（食品科学专业论文）有机相脂肪酶催化合成葡萄糖酯的研究.pdf

摘要 摘要 糖酯是由碳水化合物作为亲水基团，脂肪酸作为疏水基团的非离子表面活性剂，具 有无毒、易生物降解、h l b 值范围广( 1 1 6 ) 及良好的表面活性等优点，并且具有分散 润滑、去污、起泡、调节粘度、防止老化、防止结晶、抑菌性等作用，因此被广泛用于 食品、医药和化妆品等行业，是联合国粮农组织( f a o ) g i 世界卫生组织( w h o ) 推荐使用 的食品添加剂。本文主要研究了葡萄糖脂肪酸酯的合成，单酯的分离纯化，单酯的表面 性质，以及单酯间歇生产工艺的优化。 首先研究了葡萄糖酯的合成及单酯的分离纯化，在丙酮中，利用脂肪酶n o v 0 4 3 5 分别催化合成了一系列葡萄糖酯，包括葡萄糖月桂酸酯、葡萄糖豆蔻酸酯、葡萄糖棕榈 酸酯和葡萄糖硬脂酸酯。采用液质联用( l c m s ) 分析了反应液组成成分，发现只有单 酯和二酯合成，未发现三酯或其它多酯。研究了薄层色谱( t l c ) 分离纯化葡萄糖单酯 的展开剂体系，通过大量试验，得到甲苯：乙酸乙酯：甲醇：水= 1 0 ：4 0 ：4 5 ：1 o ( v ) 的展 开剂体系，将此展开体系作为柱层析色谱的流动相，分别分离纯化出了四种葡萄糖单酯。 利用l c m s 、h p l c 、t l c 对分离纯化出的四种单酯分别作定性和定量分析，结果表明 单酯纯度达到9 8 以上。 优化了葡萄糖月桂酸酯的间歇生产工艺条件，首先考察了不同因素如不同有机溶 剂、脂肪酶添加量、分子筛添加量、酸醇摩尔比、反应时间、反应温度、脂肪酶利用次 数、脂肪酸碳链长度等对单酯产率的影响。在单因素试验的基础上，利用响应面分析法 优化间歇生产工艺，得到葡萄糖月桂酸单酯的最佳生产条件：丙酮中，葡萄糖5 0 m m o l f l ， 加酶量3 0 9 l ，酸醇比1 ：5 ，分子筛量6 8g l 时，在5 0 c 振荡水浴反应3 0 h ，震荡速度 15 0 r r a i n ，此时单酯产量达到8 0 2 。 测定了四种葡萄糖单酯的表面活性，包括：水溶性、亲水亲油平衡值( h l b 值) 、 乳化性、起泡性。采用高效液相法研究了各单酯的水溶性，结果发现葡萄糖酯在水中的 溶解性较小；分别采用理论计算法和水数滴定法确定了c 1 2 c 1 8 四种单酯的h l b 值，水 数法的结果分别位1 1 3 ，1 0 o ，9 3 ，8 5 ；研究了温度，油的种类、脂肪酸碳链、添加 量对葡萄糖单酯的乳化性的影响，并研究了浓度、温度、脂肪酸碳链等对单酯起泡性的 影响。 关键词：脂肪酶催化，葡萄糖酯，分离纯化，响应面分析，表面性质 ab s t r a c t s u g a re s t e r sa r en o n i o n i cs u r f a c t a n t sw i t hc a r b o nh y d r a t ea sh y d r o p h i l i cg r o u pa n df a t t y a c i d sa sh y d r o p h o b i cg r o u p t h e ya r ew i d e l yu s e di nt h ef o o d ，c o s m e t i c ，d e t e r g e n ta n d p h a r - m a c e u t i c a li n d u s t r yb e c a u s ei t sh i g he m u l s i f y i n gc a p a c i t y , n o n t o x i c i t y ，w i d er a n g eo f h l bv a l u e ( 1 16 ) a n db i o d e g r a d a b i l i t y i na d d i t o n ，s u g a re s t e r sh a v et h ee f f e c to f l u b r i a c t i n g ，d e t e r g e n c y ，f o a m i n g ，a n t i a g e i n g ，a n t i - c r y s t a l l i z i n ga n da n t i b a c t e r i ae t c s u g a r e s t e r sa r er e c o m m e n d e df o o da d d i i t i v e sb yf a oa n dw h o t h ep r e s e n t e dp a p e rd e a l s 、i t i lt h el i p a s ec a t a l y z e ds y n h t e s i so fg l u c o s ee s t e r s ，t h e p u r i f i c a t i o no fl a u r o y lm o n o c s t e r s ，t h eo p t i m i z a t i o no fb a t c hs y n t h e s i so fm o n o e s t e ra n dt h e m e a s u r e m e n to fs u r f