（食品科学专业论文）林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究.pdf

林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 摘要 本研究以林蛙油为底物，选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶和复 合蛋白酶分别进行酶解实验，并通过测定每种酶的酶活力，酶解后底物的水解度( d h ) 以 及酶解液中多肽含量( t c a s t 0 和游离氨基氮的含量来判定各种酶的酶解效果。结果表明 木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活力高于其他蛋白酶，分别为5 1 0 u m g 和3 5 0 u m g ；水解 度较高，分别为1 2 3 和1 1 8 ；酸溶性多肽的得率相对较高，分别为4 3 7 和5 0 3 ； 并且水解产物中游离氨基氮的含量较低，分别为0 4 2 m g m l 和0 5 6 m g m l ；综合考虑， 本研究选用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解林蛙油制备活性肽。 采用双酶结合可控酶解技术对林蛙油进行水解。首先采用木瓜蛋白酶对底物进行水 解，利用单因素试验考察了底物浓度、加酶量、水解温度、p h 值和酶解时间对底物的水 解度及产物中酸溶性多肽含量的影响，并筛选出对其影响显著的因素进行b o x b e h n k e n 中心组合设计和响应面分析，对酶解反应的主要影响因素进行多项式回归模型建立和最优 化，确定了木瓜蛋白酶酶解底物的最佳工艺条件为：温度6 0 ，p h 值6 5 ，底物浓度1 ， 酶用量( e s ) 为1 5 ，酶水解时间3 0 h 。在此酶酶解的基础上，进一步采用碱性蛋白酶进 行水解，同样在单因素实验的基础上，运用b o x b e h n k e n 中心组合设计和响应面分析， 确定了碱性蛋白酶酶解的最佳工艺条件为：加酶量( e s ) 为0 8 7 5 ，温度5 0 。c ，p n 值为 8 0 ，水解时间3 0 h 。底物水解度和酸溶性多肽的含量分别达到1 8 4 和7 8 6 ，比单酶酶 解分别提高了5 6 和3 0 2 。 酶解物经s e p h a d e xg 1 5 凝胶柱分离，木瓜蛋白酶酶解物中多肽分子量在3 0 0 1 3 5 5 d a 之间的占总洗脱峰面积的4 1 3 ；大于1 3 5 5 d a 的占3 8 ：小于3 0 0 d a 的占2 0 7 。碱性 蛋白酶酶解物中多肽分子量在3 0 0 1 3 5 5 d a 之间的占总洗脱峰面积的3 8 2 ；大于1 3 5 5 d a 的占4 2 6 ；小于3 0 0 d a 的占1 9 2 。双酶结合酶解物中多肽分子量在3 0 0 1 3 5 5 d a 之间 的占总洗脱峰面积的5 2 6 ；大于1 3 5 5 d a 的占3 1 5 ；小于3 0 0 d a 的占1 5 9 。 将分布在3 0 0 1 3 5 5 d a 之间的物质，利用高效液相色谱分析，在峰图上出现三个高低不 同的色谱峰，保留时间依次为2 1 8 3 7 r a i n 、2 3 3 0 0 m i n 和2 4 4 9 9 m i n ，其中保留时间在2 3 3 0 0 m i n 时对应的物质含量最大。经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪分析，水解液中含有四 种不同分子量的肽类物质，其分子量分别为：7 1 2 4 d a 、8 2 6 6 d a 、1 1 0 1 2 d 棚1 3 2 6 i d a 。 关键词：林蛙油，酶解，小分子肽 p r e p a r a t i o no fr a n ao v i d u c tm i c r o m o l e c u l ep e p t i d ea n d r e s e a r c hf o ri t s m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , r a n ao v i d u c tw a st h es u b s t r a t e ，c a r o i d , a l k a l i n ep r o t e i n a s e ，e x t r a n a s e ，p e p s a s ea n d c o m p - p r o t e a s ew e r ee m p l o y e dt oh y d r o l y z es u b s t r a t e ，t h ee f f e c to fe n z y m o l y s i sw a sd e t e r m i n e db y d e t e r m i n i n ge n z y m ea c t i v i t y , s u b s t r a t e sd e g r e eo fh y d r o l y s i sa n dc o n t e n to fa c i d - s o l u b l