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利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 摘要 针对目前水产品中氯霉素检测限量极低以及发光细菌对环境污染高度敏感的特 点，本文以建立快速、敏感、低成本的氯霉素检测方法为最终目标，以筛选具有发光 性能稳定、发光强度高、易于培养、并对氯霉素高度敏感的海洋发光细菌为出发点， 研究了发光细菌的生长发光性能，建立了利用发光细菌进行水产品中氯霉素痕量检测 的方法，并对氯霉素作用发光细菌机制做了初步的研究。 第一：从青岛近海分离的多株发光细菌中筛选出株对氯霉素敏感的鳆发光杆菌 p h a t a 棚d a g n a 咖iy l 。 该菌株发光稳定，持续发光时间较长，易于培养。该 菌株在2 6 液体培养4 8 h ，发光强度保持在3 0 1 0 e 以上1 8 h 左右。对其进行发光条 件的优化，最适发光的培养条件为：温度2 5 - 3 0 ，摇瓶转速为1 5 0 r m ，初始p n 为 7 5 ，最适n a c l 浓渡为3 - 5 ；最适甘油浓度为0 4 。对e e , , g , , a t 材v l 的趋化性质进 行研究，发现该菌株对氯霉素高度敏感，适合作为检测氯霉素的工具菌株。 第二：构建鳆发光杆菌p d a g n a t h iy l 检测水产品中氯霉素残留的方法体系：接 种单菌落快速培养，制备出适宜检测的菌悬液，在细菌培养液中添加不同浓度的氯霉 素溶液，研究氯霉素浓度与细菌发光强度抑制率之间的关系。通过控制菌体起始发光 强度，菌液与氯霉素作用时间，菌液与氯霉素体积比等建立发光细菌检测水产品中氯 霉素体系。结果表明，菌体的起始发光强度控制在3 o l 矿；菌液与氯霉素的最佳作 用时间为3 0 r a i n ，菌液与氯霉素的最佳体积配比为1 ：1 ，氯霉素浓度与细菌发光强度 抑制率呈良好的线性关系。该方法的线性范围为0 1n g m l - 1 on g m l ，相关系数r 为0 9 8 9 ，该体系对氯霉素的检测灵敏度可以达到0 1n g m l ，可以作为水产品中痕量 氯霉素残留的种快速、灵敏的检测方法。用于水产品的氯霉素加标回收试验，鱼肉 中添加浓度为0 1n g g 1 on g g 时，回收率在4 0 3 4 _ 1 1 4 2 6 之间。 第三：为了更深入研究发光细菌检测法，本文对氯霉素作用发光细菌机制进行了 初步探讨。实验结果表明：低剂量氯霉素( 1r i g m e 以下) 在短效作用时间( 3 0 m i n ) 内影响的p 酬y l , 的发光强度而不是其生长。 关键词：发光细菌；氯霉素；水产品；快速检测；机制 s t u d i e so nt h ed e t e r m i n a t i o no f c h l o r a m p h e n i c o l r e s i d u e si nt h e a q u a t i cf o o d sb yl u m i n e s c e n tb a c t e r i a a b s t r a c t c o n s i d e r i n gt h el o wd c t c 商o nl i m i to fc h l o r a m p h e n i c o l ( c a p ) i na q u a t i cf o o d sa n d h i g h l ys e n s i t i v eo f l u m i n e s c e n tb a c t e r i at oe n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n , t h ee s t a b l i s h m e n to fa r a p i d , s e n s i t i v e , l o w - c o s tm e t h o df o r t h ed e t e c t i o no f c h l o r a m p h e n i c o li sn e c e s s a r y t h i sp a p e re s t a b l i s h e daq = c km e t h o dt od e t e r m i n et h et r a c ec h l o r a m p h e n i c o li na q u a t i c f o o d s t h e nd os o m er e s e a r c ho nt h em e c h a n i s mo f c h l o r a m p h e n i c o lo nl u r n i n e s c e n c e 1 s e v e r a ll u m i n e s c e n tb a c t e r i as t r a i n sw e r es e p a r a t e df r o mt h ec o a s to fq m g d a o t h e n 鲥耐e das t