a c t a n tp r o p e r t i e so fm o n o e s t e r s as e r i eo fg l u c o s ee s t e r s ( 1 a u r o y le s t e r , c a r d a m o me s t e r , p a l m i t i ce s t e ra n ds t e a r i ce s t e r ) w e r es y t h e s i z e di na c t o n es o l v e n tc a t a l y z e db yl i p a s en o v 0 4 35 t h ee s t e r sw e r ei d e n t i f i e d b yl c m s ，w h i c hs h o w e dt h a to n l ym o n o e s t e ra n dd i e s t e r sw e r es y n t h e s i z e d t h eo p t i m a l a g e n tf o rt h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) w a st e s t e da n do p t i m i z e d ，t h ef i n a ld e v e l o p i n g a g e n tw a st h em i x t u r eo fm e t h y l b e n z e n e ，a c e t i ce s t e r , m e t h a n o l ，a n dw a t e rw i t ht h ev o l u r n i c p r o p o r t i o no f10 ：4 0 ：4 5 ：1 0 t h i sd e v e l o p i n ga g e n tw a sa p p l i e d t os i l i c a g e lc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y 嬲m o b i l ep h a s ef o rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fg l u c o s em o n o e s t e r s t h e p u r i f i e dm o n o e s t e r sw e r ea n a l y z e db yh p l c e l s da n dl c m s ，c o n f i r m i n gt h ep u r i t yo ft h e m o n o e s t e r t h eb a t c hs y n t h e s i so fl a u r o y lg l u c o s ew a so p t i m i z e d t h ei n f l u e n c e so fd i f f e r n tf a c t o r s ( o r g a n i cs o l v e n t ，t e m p e r a t u r e ，t i m e ，m o l a rr a t i oo ff a t t ya c i da n dg l u c o s e ，t h ea m o u n to f l i p a s ea n dm o l e c u l a rs i e v ee t c ) w e r es t u d i e d t h em e t h o do fr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i sg a v e t h eo p t i m a lc o n d i t i o n si na c e t o n ea sf o l l o w s ：t h em o l a rr a t i oo fl a u r i et og l u c o s e5 ：1 ，t h e a m o u n to fm o l e c u l a rs i e v e6 8g l ，t h ea m o u n to fl i p a s e3 0 9 l ，t h es h a k i n gs p e e do ft h ew a t e r b a t h15 0 r m i n ，t h et e m p e r a t u r e5 0 ，t h er e a c t i o nt i m e3 0h o u r s t h ec o n v e r s i o nr a t i oo ft h e l a u r i cg l u c o s em o n o e s t e rr e a c h e d8 0 2 i nt h i so p t i m i z e dc o n d i t i o n t h es u r f a c t a n tp r o p e r t i e ss u c ha st h es o l u b i l i t y ，t h eh l bv a l u e ，t h ee m u