ep e p t i d e 、f r e ea m i n o a c i d si nt h ed i g e s t t h er e s u l tw a s t h ee n z y m ea c t i v i t yo fc a r o i da n da l k a l i n ep r o t e i n a s ew e r eh i g h e rt h a nt h e o t h e rt h r e ee n z y m e s ，510 u m g , 3 5 0 u m gr e s p e c t i v e l y ；d e g r e eo fh y d r o l y s i sw a sh i g h e r ，12 3 a n d1 1 8 r e s p e c t i v e l y ；t h ec o n t e n to f a c i d - s o l u b l ep e p t i d ec o n t e n tw a sh i g h e rr e l a t i v e l y , 4 3 7 a n d5 0 3 r e s p e c t i v e l y ； t h ec o n t e n to ff r e ea m i n oa c i d sw a sl o w e rr e l a t i v e l y , 0 4 2 m g m la n d0 5 6 r e s p e c t i v e l y i ns u m m a r y , c a r o i d a n da l k a l i n ep r o t e i n a s ew e r ee m p l y e dt op r e p a r ea c t i v ep e p t i d e r a n ao v i d u c tw a sh y d r o l y z e db yc o m b i n a t i o no ft w oe n z y m e s f i r s t l y , s u b s t r a t ew a sh y d r o l y z e db y e m p l o y i n gc a r o i d ，t h ee f f e c tt od e g r e eo fh y d r o l y s i s a n df r e ea m i n oa c i d si n d i g e s tb ys u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n 、e n z y m ea m o u n t , h y d r o l y t i ct e m p e r a t u r e , p sa n dh y d r o l y t i ct i m ew e r ed e t e r m i n e db ys i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t , i m p o r t a n tf a c t o r sw e r es c r e e n e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t t h eb e s tt e c h n o l o g y c o n d i t i o nb yc a r o i dw a s t e m p e r a t u r e6 0 ，p h6 5 ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a e t1 ，e f f l z y m ea m o u n t1 5 ， h y d r o l y t i ct i m e3 0 h o nt h eb a s eo ft h ea b o v ee x p e r i m e n t , a l k a l i n ep r o t e i n a s ew a se m p o l y e dt oh y d r o l y s i s a g a i n f i r s t l y , s i n g l ef a c t o rw a se m p l o y e d ，t h a nt h eb e s tt e c h n o l o g yc o n d i t i o nb ya l k a l i n ep r o t e i n a s ew a t q ： t e m p e r a t u r e5 0 。