r a j n 用刎拍锄饿删fy l 砌c hi ss e n s i t i v et oc h l o r a m p h c n i c 0 1 t o o p t i m i z et h el u m i n o u sc o n d i t i o n , r e s u l t sa r e ：t h eo p t i i n u n lt e m p e r a t u r ei s2 5 3 0 ；f l a s k s p e e di so fl5 0r m ；k f i f i a lp h i so f 7 5 啦c o n c e n t r a t i o no f s o d i u mc h l o r i d ei s3 - 5 ；t h e c o n c e n w a f i o no f0 y c = i ni s0 4 t h e nd os o m er e s e a r c ho nt h ec h c m o t a x i so f 刷娥留删断y l , o b 捌t h ec o n c l u s i o n ：剧痂删fy li se s p e c i a l l y s e n s i t i v et o 2 s y s t e mc o n s m 枷o n ：ar a p i dc u l t i v a t i o no fs i n g l ec o l o n yw a sa d o p t e dt op r o d u c e at y p e o fl u m i n e s c e n tb , a c t e f i as u s p e n s i o ns u i t a b l ef o rd e t e c t i n gc a pi ns e a f o o d e x p e r i m e r a s i n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m u mi n t e m e t i o nt i m ew a sa p p r o x i m a t e l y3 0m i n u t e s ，t h ei n i t i a l l u m i n e s c e n c eo f p d a g n a t h iy lw a s3 o l o s ，t h eo p t i m u mv o l u m er a t i oo f t h eb a c t e r i a s u s p e n s i o n t ot h ec a ps o l u t i o nw a s1 ：1f o rt h e i ri n t e r a c t i o n s u n d e rt h es y s t e mc o n d i t i o n s ， t h ei n h i b i t i n ge f f e c t so f c a po nl u m i n e s c e n tb a c t e r i ap r e s e n t e dg o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i p ， t h el i n e rr a n g ew a sf r o m0 1n g m lt o1 0r i g m ew i t hi 誓o f0 9 8 9 t h es e n s i t i v i t yo f t h i ss y s t e mi nd e t e c t i n gt r a c ec a pc a nr e a c ho 1 n g m l t h es y s t e mc a nb eu s e da sa r a p i d a n dc o n v e n i e n ts c r e e nm e t h o df o rd e t e c t i n gc a pi ns e a f o o d t h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e l g 4 0 3 4 0 0t o11 4 2 6 w h e ns a m p l e s 旧陀s p i k e dw i t h0 1 n g gt o1 0 n g g 3 s o m er e s e a r c hw a sd o n eo nt h em e c h a n i s mo fc h l o r a m p h e n i c o lo nl u m i n e s c e n c et h e r e s u l t sa r c ：t r a c ec h l o r a m p h e n i c o l ( b e l o w1 0n g m l ) i n f l u e n c e dt h el u m i n o u si m e n s i 缈 k e yw o r d s ：l u m i n e s c e n tb a c 蚓a ；e h l o r a m p h e n i c o l ；a q u a t i cf o o d s ；r a p i dd e t e c t i n g ； 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得l 洼! 