l s i f i n ga b i l i t y , f o a m i n ga b i l i t y o ff o u rp u r i f i e dg l u c o s em o n o e s t e r sw e r em e a s u r e d 1 1 1 es o l u b i l i t yw a s a n a l y s i s e db yh p l cm e t h o d ，w h i c hs h o w e dt h a tg l u c o s em o n o e s t e r sh a ds m a l ls o l u b i l i t yi n w a t e r t h eh l bv a l u ew a ss t u d i e db yc a l c u l a t i o na n dw a t e rt i t r a t i o n ，t h eh l bv a l u eo ff o u r m o n o e s t e r sc o n f i r m e db yw a t e rt i t r a t i o nw e r e1 1 3 ，10 0 ，9 3a n d8 5r e s p e c t i v e l yw h i c hw e r e h i g h e rt h a nt h er e s u l t so b t a i n e db yc a l c u l a t i o n t h ei n f l u e n c e so ft e m p e r a t u r e ，c o n c e n t r a t i o n ， d i f f e r e n tf a t t ya c i d so nt h ee m u l s i f i n ga n df o a m i n ga b i l i t yo fg l u c o s em o n o e s t e r sw e r ea l s o s t u d i e d i i k e y w o r d s ：l i p a s e c a t a l y z e ，g l u c o s ee s t e r ，r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ，s e p e r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o ns u r f a c t a n tp r o p e r t y i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留，使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，, - q - 以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存，汇编学位论文， 并且本人电子文档的内客和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 导师签名： 盔霆 1 - 皇兹 日期： 第章绪论 第一章绪论 1 1 前言 表面活性剂是具有很强的表面活性，加入很少的量就能显著降低溶剂表面张力和液 液界面张力，改变体系界面状态，从而产生润湿、乳化、起泡、增溶等作用的一类物质。 近年来，表面活性剂已进入食品、化妆品、医药、能源、材料、环境工程、冶金、机械、 电子、农业等领域，作为一种负载“功能 型化工材料，有效地改进相关工艺、提高效 率、改善产品质量、节约能源和改善环境，起着被誉为“工业味精的功能助剂的作用。 表面活性剂工业已成为化学工业发展较为迅速的知识、技术密集型行业之一。 随着人类对环境和资源的日益重视，表面活性剂的生产和开发逐渐向绿色化学方向 发展。突出表现在三个方面川： ( 1 ) 产品的无毒害化：最大限度地降低表面活性剂中的有害物质含量，要求对人体 刺激低，生物降解性能好，逐步限制和淘汰生物难降解的产品。 ( 2 ) 反应过程绿色化：提高反应的选择性，采用绿色催化剂和溶剂，降低环境污染， 例如糖酯的生产由化学法向脂肪酶催化合成法转移。 ( 3 ) 反应原料的可再生化：选用可再生原料已经成为必然趋势。来自动植物的天然 可再生资源( 糖、淀粉、氨基酸、肽，甾醇及油脂等) 在自然界中十分丰富，价格低廉， 由此衍生的表面活性剂具有非常理想的生物降解性和人体安全性，发展空间较大。 因此，随着人类环境意识的日益增强，天然表面活性剂的研究与开发越来越受到重 视。 1 2 天然表面活性剂 1 2 1 天然表面活性剂的定义 严格而言，天然表面活性剂应该是直接来自于动植物等天然资源，经过诸如萃取、 结晶、蒸馏等分离过程而获得的，而不涉及任何有机合成反应。事实上，目前使用的大 多数表面活性剂都不能满足这个要求。因为这种严格意义上的天然表面活性剂尽管在自 然界储量非常丰富，但是它们的提取过程十分复杂和昂贵，获得这些物质的消耗远远超 过合成表面活性剂的成本。 天然表面活性剂的概念常用于更广的范围内。在表面活性剂的结构中，只要极性基 团或疏水基团两者之一来自天然原料，就可称之为天然表面活性剂【2 】。 