c ，p h8 0 ，e n z y m ea m o u n t0 8 7 5 , h y d r o l y t i ct i m e3 0 h s u b s t r a t e sd e g r e eo fh y d r o l y s i s a n dc o n t e n to fa c i d s o l u b l ep e p t i d ei nd i g e s tr e a c h e d18 4 a n d7 8 6 r e s p e c t i v e l y , w h i c hw a s5 6 a n d 3 0 2 h i g h e rt h a ns i n g l ee n z y m eh y d r o l i z a t i o n t h ed i g e s tw a ss e g r e g a t e db ys e p h a d e xg - 1 5g e lc o l u m n p o l y p e p t i d em o l e c u l a rw e i g h tb e t w e e n 3 0 0 1 3 5 5 d ao c c u p i e d4 1 3 o fa l le l u t i n gp e a l 【a r e ai nd i g e s tb yc a r o i dh y d r o l i z a t i o n , h i g h e rt h a n1 3 5 5 d a o c c u p i e d3 8 ，l o w e rt h a n3 0 0 d ao c c u p i e d2 0 7 p o l y p e p t i d em o l e c u l a rw e i g h tb e t w e e n3 0 0 1 3 5 5 d a o c c u p i e d3 8 2 o fa l le l u t i n gp e a l ( a r e ai nd i g e s tb ya l k a l i n ep r o t e i n a s eh y d r o l i z a t i o n , h i g h e rt h a n13 5 5 d a o c c u p i e d4 2 6 l o w e rt h a n3 0 0 d ao c c u p i e d1 9 2 p o l y p e p t i d em o l e c u l a rw e i g h tb e t w e e n3 0 0 - 1 3 5 5 d a o c c u p i e d5 2 6 o fa l le l u t i n gp e a l 【a r e ai nd i g e s tb yc o m b i n a t i o no f t h ea b o v et w oe n z y m e sh y d r o l i z a t i o n , h i g h e rt h a n1 3 5 5 d ao c c u p i e d31 5 ，l o w e rt h a n3 0 0 d ao c c u p i e d15 9 h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dl a s e rd e s o r p t i o nt i m e - o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r yw e r e e m p l o y e dt oa n a l y z ea n dd e t e c t et h ed i g e s t t h e r eh a v eb e e nt h r e ec h r o m a t o g r a p h i cp e a t , r e t e n t i o nt i m ew a s 2 1 8 3 7m i n , 2 3 3 0 0m i na n d2 4 4 9 9m i nb yt u r n s t h ec o n t e n to f m a t e r i a lw h i c hr e t e n t i o nt i m ew a s2 3 3 0 0 w a sm a x i m a l t h e r ew e r ef o u rm o l e c u l a rw e i g hp e p t i d e ，m o l e c u l a rw e i g h sw e r e7 1 2 4d a , 8 2 6 6d a , 1 1 0 1 2 d aa n d13 2 6 1d ar e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：r a n ao v i d u c t , e n z y m o l y s i s ，m i e r o m o l e e u l ep e p t i d e i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了 谢意。 学位做作者妣黻签字吼瑚年月咖 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 的全部或部分内容。 学位敝储躲相谴蜘签邦期：川年多月驹 导师 签字日期：以年多月侈咱 吉林农业大学硕士学位论文林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 第一章引言 林蛙油( o v i d u c t u sr a n a e ) 又名田鸡油、蛤蟆油、哈什蚂油。系蛙科动物中国林蛙雌性 成体的输卵管干燥后形成的脂肪状物质。“哈士蟆”、“哈蟆油”为满语，在历代本草中 均有相关记载。