垫遗耋墓 丝重要鳖别壅明的：奎迎窒2 或其他教育机构的学位或证书使罔过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作槛名：书眵昀签字日期：山以午f 月圬日 j 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。( 保密 的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作撇：乏泌研 导9 嗽： 签字醐：狮降期江日 签字日期：方年妇蜥 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 o 刖舌 0 1 我国水产品行业现状及安全质量现状 改革开放3 0 年以来，我国水产业发展迅速，养殖规模不断扩大，养殖品种 增多，产量迅猛增大，经济效益和社会效益显著增加，我国已经成为一个水产 大国。水产品总量大幅增长，综合效益明显增强。据农业部预计，2 0 0 7 年中国 水产品总量可达5 4 7 0 万吨，渔业产值超过4 9 8 0 亿元，渔民人均纯收入可达6 5 0 0 元，同比增长5 3 。随着我国水产品产量的增加，我国水产品国际贸易量也在 持续增长，2 0 0 7 年我国水产品出口额达9 7 4 亿美元，我国水产品出口已连续六 年居世界首位，约占世界水产品贸易总额的十分之一。水产品出口也从改革开 放初期的年均四五千万美元上升到2 0 0 7 年的9 7 4 亿美元，年均出口额增速高 于同期农产品出口额增速近5 个百分点。从2 0 0 2 年起，我国水产品出口跃居世 界首位，约占世界水产品贸易总额的1 0 。水产品进口量从5 8 万吨增加到 3 4 6 4 万吨，增长了5 9 倍，年均增长1 7 。可见，水产品及水产品加工是我国 农业的一个重要组成部分，在国民经济中占有较为重要的地位。 2 0 0 7 年，质量安全问题和国际贸易保护主义以及由此引发的贸易争端依然 是影响我国水产品出口最突出、最根本的问题。2 0 0 7 年在国务院产品质量和食 品安全专项整治领导小组的统一领导下，农业部开展了包括水产品在内的农产 品质量安全专向整治行动，水产品质量安全水平得到显著提升。 o 1 1 水产品安全现状一药物残留现状 近年来，随着经济的高速发展，由于实施高密度饲养以及过度投饵，施肥， 再加上池塘老化和受工业废水污染以及自然灾害影响，全国水产病害相当严重。 据统计，2 0 0 3 、2 0 0 4 年水产养殖病害损失分别为1 1 1 2 5 亿元和1 5 1 4 4 亿元， 为预防和治疗水产动物疾病，最直接的办法就是使用药物防治n 1 ，因此，在水产 养殖生产中，大量的抗生素及化学药物被广泛应用于水生动物疾病的防治，这 些药物在降低水产动物的发病率与死亡率方面起到了十分显著的作用。在发挥 积极作用的同时，由于药物的滥用、违禁使用也造成了水产品中药物残留问题。 在集约化养殖迅速发展的今天，水生生物疾病的发生更加频繁，药物在水产养 殖上的应用更加广泛，水产品中药物残留问题日益突出。水产品中残留的药物 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 通过食物链进入人体，对人类的健康产生了巨大的潜在威胁。药物残留对人体 的危害主要是慢性、长期和累积性的，主要表现为耐药性反应、变态反应、中 毒反应以及致癌、致畸、致突变作用等嘲。因此，药物残留问题越来越受到各国 农业部门及卫生部门的高度重视，氯霉素残留问题即为其中的热点之一脚。 o 1 2 氯霉素的残留现状及危害 氯霉素是一种广谱抗生素，对多种病原菌有较强的抑制作用，由于其效高 价廉，曾在水产养殖业中得到广泛应用。但是氯霉素存在着严重的毒副作用， 能引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏症，新生儿、早产儿灰色综合症 等“，低浓度药物残留还会诱发致病菌的耐药性，对人类的健康构成巨大的潜 在威胁哺1 。因此，美国和欧共体已禁止在食用性动物中使用氯霉素，并规定氯霉 素的残留量为零删。中国农业部已将氯霉素从2 0 0 0 年版中国兽药典中删除 1 0 j 。但是，自2 0 0 1 年以来，我国出日水产品频频被进口国检出有氯霉素残留。 2 0 0 1 年4 月，德国雷斯蒂克( r i s i t i c ) 公司对我国浙江舟山地区出口的中国红虾 查出氯霉素残留不符合欧盟标准。2 0 0 1 年9 月底，欧盟因氯霉素残留问题将中 国冻虾产品纳入其食品快速预警机制。1 1 月欧盟派专家来我国考察药物残留控 制体系之后得出结论：“目前中国无法向欧盟充分保证向欧盟出口的动物源性食 品不含有害兽药残留和其它有害物质”。2 0 0 2 年1 月2 5 日做出禁止进口我国动 物源性食品的决定，之后，欧盟又相继查出了我国福建省出口的鳗鱼、江苏省 出口的淡水小龙虾也存在氯霉素残留n 引。 