（食品科学专业论文）双低油菜籽ACE抵制肽的分离纯化及其性质评价.pdf

江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致， 允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国 学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂 志社将本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。 论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密口。 学位论文作者签名：母万缸 2 0 i l 年多月7 , 日 指导教师签名：与时 2 j ，f 年歹月，z 日 p r o p e r t i e se v a l u a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fa n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t i n gp e p t i d e sf r o m d o u b l el o wr a p e s e e d 姓名 2 0 1 1 年6 月 江苏大学硕士学位论文 摘要 高血压病是当今世界最大的流行病之一，现代研究表明，抑制血管紧张素转 换酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 的活性是治疗高血压的重要途径。 a c e 抑制肽以其天然、无毒副作用的降压功效，成为近年来高血压病研究的一 个热点。 菜籽饼粕是菜籽油生产过程中的副产物，我国每年菜籽饼粕产量居世界第一 位。但是，目前我国对双低油菜籽粕的利用相当有限，仅用作肥料或饲料，造成 了资源浪费。本课题组及其他学者已有的研究表明，通过酶解双低油菜籽粕蛋白 可以释放出具有a c e 抑制活性的多肽，因此在开发降血压健康产品方面具有广 阔的发展前景。 本课题组已经完成了双低油菜籽a c e 抑制肽酶法制备技术的研究。因此就 研究工作的持续开展而言，进一步需要研究的工作包括：( 1 ) 对酶解产物进行分 离纯化，得到高活性的产品；( 2 ) 鉴定酶解产物中含有的高a c e 抑制活性多肽 片段的结构；( 3 ) 评价具有高a c e 抑制活性多肽的性质，为后续降血压健康产 品的开发提供理论依据。 本研究以双低油菜籽蛋白为原料，通过对酶解产物多步分离纯化，制备高活 性双低油菜籽a c e 抑制肽，对其化学结构进行初步鉴定，对高活性双低油菜籽 a c e 抑制肽的性质进行了评价。具体如下： 按照本课题组已经确立的条件，用碱性蛋白酶酶解双低油菜籽蛋白。双低油 菜籽饼粕蛋白经超声( 料液浓度5 、温度2 0 、超声功率6 0 0 w 、每批处理液 1 5l ) 预处理4 0m i n ，用碱性蛋白酶进行酶解，酶解参数为：p h9 0 、温度5 0 、 底物浓度5 、加酶量( e s ) 5 、酶解时间3 0m i n 。在此工艺条件下，酶解产 物的i c 5 0 值为2 0m g m l 。 采用超滤技术对双低油菜酶解产物中的a c e 抑制肽进行了分离提纯研究， 考核了分离参数对分离效果的影响。对于截留分子质量为5k d a 的第一级超滤分 离而言，操作压力为0 5k g c m 2 、多肽液温度为4 5 。c 、多肽液浓度为3 时具有 较高的分离效果；对于截留分子质量为3k d a 的第二级超滤分离，操作压力为 o 7k g c m 2 、多肽液温度为3 5 。c 、多肽液浓度为3 时具有较好的分离效果。在 此超滤工艺参数下，产品的i c 5 0 值下降了1 4 ，为1 7 2m g m l ，活性总回收率 达到7 6 4 4 。 双低油菜籽a c e 抑制肽的分离砘化及其性质评价 采用葡聚糖凝胶层析和离子树脂交换技术对双低油菜籽a c e 抑制肽逆行进 一步分离纯化研究，考核了工艺参数对分离效果的影响。用s e p h a d e x g 1 0 纯化 双低泔菜籽a c e 抑制肽，确定最佳工艺参数为：洗脱剂为蒸馏水，洗脱剂流速 为1 0m l m i n ，样品浓度为1 0 0m g m l ，加样量1 5m l ，在此工艺参数下，产品 的i c 轧值为1 2 2m g m l ，下降了3 0 ，活性肽总回收率合计为6 9 8 1 。用阳离 子树脂d 0 6 1 纯化双低油菜籽a c e 抑制肽，确定最佳工艺参数为：初始平衡缓 冲液为0 0 1m o l l 的醋酸缓冲液，洗脱液的组成为：a 液：初始缓冲液、b 液： 初始平衡缓冲液+ 1 0m o l ln a c i ，洗脱剂流速为1 0m l m i n ，上样量1 0 0n a g ，在 此工艺参数下，产品的i c s o 值为0 4 7m g m l ，下降了6 1 5 ，活性肽总回收率 合计为6 4 2 0 。 