（食品科学专业论文）噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探.pdf

噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 摘要 细菌胞外多糖是用来研究和制备新型生物寡糖的良好来源，现已发现微生物 胞外多糖通常是由双糖至八糖形成的规则的重复单位构成，而这些重复单位则是 由2 4 种单糖所组成，其中许多糖链上又携带有乙酰、丙酮酸、糖醛酸等特征 基团。这些特点决定了胞外多糖组成和结构的多样化。借助于酶解技术，就为批 量制备这些重复寡糖序列提供了可能性，从而开发出具有新型生理活性的寡糖因 子。本论文以k l e b s i e l l ak 1 3 为出发菌株，噬菌体聚糖酶为工具酶，期望能获得 具有新型生物活性的寡糖组分。 由于胞外多糖产量的大小影响着酶解产物的批量生产。因此本文对影响该菌 胞外多糖产量的培养基及培养条件进行了优化，由单因素试验和正交试验确定了 该菌株发酵产糖的最佳培养基组成及发酵产糖的最佳条件。以发酵基础培养基为 对照，优化条件下对k l e b s i e l l ak 1 3 进行液体培养，其e p s 产量为4 5 9 9 l ，比 对照产量增加了7 3 9 。 对专一性侵染k l e b s i e l l ak 1 3 的噬菌体p 1 3 的生物学性质进行了初步研究， 结果表明该噬菌体形态近似圆形，大小约2 3 n m ，核酸类型为单链r n a ，核酸长 度大于1 5 0 0 0 b p ；该噬菌体的噬菌斑为透明规则的圆形，外围为由于噬菌体聚糖 酶释放所形成的半透明环，效价为2 o 1 0 y p f u m l ，对宿主细胞的裂解稳定性好， 感染宿主菌k l e b s i e l l ak 1 3 的潜伏期及爆发期较短。 对噬菌体p 1 3 所分泌的噬菌体聚糖酶降解胞外多糖的反应条件进行了优化， 结果表明反应温度为4 8 c 、胞外多糖浓度为1 、反应液初始p h 值为6 5 、反应 时间为2 h 及酶液浓度为原液的4 倍时该酶降解胞外多糖的活力最高，寡糖的得 率约为2 5 。 在寡糖的生物活性研究方面，采用体外分析方法对获得的酶解产物进行益生 元活性和抑菌作用的研究，并选择了其它几种寡糖作比较。结果表明，k l e b s i e l l a k 1 3 寡糖( k o s ) 的p i 值较高、产气量低、短链脂肪酸含量一般但种类较多，较 适合作为益生元；对寡糖抑菌作用的分析表明，与o h 的细菌数相比，寡糖k o s 对大肠杆菌0 1 5 7 的抑制作用及对乳酸菌的促生长作用很明显，对单增李斯特菌的 l v 抑制作用不明显，对沙门氏菌的生长有一定的促进作用；对大肠杆菌0 1 5 7 、沙门 氏菌的抑菌作用及对乳酸菌的促生长作用，寡糖k o s 优于葡萄糖。目前尚没有关 于此寡糖相关活性方面的报道，通过该研究丰富了当前寡糖的应用前景。 在寡糖结构分析方面，以酶解产物为研究对象，经分离纯化制备出五、十、 十五糖，借助于一级质谱确定了各片段的分子量大小。结合红外光谱，核磁共振 图谱及气相色谱等初步确定了寡糖的结构框架。试验表明利用噬茵体聚糖酶降解 胞外多糖后得到的酶解产物易于分析、产物组成简单、结果重复性非常高，是我 们研究细菌胞外多糖结构的一种理想的工具酶。 关键词：k l e b s i e l l ak 1 3 ；培养条件优化；噬菌体聚糖酶；生物活性；寡糖结构 分析 v c h e m i c a la n db i o l o g i c a lp r o p e r t i e so nt h e b a c t e r i o p h a g e b o r n eg l y c a n a s ea n di t sh y d r o l y s a t e s a b s t r a c t e x o p o l y s a c c h a r i d e ( e p s ) o fb a c t e r i ai saf a v o r a b l es o u r c ef o rt h ep r e p a r a t i o no f n e w t y p e o l i g o s a c c h a r i d e s w i t h s p e c i a l b i o a c t i v i t i e s g e n e r a l l y , e p s o f m i c r o o r g a n i s mw a sc o m p o s e do fd i s a c c h a r i d et oo c t a s a c c h a r i d er e p e a t i n g u n i t s t h e r e p e a t i n g u n i t sc o n s i s to ft w ot of o u rm o n o s a c c h a r i d e s ，s o m eo ft h es u g a rc h a i n s t r u c t u r e sc o n t a i n i n gc h a r a c t e r i s t i cf u n c t i o n a lg r o u p s ，s u c ha