1 2 2 糖酯表面活性剂 糖酯( s u g a re s t e r ) 是天然活性剂中最具代表性的一类，是糖与脂肪酸发生酯化反 应而生成的一类有机化合物的总称，以糖( 单糖、二糖、多糖，衍生多元醇) 作为亲水 基团，脂肪酸作为亲油基团，表现出良好的双亲性，是一种优良的非离子表面活性剂【3 卅。 糖酯具有良好的乳化、分散增溶、渗透、起泡、粘度调节、防止老化、抗菌等性能，还 具有无毒、无臭、无刺激性、易生物降解等优良特性，可应用于食品、医药、化工、化 妆品、洗涤剂、纺织及农牧业等行业【5 1 。 尽管可用作表面活性剂极性基团的糖有许多种，但从工业化的角度看，仅少数几种 江南大学硕士学位论文 能满足价格、品质和可获得性的要求。这几种糖主要是：来源于甜菜和甘蔗的蔗糖，由 淀粉水解得到的葡萄糖和由葡萄糖氢化产生的山梨醇【6 】。 目前在糖基表面活性剂中，烷基多苷的年产量最大，葡萄糖酰胺次之，而糖酯( 蔗 糖酯、葡萄糖酯、麦芽糖酯等) 的产量较小，但它们的性能优势较大，原料丰富，因此 发展空间较大。 由于以糖基作为亲水性基团，糖酯具有一些独特的功能【_ m 】： ( 1 ) 糖基的引入使表面活性剂具有非常好的生物降解性能和毒理学性质，对皮肤和 眼睛无刺激作用。 ( 2 ) 糖基是含有多个羟基的极性基团，与传统的聚氧乙烯醚型表面活性剂相比，糖 酯具有更强的亲水性和憎油性，这使得糖酯在油水体系中具有更强的界面化学性质。糖 基表面活性剂的溶液性质受温度变化影响较小，因此更适于配方工作；而聚氧乙烯型表 面活性剂在油性界质中饱和度较大，这意味着作为增溶剂、乳化剂和洗涤剂时需要较高 浓度的表面活性剂。 ( 3 ) 糖基具有络合金属离子的作用，一些糖基非离子表面活性剂具有较强的抗硬水 能力，这不仅因为这些表面活性剂为非离子型的，另一个重要原因是糖基可以和c a 什 等金属离子形成水溶性络离子，在这种络离子中c a 没有嵌到糖环中去。 ( 4 ) 糖基使表面活性剂有抗菌性。 1 3 糖酯的合成与应用 1 3 1 糖酯的合成方法 糖酯的最早合成可追溯到十九世纪中叶，通过蔗糖和脂肪酸或酸酐直接酯化，或者 是在吡啶中和脂肪酰氯进行酰基化反应，这些方法的产率低，溶剂毒性大，成本高，很 难实现工业化【l o l 。1 9 4 8 年，以美、英两国为首的西方制糖工业开始了对以蔗糖为化工 原料的研究，并为此成立了国际性的研究机构，从而开辟了一个新的领域：糖化学 ( s u c r o s cc h e m i s t r y ) ，加速了糖酯研究的进展。1 9 5 6 年，o s i p o w 等【l i j 用二甲基酰胺作 为溶剂通过酯交换反应成功地合成出高产率的蔗糖酯，标志着蔗糖酯工业化的开始。 1 9 6 3 年法国m e l l e b e z o m 公司的蔗糖酯年产量达到2 0 0 0 吨，1 9 6 7 年日本三菱公司的蔗 糖酯年产量为1 2 0 0 吨。 由于溶剂法的溶剂价格昂贵而且毒性较大，1 9 6 7 年o s i p o w 等合作开发了丙二醇为 溶剂的微乳法【1 2 】，1 9 7 1 年日本第一制药株式会社实现了该方法的工业化。 2 0 世纪7 0 年代以来，糖酯的研究分为两个方向：一是开发h l b 值为2 1 6 的系列 产品，主要用作食品乳化剂；二是开发脂肪代用品蔗糖聚酯( 平均酯化度6 8 ) 【l3 1 。目 前世界上主要的糖酯生产公司有：日本第一制药株式会社和三菱化学株式会社，美国的 c r o d a 公司和德国的s i s t e m a 和g o l d s c h m i d t g o n g 公司。 我国对蔗糖酯的研究始于2 0 世纪7 0 年代末，目前国内生产蔗糖酯的厂家有3 0 多 个，总产量3 0 0 0 吨左右，其中年产量3 0 0 吨以上的主要有：湛江油脂厂，湛江食品添 加剂厂，大连中兴有机化工厂、金华第二制药厂等。 糖酯的合成方法有多种，按反应状态分，有均相法和非均相法；按工艺条件分，有 2 第一章绪论 溶剂法，无溶剂法，和微乳法等；按反应方式分，有酰氯法，酯交换法直接脱水法和微 生物法；各种方法简要介绍如下。 1 3 1 1 酰氯酯化法 1 9 5 0 年以前，合成蔗糖酯均采用此法。利用脂肪酰氯，在含有氮有机溶剂如氮杂苯、 吡啶中将蔗糖酰基化，得到蔗糖酯。该法可防止聚酯的产生，单酯成分高，适用于低级 脂肪酸蔗糖酯的合成。但溶剂毒性大，价格高，不能用于工业化生产【1 4 】。 1 3 1 2 酯交换法 酯交换法是指在催化剂作用下，糖和脂肪酸酯发生酯交换反应生成糖酯，根据具体 生产工艺不同，酯交换法又可分为：溶剂法、无溶剂法和微乳化法。 ( 1 ) 溶剂法 又称为s n e l l 法【1 5 , 1 6 , 1 7 】，在碱性催化剂( k e c 0 3 ) 作用下，脂肪酸低碳醇酯和蔗糖溶 于共溶剂中发生酯交换。反应结束后，去除溶剂、未反应的醇酯和糖，再以结晶等方式 对产品分离纯化。目前合成糖酯的溶剂除d m f ( 二甲基甲酰胺) 外，常用的溶剂还有 d m s o ( 二甲基亚砜) 、二甲苯、丙二醇和水等。 此法优点是工艺简单反应条件温和，糖不易焦化；收率高，脂肪酸甲酯转化率在9 5 以上。但溶剂d m f 价格昂贵，易燃，有毒，产品不易纯化，所以有一定的局限性，生 产的糖酯可作为洗涤剂和饲料工业的添加剂。 ( 2 ) 微乳法 微乳法是在溶剂法的基础上发展起来的，不含有毒溶剂，反应条件温和，但体系不 够稳定，工艺要求高【1 2 , 1 8 。根据溶剂不同微乳法又可分为：丙二醇法和水溶剂法。 “丙二醇法以丙二醇为溶剂，以无水碳酸钾为催化剂，借助于脂肪酸皂的乳化作用， 使糖和脂肪酸低碳烷醇酯在微乳化状态下进行酯交换反应，反应中不断蒸出溶剂丙二 醇。此法工艺简单，不含有毒溶剂，反应条件温和，溶剂可回收，但由于焦糖化，糖损 失可达1 0 左右，产品间或有着色现象。 水溶剂法又称水乳化法，以水代替丙二醇，使糖、脂肪酸皂在溶剂水中成为均一的 蔗糖一肥皂溶液，然后提高温度，同时加入碱性催化剂和部分或全部原料酯进行减压脱 水即可。该法产品单酯含量高，反应条件温和，反应时间短，但体系不够稳定，原料酯 易发生水解，工艺条件要求高，反应需严格控制温度和压力，避免出现焦糖化现象。 ( 3 ) 无溶剂法 无溶剂法又分为常压法、熔融法、相溶法和非均相法【1 9 。2 0 1 。 常压法又称t a l 法，在常压和无溶剂条件下实现酯交换反应。1 9 7 5 年，英国最大 的砂糖公司t a t e & l y l e 公司利用蔗糖和甘油三酸酯在大量催化剂k 2 c 0 3 作用下进行皂 化，生成了蔗糖酯，其产品可用于洗涤工业。 熔融法将糖、催化剂中性皂( 常为油酸钠、棕酸钾或油酸锂) 和脂肪酸酯混合进行 搅拌，在惰性气体存在下加热到1 7 0 1 8 5 ，经短时间就可溶解或熔融成流动的均态 物质，然后加酸( 常为柠檬酸) 使催化剂钝化，冷却提纯得到产品蔗糖酯。该法反应速 度极快( 4 - - 2 0m i n ) ，收率好，糖酯占反应后混合物重量的4 5 左右。 江南大学硕士学位论文 相溶法【2 l 】借助一种亲和促进剂，如蔗糖酯、肥皂等，使蔗糖和脂肪酸甲酯产生相溶 性，从而实现酯交换。此法反应速度快，着色小，原料酯转化率9 0 以上。 非均相法将糖、脂肪酸甲酯和k 2 c 0 3 在1 3 0 - 1 6 0 。c ，压力1 1 3 3k p a - - , 2m p a 下搅 拌，进行酯交换。此法工艺简单，原料酯转化率为6 0 - - 9 0 ，但催化剂用量大，反应 速度慢。 1 3 1 3 直接脱水法 蔗糖与脂肪酸在酸性催化剂( 对甲苯磺酸) 存在下直接反应，脱水生成糖酯【2 2 1 。此 法步骤简单，但由于酸性催化剂存在，糖易分解，产率低，并且溶剂毒性大，产品纯化 困难。 1 3 1 4 酶法催化合成 随着生物工程技术的发展，人们发现微生物如根霉、肠杆菌、曲霉、假单胞菌、色 杆菌、念珠菌、粘液菌和青霉属的脂肪酶，可以催化糖和脂肪酸反应生成糖酯。据报道， 用一株接杆菌a r t h r o b a c t e r s p l 在3 0 、p h 7 1 0 、含6 8 蔗糖的培养基中生长四天， 经适当代谢控制得到糖酯；将葡萄糖培养该菌所得到的休止细胞悬浮在蔗糖溶液中也可 获得糖酯。 化学合成法有许多缺点，如反应条件剧烈，产品毒性大、成分复杂、分离纯化困难、 产品色泽深等。酶法合成克服了化学法的以上缺点，条件温和、没有毒性物质产生、产 品易于纯化、产品色泽浅。酶法合成得到的糖酯，其临界胶束浓度c m c 值低，表面张 力大，乳化性能、助溶性、泡沫性能等均优于化学合成的产品，并且还具有增强免疫、 抗肿瘤等特殊功能【2 3 彩】。目前，酶法合成是世界上研究较多的方法，也是符合绿色化学 发展趋势的合成方法。 1 3 2 糖酯在食品及相关领域中的应用 糖酯因其高度的安全性和良好的表面活性等优点，已相继被日本、世界粮农组织、 世界卫生组织、欧盟、美国和中国等国家和组织批准作为食品添加剂和药用辅料，世界 粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 食品添加剂标准委员会于1 9 6 9 年承认蔗糖 酯是高效而安全，可无限量加入的食品添加剂。糖酯在食品及相关领域中的应用在以下 几个方面【2 们。 1 3 2 1 乳化剂 糖酯具有较宽的h l b 值( 1 1 6 ) ，既可用于w o 型乳化，又可用于o w 型乳化， h l b 高的糖酯可以制备水包油( o w ) 型乳剂，h l b 较低的糖酯通常用来制备油包水( w o ) 型乳化：糖酯的乳化稳定性好，并且可防止乳蛋白的凝聚和沉淀。在冰淇淋、人造奶油、 起酥油中添加质量分数为0 1 0 。5 的高蔗糖酯除能保持稳定乳化状态外，还能使 油脂凝聚，提高产品的油腻感【3 0 1 。在牛奶糖、果仁糖等油脂较多的糖果中加入质量分数 为o 1 0 5 的糖酯，可提高熔化糖的乳化性，防止油脂分离，还能防止粘牙和对包装 纸的粘附。 1 3 2 2 抗老化剂 糖酯能与淀粉形成络合物，防止淀粉结晶，增强淀粉的抗老化性，因而可增强面制 4 第一章绪论 食品的柔韧性，并且延长货架寿命【3 1 1 。 1 3 2 3 结晶调节剂和粘度调节剂 糖酯对结晶有两方面的作用，低h l b 值的糖酯能抑制食品中脂肪的结晶，而高h l b 值的糖酯又可抑制结晶析出，因此可提高产品的稳定性，。高h l b 值得糖酯有增粘作用， 低h l b 值得糖酯有降粘作用。因此，糖酯常与卵磷脂配合使用，作为巧克力、制糖工 业的粘度调节剂【3 2 】。 