由于欧盟禁令，美国、日本等国已高度关注我国出口水产品的质量，2 0 0 2 年1 月，美国f d a 也对我国虾类产品发出预警通报，并发文再次强调禁止在动 物源食品中使用氯霉素、磺胺类等1 1 种药物o ，2 0 0 2 年5 月2 4 日，美国路易斯安 娜州农林部通过紧急法案，对中国进口的所有小龙虾和虾类产品进行氯霉素检 测：接着，美国佛罗里达州检出中国虾类含氯霉素：2 0 0 2 年3 月中旬，日本厚生 省宣布对我国动物产品实施严格检查，并公布了包括氯霉素在内的11 种药物的 残留限量n 饥。不仅给我国经济造成了巨大损失，还严重损害了我国水产品在 世界贸易中的形象。 目前，我国农业行业标准一水产品中氯霉素残留量的测定n 幻方法的最低检测 2 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 限为o 3ug k g ，已不能满足当前国际上残留限量的要求。检测部门多借鉴畜 产品的检测方法或参照国外资料进行检测，而国内文献报道的水产品中氯霉素 的检测方法多为高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱一质谱联用法或者酶联 免疫法n 1 ，操作繁琐，检测成本高。为提高我国水产品质量、增加出口、保护 消费者的身体健康，建立灵敏度高、准确可靠的氯霉素检测方法已成为当务之 急。 0 1 2 1 氯霉素的理化性状 氯霉素( c h l o r a m p h e n i c o l ，c a p ) 是于1 9 4 7 年从委内瑞拉链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sv e n e z u e l a ) 的培养滤液中分离出的结晶性抗菌素。1 9 4 8 年用化 学方法合成成功，是第一个采用化学合成法生产的抗生素，1 9 4 9 年广泛用于临 床。氯霉素为一种广谱抗生素，化学名称为：o - 苏式- i - 对硝基苯基一2 一二氯乙酰 胺基一1 ，3 一丙二醇瞳。分子式：c 。h 。c 1 2 n 。0 5 ，分子量：3 2 3 1 3 。纯品氯霉素为中性 的白色或微带黄绿色针状、长片状结晶或结晶性粉末，味极苦，熔点为1 4 9 - - - , 1 5 1 【捌，其化学结构式如下： 吣 o h i | 0 0 图肛1 氯霉素分子结构式 f i go - lm o l e c u l a rf o r m u l ao fc h l o r a m p h e n i c o l 氯霉素的化学性质极为稳定，在干燥状态下一可保持抗茵活性达5 年以上。 p h2 - - 9 时对氯霉素水溶液的效价无影响，p h1 0 以上则可失去活性。氯霉素略 溶于水，在水中的溶解度为0 2 5 m g m l ，但易溶于有机溶媒如甲醇、乙醇、丁醇、 丙酮、乙酸乙酷、丙二醇等，在乙醇中的溶解度可达4 0 0 m g m l ，稍溶于乙二醚， 不溶于苯及石油醚。其水溶液稳定，可冷藏保存几个月，煮沸5 小时也无改变1 。 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 o 1 2 2 氯霉素的抗菌作用 氯霉素为一种广谱抗生素，一般而言，氯霉素对革兰氏阴性细菌的作用较 革兰氏阳性细菌的作用强。 细菌对氯霉素有发展缓慢的耐药性，其耐药性的产生是通过基因的突变或 耐药因子的转移。具有耐药因子的细菌可产生乙酰转移酶使c a p 乙酰化而失效 【纠】 o 氯霉素在临床上主要用于防治幼畜副伤寒、幼畜白痢、牛巴氏杆菌病、幼 畜肺炎及家畜的肠道感染、尿路感染、呼吸道感染和鸡白痢、鸡伤寒、禽霍乱 等。外用对牛乳腺炎、子宫炎、传染性角膜炎、羊腐蹄病有效。水产养殖中主 要用来治疗常见养殖鱼类弧菌病、竖鳞病、红鳞病：鳗赤鳍病、红点病、爱德华 氏菌、烂尾病等：海水鱼类的弧菌病、腹胀满病、类结节症以及诺卡氏菌症等： 鳖腐皮病、红脖子病、穿孔病、赤斑病等：虾爆发性出血症、弧菌病、红腿病等、 蟹黑鳃病、水肿病、稚蟹爆发性流黑鳃病等嘲。 0 1 2 3 氯霉素的各种副反应 氯霉素引起的副作用有以下几方面汹1 ： 1 ) 对血液系统的影响 氯霉素对血液学方面的毒性表现为与剂量有关、呈可逆性的骨髓抑制或少 见的与剂量无关、不可逆的再生障碍性贫血。 骨髓抑n - 往往与氯霉素的血药浓度有关，血药浓度超过2 5ug m l 及长期 应少目时即易出现与剂量有关的造血抑制。 再生障碍性贫血：与剂量大小和疗程长短无关，但偶可继发于有明显骨髓 抑制而未及时停药者。临床表现为皮肤粘膜癖点、癖斑、苍白、咽痛、黄疽、 高热等，应用氯霉素后再生障碍性贫血的发生率估计为1 ：4 0 0 0 0 ，一旦发生， 则难逆转，死亡率可高达5 0 ，少数可发展为粒细胞性白血病。此反应原因可能 是某些人群存在遗传性体质异常，其骨髓造血细胞有某种代谢缺陷，因而对氯 霉素分子中硝基苯基团的作用特别敏感。 白血病：氯霉素引起的严重骨髓损害者中少数幸存者可能逐渐进展至粒细 胞性白血病。