本草图经( 宋苏颂) 嘏墓项下：“又有一种大而黄色，多在山石中 藏蛰，能吞气饮风露，不食杂虫，谓之山蛤，山人亦食之，此主小儿劳瘦及疮疾等最良。 本草纲目转述了本草图经中对山蛤的描述，并将其从嘏墓项下分出单列，以示其 体型、生态、颜色上与一类有别。由于古本草对其描述简单，比较看来，中国林蛙与本 草图经和本草纲目中山蛤的描述比较接近。明确记载哈士蟆、哈士蟆油的文献资料 最早出现在清代。清乾隆三十七年( 公元1 7 7 2 年) 始著的四库全书盛京通志卷一 百“物产中有：“山蛤多伏岩中，似暇而大，腹黄红色，俗呼哈什蟆，向亦弃贡。 的记述。此描述不仅与本草图经和本草纲目中所记极为相似，同时指出山蛤的俗 称为哈士蟆，当时已认定哈士蟆与古本草之山蛤为同一物。辽海丛书沈故篇卷三中 有：“哈士蟆形似田鸡，腹有油如粉条，有籽如鲜蟹黄，取以作羹，极肥美，然惟兴京一 带有之，满洲人用以祀祖，取其洁也。的记述。以上可以看出，林蛙油起初在东北民间 作为美味食品应用，使用过程中发现具有明显的滋补强壮功效，达到“人所珍视 的程度， 以致成为名贵药材与补品【l 】。中国林蛙油含有人体需要的多种营养成分，近代，经中医多 年临床实践证明：中国林蛙油生用或与其它中药配伍，具有健脾胃、滋阴补肾、补虚退热、 润肺生津和利水消肿的功能。如今，中国林蛙油已经成为海内外畅销的医疗保健品。 1 1 林蛙油 1 1 1 林蛙油的化学成分 我国学者从2 0 世纪8 0 年代开始对林蛙油的成分及生物学活性进行研究，迸一步证实 了林蛙油的部分药理作用。 1 1 1 1 一般成分与甾体 王丽兰等对产自吉林省的林蛙油进行了一般成分测定，分析了1 8 种氨基酸所占百分 含量。并采用沙氏丙酮回流提取、氧化铝层析及硅胶薄层层析分离得到雌二醇、维生素a 和胆固醇 2 1 ；1 9 8 5 年，王春霖等人用放射免疫的方法对林蛙油的甾体激素进行了分析， 结果表明：林蛙油中含雌二醇5 2 3p g l o o m g + 5 8 9 p g l o o m g ，孕酮1 8 7 9 p g l o o m g + 1 9 4 p g l o o m g 。应用脂溶性成分对杂种小自鼠雌体进行催情实验，证明：林蛙油可以促进幼 鼠性成熟，其中雌二醇含量高，作用就强【3 】；1 9 9 0 年王丽兰等又分析了林蛀油中核酸含 量 4 1 ；1 9 9 6 年，吴千红等对1 - 3 龄中国林蛙的油、卵和去内脏躯体中氨基酸组分进行了测 定比较，并对其营养价值做了初步评价。结果表明：不同部位的氨基酸含量及必需氨基酸 模式不同，油中氨基酸含量最低，油的质量与蛙龄有一定的关系，从化学分析看以3 龄蛙 l 吉林农业大学硕士学位论文 林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 油最佳，3 龄蛙油越冬前后比较，并未显出明显差异1 5 j 。 1 1 1 2 固醇类 赵文英等利用硅胶柱层析、石油醚乙醚乙酯梯度洗脱，从石油醚提取物中分离鉴定 了3 个化合物，通过理化性质及波谱分析分别确定为胆甾3 ，6 乙酮( a v ) 、甾醇( a v i ) 和胆甾4 烯3 酮( a r v ) 。其中a v 和a 为首次从该属动物身上分离得到【6 】。 1 1 1 3 脂肪酸、酯类、磷酸类及氨基酸 磷脂是一切组织细胞不可缺少的成分，对维持生物膜结构的完整与功能，以及对维护 人体正常的生理机能有重要意义 7 1 。据报道，磷脂具有溶解和清除某些过氧化脂质、调节 内分泌体系、延缓衰老等作用【8 j ；1 9 9 0 1 9 9 3 年间，崔香顺等测定4 批林蛙油中总磷脂的 含量，其变动范围在0 6 8 1 0 1 唧；刘磊等采用高效液相色谱法分别对哈士蟆卵油和哈 士蟆卵渣中的磷脂含量进行了测定，发现其中均含有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂 1 0 l ；卫功庆对林蛙油与青蛙油脂肪酸及胆固醇做了比较研究，结果表明：二者均含有2 0 种脂肪酸，林蛙油中独含有1 4 碳不饱和脂肪酸，而青蛙油中独含有2 4 碳饱和脂肪酸，胆 固醇在林蛙油及青蛙油中的含量分别2 1 2 m g k g 和4 9 2 m g k g1 1 1 】；赵文英等对林蛙油石油 醚提取物中分离出的脂肪酸进行了分析，检验出1 6 种经甲酯化处理的脂肪酸和6 种脂肪 酸乙酯。林蛙油中脂肪酸的多次分析结果表明：林蛙油中含有1 2 种脂肪酸，其中不饱和 脂肪酸5 种，饱和脂肪酸7 种，比例约为3 ：2 。林蛙油的脂肪酸中1 1 十八碳一烯酸甲酯 的含量最高达4 4 2 5 ，1 4 甲基十五碳酸甲脂为2 6 7 3 1 2 1 e 1 1 1 4 脂溶性维生素类 1 9 9 1 年林纪娴等又对中国林蛙与中华大蟾赊输卵管几种脂溶性维生素进行了比较分 析【l 引，其维生素a ，d ，e 对机体的生长发育、健康强壮、延缓衰老诸方面都有重要作用。 林蛀输卵管中此3 种脂溶性维生素含量均较高，分别为蟾赊输卵管的1 5 3 倍、1 5 2 倍和 1 7 3 倍【1 4 1 。 