酸十 能量+ c 0 2乳糖半乳糖半乳糖 图1 l .b . s .t 菌乳糖代谢机制f ig 1 t h e m e t a b o l i c m e c h a n i s m o f l . b a n d s .t o n l a c t o s e 目 前工业上普遍采用的防止后酸化的方法有后加热处理 ( 1 9 9 8 ,茜娜思高) 、发醉后快速冷却 ( v e d a n u rt h a , 1 9 8 2 ) 、改变球杆菌比例 ( a l l e n , 1 9 9 5 ) .添加细菌素 (w e in b r e n n e r . 1 9 9 7) 等方 法。 后加热处理的方法在实验室里己研究的较为成熟， 有的己 成功应用到工厂实际生产中，但因产品不含有活菌而使酸奶制品的营养价值大为折扣。发醉后快速冷却目的是使菌体的活力下降。 酸 奶在发 醉过程中， 首先 快速生长的是 嗜热链球菌， 当 乳的p h 值从6 .5 下 降到5 .5时， 保加利 亚 乳杆菌 的生长开 始加快， 而嗜热 链球菌的生 长 逐 渐减慢 当 乳 的p h值下降 到5 .0 时， 保加利亚 乳杆菌 控制了 酸奶的 发酵。 当 乳的p h 值下降 到5 .0 左 右时 则 发生酪蛋白 凝聚，乳开始凝结。而当酸奶在冷藏过程中，占 优势的保加利亚乳杆菌继续发酵 乳糖 产酸， 会使酸 奶的p h值下 降到3 .5 所以 增加 发酵 剂中 球菌 对 杆菌的比 例， 可 使酸奶后发醉减弱丝垫 些 舀 一 燮 9uo ? 鉴 里 型 毖 望 业/w m m a 鳖 里 鉴 叁 坠 ) 里 细 l1 索 是 细 菌 代 谢 过 程 中 合 成 并 分 泌 到 环 境 中 的 一 类 对 同 种 或 亲 缘 较 近 的 种 有 抑制 竹 用 的 杀 菌 蛋 白 或 多 肚 。 近 年 来 有 人 把 乳 酸 链 球 菌 产 的 乳 酸 链 球 菌 素 、 丙 酸 杆 菌 产 的丙 酸 杆 菌 素 等 应 用 到 酸 奶 制 作 中 ， 来 抑 制 酸 奶 的 后 酸 化 其 中 乳 酸 链 球 菌 产 的 乳 酸 链 球菌 素( n is i n ) 是 国 际 上 允 许 应 用 到 食 品 中 的 防 腐 剂 我 国 也 于! 9 9 0 年 签 证 批 准 乳 酸 链球 菌 素( n is in ) 为 食 品 保 藏 剂 s .b a y o u m i ( 1 9 9 1 ) 将n is i。 以 不同 剂 量 不 同 时 间 添 加到 酸 奶 中 ， 成 功 抑 制了 酸奶 的 后 酸 化， 而 我国 还未 见 有 将n i s i n 用 于 酸 奶 制 品 的 报 道 目 前， 国内 外学者正 对乳酸菌 细胞的 生长 代谢调 控 机制进行 更深 入的研 究与 探讨，以 便人 为地对其生长代谢进行调控，更好的为人 类的需求服务操纵子c s 遏翻 泽氨基酸 t r n辅阻遏物 1诱导物核糖体酶 c塾|jtj抑制图 2 蛋白质 ( 酶 夕合成的调节模型f i g 2 t h e m o d e l o f p r o t e in o r e n z y m e s y n t h e s i s硕士学位论文酸奶制品在贮存过程中发生后酸化的机理及控制措施的研究东北农业大学2 材料与方法2 . 1 . 1试验材料与设备试验材料菌种:保加利亚乳杆菌 ( c h 9 - 3 )东北农业大学食品学院提供 ( l .b ) 嗜热链球菌 ( c h 9 - 9 )东北农业大学食品学院提供 ( s . t )脱脂乳粉:澳大利亚进口葡萄糖测定试剂盒:上海荣盛生物技术有限公司出品溶菌 酶:上海丽珠东风生物技术有限公司出品 ( 2 0 0 0 0 u / m g )o n p :中国医药集团上海化学试剂公司o n p g : s i g m a 公司出品n i s i n : ( s i g m a 公司 出品，其活力为! 。 。 万i u / g )s 一 r. 乳糖营酶:a mr e s c o制造乳 酸菌 琼脂 培 养基、 乳清 培养基、 酸化m r s 培养基( p h = 5 .4 ) . m 1 7 培 养ii 配料中的化学试剂均为分析纯，生物制剂均为进口或国产脱盐乳清粉:龙丹乳业集团制造牛 胆盐北京医用品厂链霉紊:哈药总厂医用去离子水:由东北农业大学生命中心提供其它所用化学试剂均为分析纯2 . 