sa c e t y lg r o u p ，a c e t o n e a c i do ru r o n i ca c i d s ot h ec o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r eo fe p sa r e v e r yd i v e r s i f o r m b y m e a n so fe n z y m eh y d r o l y s i s t e c h n o l o g y , o l i g o s a c c h a r i d e sw i t hn o v e lb i o l o g i c a l a c t i v i t yc a nb ep r o d u c e d i nt h i sw o r k ，w et r i e dt op r o d u c ee p sf r o mk l e b s i e l l ak13 ， a n du s e d b a c t e r i o p h a g e b o r n eg l y c a n a s e a st o o l e n z y m e t oo b t a i nn e w o l i g o s a c c h a r i d e sw h i c hm a yp o s s e s ss o m en o v e lb i o l o g i c a la c t i v i t i e sa n da p p l i c a t i o n p o t e n t i a li nt h ea r e ao fp r e b i o t i c sa n da n t i h a r m f u lb a c t e r i af a c t o r s a tt h eb e g i n n i n go ft h i sw o r k ，t h em e d i u mc o m p o n e n t sa n dc u l t u r ec o n d i t i o n s f o rt h ep r o d u c t i o no fe p sf r o mk l e b s i e l l ak 13a r eo p t i m i z e d r e s u l t ss h o w e dt h a t e p sy i e l dr e a c h e d4 5 9 9 l ，i m p r o v e d7 3 9 c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 b i o l o g i c a lp r o p e r t i e so fp 1 3w e r es t u d i e d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ev i r u sp a r t i c l e a p p r o x i m a t e dt or o u n d ；2 3 n mi ns i z e t h en u c l e a ra c i dt y p eo ft h ep h a g ei ss s r n a a n dl o n g e rt h a n15 0 0 0 b p t h ep l a q u eo nt h es o l i dp l a t ei sr o u n da n dh y a l i n e ，a r o u n d o fw h i c hi sh a l o ，f o r m e db yt h er e l e a s e dg l y c a n a s ef r o mb a c t e r i o p h a g e t h ep h a g e t i t e ri s2 0 x10 9p f u m l ，a n dt h es t a b i l i t y ，l a t e n c ya n db u r s t p e r i o dt oi n f e c th o s tc e l la r e g o o d t h er e a c t i o nc o n d i t i o n so fg l y c a n a s e d e g r a d i n ge x o p o l y s a c c h a r i d ea r e o p t i m i z e d r e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s ：r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，4 8 c ；c o n c e n t r a t i o n o fe p s ，1 ；t h ei n i t i a lp h ，6 5 ；r e a c t i o nt i m e ，2h o u r s ；c o n c e n t r a t i o no fg l y c a n a s e ，4 t i m e so fs t o c ks o l u t i o n t oe v a l u a t et h ep r e b i o t