采用r p h p l c 技术对双低油菜籽a c e 抑制肽进行进一步分离纯化研究， 通过r p h p l c 多级顺序分离，双低油菜籽a c e 抑制肽的i c 5 0 值进一步下降到 0 0 8 7m g m l 。通过l c m s 分析，初步推断高活性的双低油菜籽a c e 抑制肽的 结构为l e u g l y p r o 、i l e g l y p r o 和v a l a l a p r o 等三肽，以及c y s i l e 和c y s l e u 等二肽。通过相关文献及降血压肽的基因库查询比对，发现已有研究从其他植物 蛋白酶解产物中分离纯化出三肽l e u g l y p r o 和v a l a l a p r o ，而三肽i l e g l y p r o ， 二肽c y s i l e 和c y s l e u 等尚未见报道，还需进一步确认。 对高活性的双低油菜籽a c e 抑制肽进行了性质评价。发现双低油菜籽a c e 抑制肽具有良好的热稳定性及酸碱稳定性，在高温，强酸性和强碱性等条件下保 留3 h 时，其a c e 抑制活性仍保留初始值的7 5 5 4 以上。此外，双低油菜籽a c e 抑制肽具有较好的抗胃肠道酶解性，经胃肠道模拟消化后，其a c e 抑制活性保 留初始值的8 4 4 8 以上。动物试验结果进一步表明双低油菜籽a c e 抑制肽在体 内具有显著降血压作用。 关键词：双低油菜籽，a c e 抑制肽，分离纯化，性质评价 a n n u a lp r o d u c t i o no fr a p e s e e dm e a lr a n k sf i r s ti nt h ew o r l d h o w e v e r , a tp r e s e n t ，t h e u s eo fd o u b l el o wr a p e s e e dm e a li sl i m i t e di nc h i n a ，b e c a u s ei ti su s e d 鹤f e r t i l i z e ro r a n i m a lf e e d ，w h i c hr e s u l t si nw a s t eo fr e s o u r c e s 。o u rr e s e a r c hg r o u pa n do t h e rs t u d i e s h a v ei n d i c a t e dt h a tt h eh y d r o l y s a t e so fd o u b l el o wr a p e s e e dm e a lp r o t e i nh a v es o m e p e p t i d e sw i t ha c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yw h i c hh a v ew i d ea p p l i c a t i o n sf o rs u s t a i n a b l e d e v e l o p m e n t t h er e s e a r c hg r o u ph a sc o m p l e t e dt h ee n z y m a t i cp r e p a r a t i o no fa c ei n h i b i t o r y p e p t i d e so fd o u b l el o wr a p e s e e dm e a l i nt e r m so fo n g o i n gr e s e a r c hw o r k , f u r t h e r w o r kn e e d st ob ed o n eo n ：( 1 ) i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fp e p t i d e sw i t hh i g ha c e i n h i b i t o r ya c t i v i t yf r o mt h eh y d r o l y s a t e s ；( 2 ) i d e n t i f i c a t i o no fp e p t i d e sw i t hh i 曲a c e i n h i b i t o r ya c t i v i t y t h ep u r p o s eo ft h e s er e s e a r c hm i l e s t o n e si st op r o v i