1 3 2 4 润湿与分散剂 糖酯的表面活性较强、可以吸附在分散相固体小粒子上，使分散相固体微粒均匀分 散且不易沉淀，呈现出较好的润滑分散性。一些代乳粉、奶粉、可可粉等粉末食品在冷 水或温水中溶解性较差，加入糖酯能使其润滑分散性大大提高，即使在冷水中也能迅速 溶解，而且仍保持食品原有风味 3 3 】。在冷冻饮料和其他加入固体添加剂的饮料或易有糖 结晶生成的食品中加入糖酯能显著提高其稳定性【3 4 】。 1 3 2 5 抗菌剂 糖酯对微生物具有较广泛的抑制作用，其中蔗糖酯对革兰氏阳性菌g + ，特别是形 成孢子的g + 菌的抑制作用较大【3 5 1 。除抑菌作用外，糖酯也能使食品中的抗氧化剂、防 霉剂等充分分散，协同提高产品的保质期。如罐头中加入糖酯有防腐作用，水果和蔬菜 经糖酯溶液浸渍后贮藏，可提高保鲜掣3 6 j 。 1 3 2 6 改善食品的加工性能 糖酯润滑效果好，食品中加入糖酯后可改良性能，风味，并且在加工过程中具有不 粘模具、加工方便、产品外观光亮完整等优点。如在巧克力、糖果、糕点、面包、蛋糕 等中运用就能起到明显的效果 3 7 - 3 8 1 。 此外，糖酯还可广泛应用于日常洗涤化工业、化妆品、医药、农业、发酵工业、纺 织印染业、等多种行x _ 州a 3 9 - 4 0 】。 1 4 非水相酶催化技术的研究 1 4 1 非水酶学的发展 长期以来，人们一直以为生物功能大分子如蛋白质、核酸等只能在水溶液中发挥其 生物功能，这种观点极大地束缚了人们的思想。在非水相中进行酶催化反应早在1 9 1 3 年就有报道，但真正引起人们广泛关注的是1 9 8 4 年，z a k a 和k l i b a n o v 4 q 报道了脂肪酶 在有机溶剂中具有极高的热稳定性和较高的催化活性，可以进行酶催化反应，这一研究 打破了过去认为酶只能在水溶液中反应的观点，引起了人们极大的兴趣。 近几十年来，非水酶学( n o n a q u e o u se n z y m o l o g y ) 的研究十分活跃，现已报道， 酯酶、脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶等水解酶类；过氧化物酶、过氧化 氢酶、醇脱氢酶、多酚氧化酶等氧化还原酶类和醛缩酶等转移酶类中的几十种酶在适宜 的有机溶剂中具有较高的催化活性，可以催化氧化、脱氢、还原、脱氨、羟基化、酯化、 酰胺化、聚合等多种化学反应【4 2 - 4 3 。 与在水相中进行的反应相比，酶在非水相中进行催化反应有许多优点【删： ( 1 ) 在某些情况下可以改变酶对底物的专一性以用于特殊用途； 5 江南大学硕士学位论文 ( 2 ) 提高了非极性底物的溶解度，很多不溶于水或在水中不稳定的产品能用有机溶 剂中的酶来催化生产。 ( 3 ) 抑制依赖于水的某些不利反应( 如酸酐和卤化物的水解) ： ( 4 )酶的热稳定性提高； ( 5 ) 使热力学平衡向有利于合成的方向偏移； ( 6 ) 由于酶不溶于有机溶剂，所以固定化方法简单且不易脱落； ( 7 ) 酶可以通过简单的离心、过滤等操作进行回收； ( 8 ) 从低沸点的有机溶剂中分离纯化产物比水中简单； ( 9 ) 没有微生物的污染。 1 4 2 非水相酶促反应体系 非水相酶催化反应体系有很多种：如有机相体系、无溶剂体系、超临界体系和反胶 束体系等。 1 4 2 1 有机相体系 有机相体系是非水相酶催化体系中用的最多的一种【4 5 1 ，有机溶剂的作用主要有两 点：一是改变水解酶酶作用的方向，使反应向合成方向进行；二是增加疏水性底物的溶 解性。酶的结构在水相和有机相中并没有显著的变化，然而适当的水对酶的催化作用是 必需的，且不同酶的必需含水量不同，在有机相酶催化反应体系中存在相应的最适水含 量。 1 4 2 2 反胶束体系 在水有机溶剂两相体系和微水有机溶剂单相体系中，仅有少数的酶能保持催化活 性。反胶束体系能较好地模拟酶的天然环境，因而大多数酶在反胶束体系中能够保持活 性和稳定性，甚至表现出“超活性”t 4 6 - 4 7 】。自1 9 7 4 年w 色l l s 发现磷酸酯酶a 2 在卵磷脂 ，乙醚水反胶束体系中具有卵磷脂水解活性以来，国外有2 0 多个实验室对5 0 多种酶在 反胶束中的酶学性质作了广泛的研究。 1 4 2 3 超临界流体体系 超临界流体是一种超过临界湿度和临界压力的特殊物质，物理性质介于液体和气体 之间。超临界流体作为酶反应中间介质，具有明显的特点和优点【4 8 l ： ( 1 ) 有似液体的密度、类似气体的扩散性和粘度，因此显示出较大的溶解能力和较 好的传递特性，从而大大降低酶反应的传质阻力，提高酶反应速率。 ( 2 ) 反应底物的溶解性对超临界的操作条件( 如温度、压力) 特别敏感，通过简单 改变操作条件或附加其它设备，可达到反应物和底物分离的目的。 ( 3 ) 无毒、不可燃、化学惰性、易与反应物一底物分离、价格便宜。 这些优点和特点使超临界体系在工业上，尤其是在食品与发酵行业上的应用，具有 广阔的发展前景。 1 4 2 4 无溶剂系统 一般来说，酶反应都是在溶有底物的溶剂中进行的均相反应，选择对底物溶解性好 又不使酶失活的合适溶剂比较困难。无溶剂系统是指反应体系中没有附加的溶剂，只含 6 第一章绪论 有反应物和酶 4 9 】。