可能由于氯霉素促进了非整倍细胞系列的发育，最后发展成为白 血病，以儿童或5 0 7 0 岁的老年患者中多见。 4 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 2 ) 灰婴综合症 1 9 5 9 年首次报道，主要发生在早产儿及新生儿，是由于应用大剂量氯霉素 后血药浓度异常增高所引起的循环衰竭，偶尔亦可发生在低剂量治疗时。 3 ) 神经系统 氯霉素偶可引起视神经炎、球后视神经炎及视力障碍，并发展至视神经萎 缩和失明。 4 ) 变态反应 氯霉素的变态反应极少，可表现为各种皮疹、药物热、血管神经性水肿等， 直接接触可发生接触性皮炎或接触性结膜炎。 5 ) 其他 口服氯霉素可以引起消化道症状：食欲减退、恶心、腹泻、口角炎、口腔苦 味等，但胃肠道反应较少见。 0 1 3 国内外对水产品中氯霉素残留检测方法的研究现状 氯霉素的检测方法分为传统微生物法、免疫分析方法、色谱法和其他方法。 0 1 3 1 传统微生物法检测氯霉素 主要原理是样品中如有残留抗生素残留，则对培养基中的细菌产生抑菌圈， 根据抑菌圈的有无及大小来判定结果，采用不同的实验菌，可检测不同的抗生素 残留。目前微生物法主要有棉签法、杯碟法、纸片法等。适用于食品中抗生素 的初步筛选。 0 1 3 2 免疫分析方法检测氯霉素 免疫分析法是以抗原与抗体特异性结合反应为基础的分析技术。包括酶联 免疫吸附实验( e l i s a ) 嘲、放射免疫法( r i a ) 嘲、固体免疫传感器等。目前使用 最普遍的是e l i s a ，e l i s a 是基于抗原和抗体反应而建立的，由于氯霉素是半抗 原，不能刺激机体产生抗体。要使半抗原性物质具有免疫原性，就需使其与大分 子载体物质( 蛋白质) 相结合制备人工抗原，而后将其作为抗原进行使用，动物体 内即可产生相应特异性的抗氯霉素的抗体。在此基础上建立酶联免疫竞争法测 定氯霉素含量。 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 0 1 3 3 放射免疫法( r i a ) 检测氯霉素 a r n o l d 和s o m o g y l 畸1 建立了放射免疫分析检测方法。该方法灵敏度高，最 低检测限为2 0 0 n g k g ，适用于肉蛋奶中氯霉素的筛选。但该法具有同位素半衰 期短、存在放射性污染及需要复杂仪器设备等缺点，应用范围受到限制。 o 1 3 4 色谱技术检测氯霉素 色谱技术包括高效液相色谱法和气相色谱法在氯霉素残留检测方法上正 在由各种分析技术联用代替单一的色谱技术。目前检测氯霉素的联用技术有液 相色谱质谱联用( l c - m s ) 嘲、气相色谱质谱联用( g c m s ) 嘲、高效液相色谱光阵检 测器、气相色谱电子捕获检测器( g c - e c d ) 等，l c m s 现在已进入实用阶段，是美国 f d a 推荐使用的氯霉素确证方法。色谱方法可检出样品中的痕量污染物，具有检 测限低、精确度高等特点，但是存在着操作复杂、时间长、成本较高的问题， 尤其不适宜作为水产品生产流通过程中的现场监测，也无法对污染物质进行生 物危害性评估。 0 1 3 5 其它技术检测氯霉素 主要有超临界流体色谱( s f c ) 和毛细管区域电泳( c z e ) 等，s f c 可弥补g c 和 h p l c 的不足，可以方便的连接，但不可能替代这两种。 o 1 3 6 各种氯霉素检测技术的比较 表0 - 1 各种氯霉素检测方法的比较 t a b l e o lc o m p a r i s o no fd i f f e r e n td e t e c t i o n 6 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 0 2 发光细菌 0 2 1 发光细菌简介 图0 - 1 发光细菌 f i g o 1l u m i n e s c e n tb a c t e r i a 发光细菌是指在正常的生理条件下，在细菌生长过程中伴随有可见荧光发 射的一类细菌，这种可见荧光波长在4 5 0 4 9 0 n m 之间，在黑暗处肉眼可见。这类 细菌绝大部分发现于海洋中，与发光浮游生物同是引起海面发光的原因嘲。 海洋发光细菌多生活在热带和温带海洋中。它们大多是以寄生、共生或腐 生的方式生长在鱼、虾、贝、藻等生物体上，为这些鱼、虾、贝等提供了新的 光源，使它们更有利于觅食和驱敌。一个水母发出的光可让人在黑暗中看清人 的面孔。 海洋发光细菌一般的生活方式可分为四种幽棚1 ：( 1 ) 自由浮游生存在海水 中，密度不高，以海水中的有机物质为生；( 2 ) 附着生存在海洋生物体表，以 海洋生物分泌的有机物质为生，例如鱼类、软体动物、甲壳类生物体表均可分 离出这些发光细菌；( 3 ) 共生于海洋动物的消化道中如许多鱼类的消化道中常 含有大量的发光菌，这些发光菌可随着鱼类的排便而散布到广大的海洋中；( 4 ) 共生于海洋动物的发光器内：许多深海鱼类或软体动物具有发光器用来诱捕或 吸引异性交配，这些生物的发光器共生着大量的发光细菌，宿主提供了安定舒 适的生长环境与养分供发光菌维持生存，而宿主也可透过各种调节与控制的方 式来调节光的开启与强弱，二者之间建立了密切的共生关系，互谋其利。