（食品科学专业论文）树莓超氧化物歧化酶的化学修饰及固定化研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 歌者艳 时间： 2 年彳月服日 导师签名： 、莎坶 时间：o 7 年f 月，o 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 弧裔艳时间：2 0 叼年月j 2 日 新签名：毛坊时间：加。夕年月c ，印 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 超氧化物歧化酶是体内自由基主要清除剂之一，简称为s o d 。现已证明树莓是富含 s o d 的水果资源。本文首先以树莓为原料，通过盐析、凝胶层析等步骤对树莓s o d 进 行提取纯化，然后针对s o d 作为药用酶稳定性差的缺陷，对树莓s o d 进行了化学修饰 与固定化研究。这些为对树莓s o d 的进一步深入研究及其在药品、保健食品和化妆品 方面的应用打下了一定基础。 本文在前人研究的基础上，拓展了关于s o d 化学修饰的新思路：在对s o d 进行分子 改造的同时，着重于扩展其功能，使之成为具备复合型功能的酶分子。本文选用了具备 清除自由基、增强免疫等功能的壳聚糖作为修饰剂对s o d 进行改造。 首先，应用四种氧化降解法，主要包括：h 2 0 2 降解法、h a c h 2 0 2 降解法、h 2 0 2 n a c i o 降解法和n a b 0 3 降解法，在优化条件下制备了四种低聚水溶性壳聚糖。用四种低聚水 溶性壳聚糖对树莓s o d 进行化学修饰，h 2 0 2 降解法制备的低聚水溶性壳聚糖作为修饰 剂得到的修饰酶总活力较高，可达到7 1 2 3 8 u m l 。s o d 经h 2 0 2 降解法制备的低聚水溶 性壳聚糖修饰后，s o d 氨基修饰率为5 9 2 7 ，s o d 活性保持度为6 3 1 2 。修饰s o d 的温度稳定性、p h 稳定性均明显提高，同时与天然s o d 相比，修饰s o d 的木瓜蛋白 酶酶切耐受性明显增强。修饰s o d 的体外半衰期为4 8 6 7 1 h ，天然s o d 的体外半衰期 为9 4 2 7 h ，修饰酶的体外半衰期较天然酶体外半衰期延长了约四倍。结果表明，低聚水 溶性壳聚糖修饰s o d 是可行的，低聚水溶性壳聚糖可作为一种较好的修饰s o d 的化学 修饰剂。 壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，分子中游离氨基多，反应活性好，是 固定化酶的良好载体，有着广泛的应用前景。 本文对壳聚糖采取不同处理方法，将其用于对树莓s o d 进行固定化，比较酶活力 及酶活回收率，筛选出了较优的壳聚糖载体的制备方法，结果表明，壳聚糖粉固定化 s o d 和网状壳聚糖固定化s o d ，酶活力和酶活回收率均较理想。分别确定了壳聚糖粉 固定化s o d 和网状壳聚糖固定化s o d 制备的最佳条件，并考察固定化s o d 的酶学性 质。 壳聚糖粉固定化s o d 研究表明，以壳聚糖粉为载体，戊二醛交联法制备固定化 s o d ，优化条件下活化中戊二醛浓度取o 4 制备的固定化酶，所得壳聚糖酶粉活力 摘要 1 9 2 u g ，酶活回收率为3 4 ，热稳定性和酸碱稳定性较天然酶有很大的提高，且具有良 好的贮存稳定性，固定化酶粉可实现反复使用，提高了利用率，壳聚糖粉可用于制备固 定化s o d 。 网状壳聚糖固定化s o d 研究表明，以网状壳聚糖作为载体，戊二醛为交联剂，在 最佳固定化反应条件下，网状壳聚糖载体制备过程中，戊二醛浓度取1 0 ，固定化反 应中戊二醛浓度取o 1 ，所得固定化s o d 酶活力为3 3 0 u g ，酶活回收率为5 8 3 3 ， 热稳定性和酸稳定性较天然酶有很大的提高，且具有良好的贮存稳定性，固定化酶可实 现反复使用，提高了利用率。结果表明，以戊二醛预交联的网状壳聚糖作为载体可用于 制备性能较优的固定化s o d 。 关键词：树莓；超氧化物歧化酶；壳聚糖；化学修饰；固定化 2 沈阳农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) i so u eo ft h em o s t j m p o i l a n tp u r g e re l i m i n a t e0 2 o u to f b o d y s o di sa b b r e v i a t i o no fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e t h er a s p b e r r yh a sb e e np r o v e dt ob ea f i u i tr e s o u r c er i c hi ns o d t h es u b j e c t sh a v es t u d i e dt h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fs o d i nr a s p b e r r yb yt h es t e p so fs a l t i n go u ta n dg e lc h r o m a t o g r a m i no r d e rt oa v o i d i n gt h ed e f e c t s o fs o da sm e d i c i n e 。