d ea s u f f i c i e n t b a s i sf o rt h ed e v e l o p m e n ta n df o l l o w - u pp r o d u c t s ，e n r i c ht h ed a t a b a s eo fa c e i n h i b i t o r yp e p t i d e s ，a n dt ob u i l de f f i c i e n tp r o t o c o l sf o rs p e c i f i cp e p t i d e s ；0 ) s t u d yt h e f u n c t i o n a lp r o p e r t i e ss u c ha ss t a b i l i t ya n di nv i v oe f f e c t so ft h eh i g ha c ei n h i b i t o r y p e p t i d et op r o v i d eat h e o r e t i c a l b a s i sf o rt h es u b s e q u e n td e v e l o p m e n to fh e a l t h p r o d u c t s i nt h i ss t u d y , d o u b l el o wr a p e s e e dp r o t e i nw a su s e da sr a wm a t e r i a l s ，t h r o u g ht h e m u l t i - s t e pp u r i f i c a t i o no fh y d r o l y s a t e s ，h i 【g l la c t i v i t yo fa c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw e r e o b t a i n e da n dt h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo ft h e mw e r ei d e n t i f i e d ，t h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e s o ft h ea c e i n h i b i t o r yp e p t i d e sw e r ea l s os t u d i e da sf o l l o w s ： d o u b l el o wr a p e s e e dp r o t e i nw a sh y d r o l y s e db ya l c a l a s ew i t ht h eo p t i m a l i i i 双低油菜籽a c e 抑制肽的分离纯化及其性质评价 c o n d i t i o n so u rr e s e a r c hg r o u ph a de s t a b l i s h e d ：p r o t e i ns o l u t i o n s ( 5g l o o m lo n p r o t e i nb a s i s ) w a sm a d eb yd i s p e r s i o no f7 5 0go fp r o t e h lp o w d e ri n1 5l o fd i s t i l l e d w a t e ra n dk e p ta t2 0 t h es o l u t i o nw a si m m e d i a t e l yt r e a t e dw i t ha c y c l i cu l t r a s o u n d f o r2 0m i nw i t hp o w e ro u t p u to f6 0 0w ：a f t e rs o n i c a t i o n t h ep ho ft h et r e a t e dp r o t e i n s o l u t i o nw a sa d j u s t e dt o9 0w i t h1m n a o h ，a n dt h e ni n c u b a t e di naw a t e rb a t ha t 5 0 c t h eh y d r o l y s i sp r o c e s sw a ss t a r t e db ya d d i t i o no fa l c a l a s e ( t h ee n z y m e - t o s u b s t r a t er a t i ow a s5 ：1 0 0w wo np r o t e i nb a s i s ) t h er e a c t e dm i x t u r ew a si n c u b a t e da t 5 0 。