发光 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 细菌属大多为革兰氏阴性、兼性厌氧菌，大小约0 4 - 1 0 1 0 2 5 i lm ；无孢子、 荚膜，有端生鞭毛一根或数根。 表0 _ 2 发光细菌分类 m 出l e0 2t h ec l a s s i f i c a t i o no fl u m i n e s c e n tb a c t e r i a 0 2 2 发光细菌的发光机理 发光细菌的发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同 的，属于酶促氧化反应，是由分子氧作用，胞内荧光酶( l e ) 催化，将还原态的 黄素单核苷酸( f m n h ：) 及八碳以上的长链脂肪醛( r c h o ) 氧化为f m n 及长链脂肪 酸，同时释放出最大发光强度在波长为4 5 0 - - - 4 9 0 n m 的蓝绿光。发光细菌的发 光原理及电子转移方程1 如下。 8 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 n a d p h 荧光色素酶 o 0 2 + 醛 激活的荧光色素酶 荧光色素酶+ 光 图0 - 2 发光细菌电子流转移途径 f i 9 0 - 2t r a n s f e ro fe l e c t r o nf l o wo f l u m i n e s c e n tb a c t e r i a 荧光素酶 f m n h 2 + r c h o + 0 2 i _ f m n + r c 0 0 h + h 2 0 + h v m + n a d h 脱氢酶 n a d h 2 + f m n n a d + r m n h 2 图0 - 3 发光细菌发光原理图 f i 9 0 3t h em e c h a n i s mo fl u m i n e s c e n c e 9 几儿v 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 0 3 发光细菌检测水产品中的氯霉素 0 3 1 发展新检测方法的必要性 随着人们环境意识的不断加强，由药物残留引起的食品安全问题也越来越 受到人们的关注。为了保障消费者的安全和健康，提高水产品的质量安全水平， 增强渔业产品的国际竞争力，我国政府已经意识到加强水产品中药物残留监控 的必要性。要建立有效的监测体系，就必须有高效的监测手段和方法，所以针 对药物残留快速检测方法的研究势在必行。 对于环境以及食品污染，传统的分析鉴定手段难以达到实时、迅速、在线 分析的要求。以气相、液相色谱以及分光光度计等仪器分析的方法可检出样品 中的痕量污染物，具有检测限低、精确度高等特点，但是存在着操作复杂、时 间长、成本较高的问题，尤其不适宜作为食品生产流通过程中的现场监测，也 无法对污染物质进行生物危害性评估。因此发展新的快速、准确评价各类污 染物的毒性的有效方法显得非常迫切。 0 3 2 发光细菌的自身条件 发光细菌生长初期发光很弱，对数生长中期发光强度达到高峰，稳定期时 发光强度下降。研究发现细菌细胞合成的“自诱导物川蚓( a u t o i n d u c e r ) 在对数 中期大量积累导致发光迅速增强。发光细菌在低密度的菌液中，单个细胞的发 光亮度都很低；但当细胞继续分裂繁殖到达较高密度时，其分泌的小分子“自 动诱导素 ( 可诱导发光反应) 也逐渐累积而提高浓度，于是可加强细菌发光基 因的表现，使每一个细胞的发光亮度突然大幅增加，因此表现出细胞密度提高 与单位发光亮度增加的双重效应。 发光作用是发光细菌正常生理状态下所具有的性质，它是细胞呼吸作用的 副产物，而呼吸作用则是细胞和生物代谢的基本过程，细菌的发光直接和其呼 吸相关，在一定的实验条件下发光强度是恒定的，当细胞活性受到毒性物质作 用后，其活性将受到抑制，从而使呼吸速率下降，进而导致发光降低，样品的 毒性越强，发光细菌的光损失越多，即光强变化的程度与受试物的浓度在一定 范围内呈现相关关系，同时与该物质的毒性大小有关。 o 3 3 发光细菌法检测的优点 发光细菌测试使用了具有发光特性的天然微生物，而有毒的化学物质，重 1 0 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 金属离子，抗生素，化学治疗剂，农药等将抑制其发光，且毒性越强，光抑制 越明显。这一方法实具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠性。 另外，发光细菌本身没有危害性。所以利用发光细菌的发光强度作为敏感的指 标物来监测有毒物质，在国内外越来越受到重视1 。 o 3 4 发光细菌的应用 1 6 7 2 年，r b o y l e 观察到发光的菌体所发出的光易被化学物质抑制；1 9 0 0 年法国生理学家尼d v b o i s - 7 f l j 用发光细菌在巴黎的国际展览会的光学宫殿大厅照 明，这大概是发光细菌最早的应用。