t h em o d i f i c a t i o na n di m m o b i l i z a t i o no fs o dw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a r h a v eb e e ni n v e s t i g a t e di n d i v i d u a l l y a l lt h ew o r kh a v eb e e nd o n et op r o v i d ef o u n d a t i o nf o r f u r t h e rr e s e a r c ho fs o da n di t sa p p l i c a t i o ni nm a t e r i a lm e d i c a ，h e a l t hf o o da n dc o s m e t i c i nt h es t u d y ，n e wm e t h o dh a sb e e na p p l i e di nt h em o d i f i c a t i o no fs o d c h i t o s a n , w h i c h i se f f e c t i v ei nb o t hf r e er a d i c a le l i m i n a t i o na n di m m u n i t ye n h a n c e m e n ti no r g a n i s m ，h a sb e e n s e l e c t e dt om o d i f yt h en a t u r a ls o dm o l e c u l ei no r d e rt oo b t a i nam u l t i p u r p o s em o d i f i e d s o dw i t hi n t e n s i f i e ds t a b i l i t y f i r s t l y , t op r e p a r ef o rm o d i f i e ds o d ，f o u rl o wm o l e c u l a rw e i g h ta n dw a t e r - s o l u b l e c h i t o s a nh a v eb e e np r e p a r e du s i n gm e t h o do f 助2d e g r a d a t i o n 、h a c - h 2 0 2 d e g r a d a t i o n 、 h 2 0 2 - n a a 0d e g r a d a t i o na n dn a b 0 3d e g r a d a t i o nu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s s o di n r a s p b e r r yh a sb e e nm o d i f i e dw i t hf o u rl o w m o l e c u l a rw e i g h ta n dw a t e r - s o l u b l ec h i t o s a n ，t h e t o t a la c t i v i t yo fm o d i f i e ds o d u s i n gl o wm o l e c u l a rw e i g h ta n dw a t e r - s o h i b l ec h i t o s a nm a d e f r o m 碣：0 2d e g r a d a t i o ns h o w e dt h eh i g h e s ta c t i v i t y ，w h i c hw a s7 1 2 3 8 u m lt h er e s u l t s h o w e dt h a tt h em o d i f i c a t i o nr a t eo fa m i n og r o u p sw a s5 9 2 7 a n dt h er e c o v e r yo fs o dw a s 6 3 1 2 t h es t a b i l i t yo fm o d i f i e ds o d a g a i n s th e a t ，p ha n dp a p a i nd e g r a d a t i o nh a v eb e e n i n t e n s i f i e ds i g n i f i c a n t l y e x t e r n a lh a l f - l i f eo fm o d i f i e ds o dw a s4 8 6 7 1 h ，a n de x t e r n a l h a l f - l i f eo fn a t i v es o dw a s9 4 。2 7 h 。