1 1 1 5 微量元素 于中泽等测定了林蛙油的微量元素，发现锰( m n ) 、铜( c u ) 在微量元素中含量最高【1 5 1 ； 胡鑫、刘成柏等采用电感偶合等离子发射光谱仪测定了微量元素的成分，结果表明：林蛙 油中含有多种微量元素，尤其是钾、钠、钙、铁、锌、铬含量较耐16 】；王秋雨等将林蛙 油和青蛙油的微量元素进行了比较，发现林蛙油及青蛙油含有丰富的钾、钠、钙、镁、铜、 锌、铁、锰、硒等微量元素。这些元素的存在使得林蛙油具有丰富的营养价值及对机体代 谢平衡的调节能力，而两者均含有对人体有害的重金属元素铅、汞、砷，前者的含量远低 于国家规定的食品卫生标准限量，后者铅、汞、砷的含量超过标准的4 倍和2 倍，不宜食 用 1 7 1 ；李媛媛等采用等离子体发射光谱法对不同产地的无机元素的含量做了分析，结果 表明：国产哈蟆油与俄罗斯产哈蟆油所含的人体必需元素含量相近，从元素的种类与含量 的比较分析来看，推断俄罗斯产哈蟆油可以代替国产哈蟆油入药，但需要进一步做动物实 2 吉林农业大学硕士学位论文林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 验【1 引。 1 1 2 林蛙油的研究现状 1 1 2 1 国内研究现状 目前国内主要从林蛙油的制取、鉴别、性状特征、理化性质、药理作用等方面的研究。 这里主要从功能特性上介绍林蛙油的药理作用： 镇咳祛痰作用 林蛙油具有补肾益精、润肺止咳之功效，临床用于治疗肺热咳嗽等【1 9 2 1 】；中华人民 共和国药典中记载：林蛙油有治疗肺疥、咳血等功效；刘玉兰等人通过药理实验证实： 林蛙油能延长s 0 2 和浓氨水致小鼠咳嗽的潜伏期，减少咳嗽次数，使小鼠酚红排出量及 大鼠痰液的排出量增加，表明林蛙油有显著镇咳祛痰作用。林蛙油的甲醇及石油醚提取物 也有不同程度的镇咳祛痰作用，甲醇提取物镇咳作用强于石油醚提取物，而后者的祛痰作 用略强于前者 2 2 , 2 3 】。 对生长发育和性功能的影响 林蛙油能提高小鼠的抗疲劳能力，其甲醇和石油醚提取物也具有不同程度的抗疲劳作 用：林蛙油能明显抑制大黄甘蓝大油所致体虚小鼠的体重减轻，能明显促进雌性小鼠的性 成熟；维生素、胆固醇、雌二醇及1 8 种氨基酸可能是对抗由氢化可的松造成的阳虚型小 鼠的有效成分；林蛙油能够明显提高果蝇的交配率( 提高幅度1 3 8 3 4 3 6 2 ) ，对性功能 有一定的改善和促进作用，且存在量效关系【2 4 之6 】。 对机体免疫功能和应激性能的影响 高燕玲等将甘肃产的林蛙油饲喂小鼠，发现林蛙油有增强机体免疫力的功能；肖向红 的研究证实：林蛙油能提高正常小鼠常压耐乏氧的时间，显著提高小鼠游泳耐力和耐寒冷 能力，较对照组提高了6 9 7 3 9 0 9 0 和4 5 1 1 4 5 8 1 。并能够增加免疫器官重量，提 高单核吞噬细胞的吞噬功能 2 3 , 2 7 】。 抗氧化和抗衰老作用的研究 1 9 9 8 年，刘玉兰等用林蛙油喂饲果蝇4 0 天后在5 低温环境下测得存活率比生理盐 水组提高了1 1 9 1 6 1 ，脂褐质( l p o ) 含量下降了1 0 4 1 5 5 。灌喂林蛙油的小鼠肝、 脑过氧化脂质含量下降，s o d 活性升高【2 8 】。 1 - 1 2 2 国外研究现状 1 9 3 4 年，日本学者久保田晴光等对林蛙油进行了成分分析，结果表明：林蛙油的主 要成分为蛋白质，占油总量的5 6 3 ( 纯蛋白质4 0 7 1 ) 。从蛋白质中分解得到1 0 余种氨基 酸，它们的含量分别为：谷氨酸1 2 9 ，甘氨酸8 5 8 ，缬氨酸3 7 8 ，羟脯氨酸7 7 4 ， 酪氨酸5 , 2 1 。此外，蛙油中含脂肪4 3 7 ，碳水化合物9 6 5 ，氮9 0 4 ，无机物3 9 6 ( 其中灰分3 7 ，磷0 2 6 ，还有微量的硫) 。同时实验还介绍了林蛙油性状及其吸水膨 3 吉林农业大学硕士学位论文 林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 胀的特性【2 9 1 。 1 9 4 0 年寿田文次郎等日本学者，以吉林产的林蛙油进行了化学成分及药理的研究， 文中阐述：林蛙油极富吸水性，成分大半为蛋白质，水分6 1 1 ，脂肪3 7 4 ，无氮有机 物2 7 2 1 ，含氮有机物4 9 4 6 ，矿物质3 7 6 ，并含有相当量的磷、硫及多种激素、维 生素a 和维生素d 等。1 0 0 9 林蛙油可释放出1 4 5 1 8 k j 的热能。其药理试验还表明：林蛙 油对小白鼠的生长发育有良好的影响，且能延长雌性小白鼠的兴奋期【3 0 】。 1 1 3 中国林蛙油产品的开发 中国林蛙全身都是宝，除了直接利用中国林蛙外，林蛙的头、皮、肝、胆、油、卵等 都可以进一步进行深加工，开发医药卫生、化妆美容及营养保健等名、特、优、稀、新的 名牌产品。蛙皮可以提取肾上腺素，在医疗上有广阔前景；林蛙卵可以提取“蛙卵油”，富 含雌二醇激素，蛙卵还可以提取卵磷脂；林蛙油用酸水解，制成水解蛋白口服液；以林蛙 油提取物为主要成分的化妆品，是理想的美容护肤佳品，对治疗痤疮和祛除老年斑有明显 疗效。 目前市场上已开发的保健品主要有胶囊和饮品两类：胶囊类( 如丽人丸) ；饮品又可分 为两类，固体( 如雪哈晶) ，液体( 如林蛙乳等) 1 。 雪哈油生物护肤营养霜：专利受理号为0 0 1 2 7 5 9 5 x 。本发明为一种含有复合多肽生物 活性因子的雪哈油生态护肤营养霜及其制备方法。