i ce f f e c ta n db a c t e r i o s t a s i so ft h e s e o l i g o s a c c h a r i d e s ， v i s t a t i cb a t c hc u l t u r ef e r m e n t a t i o n nv i t r ow a sa p p l i e dt oe x a m i n et h ee f f e c to fk o s ( o l i g o s a c c h a r i d e sf r o mk l e b s i e l l ak i3 ) ，c h o o s i n go t h e ro l i g o s a c c h a r i d e sa sc o n t r 0 1 i nc o m p a r i s o nw i t ht h eo t h e rt e s t e ds a m p l e s ，p iv a l u eo fk o sw a st h eh i g h e s t ，g a s p r o d u c t i o nw a sv e r yl o w ；s c f ay i e l do fk o sw a sm e d i u m ，b u th a v i n gm a n yt y p e s i t i n d i c a t e dt h a tk o sc a nb ea g o o dp r e b i o t i c i na d d i t i o n ，k o sh a dam a r k e di n h i b i t i o n e f f e c to nec o i l 0 1 5 7 ，b u to p p o s i t et os a l m o n e l l aa n d l a c t o b a c i l l u s g r o w t h p r o m o t i n g e f f e c to fk o so nl a c t o b a c i l l u si su s e f u lt ou s a tp r e s e n t ，t h e r ea r ef e w r e p o r t so l lt h e r e s e a r c ho fb i o l o g i c a la c t i v i t yo fo l i g o s a c c h a r i d e sf r o mb a c t e r i a le p s t h i ss t u d y e n r i c h e st h ea p p l i c a t i o np r o s p e c to fk o sa n do t h e ro l i g o s a c c h a r i d e s t os t u d yt h es t r u c t u r eo fo l i g o s a c c h a r i d e s ，e p sw a sd e g r a d e db yb a c t e r i o p h a g e - b o r n eg l y c a n a s e e n z y m eh y d r o l y s i sc o m p o n e n t sw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e db y p a s s i n gt h r o u g hb i o g e lp 4c o l u m n m o l e c u l a rw e i g h t so ft h ep u r i f i e df r a c t i o n sw e r e d e t e r m i n e db ye s i c i d m s a s s i s t a n c eo ft h ei n f o r m a t i o nf r o mg c ，i ra n dn m ro f e p sa n do l i g o s a c c h a r i d e s ，t h es t r u c t u r e sw e r e a n a l y z e d s ot h e s t r u c t u r eo f o l i g o s a c c h a r i d e sc o u l db ep r i m a r i l yi l l u s t r a t e d ac o n c l u s i o nc o u l db ed r a w nt h a tt h e b a c t e r i o p h a g e b o m eg l y c a n a s ec o u l db eu s e da sag o o dt o o lf o rt h ep r o d u c t i o no f n o v e lo l i g o s a c c h a f i d e sf r o mb a c t e r i a le p s k e y w o r d s ：k l e b s i e l l ak 1 3 ，c o n d i t i o no p t i m i z a t i o n ，b