e x t e r n a lh a l f - l i f eo fm o d i f i e ds o dw a sf o u rt i m e sb i g g e r t h a ne x t e r n a lh a l f - l i f eo fn a t i v es o d i tc a l lb ec o n c l u d et h a tu s i n gl o wm o l e c u l a rw e i g h ta n d w a t e r - s o l u b l ec h i t o s a nt om o d i f ys o di sf e a s i b l ea n dl o wm o l e c u l a rw e i g h ta n dw a t e r - s o l u b l e c h i t o s a ni sak i n do fg o o dc h e m i c a lm o d i f i c a t i o nr e a g e n t i th a sb e e nw i d e l ya p p l i e db e c a u s ec h i t o s a np o s s e s s e sg o o db i o c o m p a t i b i l i t ya n db i n d e g r a d a t i o n , m e a n w h i l e ，i tc o n t a i n sa b u n d a n ta m i n og r o u p sa n dg o o dr e a c ta c t i v i t ya sc a l e r t op r e p a r ei m m o b i l i z e de n z y m e i nt h es t u d y ，s o di nr a s p b e 玎yw a si m m o b i l i z e dw i t hc h i t o s a nf r o md i f f e r e n tp r e p a r a t i o n m e t h o d s ；t h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so fc h i t o s a nw e r eo p t i m i z e dt h r o u g hc o m p a r i n gt h e i r a c t i v i t i e sa n dr e c o v e r yr a t e s s o di m m o b i l i z e dw i t hc h i t o s a np o w d e ra n ds o di m m o b i l i z e d 3 a b t r a c t w i t hr e t i c u l a t ec h i t o s a ns h o w e dt h eh i g h e s ta c t i v i t i e sa n dr e c o v e r yr a t e s o di m m o b i l i z e d w i t hc h i t o s a np o w d e ra n ds o di m m o b i l i z e dw i t hr e t i c u l a t ec h i t o s a nh a sb e e np r e p a r e du n d e r t h eo p t i m u mc o n d i t i o nt os t u d yt h ee n z y m ep r o p e r t i e so fs o di m m o b i l i z e dw i t hc h i t o s a n i th a sb e e ns h o w ni nt h er e s u l tt h a ti m m o b i l i z e ds o dc o u l db ep r e p a r e db yc h i t o s a n p o w d e r i m m o b i l i z e ds o d o nc h i t o s a nw i t hg l u t a r a l d e h y d ea sc r o s s - l i n k i n ga g e n ts h o w e dt h e h i g h e s ta c t i v i t ya n dr e c o v e r yr a t e t h ea c t i v i t yo fs o d i m m o b i l i z e dw i t hc h i t o s a np o w d e r u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n si nw h i c hc h i t o s a np o w d e ra c t i v a t e dw i t h g l u t a r a l d e h y d e s o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n0 