无溶剂系统具有突出的优点：可避免有机溶剂引起的毒性及易燃问题， 这对于食品、化妆品、药物的生产尤为重要；增大了底物浓度，减少了反应的体积，提 高了产物的浓度；产物易于分离纯化。 另一方面，无溶剂体系中包含底物的液相和含有酶的固相，因此反应速度受到内、 外传质的限制。而且固定化酶的残体也会影响传质过程，同时反应体系黏度大、底物浓 度大，也会影响传质过程，从而降低产物得率。 1 4 2 5 低共熔多相体系 无溶剂系统只适合于底物为液体的反应。g i l l 等首先采用低共熔多相体系进行酶促 肽合成。低共熔混合物，是指两种或两种以上的混合物，在一定组分比率下会表现出比 纯组分熔点低的低共熔点，并且多相共存 5 0 j 。一定组分比率的底物以及适量的水，有时 还要加人一定量的辅助剂，就形成酶反应的低共熔多相体系。这一体系的酶反应具有避 免使用有机溶剂，适于进行食品、药物、化妆品等的生产，并且环境友好；能获得高浓 度的产物，酶易于回收再利用等优点。 应用低共熔多相体系，在调节酶催化特性上受到限制，因为对于特定的反应底物， 只能选择辅助剂来调控，并且调控的弹性有限，因此产量的提高是以损失酶的选择性为 代价的。 1 4 2 6 气体介质体系 酶促反应不仅可以用于液体介质，也可以用于气体介质。当反应底物是气体时，其 反应也可能由酶来催化，在此过程中酶作为固定相，而底物作为流动相流过酶。 1 4 3 啡水相中水对酶活的影响 水是酶蛋白表现出许多特性的决定因素，如酶的活性，酶的稳定性和特异性，水对 于非水相中酶的催化活性构型的获得和维持是必须的，但同时水也是导致酶失活的一个 重要因素，控制好非水相催化体系中的含水量十分关键。 1 4 3 1 水对酶活的有利影响 当酶处在完全干躁的环境中时基本不表现出活性，当水分加入非水相时，它在酶和 有机溶剂中进行分配，酶活则依赖于酶所结合的一部分水量，水分子直接或间接地通过 氢键、疏水键、范德华力等维持着酶分子催化活性所必须的构象。维持酶催化活性构象 的所必须的最少水量被称为“必需水”，只要有“必需水”的存在，即使在宏观的非水 相中酶也有催化活性【5 l 】。不同的酶最适含水量不同。脂肪酶分子只要结合几分子水就会 表现出很高的活力( v a l i v e t y1 9 9 2 ) ，而对于乙醇氧化酶和乙醇脱氢酶，每分子酶蛋白都 要结合上千个水分子才表现出活性【5 2 1 。 1 4 3 2 水对酶活的负面影响 在另一方面，水分与大部分酶的失活作用有关，过多的水会促进酶的聚合，这一过 程一般会导致酶的失活，这也就间接说明为什么在有机相中游离酶粉有时不表现出活力 而固定化酶则表现出活力。同时水与酶的“热失活”密切相关，a z a k s 5 3 1 等人报道，在 水溶液中，猪胰脂肪酶在1 0 0 几乎立刻失活，而在水分含量极低时0 8 0 0 1 5 ，它 在1 0 0 c 下的半衰期长达数十小时。他们对此作出的解释是：水作为一种润滑剂，给酶 7 江南大学硕士学位论文 分子提供了结构上的高度易变形，而脱水则可以使酶分子结构的刚性增强，从而提高热 稳定性。 1 4 4 非水相脂肪酶催化技术 脂肪酶的系统名称是水解三酰化甘油酯键的丝氨酸水解酶( a c y l g y c e r o lh r d r o l a s e s ) ， 广泛存在于原核生物( 如细菌) 和真核生物( 如动物、植物、真菌) 。由于细菌可在条 件极端恶劣的条件下生存，所以近来发现了许多能在极端条件下保持较高活性的脂肪酶 5 4 j 。s i g u r g i s l a d o t t i r l 5 5 等从冰岛的温泉中分离出嗜热菌的脂肪酶在高达8 0 。c 时仍有较高 的活性，f e l l e r 5 6 等从南极海域里分离出属于m o r a x e l l a 系的脂肪酶在4 c 低温下仍有较 高活性。 脂肪酶的天然底物是甘油酯类，研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的 水解反应，在低水环境下( 如有机相中) 脂肪酶可催化其逆反应一酯合成反应，还可以 催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成( 如糖酯) 、多肽合成、聚合物的合成和药物 的合成、天然风味物质的合成、天然抗氧化剂的合成、生物柴油的合成等5 7 5 8 】。 脂肪酶可以从动植物中提取，也可以通过微生物培养得到。由于基因工程技术的发 展，许多新的、纯度更高的、具有特定功能的脂肪酶在原有微生物脂肪酶的基础上通过 基因重组技术先后研发成功【5 引。目前已有多种微生物脂肪酶实现商业化生产，如来源于 哺乳动物细胞的脂肪酶h p l ( h u m a np a n c r e a t i c ) 和h g l ( h u m a ng a s t r i c ) ，来源于真菌 细胞的c a l ( c a n d i d aa n t a r a r c t i c ab ) 和a o l ( a s p e r g i i l u so r y z a e ) ，来源于细菌细胞 的p g l ( p s e u d o m o n a sg l u m a e ) 等。 