ca n dt h ep hw a sm a i n t a i n e da t9 0b yt h ea d d i t i o no f1mn a o hi nt h er e a c t i o n p r o c e s s a f t e r3 0m i no fi n c u b a t i o n ，t h er e a c t i o nw a st e r m i n a t e db yb o i l i n gf o r1 0m i n 、 i tw a st h e nc o o l e df o r2 0m i ni na ni c e - w a t e rb a t h ，a f t e rw h i c ht h em i x t u r ew a s c e n t r i f u g e da t3 , 5 0 0r p m f o r1 0m i n t h es u p e r n a t a n t ( h y d r o l y s a t e s ) w a sc o l l e c t e df o r s p r a yd r y i n ga n dt h ei c 5 0v a l u eo ft h eh y d r o l y s a t e sp o w d e rw a sd e t e r m i n e da t2 0 m g m l t h eu l t r a f i l t r a t i o nt e c h n o l o g yw a sa d o p t e df o rt h es e p a r a t i o no fa i l 酉o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e sf r o md o u b l e - l o wr a p e s e e dh y d r o l y s a t ea n dt h e i n f l u e n c eo fs e p a r a t i o np a r a m e t e r so i lt h ep u r i f i c a t i o ne f f e c tw a si n v e s t i g a t e d f o rt h e f i r s ts t a g eo fu l t r a f i l t r a t i o nw i t ht h em e m b r a n eo f5k d am o l e c u l a rw e i g h t ，t h eo p t i m a l p a r a m e t e rw a sp r e s s u r eo f0 5k e d e m 2 ，p e p t i d es o l u t i o nt e m p e r a t u r eo f4 5 ca n d p e p t i d ec o n c e n t r a t i o no f3 w h i l ef o rt h es e c o n ds t a g eo fu l t r a f i l t r a t i o nw i t ht h e m e m b r a n eo f3k d am o l e c u l a rw e i g h t ，t h eb e s tp a r a m e t e rw a sp r e s s u r eo f0 7k g c m z ， p e p t i d es o l u t i o nt e m p e r a t u r eo f3 5 * ca n dp e p t i d ec o n c e n t r a t i o no f3 u l t r a f i l t r a t i o n c o u l dr a i s et h ea c t i v i t yo ft h ea c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sf r o md o u b l e l o wr a p e s e e d m a r k e d l yw t ht h ei c 5 0v a l u eo f1 7 2m g m lw h i c hw a sd e c r e a s e db y1 4 s e p h a d e xc h r o m a t o g r a p h ya n di o ne x c h a n g er e s i nc h r o m a t o g r a p h yw e r ea d o p t e