4 w a s1 9 2u gw i t ht h er e c o v e r yr a t ea b o v e3 4 t h et e m p e r a t u r e r e s i s t a n c ea n dt h ep hr e s i s t a n c eo ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew e r em u c hb e t t e rt h a nn a t i v e e n z y m e a n dt h ei m m o b i l i z e de n z y m ea l s os h o w e dg o o ds t o r a g es t a b i l i t y i m m o b i l i z e d e n z y m ec o u l db ea p p l i e dr e p e a t e d l y , w h i c hc o u l di m p r o v et h eu t i l i z a t i o nr a t i o t h e i m m o b i l i z e ds o dc a nb ep r e p a r e db yc r o s s l i n k r i gg i n t a r a l d e h y d eo nc h i t o s a np o w d e rt h a t e x p r e s s e sg o o dp r o p e r t i e s u n d e rt h eo p t i m u mi m m o b i l i z e dr e a c t i o nc o n d i t i o n s , g l u t a r a l d e h y d es o l u t i o n c o n c e n t r a t i o nw a s1 0 d u r i n gr e t i c u l a t ec h i t o s a nw a sp r e p a r e da n dg h t a r a l d e h y d es o l u t i o n c o n c e n t r a t i o nw a s0 1 d u r i n gi m m o b i l i z e ds o dw a sp r e p a r e d , i th a sb e e ns h o w ni nt h e r e s u l tt h a tt h ei m m o b i l i z e ds o do nr e t i c u l a t ec h i t o s a nw i t hg l u t a r a l d e h y d ea sc r o s sl i n k i n g a g e n ts h o w e dt i l eh i g h e s ta c t i v i t ya n dr e c o v e r yr a t e t h ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e ds o du n d e r o p t i m u mc o n d i t i o n sw a s3 3 0 u gw i t ht h er e c o v e r yr a t ea b o v e5 8 3 3 t h et e m p e r a t u r e r e s i s t a n c ea n dt h ep hr e s i s t a n c eo ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew e r em u c hb e t t e rt h a nt h ef r e e e n z y m e a n dt h ei m m o b i l i z e de n z y m ea l s os h o w e d9 0 0 ds t o r a g es t a b i l i t y t h ei m m o b i l i z e d e n z y m ec o u l db ea p p l i e dr e p e a t e d l yw h i c hi tc o u l di m p r o v eu t i l i z a t i o nr a t i o t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h ei m m o b i l i z e ds o dc a nb ep r e p a r e db yr e t i c u l a t ec h a t o y a n tp r e c r o s sl i n k i n g w i t hal i t t l eg l u t a r a l d e h y d e , a n di te x p r e s s e sap r i o rc h a r a c t e r k e yw o r d s ：r a s p b e