1 . 2 仪器及设备高效液相色谱仪:美国w a t e r s公司制造州s - 2 5 型酸度计:上海科学仪器厂制造真空旋转蒸发器:上海医用专机厂制造7 2 1 分光光度计:上海科学仪器厂离心机:北京医用离心机厂超速离心机:上海安亭科学仅器厂电 子天平: h a n g p i n g制造超声波仪:c o l e - p a r m e r 美国制造a x 筒电 光显 微 镜:o ly m p u s 日 本 制造磁力搅拌器:上海科学仪器厂7 5 0 0 - 紫外可见分光光度计:b e c k e r m a n 德国制造n d j - 7 9 型 粘度仪:同济大学电 机厂材料与方法郭清泉2 0 0 1 年 5月2 .2 测定项目 及方法2 . 2 . 12 . 2 1 . 1酸奶的制作:脱脂乳培养基制各及菌种活化 取1 0 % 脱脂乳分装于 试管中经。 0 7 m p a 灭菌2 0 m i n ， 冷却后， 将冻千保存的 保加利u,乳杆菌和嗜热链球菌菌种转移至脱脂乳培养基中， 3 7 c 培养， 反复活化， 直到活力达到规定为止2 .2 . 1 .2 发酵剂制备及酸奶制作 日 发酵剂制备 按 %取活化好的菌种置灭菌脱脂乳内，3 7 c 培养至凝固，经鉴定合格后使用 ( 2 ) 酸奶的制作 i _ 艺如 卜 : 凝固性酸奶:原料乳 一净化与标准化一 灭菌 ( 9 0 c 5 m i n )一 冷却一接发醉剂 分装一 4 2 c 培养至凝固一 冷却 一贮存 ( 4 c )一成品贮存 搅拌性酸奶:原料乳一 净化与标准化一灭菌 ( 9 0 c 5 m i n 一冷却一接发酵剂一 4 2 培养至凝固一 搅拌并添加其他物质 一分装 一冷却一贮藏 1 4 c)一成品贮存 随机抽取两份酸奶样品充分混合后，分别于 不同贮存天数进行理化及微生 物指标测定2 . 2 . 2 实验内容与方法2 . 2 . 2 . 1 酸奶制品在贮存过程中理化性质及微生物指标变化 酸奶制作工艺同前。测定酸度、菌数、 糖分含量变化时， 测定贮存在第a8 . 1 5大 ( 贮存温度为 1 2 c)样品;测定枯度变化时，测定贮存第0 , l , 3 ,度为1 5 c)样品、 测定温度为保持在恒温 1 5 c . 1 、3 _ 5 ,7 贮存温2 .2 2 .2 引起后酸化主要发酵剂菌的确定 保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌在脱脂乳培养基内分别培养 ( 3 7 c ) 将样品适当 稀籽后， 采 用 显 微 镜直 接计 数法测定其 菌 数， 然后 用灭 菌 脱脂 乳调 整为 相同 菌 数7 .4 x , 1 0 用灭菌 乳 酸调 相同p h 值4 .5 0 ， 分别 测定 其 在贮 存第1 , 2 , 4 , 7 , 1 1 天 ( 样品 贮存 温 度为2 5 c ) p h值、菌 数变化2 .2 .2 3确定0 一 半乳糖苔酶活性，选定破壁方法 ，乳酸菌细胞破壁方法比较硕士学位论文酸奶制品在贮存过程中发生后酸化的机理及控制措施的研究东北农业大学 ( 1 ) 超声波破壁法 取保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌于乳清液体培养基中培养一段时间后，离心 ( 5 4 0 0x g , 4 c) 得菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液 ( p h = 6 . 8 o . i m k h 2 p o 4 . 0 . 5 m m m g s 0 40 . i m m m n c l 2 ) 洗涤两次，将菌体沉淀再次溶于2 0 m 1 上述磷酸盐缓冲液中，用 1 5 k h z超声波处理3 m i n( 样品始终保持在冰浴中) ，立即测定样品酶活。 ( 2 ) 渗透压冲击法 同前法一样得菌体沉淀， 将细胞悬浮于2 0 % 蔗糖溶液中， 经一段时间后离心 ( 5 4 0 0x g , 4 c) 得菌体沉淀，迅速加入2 0 m l 4 c 蒸馏水，剧烈振荡后立即测定酶活。 ( 3 )溶菌酶破壁法 同 前法得菌体沉淀， 溶于1 6 m l 上述磷酸盐缓冲液中， 加2 m 1 0 . 2 % ( w n) 溶菌酶，于3 7水浴 i h ,然后加入2 m 1 4 n n a c l ，充分混合后测定酶活 ( 4 )丙酮干粉破壁法 同前法得菌体细胞，加入 l o m l 预冷至一 2 0 的丙酮。搅拌均匀待自然沉降后弃去上清液， 经抽滤得菌体细胞，再用2 .5 m l - 2 0 的丙酮洗涤再抽滤至干， 将所得菌体细胞放入真空干燥器中，以除去丙酮得细胞干粉，用2 0 m l 上述磷酸盐缓冲液将其溶解，立即n il 定酶活。2 ) o n p 标准曲线的绘制 取i 、 支 试 管 分别加 入2 0 o wm io n p 溶液。 、 0 .2 . 0 .4 , 0 .6 . 0 .8 . i .o m l . 用 磷酸 盐 缓冲 液( p h = 7 .0 ) 补 足i m l ， 于3 7 水 浴l o m in ， 然 后 分别 加入4 m lo .5 m n a 2 c 0 3 ，以 第一个 管为 空白 ， 测量4 2 0 n m处的 吸光 度， 重复3 - 4次， 取平 均 值。以o n p ( p g ) 为 横 坐标，吸光度 ( o . d值)为纵坐标绘标准曲线。3 )蛋白浓度标准曲线绘制 采用牛血清白 蛋白为蛋白 标准物， 于六支试管内 分别 加入3 0 0 p g l m l 标准牛血清白 蛋白溶液0 . 0 .2 . 0 .4 . 0 .6 . 0 . 8 . 1 .0 m ，用蒸馏水补足 1 m l 充分混合后加试剂甲5 m l ,混合后于室温放置 1 0 m i n ，加试剂乙。 5 ml ，立即混合于3 0 保温3 0 m i n ，以第一个管为空白 ， 测定6 5 0 n m处的 吸光度， 重复3 - 4次， 取平 均值。 以牛血清白 蛋白p g 为 横坐标，吸光度 ( o . d值)为纵坐标绘标准曲线。4 )日 一 半乳糖普酶液的制备: ( 1 ) 酸奶制品蛋白质的溶液化 取 适量 酸 奶样品， 溶于 冷的 1 % e d t a ( p h = 1 2 , 4 c ) 溶液中 ( 每克 酸奶 样品大于2 0 毫克e d t a ) 、 通过e d t a 鳌 合。2 使酸奶 样品中 凝固 的 乳蛋白 溶解， 之 后离 心( 5 4 0 0 x g , 4 c ) 1 0 m in ，去除上清液， 将菌体细胞沉淀用磷酸盐缓冲液 ( 0 . i m k h 2 p o 4 ,0 . 5 m m m g s o 4、 o . i m m m n c l 2 , p h = 7 . 0 ) 洗两次。 ( 2 )菌体细胞破壁 将菌体细胞悬浮于上述磷酸盐缓冲液中，用超声波仪进行菌体细胞破壁 ( 2 0 k h z ,郭清泉材料与方法2 0 0 1 年 5月3 m in )在 进行超声波破壁的同时， 注意将样品 始终保持在 冰浴中， 防止 样品 温度升高，使酶 的 活 性受到 损失。 超声 波破壁之 后 将样品离 心 ( 1 1 4 0 0 x g , 4 c ) 1 0 m in ， 去 除 细胞残骸和未破壁细胞，立即对所得酶液进行分析5 ) 一 半乳糖普酶活性测定:方法见2 .2 .3 .82 . 2 .2 .4粗酶液中6 一 半乳糖昔酶性质的研究1 )0 一 半乳糖普酶对温度的稳定性 分别取保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌于m r s 液体培养基和m1 7 液体培养基中培养 3 7 c , 2 4 h r ) . 于 1 1 ， 0 0 0 x g 4 c 离心 1 0 m i n ， 用 磷酸盐 缓冲液 r 0 . 1 m k h 2 p 0 4 ,0 .5 m m m g s o 4、 0 . 1 m m wc l z . p h值为7 .0 ) 洗涤 沉 淀 两次， 然后 将菌 体 沉淀 溶于 上 述磷酸盐 缓冲 液中， 分别于5 c , wc , 2 5 c , 3 5 0c , 4 5 c , 5 5 c , 6 5 c , 7 5 下 处理1 0 m i n ,用超声波仪进行细胞破壁按前述方法测定酶活。2 ) 0 一 半乳糖昔酶对p h值的稳定性 前处理方法与1 ) 相同， 将所得菌体沉淀溶于p h分别为4 .0 , 4 . 