d f o rt h ed e e ps e p a r a t i o no fa n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e sf r o m d o u b l e l o wr a p e s e e dh y d r o l y s a t ea n dt h ei n f l u e n c eo f t e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r so nt h e p u r i f i c a t i o np r o c e s sw e r ei n v e s t i g a t e d f o rs e p h a d e xc h r o m a t o g r a p h y , t h eo p t i m u m p r o c e s sp a r a m e t e r sw e r e ：e l u e n to fd i s t i l l e dw a t e rw i t hae l u e n tf l o wr a t eo f1 0 m l _ m i n ，s a m p l ec o n c e n t r a t i o no f1 0 0m g m l , s a m p l ev o l u m eo f1 5m l i nt h e s e c o n d i t i o n s ，t h ei c 5 0v a l u eo fh y d r o l y s a t e sw a sd e c r e a s e db y3 0 w i t h1 2 2m g m l 0 4 7m g m lw h i c hw a sd e c r e a s e db y6 1 5 r e v e r s e p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( i 冲- i - n l c ) w a su s e dt o s e p a r a t ea n dp u r i f yt h eh y d r o l y s a t e s a f t e rt h em u l t i - l e v e lo r d e rs e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o nb yr p - h p l c ，t h ei c s ov a l u eo fa c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw a sf u r t h e r d e c r e a s e dt o0 0 8 7m g m l t h r o u g ht h el c m sa n a l y s i s ，t h e s t r u c t u r eo f a c e i n h i b i t o r yp e p f i d e s w i t h h i g ha c t i v i t y f r o md o u b l e - l o w r a p e s e e d w a s p r e l i m i n a r yi n f e r r e da st r i p e p t i d e so fl e u - g l y p r o ，l i e - g l y p r oa n dv a l - a l a p r oa l o n g w i t hd i p e p t i d e so f c y s i l ea n dc y s l e u 。 t h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so ft h ea c ei n h i b i t o r yp e p t i d e sw i t hh i g ha c t i v i t yw e r e s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep e p t i d e sc o u l dr e t a i ni n i t i a la c t i v i t yo f7 5 5 4 u n d e rv a r i o u st e m p e r a t u r ea n dp ht r e a t m e n t sa n di ne x t r e m ec o n d i t i o n so fh i l g h t e m p e r a t u r e ，s t r o n ga c i d i t ya n ds t r o n