r r y ；s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ；c h i t o s a n ；c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n ； i m m o b i l i z a t i o n 4 沈阳农业大学硬士学位论文 第一章前言 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，e c l 1 5 11 简称s o d ) ，是一种广泛存在于动 物、植物和微生物中的金属酶( c h i n g n e nc h e r ta n ds h u m e ip a n ，1 9 9 6 ) 。1 9 3 8 年m a n n 和k e i l i n 首次从牛血细胞中分离到一种蓝色铜蛋白( 命名为血铜蛋白h e m o c u p r e i n ) ， m c c o r d 和f r i d o v i c h 于1 9 6 9 年发现其具有生物催化活性并命名为超氧化物歧化酶( j o h n g ，1 9 9 3 ；陈惠芳等，2 0 0 3 ) ，从此人们便对s o d 开展了深入的研究。 s o d 是一种重要的自由基清除剂，能专一性清除氧阴离子自由基，对治疗因超氧游 离基引起的各种疾病都有一定的疗效作用。如s o d 在防辐射、抗衰老、防止肿瘤等方面 显示出独特的功效，添加到药品、化妆品中起抗炎、抗衰老的作用，作为食品添加剂添 加到食品中起保健作用( 余旭亚等，2 0 0 0 ；闵丽娥等，2 0 0 4 ) 。当前，s o d 受到了各界 各国专家学者们的广泛关注。 一、s o d 简介 ( - - ) s o d 的种类和自然分布 到目前为止，人们己从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺 乳动物等各种生物体内分离得到s o d 。s o d 按照结合的金属离子种类不同，将s o d 主 要分为三种类型( t h u y a k a w ae ta l ，1 9 8 5 ；s u s a nm e ta l ，1 9 8 1 ) 。 1 c 1 1 z n s o d 纯品c u ，z n s o d 呈蓝绿色。c u ，z n - s o d 最初是由m a n n 和k e i l i n 分离得到，并由 m c c o r d 和f r i d o v i c h 命名，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、 类囊体内以及线粒体膜间隙中也有存在。动物血( 主要有猪、牛、羊、马、禽类) 、牛 肝、猪肝、牛心、菠菜叶、豌豆、面包酵母、麦叶、刺梨等动植物体内均含有c l l ，z n s o d ( c o n s t a n t i n en e ta l ，1 9 7 7 ) 。 2 m n s o d 纯品m n s o d 呈粉红色。m n s o d 是由k e e l e 、m c c o r d 和f r i d o v i c h 首次分离得到。 主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存 在。 3 f e s o d 纯品f e - s o d 呈黄色或黄褐色。f c s o d 是由y o s t 和f r i d o v i c h 首次分离得到。存在 于原核细胞中。近年来陆续发现某些真核生物，例如一些真核藻类，甚至某些高等植物 如油菜、柠檬、银杏、番茄、水百合等体内也存在。f e s o d 在高等植物中一般仅存在 于叶绿体中而不存在于线粒体中。 另外，有研究还发现有一种以n i 作为金属辅基的n i s o d ( g u n t h e rr e g e l s b e r g e re t a l ，2 0 0 2 ) 。 5 第一章前言 ( 二) s o d 的活性中心和催化机理 1 s o d 的结构 c u ，z n s o d 的m r 约为3 2 0 0 0 ，由两个亚基构成，每个亚基含一个c u 和一个知，其中 c u 与四个组氨酸以及一个h 2 0 配位，形成个扭曲的四方平面构型，z n 与三个组氨酸的 味唑氮及一个天冬氨酸的羧基氧原子配位，形成扭曲的四面体结构。 m n - s o d 的m 哟为4 0 0 0 0 ，由两个亚基构成，每个亚基含个m n ，它与三个组氨酸、 一个天冬氨酸及一个h 2 0 配位，形成三角双锥结构，处于一个主要由疏水基构成的疏水 壳子里，并由两个亚基共同形成一个供底物进出的通道。 f e s o d 的m r 约为3 8 0 0 0 ，由两个亚基构成，每个亚基含一个f e 。其活性中心的f e 由三个组氨酸、一个天冬氨酸及一个h 2 0 配位( 张晓燕，2 0 0 2 ) 。 n i s o d 的结构与c u z n s o d 结构相似，但与c u ，z n s o d 无同源性，为二聚体，其中 每个亚基含一分子n i ，n i 与一分子的蛋氨酸( m e t ) 残基和两分子半胱氨酸( c y s ) 形成 配位键，与另一个与c u 结合的h i s 残基的n 形成配位键( 胡一鸿与牛健康，2 0 0 5 ) 。 