a c t e r i o p h a g e - b o r n e g l y c a n a s c ，b i o a c t i v i t y , s t r u c t u r ea n a l y s i s v l l 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 (或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：南禾孝钆签字日期：砷年多月g 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名： 卉车划 签字日期：矽7 年占月g 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： v 电话： 邮编： $ 日 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 u 月i j 吾 微生物多糖主要是指大部分细菌、少量真菌和藻类产生的多糖。微生物多糖 因其安全性高、副作用小、理化特性独特等优点使其在食品、化工等领域备受关 注，尤其在医药领域具有巨大的应用潜力。细菌多糖作为微生物多糖中的一种， 由于可在较短时间内可以合成大量的胞外多糖，且具有较简单的重复结构，为研 究多糖的结构及生物活性提供了理想的模型，所以近年来备受青睐。 利用酶法降解多糖制备小分子量寡糖的方法分析胞外多糖结构也是研究者 较常用的方法之一。长期以来，人们就利用噬菌体聚糖酶为工具酶，结合n m r 、 红外光谱、甲基化等技术，对细菌胞外多糖的结构进行研究。如克雷伯氏菌，目 前已经发现了2 0 多种侵染不同血清型克雷伯氏菌的噬菌体，利用这些噬菌体所 分泌的酶对克雷伯氏菌的胞外多糖进行降解，进而分析糖链结构。此外，酶法制 备的寡糖因其产品质量稳定、得率高、生物学活性多样，同时细菌胞外多糖容易 收集和纯化，所以为未来研究和批量制备有效药物和食品功能因子提供了丰富的 原料。 o 1 细菌胞外多糖的分类 胞外多糖( e x t r a c e u u l a rp o l y s a c c h a r i d e s ) 简称e p s s ，是指广义的细菌胞外多糖， 即细菌细胞外的含多糖的结构，包括革兰氏阴性菌细胞膜外的多糖成分以及革兰 氏阳性菌的肽聚糖【l 】。按照胞外多糖在基质中存在的状态，通常将其分为两个部 分：荚膜多糖( c a p s u l a rp o l y s a c c h a r i d e s ，简称c p s s ) 和一部分混合的多糖( m i x e d g r o u po fp o l y - - s a c c h a r i d e s ，简称p s s ) ，该部分与细胞膜松散结合甚至根本不结 合，主要是一些粘液和e p s s 。c p s s 和e p s s 是很难区分的，因为c p s s 通常会失 去与细胞膜的结合而溶到介质当中【2 】。 通常，革兰氏阳性菌的胞外多糖很复杂，而革兰氏阴性菌胞外多糖的结构相 对比较简单，通常是同多糖( 一般是由d 葡聚糖组成) 或杂多糖。杂多糖通常是由 双糖至八糖形成的规则的重复单位构成，而这些重复单位则是由2 4 种单糖所 组成，其中许多糖被乙酰基团所修饰。最常见的乙酰基团是乙酸酯和丙缩酮，但 有些e p s 则具有琥珀酰半缩酯等f 3 1 。 o 2 细菌胞外多糖的合成 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 在细菌胞外多糖合成的过程中，有些细菌在其生长的全过程均能分泌e p s ， 而有些细菌则只在其对数生长期和稳定期分泌。胞外多糖在营养不平衡( 如，高 的碳氮比) 和较低培养温度的条件下有利于其合成，通气量、离子浓度对其合 成也会造成影响【4 j 。细菌胞外多糖的合成机制不是完全相同的，一些革兰氏阳性 菌其胞外多糖多聚物是在细胞表面或在溶媒中生成的，而且在同聚物的生成过程 中也不需要核苷酸二磷酸糖前体和脂类载体的参与，但它们需要外源的蔗糖或其 它双糖作为糖基供体【5 1 。而革兰氏阴性菌胞外多糖( 包括杂多糖和同多糖) 的合成 则是在细胞内合成的，且核苷酸二磷酸糖起了关键作用。核苷酸二磷酸糖不仅提 供了活化的同多糖，而且使得菌体内的各种同多糖通过差相异构、脱氢、脱羧反 应相互转化。胞外多糖的合成，首先是同多糖的激活，其激活是通过糖核苷酸来 实现的；接下来是单糖有序地加到类异戊二烯酯上，形成重复单元，与此同时加 入乙酰基团( 如果有乙酰基团存在) ；在重复单元形成多聚物后经由细胞壁或细胞 膜复合物分泌到外环境中。高度特异的糖载体，影响同多糖和乙酰基团向位于原 生质膜上的类异戊二烯酯受体的转运，而类异戊二烯酯的活性则是合成胞外多糖 的关键所在。因而低的培养温度和低的生长速度，使得更多的类异戊二烯酯受体 用来合成胞外多糖【6 】。 0 3 细菌胞外多糖一级结构分析技术 多糖一级结构的分析方法很多，主要分为三类：化学方法、仪器分析方法和 生物学方法。目前多采用的是将三者结合起来进行多糖结构的分析。多糖一级结 构的分析包括对单糖组分、糖基连接方式、糖苷键的构型及不同糖苷键组成比例 等的分析。