gb a s i c i t yf o r3h b e s i d e s ，i ts h o w e dr e s i s t a n c e t oi nv i t r od i g e s t i o na n dc o u l dr e t a i n8 4 4 8 o fi n i t i a la c t i v i t ya f t e rv i t r od i g e s t i o n a d d i t i o n a l l y , a n i m a l t e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p e p t i d e s h a v ee x c e l l e n t a n t i h y p e r t e n s i v ee f f e c t si nv i v o k e yw o r d s ：d o u b l e - l o w r a p e s e e d ，a c e i n h i b i t o r yp e p t i d e s ，p u r i f i c a t i o n ， p r o p e r t i e se v a l u a t i o n v 双低油菜籽a c e 抑制肽的分离纯化及其性质评价 v i 1 2 菜籽a c e 抑制肽的制备技术及存在问题2 1 2 1a c e 抑制肽及其酶法制备。2 1 2 2 a c e 抑制肽的分离纯化3 1 2 3a c e 抑制肽的结构鉴定4 1 2 4a c e 抑制肽的稳定性及功能性质评价5 1 3 本文的立题依据、意义及主要研究内容5 1 3 1 立题依据和研究意义5 1 3 2 主要研究内容6 参考文献7 第二章超滤技术分离双低油菜籽a c e 抑制肽工艺研究 1 0 2 1 前言；1 0 2 2 试验材料和仪器设备1 0 2 2 1 试验材料及试剂1 0 2 2 2 试验仪器及设备1 1 2 3 试验方法1 1 2 3 1 血管紧张素转化酶( a c e ) 的制备。1 1 2 3 2 双低油菜籽a c e 抑制肽的酶法制备1 1 2 3 3 双低油菜籽a c e 抑制肽的超滤分离1 2 2 3 4a c e 抑制活性与半抑制浓度的测定1 3 2 3 5 活性回收率的测定1 4 2 3 6 双低油菜籽a c e 抑制肽的肽谱分析1 4 2 4 试验结果与分析1 4 2 4 1 压力对超滤膜通量的影响1 4 2 4 2 温度对超滤膜通量的影响1 5 2 4 3 多肽浓度对超滤膜通量的影响1 6 2 4 4 超滤后各组分的半抑制浓度及其活性回收率1 7 2 4 5 超滤后双低油菜籽a c e 抑制肽的肽谱1 8 v l l ! 双低油菜籽a c e 抑制肽的分离纯化及其性质评价 2 5 本章小结一1 8 参考文献1 9 第三章凝胶层析和离子交换技术纯化双低油菜籽a c e 抑制肽工艺研究2 0 3 1 前言2 0 3 2 试验材料和仪器设备2 1 3 2 1 试验材料及试剂。2 1 3 2 2 试验仪器及设备。2 1 3 3 试验方法2 2 3 3 1a c e 抑制活性与半抑制浓度的测定。2 2 3 3 2 活性回收率的测定2 2 3 3 3 双低油菜籽a c e 抑制肽的肽谱分析2 2 3 3 4 葡聚糖凝胶的预处理2 2 3 3 5 双低油菜籽a c e 抑制肽的凝胶层析纯化2 3 3 3 6 离子交换树脂的预处理。2 3 3 3 7 多肽含量的测定2 4 3 3 8 双低油菜籽a c e 抑制肽的离子交换纯化2 5 3 4 试验结果与分析2 6 3 4 1 多肽含量的测定2 6 3 4 2 凝胶层析纯化双低油菜籽a c e 抑制肽的工艺优化2 6 3 4 3 凝胶层析纯化后各组分的半抑制浓度及其活性回收率。3 1 3 4 4 凝胶层析纯化后各组分的肽谱分析3 1 3 4 5 离子交换纯化双低油菜籽a c e 抑制肽的工艺优化3 2 3 4 6 离子交换纯化后各组分的半抑制浓度及其活性回收率一3 8 3 4 7 离子交换纯化后各组分的肽谱分析。3 9 3 5 本章小结3 9 参考文献4 0 第四章高效液相色谱技术纯化双低油菜籽a c e 抑制肽及结构鉴定 v i i i 4 1 4 1 前言4 1 4 2 试验材料和仪器设备4 2 4 2 1 试验材料及试剂一4 2 4 2 2 试验仪器及设备4 2 4 3 试验方法4 2 4 3 1a c e 抑制活性与半抑制浓度的测定4 2 江苏大学硕士学位论文 4 3 2 双低油菜籽a c e 抑制肽的高效液相色谱纯化4 2 4 3 3 双低油菜籽a c e 抑制肽的结构鉴定4 3 4 4 试验结果与分析。4 4 4 4 1 双低油菜籽a c e 抑制肽r p h p l c 纯化4 4 4 4 2 双低油菜籽a c e 抑制肽r p h p l c 分析。