2 s o d 催化机理 超氧阴离子( 0 2 - ) 是生物体内的重要自由基。在人体内的正常情况下，自由基一旦产 生，就会通过各种渠道迅速清除而不至于对机体产生危害，但随人体的衰老，这种清除 能力逐渐减弱，人体就会产生疾病；在植物体内，0 2 一能使0 3 分解物和s 0 2 氧化物等多 种有害产物生成，一般情况下只有植物濒临死亡或已死亡的植物中才会产生这些有害产 物( n o r m a ne e ta l ，1 9 8 9 ) 。而s o d 是一类重要的氧自由基清除酶，其能催化超氧化物 阴离子发生歧化反应，从而清除0 2 _ 起到抗衰老作用( 丁书茂与杨旭，2 0 0 4 ；张恒，2 0 0 4 ) ， 反应过程可表示如下： s o d 0 2 - + 0 2 - + 2 e t + m q + q e a i h | 。2 斗h 2 0 + 0 2 s o d 把生物体内多余的并对细胞破坏力极强的超氧阴离子( 0 2 ) 歧化成过氧化氢 和氧气，过氧化氢随后经体内的过氧化氢酶( c a t ) 或过氧化物酶( p o d ) 分解或利用 掉，0 2 一的毒害被解除，所以s o d 在维持生物体内0 2 - 产生与消除的动态平衡中起着重 要作用( w h e n c h ih o ue ta l ，2 0 0 3 ) 。 二、s o d 修饰与固定化的研究现状 ( 一) s o d 的化学修饰 s o d 作为药用酶用于临床受以下因素的影响：半衰期短，通常只有6 m i n 1 0 m i n ； 分子量大，不易透过细胞膜：抗原性；如用于口服，易被蛋白水解酶水解。因此 对s o d 分子进行改造就显得十分重要，近年很多学者为了提高s o d 的稳定性对s o d 6 沈阳农业大学硕士学位论文 分子的修饰进行了研究。实验表明：修饰酶在耐热、耐酸、耐碱和抗胃蛋白酶水解能力 等方面都明显地优于天然酶，修饰酶较天然酶稳定，特别是酶经修饰后大大延长了在体 内停留的时间。 近年来，为了延长s o d 的半衰期，解除其免疫原性，提高其对环境的稳定性，增 加细胞膜的通透性，以充分发挥其临床效果，国内外大多采用一些不具有免疫原性的 水溶性高分子化合物对s o d 非活性部位赖氨酸( l y s ) 进行修饰。 1 聚7 _ - - 醇( p e g ) 对s o d 的修饰 用聚乙二醇修饰蛋白质其反应条件温和，酶活性保护较好，修饰后的蛋白质水溶性 较好，同时，p e g 免疫原性低，有较好的生物相容性。因此，p e g s o d 己投人工业生产， 在s i g m a 公司已有试剂商品出售。 用相对分子量为2 0 0 0 - - 2 0 0 0 0 的p e g 修饰s o d ，发现相对分子量为6 0 0 0 的p e g 修饰效 果最佳，并且运用放射性核素标记和凝胶电泳相结合的方法，研究了其在动物体内的代 谢( 赵进数等，2 0 0 3 ) 。 2 右旋耱酐和聚蔗糖对s o d 的修饰 右旋糖酐和聚蔗糖用高碘酸钠氧化或溴化氰活化后与s o d 共价结合制得 d x ( 1 0 4 ) s o d 和d x ( c b o s o d ，活力保存分别为8 1 和7 0 ，半衰期及抗酸、碱，蛋白水 解酶能力高于天然酶( 吴云等，1 9 8 6 ) 3 淀粉对s o d 的修饰 袁勤生等将药用淀粉经高碘酸钠氧化后对s o d - - c t s ( 过氧化氢酶) 复合酶进行了 共价修饰，活力回收率：s o d ，3 6 6 ic t s ，5 5 9 ( 袁勤生等，1 9 8 9 ) 。 4 同源白蛋白对s o d 的修饰 w o n g 等将同源白蛋白和异源自蛋白经戊二醛活化后对s o d 进行修饰，发现以消除 免疫原性为目的时，选用同源白蛋白为修饰剂最佳。 5 ，聚氧化烯对s o d 的修饰 y a b u k i 等以水溶性聚烯氧化物为修饰剂，先用适当方法使其转变为两个末端都具有 一定结构的化合物，再用n 一羟基琥珀酰亚胺或对硝基苯酚活化，然后对s o d 进行修饰， 使聚氧化烯分子的两个末端基团连接到s o d 上，活性回收达9 0 ( ( 杨保珍与张天民， 1 9 9 0 ) 。 6 月桂酸对s o d 的修饰 用被氯化亚砜活化的月桂酸修饰牛血c u ，z n s o d 得至t j l a - s o d ，其活性回收率为 9 3 ，修饰率为8 0 ，半衰期明显延长，蛋白质的免疫原性降低，热稳定性及抗蛋水解 酶的能力也明显增强( 阎家麟与谢文正，1 9 9 4 ) 。 7 低抗凝活性肝素对s o d 的修饰 用澳化氰活化低抗凝活性肝素( iaa h ，l o wa n t i c o a g u l a n ta c t i v i t yh e p a r i n ) 对s o d 进 第一章前言 行化学修饰，修饰酶同时具有s o d 活性和l a a h 的抗炎作用( 王凤山等，1 9 9 4 ) 。 8 肝素对s o d 的修饰 用肝素修饰人血s o d ，修饰后的s o d 不仅在体内的稳定性比天然酶高得多，而且具 有明显的抗凝血效果，具有一定的理论意义和应用价值( 金生浩与吴梧桐，1 9 9 4 ) 。 