在单糖组分分析中，一般常采用将多糖完全水解，然后进行气相色谱 分析；在糖基连接方式的分析中，常采用化学方法或仪器分析法，如甲基化、高 碘酸氧化法、s m i t h 降解法和核磁共振波谱法等。对于糖苷键构型的研究，可采 用糖苷酶水解、质谱、核磁共振等；红外光谱法也是分析多糖一级结构的非常必 要的仪器分析手段，可用它来判断吡喃环或呋哺环的形式。此外，还有很多高效 准确的方法来分析多糖的一级结构，如毛细管电泳、快原子轰击质谱等方法。 0 3 1 化学方法 化学降解的方法是分析多糖一级结构比较基础且经典的方法，具体包括部分 酸水解、过碘酸氧化、s m i t h 降解、乙酰解、三氧化铬氧化和甲基化分析等。 2 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 部分酸水解通常是采用有机酸或稀盐酸，使大分子物质水解得n d , 分子片 段，结合仪器分析进而确定糖的组成和含量；过碘酸氧化法是采用过碘酸或过碘 酸盐选择性的切断邻二羟基，然后用乙二醛或甲酸氧化，通过测定过碘酸的消耗 量及产物的种类来推测糖的连接位点和方式；s m i t h 降解包括氧化、还原、轻度 酸水解，它是过碘酸氧化的改进和扩展；甲基化分析是用完全甲基化的糖完全水 解后还原乙酰化，g c m s 分析产物结构，根据产物中乙酰基和甲基的取代位置 推断糖链的连接方式。 o 3 2 电泳方法 用于分析寡糖结构的电泳方法很多，如毛细管电泳【7 1 、利用十二烷基磺酸 钠聚丙烯酰胺凝胶电泳聚偏氟乙烯薄膜电迁移技术8 1 、荧光基团辅助的糖电泳 1 9 、1 0 】又称荧光基团标记的糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳【1 1 1 等。 o 3 3 酶学方法 糖苷酶现在已经成为糖序列分析中常用的工具酶，它们分别对于不同的糖 基、连接方式和不同的异头碳立体构型具有专一性。糖苷酶分内切型和外切型， 内切酶可以选择性的切断糖链内某种糖苷键，使复杂分子变成简单的小分子片 段；外切酶可以从一端逐个切下单糖，根据单糖的种类可以判断出该糖与糖链的 连接位点及连接的立体构型，从而获得糖链的分子结构。此外，噬菌体聚糖酶作 为一种新型的工具酶也日益受到人们的重视，噬茵体聚糖酶在通过内切作用降解 细菌胞外多糖的过程中，可以释放出其中的寡糖序列。此酶对切割位点具有非常 高的专一性，一种噬菌体产生的聚糖酶不会同时作用于两种不同的多糖结构。 0 3 4 仪器分析方法 o 3 4 1 紫外光谱 由于试验技术的限制，紫外光谱通常是指波长在1 9 0 4 0 0 n m 范围内的近紫 外区光谱，其实它在糖结构分析中用处不大，但是它可以用来判断糖复合物中是 否存在核酸或蛋白质缀合物，通常是在2 6 0 n m 或2 8 0 n m 处扫描检测看有无特征 吸收峰。 o 3 4 2 红外光谱 红外光谱技术在糖结构的研究中有着重要位置。在红外谱图中有许多谱带， 其频率、强度和形状与分子结构密切相关。各类有机化合物含有其特定的功能基， 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 特定的功能基具有特有的红外吸收带，即特征吸收带。习惯上把红外光谱图按波 数范围分为四大峰区，第一峰区( 3 7 0 0 2 5 0 0 c m j ) 为x h 的伸缩振动，第二峰 区( 2 5 0 0 1 9 0 0c m 。) 为叁键和累积双键的伸缩振动，第三峰区( 1 9 0 0 1 5 0 0c m 。1 ) 为双键的伸缩振动及o h ，n h 的弯曲振动。第四峰区( 1 5 0 0 5 0 0c m 。1 ) 又称指 纹区，它是除氢外的( x y ) 伸缩振动及各类弯曲振动，不同结构的同一类化合 物，其红外光谱的差异主要在此峰区。在糖链结构的分析中，红外图谱可以提供 各种官能团和糖苷键的波数范围的糖链结构信息；可用它来判断吡喃环或呋喃环 的形式。 0 3 4 3 质谱 质谱由于其灵敏度高，样品用量小，在寡糖分析中得到广泛应用。它是目 前寡糖序列研究常用且重要的方法之一【1 2 】。近年来，快原子轰击质谱( f a s ta t o m b o m - b a r d m e n t m a s ss p e c t r o s c o p y ，f a b m s ) 、电喷雾电离质谱( e l e c tr o s p r a y i o n i z a t i o n m a s ss p e c t r o s c o p y ，e s i m s ) 、基质辅助激光场解析质谱( m a tf i x a s s i s t e d l a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n m a s ss p e c t r o s c o p y ，m a l d i m s ) 1 1 3 1 等在测定糖的分子量 和糖链的一级结构方面都得到了广泛的应用。本实验所用的是电喷雾电离质谱， 这种方法在分析寡糖组分分子量方面得到了很好的结果。 o 3 4 4 核磁共振 在糖链结构的研究中，核磁共振波谱技术已经发展成糖序列分析中的常规方 法。特别是傅立叶技术的应用促使了碳谱的常规化，使其与氢谱相结合，得以更 好的分析糖链结构。