本产品具有滋润和保湿皮肤、延缓衰老、 软化角质层、祛除色斑，对更新皮肤细胞，扩张微血管，使皮肤娇嫩洁白有特殊功效。 冰蛤王饮料：冰蛤王饮品以林蛙油为主要原料，精选鲜牛奶，天然蜂蜜，长白山优质 矿泉水等调制而成。其中尤以林蛙油的营养保健价值最高。本品适口性强，味道醇， 奶白色，小孩咳嗽，一喝见效，具有回归自然的甜香。其上乘的质量，精美的包装，独特 的功效，内外质量和谐统一，高档次口感。 复方哈什蟆油n n 专利号为0 0 1 2 7 31 5 9 ，以具有增强免疫功能、固本培元、滋阴强 肾的蛤什蟆油、2 4 味中草药、经专性培养基培养的多种特殊微生物及其代谢产物为原料， 利用现代高科技手段( 超临界萃取、粉碎) 深加工为胶囊制剂。 林蛙油粉胶囊：本品是中国林蛙油，经干燥灭菌而制成的特殊营养食品，是一种含有 天然无污染的高蛋白、低脂肪和多种维生素的高级补品。 雪蛤饮料：由本研究室研制，香港乐陶陶有限公司生产，以林蛙油为主要原料，结合 大枣、枸杞、冰糖等辅料，调制成具有消暑、强肾等功效的功能性饮料。 食品系列：辽宁省岫岩县中国林蛙开发有限公司，用林蛙浸出液和蜂蜜、枸杞子、甘 草等生产出中国林蛙酒王、酒神、酒霸系列产品，并获得国家专利；辽宁新宾县还致力于 开发无污染、高营养中国林蛙绿色食物，现已研制出香酥林蛙排、香酥林蛙蹼、速冻林蛙 精肉等。 4 吉林农业大学硕士学位论文林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 综上所述，林蛙油具有极好的营养价值和保健作用，今后，随着中国林蛙深加工科技 水平的提高，必将有更多、更新的以林蛙为主要原料的医药、化妆、保健等新产品问世， 亦将进一步推动我国林蛙产业朝着规范化、产业化的方向发展，但特别是以林蛙油为原料 采用酶解技术生产肽类产品目前未见报道。 1 2 生物活性肽 天然食用蛋白质除提供人体合成蛋白必需的氨基酸及能量外，还发现蛋白质具有一些 特殊的生理功能，即所谓的蛋白质第三机能( t e r t i a r yf u n c t i o n ) 。近年来，对生物活性肽 ( b i o l o g i c a la c t i v ep e p t i d e sb a p ) 的研究引起了食品学界的广泛重视( 3 2 4 4 1 。研究者们发现蛋 白质经水解后得到的多肽，有比原蛋白质更好的营养性；特别是m a t t e w s 等课题组的研究 成果告诉人们，蛋白质经消化道酶作用后并不一定以完全游离氨基酸的形式被吸收，而主 要以低肽( 特别是二肽、三肽) 的形式被吸收。通过生物代谢实验也证实了低肽的吸收率比 游离氨基酸大，且比氨基酸更易、更快通过小肠黏膜而被机体吸收利用【3 5 ，3 6 1 。因此，可 以利用低肽为那些由通常饮食不能充分满足蛋白质需要的特殊人群补充蛋白质；同时，低 肽比游离氨基酸的渗透压低，吸收率高，食后不会引起腹泻等不良反应；低肽又具较低抗 原性，不会引起过敏反应。此外由于低肽结构的多样性和复杂性决定了其在细胞生理和调 节代谢功能上有活性作用，大量的研究证实了一些低肽有增强免疫、抗菌、抗病毒、抗氧 化、降血脂、降低胆固醇和降血压、促进矿物质吸收、激素调节、酶调节等作用；一些研 究人员成功的利用动植物蛋白制得了降压肽、免疫调节肽、抗氧化肽等【3 7 4 1 】。生物活性肽 是蛋白质中2 0 个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结 构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。食用安全性极高，是当前国际食品 界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。 生物活性肽( b a p ) 是一类具调节机体新陈代谢、参与生命活动调节的肽类物质。体内 肽类激素、神经递质和调质参与组成以中枢神经系统为核心的复杂调控体系，使得整个机 体能对机体内外环境变化作出快速、准确的反应。此类物质是由动物体自身合成的具特殊 生物活性的功能肽，被称为内源性生物活性肽( e n d o g e n o u sb i o l o g i c a la c t i v e p e p t i d e s ) 。而那 些源于机体外，蕴藏于天然蛋白中，在蛋白酶作用下才能释放出来，发挥生理调节作用的 肽类物质为外源性生物活性肽( e x o g e n o u sb i o l o g i c a la c t i v e p e p t i d e s ) 。这类肽分子量较小， 在构象上较松散，具有多种生物功能，因此常常被称为功能肽 4 2 】。 1 2 1 内源性生物活性肽 生物体中存在许多活性肽，它们具有不同的空间结构和生物功能，参与重要的生命活 动。因此，活性肽一直是生物化学和生物药物研究中的一个热点。随着分离技术和结构鉴 定等研究方法的飞速发展，越来越多的活性肽被认识。 1 2 1 1 源性激素肽 5 吉林农业大学硕士学位论文林蛙油小分子肤的制备及其分子量分布研究 ( 1 ) 甲状腺甲状旁腺索；( 2 ) 下丘脑垂体激素；另外还有甲状旁腺素释放肽( p t h r p ) 等。