4 5 4 4 3 双低油菜籽a c e 抑制肽的结构鉴定4 6 4 5 本章小结4 8 参考文献4 8 第五章双低油菜籽a c e 抑制肽的性质评价 5 1 前言5 0 5 2 试验材料和仪器设备5 0 5 2 1 试验材料及试剂5 0 5 2 2 试验仪器及设备。5 1 5 3 试验方法。5 1 5 3 1 双低油菜籽a c e 抑制肽的抗胃肠道酶降解性测定5 1 5 3 2 双低油菜籽a c e 抑制肽抗胃肠道酶降解的肽谱分析5 1 5 3 3 双低油菜籽a c e 抑制肽的酸、碱稳定性测定5 2 5 3 4 双低油菜籽a c e 抑制肽的热稳定性测定5 2 5 3 5 双低油菜籽a c e 抑制肽的功能性质测定5 2 5 4 试验结果与分析5 2 5 4 1 双低油菜籽a c e 抑制肽的抗胃肠道酶解试验5 2 5 4 2 胃肠道酶降解后双低油菜籽a c e 抑制肽的肽谱分析5 3 5 4 3 不同p h 值对双低油菜籽a c e 抑制肽活性的影响5 4 5 4 4 不同温度对双低油菜籽a c e 抑制肽活性的影响5 5 5 4 5 一次性灌胃双低油菜籽a c e 抑制肽对s h r 血压的影响5 6 5 5 本章小结5 6 参考文献5 7 第六章结论与展望 6 1 主要结论。5 8 6 2 工作展望5 9 致谢 攻读硕士学位期间论文发表情况 6 0 6 1 i x 右【l 】。油菜籽经加工可得约3 5 左右菜籽油和6 5 左右菜籽饼粕，中国每年可产 副产品菜籽饼粕7 0 0 。8 0 0 万吨，产量居世界第一位。油菜籽饼粕是重要的植物蛋 白质资源，双低油菜籽的培育成功，大大降低了菜籽饼粕中毒性最大的芥酸和硫 代葡萄糖苷的含量，使得双低油菜籽饼粕的综合利用得到进一步的发展【2 1 。双低 油菜籽饼粕中蛋白质含量比大豆粕更高，氨基酸尤其是赖氨酸的组成更趋合理， 含硫氨基酸含量高于大豆粕，富含磷、硒、钙等矿物质和b 族维生素f 2 】，几乎不 存在限制性氨基酸，营养价值优于任何其他植物蛋白，是一种理想的、潜在的优 质蛋白资源【蚓。 但是，目前我国对双低油菜籽粕的利用相当有限，仅用作肥料或按少量比例 添加到反刍动物和淡水鱼类的养殖饲料中【刀，造成了资源浪费。因此，如何提高 双低油菜籽饼粕的利用价值成为近年来的研究热点。 1 1 2 双低油菜籽饼粕的利用现状 目前关于菜籽饼粕的研究报道还不多，国内主要是研究菜籽饼粕蛋白水解产 物的功能性质或生物活性及各种应用，如将酶解后得到的水解蛋白用于和还原糖 进行美拉德反应制备风味物质【8 】；用于制备菜籽肽口服液【9 】；或作为高溶解性的 蛋白产品添加到食品中【1 0 】等。 国外的研究者主要以自制的菜籽浓缩蛋白或分离蛋白为对象进行了研究。 y u s t 等【1 1 l 用碱性蛋白酶水解菜籽分离蛋白，产物经纯化后得到具有抑制人类免疫 缺陷病毒蛋白酶活性的菜籽肽纯组分；v i o q u e - 等 1 2 墚用碱性蛋白酶和风味蛋白酶 水解菜籽分离蛋白，水解产物在广泛p h 范围内具有高溶解性，可以应用于液态 食品或高能饮料中，其一些组分对治疗临床综合病症有帮助。 随着双低油菜籽的培育成功和推广种植，对菜籽蛋白和菜籽多肽的研究引起 了众多学者的兴趣，菜籽生物活性肽的开发和利用逐步成为植物多肽研究领域的 双低油菜籽a c e 抑制肽的分离纯化及其性质评价 一大热点。 1 2 菜籽a c e 抑制肽的制备技术及存在问题 1 2 1a c e 抑制肽及其酶法制备 成人的正常血压是收缩压1 4 0m m h g ，舒张压9 0m m h g ，高血压是指血 压高于正常值的一种慢性疾病，它最大的危害在于对全身血管造成长期超极限的 额外压力，导致血管的脆性损伤，最终引起血管的破裂、堵塞。高血压在我国的 发病率逐年增高，高血压患者中，已发现血压升高的占2 5 ，接受治疗的只占 1 2 ，而能有效控制血压的仅有3 【1 3 1 。因此，研究生产高效安全的降血压药物 已经成为国内外科学家积极探索的一项重要课题。 血管紧张素转化酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ，缩写为a c e ) 是一 种含锌的金属肽酶【1 4 1 ，在血管舒缓激肽激肽前列腺素系统和体内肾素血管 紧张素醛固酮系统中对血压的调节起着重要的作用。目前研究表明，如果抑 制了a c e 的活性，就能够有效地防治高血压【”】。 目前，普遍采用化学合成药物如巯甲丙脯氨酸、呱哚普利【1 6 】、群多普利【1 7 】 等治疗高血压病。但是长期服用化学合成药会产生各种不适的副作用，如皮疹、 味觉异常、蛋白尿以及肝功能异常等【1 8 l ，另外化学合成类药物作用时间不长， 停药后会产生血压反跳【1 9 1 。 