核磁共振波谱仪主要分为脉冲傅立叶变换n m r 仪 ( p f t - n m r ) 和连续波n m r 仪( c w - n m r ) ，两者相比，前者灵敏度可提高 1 0 0 倍，测量速度快( 一次脉冲相当于c w - n m r 的一次扫描) ，且扩大了应用 范围，除常规1 h ，1 3 c 谱外，还可以用于扩散系数、化学交换、固体高分辨和弛 豫时间测定等。随着试验仪器的进步和发展，核磁共振波谱仪成为化合物结构分 析的必备工具。 0 4 寡糖的研究 寡糖是由2 1 0 个单糖组成的一类聚合物，又称低聚糖。根据寡糖的生物学 功能可将其分为功能性寡糖和普通寡糖两大类。功能性寡糖是指具有特殊的生理 学功能，特别是不被人和动物肠道吸收并促进双歧杆菌的增殖，有益于肠道健康 4 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 的一类寡糖，即双歧因子；普通寡糖是那些可被消化吸化、产生能量的一类寡糖， 如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精及麦芽寡糖等。 糖类在生物体中不仅提供基本的能量来源和细胞组成的结构成分，还担负着 多种特殊的生物学功能。寡糖作为人体重要的信息分子，对人类疾病的发生、发 展和预后起着重要的作用，参与到多细胞生命的全部空间和时间过程i l 引。有关 功能性寡糖的研究尽管起步较晚，但发展相当迅速，且前景可观。目前人们已经 在药物、功能食品、植物诱抗剂、促生长剂、化妆品以及饲料等众多领域开展了 对寡糖的开发和应用。借助于化学、物理、生物的各种提取、转化、降解、合成 以及分子修饰等技术，科研工作者仍在从动物、植物和微生物中不断开发各种新 型寡糖，并对其生物学功能及构效关系进行揭示。 o 4 1 寡糖的酶法制备 酶法降解胞外多糖是指利用各种专一性酶类，在温和的反应条件下，以多糖 为降解底物，高度选择性的降解多糖，通过控制反应时间或利用不同聚合度的寡 糖在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异进行分离的方法。酶法降解的难点是如何 针对不同的反应底物分离制备到专一性降解目标多糖的酶，且降解酶的稳定性和 酶活要求较高。 0 4 1 1 噬菌体聚糖酶的特点与应用 噬茵体在自然界分布广泛，更多的存在于相应宿主细菌的栖息环境中，例如 对于肠杆菌科细菌来说，污水和粪水通常是分离噬菌体的最佳来源。o g u n s e i t a n i i 纠 等发现污水中的噬菌体浓度可以达到3 1 6 1 0 6 个m l 。而噬菌体聚糖酶最早在 1 9 5 6 年就被发现可以用于降解细菌胞外多糖【l6 1 。噬菌体在侵染宿主细胞的过程 中，能够产生专一性的聚糖降解酶，将宿主细菌的胞外多糖( e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) 不断降解，逐渐穿过细菌的胞外屏障，达到细胞表面并与细 胞表面受体发生特异性结合，再侵入到细胞的内部【1 7 1 。噬菌体聚糖酶在通过内 切作用降解细菌e p s 的过程中，可以释放出e p s 中的寡糖序列。噬菌体聚糖降 解酶对切割位点具有非常高的专一性，一种噬菌体产生的聚糖酶不会同时作用于 两种不同的多糖结构。不过由于细菌的胞外多糖结构之间偶尔也会存在相同的序 列，可能会被同一种噬菌体聚糖酶所降解，例如克雷伯氏菌( k l e b s i e l l a ) k l1 的噬 菌体产生的聚糖酶除可以降解其宿主的胞外多糖外，还能够降解其它某些血清型 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 的克雷伯氏菌和大肠杆菌( ec o l i ) 某些血清型的胞外多糖【1 引。 从上个世纪6 0 年代，人们就利用噬菌体聚糖酶为工具酶，结合n m r 、红外 光谱、甲基化等技术，对细菌胞外多糖的结构进行研究。以克雷伯氏茵为例，目 前已经发现了多种侵染不同血清型克雷伯氏菌的噬菌体，并利用这些噬菌体对克 雷伯氏菌的胞外多糖结构进行分析，包括克雷伯氏菌k 3 1 1 9 1 ，k 8 2 0 1 ，k 1 0 1 2 1 1 ，k 1 1 四】， k 13 1 2 3 1 ，k i5 1 2 4 1 ，k 191 2 5 ，k 2 2 2 6 1 ，k 2 4 t 2 7 1 ，k 2 5 1 2 引，k 2 6 2 9 1 ，k 3 0 1 3 0 1 ，k 4 0 1 3 1 1 ，k 4 3 1 3 2 1 ， k 4 4 t 3 3 1 ，k 5 4 i 3 4 1 ，k 6 3 1 3 5 1 ，k 6 4 1 3 q 等血清型。 此外，噬菌体聚糖酶还可作为细菌生物膜研究的工具1 3 7 1 。细菌生物膜是自然 界中的一种由多种细菌粘附在一起形成的群体，外面包裹由细菌自身产生的胞外 多糖形成的糖被。这种糖被对于保护细菌免受环境因子如干燥或药物的破坏，以 及贮存养料和离子极为重要f 3 8 】。而细菌生物膜对医学的影响也受到了更多的关 注，因为细菌生物膜是各种细菌相互协调构成的具有高度分化结构的复杂群体 1 3 9 ，这种群体的形成被认为是细菌适应外界环境的重要机制。由于生物膜及其 糖被的存在，给利用药物杀灭致病性微生物带来更大的难度，因此，利用专一性 的噬菌体聚糖酶研究生物膜中糖被的结构，对于明确生物膜细菌的组成及生活习 性，并进而研究出破坏生物膜系统结构以及降低致病菌抗药性的方法，具有重要 意义。 