9 长半衰期重组人s o d 将一种双亲有机化合物聚苯乙烯马来酸丁酯( s m a ) 经酰胺键与重组人c u ，z n - s o d 共 价交联，制得修饰酶，其生物半衰期延长了2 2 倍，抗蛋白水解的能力亦有所加强( 骆训 懿等，1 9 9 4 ) 。 1 0 活化脂肪酸对人血s o d 的化学修饰 用酰化法合成了n - 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 和活化脂肪酸，并对人血s o d 进行了化学 修饰， ：导到了均一的酰化s o d ( a t - s o d ) 。修饰酶的热稳定性，耐酸碱性和抗蛋白酶水 解能力均有一定提高( 王转花等，1 9 9 6 ) 。 1 1 硬脂酸修饰s o d 用膜脂成分的硬脂酸作为修饰剂，对s o d 进行化学修饰。修饰s o d 对温度、p h 、蛋 白酶水解的稳定性比天然s o d 增强，且免疫原性消除，在低浓度的某些有机介质中活性 比在水中高( 邹国林等，1 9 9 6 ) 。 1 2 明胶对s o d 的化学修饰 用经水解超滤后的小分子明胶对s o d 进行化学修饰，修饰s o d 的分子量为3 3 0 0 0 4 0 0 0 0 ，修饰酶的热稳定性、酸碱稳定性和对胃蛋白酶的稳定性均有明显提高( 陈红征与 袁勤生，1 9 9 7 ) 。 1 3 牛血清白蛋白对s o d 的修饰 通过戊二醛活化牛血清白蛋白饵s a ) 对牛i 血s o d 进行修饰，修饰后酶活力保留原来 的一半，修饰酶耐热性、耐酸性以及贮藏稳定性都明显增强。用牛血清白蛋白修饰牛血 s o d 的目的在于消除抗原性( 梁贤振等，1 9 9 7 ) 。 14 母一环糊精对s o d 的修饰 用高碘酸钠将b 一环糊精氧化后，对s o d 进行化学修饰，修饰后的酶活力剩余6 6 4 8 ， l y s 残基修饰率为3 2 4 ，s o d 的抗酶解能力增加( 陈吉祥与袁勤生，1 9 9 8 ；王政等， 1 9 9 9 ) 。 15 山梨醇月桂酸酯对s o d 的化学修饰 用山梨醇月桂酸酯对s o d 进行化学修饰，修饰后s o d 对温度和p h 的稳定性均有增 加，在某些低浓度的有机介质中活性比在水中高，半衰期延长，几乎无免疫原性( 高居 易。2 0 0 1 ) 。 16 抗坏血酸一f e “对沙棘s o d 的化学修饰 用抗坏血酸一f c 3 + 对沙棘s o d 的化学修饰，发现修饰后s o d 活性、在不同p h 下的活 8 沈阳农业大学硕士学位论文 性、抗蛋白酶水解能力均有很大的变化( 李扬等，2 0 0 2 ) 。 ( 二) s o d 的固定化 1 包埋法固定s o d 用聚丙烯酰胺作包埋载体对s o d 酶固定，并对固定化后的s o d 性质进行研究。结果 表明，包埋剂聚丙烯酰胺的浓度为2 2 5 时固定化效果最好。固定化酶具有明显的热稳 定性、抗酸碱性、保存时间较长及可重复使用等优点( 周诗毅等，2 0 0 5 ) 。 利用红细胞限b c ) 低渗膨胀膜孔开放，等渗膜孔重封的原理，制备包埋s o d 的载体 红细胞，包埋率达2 0 ，包埋s o d 的完整载体红细胞有很强的活性( 符乃阳等，1 9 9 9 ) 。 2 聚苯乙烯胶体粒子表面逐层自组装固定化s o d 通过逐层自组装技术成功地把s o d 吸附在聚苯乙烯胶体粒子表面。通过测定s o d 被 胶体粒子吸附后上清液的生物活性，得到聚阴离子型s o dc o h = 8 o ) 和聚阳离子型s o d ( p h = 4 3 ) ，在聚苯乙烯胶体粒子表面的吸附量分别为1 2 i u 和1 5 i u ，相对活性分别为2 3 4 和2 9 ( 何成毅等，2 0 0 5 ) 。 3 s o d 脂质体 s o d 脂质体的研究国内外均有报道，最早于m i c h e l s o n 将牛的c u ，z n s o d 埋入以磷脂 为主要成分的脂质体中，试验发现脂质体能够更好的附着在细胞膜上，使大鼠机械性外 伤和x 一射线损伤的治愈时间缩短一半( m i c h e l s o n ，1 9 8 6 ) 。孙君社等利用超临晁流体技 术制备靶向s o d j 旨质体，将磁性材料硫酸铁与s o d 混溶后再与卵磷脂充分乳化，再经过 c 0 2 溶胀沉析获得s o d 靶向脂质体，包封率高达9 6 ( 孙君社等，2 0 0 2 ) 。华东师范大 学利用一种新的材料一半乳糖神经酰氨来制备s o d j 旨质体，包封率3 5 6 8 ( 许琛琦与秦 德安，2 0 0 1 ) 。肺表面活性物质( p s ) s 0 d 脂质体的制备是采用旋转蒸发法将p s - 与s o d 结 合，制备p s s o d j 质体。p s s o d 脂质体可作为s o d i 薤入肺组织细胞的有效载体。( 潘 玉柱等，2 0 0 3 ) 4 s o d 微球 微球是近年发展的新剂型，它是以明胶( y o s h i o k aj ，1 9 8 1 ) 、白蛋白( l o n g owec t a i ，1 9 8 2 ) 、淀粉( s h a k e rd ，w i l l i a me ，1 9 8 2 ) 、聚丙交酯( s p e n l e h a u e rg e ta l ，1 9 8 6 ) 等为材料制 成的球形载体给药系统，具生物可降解性能，应用较广。