目前脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、日用化学工业、农业化学工业、油脂化学 工业、洗涤和表面活性剂工业、化妆品、制药行业等许多领域得到广泛的应用【6 0 卅】。 1 5 立题的背景和意义 1 5 1 立题背景 糖酯是一种优良的非离子表面活性剂，采用自然界广泛存在的天然可再生资源糖为 原料，具有广阔的发展前景。当今表面活性剂工业正向绿色化学的方向发展，逐渐要求 产品无毒害化、反应原料可再生化、反应过程绿色化。糖酯作为一种优良的天然表面活 性剂，符合绿色化学的产品无毒害化和反应原料可再生化两大要求，但其反应过程仍需 要进一步绿色化。 目前国内外商业化生产的糖酯全部是由化学法合成的，化学法存在许多不足，主要 包括：反应过程中条件激烈，容易发生糖的碳化和内酯化等副反应，而且由于化学合成 反应对酯键位置的选择性差，酯键数量难于控制，生成产物为多种酯的异构体和副产品 的混合物，产品难于分离纯化，产品色泽较深等缺点【6 2 】。酶法生产具有反应条件温和及 良好的区域和位置选择性，以及明显的立体专一性，产品纯度高、色泽浅的产品，产品 容易分离纯化等优点。酶法生产不仅符合绿色反应过程的要求，并且解决了化学法生产 的诸多缺点，已越来越受到人们的重视旧j 。 目前国内外研究较多并实现工业化生产的仍是以蔗糖酯为主的二糖酯，而对葡萄糖 酯、果糖酯等单糖酯的研究相对较少。采用葡萄糖生产糖酯与蔗糖相比有许多优点，如 8 第一章绪论 葡萄糖含有较少的羟基，酶法生产葡萄糖酯反应过程更简单，副产物更少，单酯转化率 更高、产品的分离纯化更简单等【6 4 1 ，此外，对葡萄糖酯的研究将有利于解决我国国内糖 酯产品单一的问题，有利于实现糖酯h l b 值的系列化。 1 5 2 立题意义 针对以上问题，本文研究了酶法生产葡萄糖酯，采用生物表面活性剂脂肪酶 n o v 0 4 3 5 ，在丙酮中合成了多种葡萄糖酯，通过大量实验探索出了采用柱层析和薄层 色谱分离纯化葡萄糖单酯的分析条件，研究了分离出的葡萄糖单酯一些表面性质，并优 化出葡萄糖单酯间歇生产工艺，提高了单酯转化率。此外，问题的研究将为有机相脂肪 酶催化葡萄糖酯的工业化生产提供理论依据，本项目的研究成果对于其他酶催化生物转 化技术的工业化也具有理论研究价值和现实意义。 1 6 本论文的主要研究内容 1 有机相中酶法催化合成葡萄糖脂肪酸酯( c 1 2 c 1 8 饱和脂肪酸) ，及四种葡萄糖单 酯的分离、纯化、鉴定。 2 葡萄糖月桂酸酯的酶法间歇生产工艺的研究，通过单因素实验和响应面分析实 验，优化单酯间歇生产的最佳工艺条件。 3 研究葡萄糖脂肪酸酯作为非离子表面活性剂的部分理化性质( 溶解性、乳化性、 起泡性、h l b 等) 。 9 江南大学硕士学位论文 第二章葡萄糖脂肪酸酯酶法合成产物的分离和分析 2 1 前言 无论用何种方法合成糖酯，其产物均为单酯、多酯、未反应的糖和脂肪酸等组成的 混合物。对产物进行分析，是对合成工艺进行优化的必要前提。而分析过程中对产物进 行的分离，也为工业分离提供必要的基础。 糖酯的分析不仅包括对反应粗产物的分析，还包括对精制后的产品进行鉴定。前者 可用于进行反应工艺的优化，并为选择合适的精制方法提供方向；后者可用于产品质量 监控，并确定产品应用范围。 对于糖酯反应产物这样的复杂体系，很难用一种方法完成其定性或定量分析，常用 的分析思路是先用适当的方法进行定性检测，然后设法将混合物分离，再对分离后的产 物进行定量和定性分析。 在糖酯的分离方面，常用的方法是色谱分离法，色谱是一种利用物质在固定相和流 动相之间不同的分配比例，达到分离目的的技术。当流动相流经固定相时，被分离物质 在两相间分配，不断经历吸附和解吸的过程，随着流动相不断向前流动，被分离物质间 出现向前移动的速度差异，而达到分离。色谱法的最大特点是分离效率高，而且既可用 于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化，因而广泛用于科学研究和工业 生产。 色谱有许多种不同的形式，按色谱的机理分有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 凝胶过滤色谱、亲和色谱等：按操作形式分有柱色谱、纸色谱、薄层色谱、高效液相色 谱等。硅胶色谱法是柱色谱法的一种，采用硅胶作为固定相，其分离原理是根据物质在 硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较强的物质易被硅胶吸附，极性较弱 的物质不易被硅胶吸附，整个色谱过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。薄层色 谱与硅胶色谱的原理相同，薄层色谱操作简单，常可作为柱色谱之前的一种“预试验”， 来探索硅胶柱色谱的分离条件。 在糖酯的检测方面，气相色谱( g c ) 和气质联用( g c m s ) 【6 5 】也被用来定量和定 性分析糖酯，但需对糖酯衍生化，过程较繁琐。h p l c 是常用的分析手段，但常用的紫 外检测器和示差检测器在用于糖酯的分析时不理想，因糖酯的紫外吸收较弱，而示差检 测器不能用于梯度洗脱1 6 引。最近人们尝试用蒸发光散射检测器，收到了较好的效果【6 7 】。 e l s d ( e v a p o r a t i v el i g h