其后根据其冷光性，有人提出将其利用于 严防热光的火药库和采矿业中；二战中有应用于灯火标志的记载( h a r v e y ，1 9 5 2 年) 嘲。 上世纪7 0 年代至8 0 年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人 体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体生物毒性，现已成为一种简单、 快速的生物毒性检测手段。8 0 年代初我国引进了这项技术，并先后分离出海水 型和淡水型的发光细菌，用以检测环境污染物的急性生物毒性。 利用发光细菌对氧气敏感发光的性质当氧的浓度为十万分之一时，发 光细菌就能产生可测出的光，将其应用于微量氧气的检测、滤器和滤膜孔径的 测量或裂缝的检查，真空度的测定以及对氧气通过橡胶和其它物质的扩散状况 的测定等口7 1 。 在医药工业上嗍，由于麻醉剂和不少化学药品如乙醚、乙醇等对细菌发光 有影响，发光细菌主要用作抗生素、麻醉剂的检查和毒性实验，以及作为研究 药物作用的模型系统：在生物化学研究中还利用发光细菌制备生物传感器，作 为研究光合作用的材料等，例如利用粗酶制剂( 含二磷酸吡啶核苷酸脱氢酶) 检测d p n h 浓度以及先前酶促反应中被氧化的底物浓度；依d p n h 氧化的速率来测 定草酰乙酸盐。 苹果酸脱氢酶 草酰乙酸盐+ d p n h = 二= 二二= 2 苹果酸盐+ d p n 近年来，利用发光细菌毒性实验检测环境污染物急性毒性备受重视1 ，欧 美国家已经开始利用发光分析来进行食物中金属毒物的快速检测，并e 经进行 了大量的研究应用，多用在环境污染和水质检测中，其原理是：许多金属离子 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 对化学发光反应有明显的催化或抑制作用，且催化或抑制作用的大小与金属离 子的浓度呈一定函数关系。我国于1 9 9 5 年将这一方法列为环境毒性检测的标准 方法( g b t 15 4 4 1 - - 1 9 9 5 ) 。 o 3 5 发光细菌检测水产品中的氯霉素 目前水产品中的氯霉素检测基本上是应用传统的微生物检测、理化检测、 e l i s a 酶联免疫的方法或色谱技术检测。但是每种方法都有一定的局限性，优 缺点见表o 一1 。 目前将发光细菌用于水产品中氯霉素的测定的报道很少，我们根据发光细 菌法检测的检测限低，灵敏度高的特点，建立一种发光细菌检测痕量氯霉素的 方法体系。该体系具有仪器化程度较低，快速，灵敏的特点，可以作为水产品 中氯霉素残留的一种快速、灵敏的筛选检测方法。 1 2 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 参考文献 【l 】杨先乐，我国水产品的药物残留状况及控制对策【j 】，动物保健 【2 】肖培弘，水产养殖药物残留的危害及监控措施【j 】水产科技情报，2 0 0 3 ，3 0 ( 2 ) ：6 8 7 1 【3 】周志峰，水产品中氯霉素的残留与检测叨现代农业，2 0 0 4 ，1 2 ：1 4 - 1 5 【4 】4 a l l e ne d r e v i e wo fc h r o m a t o g r a p h i cm e t h o d sf o rc h l o l a m p h e n i c o lr e s i d u e si nm i l l ( e g g s ， a n dt i s s u e sf r o mf o o d p r o d u c i n ga n i m a l s 闭j a o a c ，19 8 9 ，6 8 ( 5 ) ：9 9 0 - 9 9 9 【5 】c l a r ks b ，b a r r e l lr a ，n a n d r e a , c a ，e ta 1 d e t e r m i n a t i o no fc h l o l a m p h e n i c o lr e s i d u e i n l a wm i l k b yg a s - l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w i t h e l e c t r o n - c a p t u r ed e t e c t o r j l a b o r a t o r y i n f o r m a t i o nb u l l e t i n , 1 9 9 1 ，3 5 ( 2 9 ) ：5 6 - 4 9 【6 】胡项飞，沈建忠氯霉素类抗生素的残留分析【j 】中国兽药杂志，2 0 0 1 ，3 5 ( 5 ) ：5 5 5 7 【7 】f d a n e w s ，j u n e l 4 ，2 0 0 2 ；h t t p ：w w w f d a g o v b b s t o p i c s nw s 2 0 0 2 1 n e w 0 0 8 1 5 h m a l 【8 】r