它的开发对发展控释与靶向给 药系统有重大意义，可提高疗效，降低毒副作用。邹国林等采用明胶作为微球基质制备 s o d 明胶微球，制备的s o d 包裹率较高，s o d 平均包裹率为7 9 6 ( 邹国林等，1 9 9 5 ) 。 近年来，可生物降解的控释给药系统受到人们的广泛重视，聚乳酸由于其良好的生 物相容性和可降解性而被用作药物载体。刘剑利等即以外消旋d ，l - 聚乳酸为载体采用复 乳溶剂挥发法制备s o d 一聚乳酸微球，并考察其体外释药特性。得到了包封率为7 8 7 、 粒径大小和分布均较满意的s o d 聚乳酸微球。研究表明，较高的p h 值更有利于药物的释 放。( 刘剑利等，2 0 0 6 ) 9 第一章前言 刘玲等利用复乳溶剂挥发法制备了超氧化物歧化酶( s o d ) 的乳酸一羟乙酸共聚物 f f l o n ) 微球，考察了各工艺因素对微球粒径、包封率等的影响，通过扫描电子显微镜 ( s e m ) 、差示扫描量热分析( d s c ) 初步研究了其性质( 刘玲与袁勤生，2 0 0 3 ) 。同时研究了 微球制备过程中各因素对s o d 活力的影响，结果表明，制备条件对s o d 活性影响不大， 可在较大范围内改变制备条件，为s o d 微球的制备打下一定基础( 刘玲等，2 0 0 3 ) 。 三、壳聚糖作为固定化酶载体的研究进展 固定化酶是2 0 世纪6 0 年代发展起来的一项新技术( 禹邦超与文德立，1 9 9 4 ) 。固定 化酶具有可以提高酶的稳定性、容易进行反应及控制、便于底物和产物的分离等优点( 陈 陶生等，1 9 8 7 ) ，但同时也有以下缺点：失活、单位体积活力降低、反应底物和产物的扩 散受到限制等( 杨节非编译，1 9 9 4 ) 。 甲壳素又名几丁质、壳多糖，是迄今为止发现的地球上数量仅次于纤维素的唯一天 然碱性多糖，估计地球每年生物合成的甲壳约为1 0 0 亿t ( 邢晓慧等，2 0 0 2 ；孙华林，2 0 0 2 ) 。 壳聚糖为甲壳素的脱乙酰产物，具有多方面的生理功能。近年来的研究表明，在动物体 内，壳聚糖可降血脂、抗肿瘤和提高机体免疫力。在壳聚糖分子中，有相当数量的游 离氨基，这些氨基可以和双功能试剂发生交联作用，因此，可成为许多酶的固定化载体。 这种载体的机械性能良好，化学稳定性高，耐热性强，具有良好的表面活性，价格也比 琼脂糖凝胶便宜而且由于壳聚糖有与其它金属离子，如c u 2 + c d 2 + 等鳌合的能力， 因此可以保护酶不受金属离子的干扰和抑制( 孙华林，2 0 0 2 ) 。到目前为止，以壳聚糖 做固定化酶载体的酶已经有很多种，如酸性磷酸脂酶、d 一葡萄糖氧化酶、b 一半乳糖 苷酶、胰蛋白酶、尿素酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶等。 ( 一) 壳聚糖作为固定化酶载体的固定化方法 壳聚糖作为载体的固定化方法报道较多的有吸附法、包埋法、通过双功能试剂交联 的共价结合法。目前，使用较多的是用戊二醛作交联剂的共价结合法。载体的形态有片 状、球状、膜状、无定形等。 1 吸附法：吸附法是最简单、最具经济吸引力的方法，操作简单可供选择的载体 类型多，吸附过程可以同时达到纯化和固定化的目的，且酶失活后可重新活化再生( 刘 春叶等，2 0 0 2 ) 。采用富含自由氨基的丝素一壳聚糖合金膜为载体，吸附固定从柞蚕蛹提 取分离的超氧化物歧化酶侣o d ) ，制得的固定化酶活力为8 9 1 u g 载体，酶的活力回收达 至i j 3 5 9 ( 纪平雄等，2 0 0 3 ) 。 2 包埋法：包埋法是将酶物理包埋在多聚物内的一种方法，反应条件温和、便宜、 简便。常用包埋载体有聚丙酰胺、淀粉、聚乙烯醇、海藻酸盐、胶原、明胶等。采用壳 聚糖与羧甲基纤维素钠形成胶囊将木瓜蛋白酶固定化，研究了固定化木瓜蛋白酶的最佳 固定化条件，所得固定化木瓜蛋白酶活力回收率可达6 9 8 ( 黄泽元，2 0 0 2 ) 。 3 载体偶联法：将酶分子的必需基团经共价健与载体结合的方法，又称共价法。 沈阳农业大学硕士学位论文 载体含功能基团：芳香氨基、羟基、羧基、羧甲基、氨基等，是研究中最活跃的一类方 法( 罗九甫，1 9 9 6 ) 。另外交联法是指利用双功能或多功能试剂，使酶分子之间或酶蛋 自与其它惰性蛋白之间发生交联，凝聚成网状结构，对酶进行固定。戊二醛是应用最广 泛的双功能试剂。 目前，使用较多的是用双功能试剂戊二醛做交联剂，使酶分子的必需基团经共价健 与载体结合的共价结合法。以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂制备固定化木瓜蛋白酶。 所制备的固定化木瓜蛋白酶的最适p h 8 0 ，最适温度7 0 ，与溶液酶相比，固定化酶的 热稳定性显著提高( 黄建韶等，2 0 0 2 ) 。 在实际应用中，一种固定方法常不能达到理想的结果，往往凡种固定方法联合使用。 吸附法与交联法联合使用可提高固定化胰蛋白酶的活性稳定性。以粉末状壳聚糖作为载 体，采用吸附一交联的方法将a - 葡萄糖苷酶固定化，酶活力回收率为5 9 6 ( 岳振峰等， 2 0 0 0 ) 。 ( 二) 壳聚糖作为固定化酶载体