o 4 1 2 利用噬菌体聚糖酶降解细菌胞外多糖 0 4 1 2 1 微生物胞外多糖在寡糖制备中的潜力 细菌胞外多糖是可以用来研究和制备新型生物寡糖的良好来源，因为现己发 现，微生物胞外多糖通常是由双糖至八糖形成的规则的重复单位构成，而这些重 复单位则是由2 - 4 种单糖所组成，其中许多糖链上又携带有乙酰、丙酮酸、糖 醛酸等特征基团。这些特点决定了胞外多糖组成和结构的多样化。借助于酶解技 术，就为批量制备这些重复寡糖序列提供了可能性，从而开发出具有新型生理活 性的寡糖因子。 利用噬菌体聚糖酶对细菌胞外多糖进行降解，可以获得各种结构和组成的新 型寡糖。由于细菌胞外多糖组成的均一性，再加上噬菌体聚糖酶作用方式的高度 专一性，使得酶解获得的寡糖产物能够保持良好的均一性，保证了寡糖产品的质 量和得率【4 0 1 。例如克雷伯氏菌k 1 4 的胞外多糖经相应的噬菌体聚糖酶作用后， 主要水解产物为有分枝的六糖【4 1 l ；克雷伯氏菌k 2 6 的噬菌体产生的聚糖酶为p 一 6 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 半乳糖苷酶，水解宿主细胞的胞外多糖后，可以产生出一种新型的七糖1 4 2 1 。大 肠杆菌4 3 1 、霍乱弧菌( c h o l e r a ) 1 4 4 1 等其它各种细菌的荚膜多糖也能够被相应的噬 菌体降解，产生特殊结构的寡糖。 0 4 1 2 2 利用噬菌体聚糖酶进行寡糖制备的研究方法 细菌胞外多糖通常具有相当高的粘度，由于噬菌体聚糖酶为内切作用方式， 在酶解的过程中，胞外多糖的粘度会在很短的时间内迅速下降，同时释放出的寡 糖会导致反应液中的还原力逐渐升高【4 5 1 ，说明多糖不断被降解，酶解寡糖产生。 将酶解产物经过超滤并浓缩后，冻干，即得到粗寡糖。如果将噬菌体点种到宿主 细胞的培养基平板上，培养2 4h 后，在点种部位由于噬菌体对宿主细胞的裂解， 可以形成明显的噬菌斑。在噬菌斑的外围会形成一层半透明圈，这是噬菌体在生 长过程中不断释放出的聚糖酶导致宿主细胞的胞外多糖发生裂解所致。随着培养 时间的延长，噬菌斑的大小没有明显的变化，而噬菌体聚糖酶却在不停的释放， 使透明圈的直径不断扩大。 0 4 2 寡糖的分离 寡糖的分离方法较多，主要有：石墨化碳柱( g r a p h i t i z e dc a r b o nc o l u m n ，g c c ) 4 6 1 ，高压液相色谱和高效毛细管电泳( h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，h p c e ) 4 8 、4 9 1 ，纤维柱层析、硅胶柱层析、离子交换法层析及凝胶 柱层析等。凝胶柱层析法是2 0 世纪6 0 年代发展起来的一种分离技术，固定相凝胶 具有分子筛的性质。该方法是测定分子量的有效工具，根据糖的分子量范围选择 合适的凝胶，控制洗脱速度，分离效果会很好，特别是当寡糖的分子量相差较大 时，很容易获得纯品。 0 4 3 寡糖的生物学活性 目前对于寡糖生物学活性的研究主要是对一些功能性寡糖及天然寡糖结构 进行改造得到的众多寡糖类衍生物进行的活性研究。不同的寡糖种类和来源决定 了它们特有的生物学活性。 0 4 3 1 作为益生元的开发 益生元( p r e b i o t i c s ) 是指能够选择性地促进机体肠道内原有的一种或有限几 种有益细菌( 益生菌) 生长或其活性的一种非消化性的食品功能因子【4 5 1 。这类 物质最早发现的是双歧因子( b i f i d u sf a c t o r ) ，主要是指各种寡糖或低聚糖，常见 7 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 的有乳果糖( 1 a c t u l o s e ) 、蔗糖低聚糖( o l i g o s u c r o s e ) 、棉子低聚糖( o l i g o f a f f i n o s e ) 、 异麦芽低聚糖( o l i g o m a l t o s e ) 、玉米低聚糖( c o r no l i g o s a c c h a r i d e s ) 和大豆低聚 糖( s o y b e a no l i g o s a c c h a r i d e s ) 等。这些糖类因其结构特异性，既不被人体消化 系统消化和吸收，亦不被肠道有害菌群分解和利用，只能为肠道有益菌群如双歧 杆菌和乳杆菌利用，促进有益菌的生长繁殖，抑制有害菌的生长，从而达到调整 肠道正常菌群的目的。 m o n s a n 4 6 1 等发现，来自乳酸菌胞外多糖的具有均质结构的寡糖具有促进人 体健康的作用，例如，一些果寡糖和葡寡糖能够作为益生元促进肠道有益微生物 的生长。b e l l o l 4 刀等也通过体外实验证明由乳酸菌产生的果聚糖类型的胞外多糖 具有益生元活性。而c i n q u i n t 4 8 】在对三口嘲1 6 口c 川淞r h a m n o s u sr w - 9 5 9 5 m 菌株产生 的胞外多糖进行实验时发现，该多糖不会被婴儿肠道微生物所利用，因此不具有 任何益生元效果。