( 3 ) 胃肠道调节肽：胃泌素( g a e t r i n ) 、胃动素( m m i l i n ) ，胃抑素( g i p ) ，神经降压素 ( n e u r o t e n s i n ) 、血管活性肽0 ，i p ) 4 3 , 4 4 1 。最近研究发现了一些新的激素调节肽，如从猪胰脏 中提取的胰岛素增效肽和胰岛素拮抗肽，起着调节胰岛素水平的作用。从猪脊髓提取到的 n e u r o m e d i nu 能够强烈收缩鼠子宫平滑肌，而且使鼠血压升高并诱导促皮质素和皮质酮 释放【4 5 1 。 1 2 1 2 多肽生长因子类 已发现人和哺乳动物体内存在各类生长因子( g r o w t hf a c t o r s ) 能强烈促进细胞生长，对 细胞分化、生长、增殖及功能都有调节作用。有胰岛素( i n s u l i n ) ，胰岛素样生长因子 i ( i g f i ) 、胰岛素样生长因子- i i ( i g f - i i ) 、表皮生长因子( e g f ) 、转化生长因子( t g f ) 、神经 生长因子( n g f ) 、血小板源生长因子( p d g f ) 、促红细胞生成素( e p o ) 等。此外，还含有白 细胞介素等细胞因子 4 5 , 4 6 。 1 2 1 3 神经肽 自从从猪脑提取液中发现甲硫脑啡肽和亮脑啡肽以来，已发现十几种内源阿片肽，如 孤啡肽( o r p b a n i n ，o f q ，f q ) ，p - 内啡肽( p - e d n ) ，强啡肽( d y n o r p h i n ，d y n ) ，脑啡肽 ( e n h e p h a l i n ，e n k ) 。并对其生理、药理作用做了深入的研究。研究发现，阿片肽一级结 构n 末端均为t y r - g l y - g l y - p h e 结构，提示其功能的相关性。阿片肽的6 、l c 、“三种受体 介导很多生理反应，从而发挥其生物学效应。 1 2 1 4 抗菌肽 抗菌肽是动物机体具有天然免疫力的重要原因，最先被认为是一些微生物产生的拮抗 或杀死其它微生物的小肽。随着认识的深入，发现在哺乳动物体内也有类似物质存在。这 些抗菌肽尽管在长度上不同，但几乎所有的抗菌肽在木质上都是阳离子型的，两亲结构是 它们的共同特征。对抗菌肽作用机制的研究表明【4 7 】，昆虫抗菌肽活性的作用位点是在质 膜上形成离子通道性质的孔道，使细胞内外渗透压改变，细胞内溶物尤其是钾离子大量渗 出，致使细菌死亡。哺乳动物的抗菌肽杀菌活力在于依次穿过细菌的外膜和内膜，类似于 在质膜上形成离子通道。 1 2 1 5 其他活性肽 免疫活性肽，如干扰素、胸腺肽；运输陛肽，如酪磷肽、谷胱甘肽。 1 2 2 外源性生物活性肽 目前国内外研究的外源性活性肽按其来源主要有乳源性生物活性肽、血清肽、大豆肽、 小麦肽、胶原肽、水产肽、玉米肽、珠蛋白肽、谷胱甘肽等。蛋白质经酶解后可产生多种 活性的多肽，其涉及神经、激素和免疫调节、抗血栓、抗高血压、抗胆固醇、抗细菌病毒、 抗癌、抗氧化、消除自由基、改善氮素吸收和矿物质运输、促生长、调节食品口味、风味、 6 吉林农业大学硕士学位论文 林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 硬度等多重功效。 1 2 2 1 免疫活性寡肽 免疫活性肽( i m m u n o p e p t i d e s ) 是一类由免疫细胞( 淋巴细胞、单核巨噬细胞等) 及相关细 胞( 成纤维细胞、内皮细胞等) 产生的具有调节细胞功能的蛋白质多肽分子，如髓源性防御 素、胸腺素、干扰素等【4 引。此外，还包括来源于致病有机物和来源于食物的免疫诱导肽。 目前，从牛乳、人乳及植物蛋白中获得的不同序列的免疫活性肽共有9 种1 4 9 1 ，这类肽能 够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨嗜细胞的吞噬功能，提高机体抵御 外界病原体感染的能力，降低机体发病率。人乳和牛乳的酪蛋白中检测到了具有免疫刺激 活性肽【5 0 1 ，乳蛋白来源的免疫活性肽包括人乳蛋白来源的v a l g l u - p r o t y r ，g l y l e u - p h e 及牛乳蛋白来源的l e u - l e u t y r ，t h r - t h r - m e t p r o - l e u - t r p ，它们具有刺激鼠腹腔巨细胞 吞噬绵羊红细胞的功能，并可提高老鼠抗感染能力【5 l ，5 2 1 。人免疫球蛋白来源的免疫活性 肽有l y s - p r o a r g ， a r g - g l y g i n - p r o - a r g 等；大豆蛋白和大米蛋白通过合适的酶降解后， 也能产生免疫活性肽，如n - a r g - p r o a r g ，h i s c y s g i n - a r g p r o - a r g ，g l y t y r - p r o m e t t y r - p r o l e u - a r g 等。微生物源的胞壁酞二肽( m d p ) 可增强识别巨噬细胞的功能，加强 宿主对许多病原的非特异性反应【5 3 1 。此外，阿片样活性肽、抗菌肽、乳转铁蛋白z 、抗血 栓转换酶抑制剂等生物活性肽也具有较强的免疫活性。 