a c e 抑制肽拥有合成药物无法比拟的优点，首先，a c e 抑制肽对高血压病患 者可起到降压作用，对血压正常者无降压作用；其次，a c e 抑制肽是经食用级酶 在温和条件下处理获得的，其安全性极高，无副作用；此外，由于它们还具有较 好的酸、热稳定性、水溶性、粘度随浓度变化迟钝等优点，易于作为功能因子添 加制成各种食品或保健品，具有极好的市场前景【她2 1 1 。本课题组及其他学者已有 的研究表明【2 2 】，通过酶解双低油菜籽粕蛋白可以释放出具有高a c e 抑制活性的 多肽。因此在开发降血压健康产品方面具有发展前景。 本课题组已经完成了双低油菜籽a c e 抑制肽酶法制备技术的研究。因此就研 究工作的持续开展而言，进一步需要研究的工作包括：( 1 ) 对酶解产物进行分离 纯化，得到高活性的产品；( 2 ) 鉴定酶解产物中含有的高a c e 搁j 制活性多肽片段 的结构，其目的一方面在于为后续的产品开发提供更充分的依据，同时可以丰富 a c e 乖i j 制活性多肽的数据库，另一方面为今后深入探讨目标多肽的检测方法奠定 2 江苏大学硕士学位论文 基础；( 3 ) 评价具有高a c e 抑制活性多肽的性质，如稳定性及体内降压效果等功 能性质，为后续降血压健康产品的开发提供理论依据。 1 2 2a c e 抑制肽的分离纯化 由于双低油菜籽粕蛋白的酶解产物由许多分子链长度不等的多肽混合物、 少量游离氨基酸、糖类和无机盐等成分组成。因此，对酶解产物的分离纯化， 一方面是为了提高产品的a c e 抑制活性，另一方面更进一步的纯化则是为了 进行目标多肽结构的鉴定，为后续的产品开发提供更充分的依据，同时也可 以丰富a c e 抑制活性多肽的数据库。 目前a c e 抑制肽分离纯化常用的方法主要有以下几种： ( 1 ) 根据分子质量大小差别的分离方法( 以制备高活性产品为目的) 主要有超滤和凝胶过滤等方法。超滤( 简称o f ) 是以压力为推动力，利用 超滤膜不同孔径对液体进行物理筛分的分离过程。凝胶过滤又叫分子筛层析，凝 胶具有网状结构，小分子物质由于分子体积相对较小能够进入其内部，而大分子 物质由于分子体积相对较大则被排阻在外部，当混合溶液通过凝胶过滤层析柱时， 溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了【2 引。 ( 2 ) 根据带电性质进行分离的方法( 以制备高活性产品为目的) 肽类是两性物质，分子中具有多个正电荷和负电荷，可利用肽分子的这 种性质将它们分离。目前主要有聚焦层析、离子交换层析等方法。聚焦层析 是利用层析过程中固定相偶联具有两性解离功能的有机分子为配基，与流动 相中某些具有两性粒子发生等电聚焦反应而进行分离的一种方法【刎。离子交 换层析是在离子交换剂为固定相，洗脱液为流动相的系统中进行的。离子交 换层析主要是根据上述离子交换剂对各种离子或离子化合物的结合力的差异 性把不同的物质分开的。 ( 3 ) 高效液相色谱( h p l c ) 法( 以目标多肽结构鉴定为目的) 高效液相色谱法采用了新型的高压输液泵、高灵敏度检测器及高效微粒 固定相，兼有液相层析的功能，可在常温下分离纯化物质以及具有气相色谱 高压、高速、高分辨率和高灵敏度的特点。 在进行a c e 抑制肽的分离纯化时，最好是将分离原理不同的多种手段结 合使用，从而使得到的目标产物更纯、活性更高。如j i a n h u az h a n g 等【2 5 】用 s e p h a d e x 2 5 凝胶层析和h p l c 处理豆豉曲，获得了较高a c e 抑制活性的短 3 双低油菜籽a c e 抑制肽的分离纯化及其性质评价 肽；s u e t s u n a 2 6 】用阳离子交换树脂d o w e x5 0 w - x 4 和s ps e p h a d e x g 2 5 凝皎从 1 5 种，( r l 贝类的胃蛋白酶水解产物中分离提取了a c e 抑制肽；k w o n 等 2 7 1 采用 凝胶过滤色谱法和h p l c 法从红小豆中分离出氨基酸序列为 v a l g i v l e u p r o i l e p h e 的a c e 抑制肽。 尽管目前关于a c e 抑制肽分离纯化的研究很多，但是来源于菜籽饼粕蛋 白的却鲜见报道，且因为原料的不同，各种分离纯化技术的工艺参数也不尽 相同。因此，很有必要对菜籽饼粕蛋白的酶解产物进行分离纯化研究，以获 得高活性的产品。 1 2 3a c e 抑制肽的结构鉴定 目前国内外学者普遍认为，a c e 抑制肽的活性与其自身特征有关。c h e u n g 等【2 8 】认为t r p 、t y r 、p h e 和p r o 在肽链的羧基端以及肽链氨基端有支链脂肪族 氨基酸时活性较好。安桂香等【2 9 】认为：对于二肽来说，若n 末端为g l y 残基， c 末端为t y r 、t r