a m o sm m u n o zp a r a n d aa e ta 1 d e t e r m i n a t i o no fc h l o r a r n p h e n i c o lr e s i d u e si ns h r i m p sb y l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y 【j 】jc h r o m ab ，2 0 0 3 ，1 ：1 - 8 【9 】l a v a ng i n k e l ，h j v a nr o s s u m ，e w z 0 0 埘e s ，e ta 1 d e v e l o p m e n tv a l i d a t i o n o fa g a sc h r o m a t o g r a p h i c - m a s ss p e c t r o m e t r i cp r o c e d u r e f o ri d e n t i f i c a t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no f r e s i d u e so f c h l o l a m p h e n i c o l j a n a l y t i c a lc h i m i c a a c t a , 1 9 9 0 ，2 3 7 ：6 1 - 6 9 【1 0 】肖乐氯霉素风波【j 】中国水产, 2 0 0 2 ，7 ：1 2 1 6 【1 1 】李晓川，孔轶群，冷凯良等水产品中氯霉素残留测定方法的分析研究忉海洋水产研 究，2 0 0 2 ，2 3 ( 4 ) ：7 6 81 【1 2 中华人民共和国水产行业标准s c t3 0 1 8 - 2 0 0 4 水产品中氯霉素残留量的测定气相色谱 法【s 】 【1 3 】李鹏，邱月明，蔡慧霞，等气相色谱质谱联用法测定动物组织中氯霉素、氟甲砜霉素和甲 砜霉素的残留量【j 】色谱，2 0 0 6 ，2 4 ( 1 ) ：1 4 1 8 【1 4 】沈美芳，吴光红，费志良，等气相色谱法测定水产品中氯霉素残留前处理方法的比较【j 】水 产学报，2 0 0 5 ，2 9 ( 1 ) ：1 0 3 - 1 0 8 【1 5 】王玉飞，吴开封，李继革食品中氯霉素残留量的定量检测方法研究f j 】中国公共卫生， 1 3 利用海洋发光细菌进行水产品中氯霉素残留检测的方法研究 2 0 0 ，2 0 ( 7 ) ：8 4 7 8 4 8 【1 6 】黄冬梅，于慧娟，李庆，等g c m s 测定水产品中氯霉素的残留量 j 】分析科学学 报，2 0 0 6 ，2 2 ( 1 ) ：6 5 - 6 7 【1 7 】黄志勇，李森，孙茂营，等养殖水产品中氯霉素残留量的高效液相色谱测定方法【j 】食品科 学，2 0 0 5 , 2 6 ( 5 ) ：1 9 1 1 9 4 【1 8 谢守新，林海丹，秦燕，等液相色谱- 电喷雾串联质谱内标法测定水产品中氯霉素药物残留 叨中国卫生检验杂志，2 0 0 6 ，1 6 ( 1 1 ) ：1 2 9 8 1 2 9 9 f 1 9 欧阳立群，吴富忠水产品中氯霉素残留量的高效液相色谱测定们中国卫生检验杂志， 2 0 0 5 ，1 5 ( 2 ) ：1 7 8 【2 0 张胜帮，董十华，刘继东，等酶联免疫检测法测定水产品中残留氯霉素的研究【j 】中国食 品学报，2 0 0 6 ，6 ( 5 ) ：13 3 13 6 【2 1 】王桂枝，石德时，毕丁仁氯霉素在动物性食品中残留的危害【j 】中国畜产与食品，1 9 9 9 ，6 ( 3 ) ： 1 3 2 1 3 3 【2 2 】中国兽药典委员会编中华人民共和国兽药典【m 】北京：农业出版社，1 9 9 0 【2 3 】中国人民解放军兽医大学药理教研室编新编兽药药物手册 m 】吉林：吉林科学技术出版 社，1 9 8 6 【2 4 华南农学院主编兽医药理学【l 川一匕京：农业出版社，1 9 9 0 ，【2 5 】朱模忠兽药手煅【l 嘲北京：化学工业出版社，2 0 0 2 【2 6 】戴自英实用抗菌药物学 m 】上海：上海科学技术出版社，1 9 9 2 ，1 2 ：2 0 8 - 2 1 3 【2 7 】a r n o l d ，d ，a s o m o g y i t r a c ea n a l y s i so fc h l o r a m p h e n i c o lr e s i d u e si ne g g , m i l la n dm e a t ： c o m p a r i s o no f g a sa n dr a d i o i m m u n o a s s a y j a o a c ，19 8 5 ，6 8 ( 5 ) ：9 8 4 - 9 9 0 【2 8 】杜宗军，王祥红，李海峰，等发光细菌的研究和应用【j 】高技术通讯，2 0 0 3 ，1 2 ：1 0 3 1 0 6 【2 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