肠道有益微生物能否消化和利用某种多糖或寡糖，与这种多糖 或寡糖的化学组成、结构和聚合度密切相关。目前国外一些研究机构借助于 f i s h 、r e a l - t i m ep c r 等技术，开展了从细菌胞外多糖及其寡糖中广泛筛选益生 元的研究工作。 0 4 3 2 抑菌作用 寡糖对病原菌的抑制作用决定了它在医药领域的应用，尤其是近年来抗生素 的广泛应用导致了病原菌的抗药性，寡糖作为一种新型的非抗生素药物可以替代 抗生素。目前对寡糖抑菌作用研究较多的有壳寡糖、果寡糖和半乳糖苷寡糖等。 s h i n 等酬用分子量为1 8 1 4 d a ，脱乙酰度为8 4 的壳寡糖处理非编织布料，发现 0 0 1 的浓度对普通变形杆菌的抑菌率就达到9 0 ，而对金黄色葡萄球菌、大肠 埃希氏菌需0 0 5 的浓度，对肺炎克雷伯杆菌和铜绿假单胞菌即使浓度达1 0 ， 抑菌率只能达到3 0 。不同的寡糖种类对病原菌的抑制效果是不一样的，这与寡 糖的特异性结构有关。 0 4 3 3 病原菌受体模拟物 寡糖可以用来制备抑制病原菌或其毒素对宿主组织侵染的受体模拟物，被称 为“d e c o y ”寡糖，这些寡糖含有同被侵染的宿主组织相同或相似的结构成分，可 以竞争性地同病原菌或其毒素发生结合，封闭病原菌或其毒素表面的粘附位点， 从而抑制病原菌或毒素对宿主细胞的粘附，达到防止疾病感染的目的。“d e c o y ” 8 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 寡糖的半数抑制浓度( i c 5 0 ) 可以达到几十微摩尔浓度的水平。 以空肠弯曲菌( c a m p y l o b a c t e rj e j u n i ) 为例，该菌致病的第一步是对宿主肠 道粘膜的粘附，其粘附的工具是鞭毛和细胞壁表面的脂多糖( l p s ) 层，这一过程 能够被d 一葡萄糖、d 甘露糖和d 一岩藻糖等多种单糖或寡糖不同程度地抑制【5 5 】； 特别是细菌脂多糖层对宿主粘膜的粘附作用，可以有效的被l 岩藻糖所抑制， 且抑制效果与岩藻糖的作用浓度存在相关性【5 6 ，5 7 1 ，当作用浓度为5 0 m m 时，l 岩藻糖和d 一岩藻糖对空肠弯曲菌的粘附抑制率分别达到5 3 和4 4 。体外实验 还证明，空肠弯曲菌的粘附作用能够被母乳中的仅一1 ，2 岩藻寡糖显著抑制【5 8 ，5 9 1 。 原因在于，岩藻寡糖能够作为一种粘附受体类似物，同位于肠道上皮细胞中的受 体进行竞争，与空肠弯曲菌的粘附受体位点发生结合，从而减少病原菌同肠道上 皮细胞粘附的机会。在对鳗弧菌( 矿a n g u i l l a r u m ) 的研究中，w a n g i 删等也发现， 半乳糖、乳糖和n 乙酰半乳糖胺的存在都可以对鳗弧茵的细胞粘附产生部分抑 制作用。尽管在这些工作中，寡糖对病原菌的粘附抑制率并非1 0 0 ，说明在病 原茵对宿主粘附过程中应该还有其它受体成分参与，但寡糖无疑是参与病原菌组 织粘附的重要受体。因此，努力寻找和发现具有不同结构、组成和连接方式的新 型寡糖，分析他们对肠道病原菌的粘附抑制效果，对于迸一步阐明肠道病原菌的 侵染机理和粘附方式，以促进有效药物的研究与开发无疑具有重要的意义。 0 4 3 4 对植物的诱抗作用 只有一定范围内聚合度的寡糖才具有激发子活性，聚合度太小的寡糖不能诱 导植物产生防卫反应，而太大则由于细胞壁的屏蔽作用无法与细胞膜接触，一般 具有活性的寡糖聚合度在4 1 6 之间。目前已发现的具有诱抗活性的寡糖包括寡 聚葡萄糖、寡聚几丁质及寡聚脱乙酰壳多糖等。据报道，壳寡糖能诱导悬浮的水 稻细胞产生稻保卫素；寡半乳糖醛酸在高等植物中诱导植保素以抵抗真菌和细菌 病原菌的侵入。 0 4 3 5 免疫调节作用 糖链还与自身免疫性甲状腺炎、红斑狼疮等多种自身免疫病有关，肿瘤细胞 的浸润、迁移行为与肿瘤细胞及其基质细胞表面的糖链组成也密切相关，已发现 岩藻糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖及唾液酸等均可参与细胞表面糖特异性受体的 组成。例如在肺细胞表面的q l 一岩藻糖受体在介导细胞间的特异性识别过程中发 9 噬菌体聚糖酶及其酶解产物的化学及生物学研究初探 挥作用，通过添加含岩藻糖的糖蛋白，可以有效地抑制3 l l 肿瘤细胞对肺细胞 的粘附【6 1 】。克雷伯氏菌和大肠杆菌等细菌中，有很多血清型( k 抗原) 的菌株胞外 多糖的重复序列中存在岩藻糖这一组分，如克雷伯氏菌k l 的胞外多糖中含有 f u c a l - 3 g l c 序列，克雷伯氏菌k 6 3 的胞外多糖中含有g a l a l - - - 3 g a l a a l - - - 3 f u c 序列【6 2 1 ，在大肠杆菌k 2 7 ，k 2 8 ，k 4 2 及k 8 7 等多种菌株的胞外多糖中都存在 不同连接方式的岩藻糖成分。 o 5 研究展望 细菌胞外多糖因其来源广，种类多，产量大，质量稳定等优点占据了较强的 市场竞争力和广阔的发展前景。对于细菌胞外多糖的开发利用取决于多糖的生物 学性质或功能特性，这些性质的研究就要进行多糖结构的分析，通过构效关系的 研究开发具有新型功能的产品。目前对于多糖结构的研究主要是通过分析其寡糖 结构进而推断；酶法制备寡糖是现在研究的热点，不断发现新型的降解酶也是研 究的重点。长期以来，人们就利用噬菌体聚糖酶为