1 2 2 2 抗高血压活性肽 血压调节中，血管紧张素i i 能引起血管强烈收缩，而血管紧张素i i 是由血管紧张素 i 通过酶转换而形成的。一般认为凡是能抑制血管紧张素转换酶的物质就有降血压的功能 5 3 - 5 5 1 。事实上，在许多蛋白质的酶解物中都有血管紧张素酶抑制剂。同时，在大豆、小麦、 丝蛋白、明胶、海洋鱼类的酶解产物中同样发现了抗高血压肽【5 6 ，5 7 1 ，在一些发酵制品中 也发现抗高血压肽的存在，如酸奶、酱油等。 1 2 2 3 类鸦片活性肽 许多食物蛋白经酶解后都会产生类鸦片活性肽，如小麦、大米蛋白。其功能主要是镇 痛，同时涉及许多生理反应。如源于小麦谷蛋白的胃蛋白酶及噬热菌蛋白酶酶解物的肽序 列有g y y l ) t ，g y y p ，y g g w 和y g g w l 等【5 8 ，5 9 1 。 1 2 2 4 促进矿物质吸收肽 该类肽中目前研究最多的是酪蛋白磷酸肽，是以牛乳酪蛋白为原料，经单一酶或复合 酶系水解，再经分离纯化而得到的含有成簇的磷酸丝氨酞基的肽，其可提高钙、铁、锌等 矿物质的溶解度以及和矿物质结合等方式，从而促进矿物质的吸收【6 0 1 。 1 2 2 5 其它活性肽 美国的m eg r a t h 从楼( t r i c h o s a n t hk i r i l o w i im a x i m ) 根部提取到肽段g l q ，它只杀死爱 滋病毒，对正常细胞无影响，现已进入期临床试验1 6 1 1 。另有报道，茜草( i z u b i a a k a n e n a k 扪 中存在一组高效低毒的抗癌活性环己肽【6 2 1 。在胰岛素、酪蛋白、核糖核酸酶和大豆蛋白 7 吉林农业大学硕士学位论文林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 的酶解物中有促生长且太【6 3 , 6 4 1 。一些研究发现食物中含有环肽( c y e l n ，c l i p ) ，外源给予c h p 可明显显示许多生物活性。食物源环肽的产生可能是食物加工的热操作水解或酶解蛋白所 致。 1 2 2 6 食品感官肽 具有不同氨基酸序列的肽能够增进酸、甜、苦、辣和咸等味觉。通过模拟、掩盖和增 进口味，肽可以被设计用来改善人和动物的适口性。研究发现，赖氨酸二肽是有效的阿斯 巴甜替代品，因为它不含有酯的功能特性，因而在食品加工和贮存过程中更加稳定【6 5 】。 另有报道，啤酒、咖啡、果汁和奶酪中有苦味肽的存在睁，6 7 1 。而牛肉经木瓜蛋白酶水解 可得酸味肽【6 l 】。先后发现了咸味肽、增强风味肽、抗氧化肽和表面活性肽，见表1 1 【鹋6 9 1 。 表1 - 1 感官肽 t a b l e 1 - 1s a n o rp e p t i d e s 1 2 2 7 大豆蛋白源活性肽的功能 大豆多肽具有许多独特的理化性能与生物活性，其氨基酸组成与大豆蛋白十分相似， 必需氮基酸平衡良好且含量丰富，而大豆多肽比大豆蛋白的稳定性要好，溶解性、乳化性 都有所提高【7 0 l 。进入9 0 年代，对大豆小肽的研究成为大豆蛋白改性的研究热点。 动物模型试验证明：大豆蛋白水解产生的肽易消化吸收，可为那些由饮食不能满足蛋 白质营养需要的人员提供氮素营养，如胰腺炎、短肠综合症和c r o h n 氏病患者及婴幼儿、 老年人和运动员等。作为肠道营养液同时可起到降血压、降胆固醇、抗疲劳和抗氧化等生 理功能【7 1 - 7 3 】。关于对免疫影响的报道不多且结果不一致。有报道认为大豆蛋白水解产物中 含有调节免疫的活性肽，有抑制肿瘤的作用1 7 4 1 ；还有的报道认为大豆蛋白水解产生的混 合小肽对免疫有双重的调节作用，即既有正面效应也有负面效应【7 副。 8 吉林农业大学硕士学位论文林蛙油小分子肽的制备及其分子量分布研究 1 3 蛋白质酶解机理和活性肽的制备方法 1 3 1 蛋白质酶解机理 蛋白质在水溶液中，在蛋白酶的作用下，其中的肽键断裂，形成肽链长短不一的多肽 及少量的游离氨基酸，如图卜1 所示： i i i 擎9譬守l ；l 它 一n c c n c c n c c n c c l i；ii l l h r h r l h 魁 i t l 翻时脯；+ o ， ￥? 擎 髫 一一彳一c 一，一导一c 一伊。 h r h 勉 心州4 i 。旷 ! f i i l铲r譬 一一宁一c 一宁一譬一c o h 雕， 图1 - l 蛋自质酶解示意图 f i g 1 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so fp r o t e i n 由图1 1 可以看出，蛋白质在水解过程中，随着其断裂为各种大小不等的多肽及少量 游离氨基酸，溶液中各种多肽和氨基酸的羧基和氨基逐渐显示出其效应，表现为水解液的 p h 值随着水解的进行而下降；同时溶液中的可溶性蛋白质的含量随水解进行逐渐增加。 各种蛋白质酶解过程中采用的检测方法也大多是基于蛋白质酶解过程的这两个特点。在酶 解过程中，正确选择蛋白酶是生产上的关键。现有的蛋白酶种类很多，蛋白酶按水解蛋白 质的方式不同可分为以下几种【7 6 , 7 7 】。 1 3 1 1 内切酶 切开蛋白质分子内部肽键c o - n h ，将蛋白质水解成分子量较小的多肽类。包括动物 蛋白酶，如