5 , 5 . 0 , 5 - 5 , 6 _ 0 ,6 . 5 , 7 . 0 . 7 .5 , 8 。 、 8 .5 , 9 . 0 , 9 .5 的相同体积的磷酸盐缓冲液中， 用超声波仪进行细胞破壁处理，1 0 mi n后立即测定酶活2 . 2 . 2 . 5酸性条件下发酵剂菌经超声波处理前后s - 半乳糖普酶活力的变化 将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌于w s 液体培养基和m1 7 液体培养基中培养 ( 3 7*c , 2 4 h r ) ， 于 4 c 一 f i l ，0 0 0 x g离 心 1 0 m in , 用磷酸盐缓冲 液 ( 0 . 1 m k h : p 0 4 .0 5 m m m 9 s o 4 、 o . i m m m n c l 2 , p h 值为7 .0 ) 洗涤 沉 淀两 次， 分别 用p h 值为3 .5 , 4 .0 ,4 . 5 的 磷酸盐缓冲液将菌体溶解， 充分混匀后将菌悬缓冲液分成两部分， 一部分先经超声波处理后 ( 2 0 k h z , 1 0 m in ) 后，静止，于0 , 1 、 2 . 3 h r , 3 7 下测定0 - 半乳糖普酶活力， 将另一部分菌悬液先于3 7 下静止培养，于0 . 、2 , 3 h r 侧定0 - 半乳糖昔酶活力 测定前用超声波进行细胞破壁，以释放 s半乳糖昔酶) 。2 . 2 .2 . 6 关键酶形成期的研究川 确定链霉素对几 半乳糖若酶活力的影响 取0 ， 半 乳 糖昔 酶溶于 磷酸盐 缓冲 液 0 . 1 m k h ; p o , . 0 .5 m m m g s o , 、 0 . 1 m h4 m n c l , ,p h = 7 .0 ， 中， 一 部分 加 入l m l 链霉素 溶液 ( i o o o o u / m l ) ， 另 一部 分 加入 相同 体 积的 双 蒸水，按测定酶活的方法分别测定酶活。2 ) 在酸奶样品中添加链霉素 酸奶正常发酵结束后，将其分成两组，一组继续冷却贮存为对照组，另一组添加i o o o o u / m l 的链霉索， 使酸奶样品中的链霉素剂量s 0 0 u / m l 既要保证杀死全部发酵剂菌，又 要低于测定其对0 一 半乳搪昔酶活力 影响时的剂量， 将链霉素与酸奶充分混合后. 冷却硕士学位论文酸 奶 制 品 在 贮 存 过程 中 发 生 后 酸 化 的 机 理 及 控 制 措 施 的 研 究东 韭 空 业 主 全贮 存，比 较两 组酸奶样品 在贮存第1 . 3 . 4 . 6 天的p h值变 化。2 2 .2 . 7 酸奶制品的贮存温度对发生后酸化的影响酸奶制作方法同前，将所得酸奶制品分别于 5 c . 1 5 c . 2 5 c 贮存，分别测定产品贮存第。 天、第1 天、 第3 天、第7 天的p h值。2 . 2 . 2 . 8 防止酸奶制品发生后酸化的控制措施1 ) 对保加利亚乳杆菌进行紫外菌种诱变选育 ( 1 ) 取保加利亚乳杆菌于mr s 液体培养基中( p h = 5 .4 ) 培养2 4 h r , 于5 4 0 0 x g , 5 m i n离心，去 掉上清液后， 加入无菌生理盐水洗涤打散菌体，再离心去掉上清液， 将所得菌体沉淀用无菌生理盐水稀释，制成菌悬液。 ( 2 ) 取 1 0 m l 菌 悬液置于直径9 c m的培养皿中， 放入无菌磁力搅拌子，于 磁力搅拌器上， 选用2 0 w紫外灯，菌悬液距紫外光源3 0 c m( 正式照射前， 先开启紫外灯 1 0 m i n )然后将培养皿盖打开，在搅拌状态下 分别照射 1 m i n . 2 m i n . 3 m i n . 4 m i n ( 3 ) 分别取已经过紫外照射的保加利亚乳杆菌和未经紫外照射的保加利亚乳杆菌 im l , 经适当 稀释分离，采用平皿菌落计数法测定菌数。计算紫外致死率。根据紫外致死率选择适当的照射时间。紫外致死率%未经紫外照射的菌数一 经紫外照射的菌数未经紫外照射的菌数 ( 4 ) 取2 m l 致死率为8 0 -9 0 % 的经紫外照射的变异保加利亚乳杆菌，于m r s液体培养基中 p h = 5 .4 ) 培养6 h r ( 避光培养)