（食品科学专业论文）基因重组技术优化红霉素发酵菌的研究.pdf

沈阳农业丈学博士学位论文 摘要 红霉素发酵生产属于好氧发酵，需要充足的氧气供应。由于氧在水中的 溶解度较低，距离微生物正常生长的需氧量相距甚远，而供氧不足会导致菌 体生长不良和红霉素产量的下降。要提高红霉素的产量必须提供足够的氧气， 但这将提高红霉素的生产成本。 透明颤菌血红蛋白( v h b ) 是迄今为止发现的唯一一种原核生物血红蛋白， 它与真核生物的血红蛋白具有较高的同源性，在贫氧条件下能够促进细胞旧 生长和蛋白质的合成。利用v h b 在糖多孢红霉菌中表达透明颧菌血红蛋白基 因( v g b ) ，解决红霉素发酵生产中的供氧问题，将对工业生产产生巨大的科学 意义，并可能带来巨大的经济效益。 本文的研究从透明颤菌的筛选入手，并对其进行了生理和生化测试。测 定结果显示：目标菌中血红素的含量非一般细菌可比，就目前所知，这种菌 只能是透明颤菌。对透明颤菌培养条件的研究结果显示，在含有蛋白胨o 3 0 a ， 酵母粉0 7 ，n a a c0 0 2 ，p h7 8 的培养基中1 5 0 r p m ，3 4 ( 2 培养时生长最好。 根据v g b 的核酸序列设计引物，扩增出v g b 基因，并与质粒p q e - 3 0 连接， 构建载体p q ev ，将其转入大肠杆菌中，并通过s d s p a g e 和w e s t e r nb l o t t i n g 分析证明v g b 基因在大肠杆菌中得到了克隆和表达。对转入大肠杆菌的p q ev 中的d n a 序列进行测序，将测序结果与已发表的v g b 基因序列进行比较，同 源性为9 7 ，证明是，啦基因。 根据报道的核酸序列设计引物，分别通过p c r 反应扩增p m e r r 启动子和 糖多孢红霉菌染色体上的两段d n a 片段，与之前扩增的v g b 以及从质粒 p b l l 0 1 中酶切获得的g u s 基因共五段碱基序列，首先在体外连接成片段3 ， 然后再与载体p b l u e s c r i p ts k 经t 4 连接酶连接，得到构建的载体p b l u e v 。 对p b l u e v 进行j ”i 和b s t xi 双酶切，将含有y 庐的一段通过电穿孔转 化法转入糖多孢红霉菌中。提取糖多孢红霉菌转化菌株的基因组d n a ，经 m s ti 和b g li 酶切消化，以扩增的片段1 为探针，进行s o u t h e r nb l o t t i n g 检测， 实验结果证明，啦基因已经整合到了糖多孢红霉菌的染色体中。w e s t e m b l o t t i n g 分析进一步证明，重组菌株能够合成血红蛋白。 本文就v g b 基因表达对糖多孢红霉菌发酵产量的影响进行了研究。对转化 前后糖多孢红霉菌的原始菌株和重组菌株进行补料分批培养，培养结果显示： 重缀菌株与原始菌株相比，总蛋白浓度约低2 7 ，红霉素体积产率提高2 9 ， 这说明重组菌株的比代谢活性得到了显著提高。对重组菌株和原始菌株的发 摘要 的发酵液进行w e s t e r nb l o t t i n g 分析，前者在整个发酵过程中的所有发酵液中 均检出了与阳性对照相对应的清晰v h b 谱带，而后者中未能检出。 本文利用基因重组技术优化红霉素发酵菌株，对于红霉素的发酵生产具 有重大的意义。 关键词：质粒；电穿孔转化；糖多孢红霉菌；血红蛋白：v g b 沈阳农业大学博士学位论文 刖吾 抗生素发酵生产需要充足的氧气供应，由于氧在水中的溶解度较低，距 离微生物正常生长的需氧量相距甚远，而供氧不足会导致菌体生长不良和抗 生素产量的下降。因此，溶氧问题成为抗生素发酵生产的重大问题。 红霉素是由糖多孢红霉菌产生的一类大环内酯类抗生素，在临床上广泛 用于治疗由原核病原体如链球菌、葡萄球菌、支原体、衣原体等引起的感染， 目前每年的需求量都在不断增加。这就要求我们提高红霉素的产量。红霉素 发酵生产属于好氧发酵，要提高红霉素的产量必须提供足够的氧气。目前， 通常采用提高搅拌速度和增加通气量等方法来解决氧气不足的问题，但这往 往对设备的要求较高，需要消耗大量的能量，从而增加生产成本。 尽管研究者利用经典的菌株改良方法如诱变和筛选等对其进行了改良 但发酵获得红霉素的最终效价与其它几种二次代谢物( 如青霉素) 相比仍然 很低。既然用经典的菌株改良方法无法提高红霉素的产量，人们开始将基因 工程等新的研究手段应用于这方面的研究。 然而任何新的方法必须考虑到菌体进行大规模发酵培养时所处的特殊 生长条件。菌体培养过程中处在粘稠、营养丰富、复杂的环境中，在这种条 件下，对数生长期的块状菌丝体所需的氧气可能会受到限制，从而使红霉索 的产量减少。在大规模的生物反应器中提高氧气的利用率是解决这一问题的 有效途径，然而通过提高气液转移率却无法改善块状菌丝体形成过程中氧气 受限的问题。因此，我们试图找到一种能够有效提高细胞利用氧气能力的方 法，从而降低氧能耗，提高红霉素的产量。 透明颤菌血红蛋白( v h b ) 是迄今为止发现的唯一一种原核生物血红蛋 白。它与真核生物的血红蛋白具有较高的同源性。研究表明，v h b 能够与! 氨 结合形成氧合态，并且介入细胞与氧有关的代谢途径，从而改变氧限条件下 细胞的原有生物代谢方式，在贫氧的条件下促进细胞的生长和蛋白质的合 成，并且它的表达随溶氧水平的下降而增加。此特点正适合于传统发酵菌株 的基因改造。 利用透明颤菌血红蛋白基因的分子克隆，能够在细胞内从分子水平上增 强重组菌株对氧的摄取和利用能力，从而在氧限条件下促进细胞生长和产物 合成，实现细胞高密度培养和产品高产率发酵，解决传统发酵过程中由于氧 不足而导致的产率低下和成本高的问题，而且v h b 的应用还不需要附加的 设备投资，这更进一步地降低了发酵成本。可以说，v h b 的发现及研究进展 前言 为利用分子克隆技术解决微生物发酵过程中氧气的供求矛盾及实现高密度 发酵培养提供了良好途径。 目前的资料显示，从透明颤菌中分离得到的v h b 已成功地在多种异源 菌株中获得了表达，这说明基因工程技术应用于抗生素产生菌的改造是可行 的方案，丽构建高产基因工程菌恰恰是工业生产中利用新技术所要达到的目 标。正是由于这些促使我们将这一基因用于提高糖多孢红霉菌中红霉素生物 合成的研究。 利用v h b 在糖多孢红霉菌中的表达，解决红霉素发酵生产中的供氧旧 题，将对工业生产产生巨大的科学意义，并可能带来巨大的经济效益。 沈阳农业大学博士学位论文 第一章文献综述 1 1 透明颤菌血红蛋白的性质及其重组基因的应用研究 透明颤菌( h t r e o s c i l l a ) 是一种专性好氧的革兰氏阴性菌，通常生长在泥 潭、沼泽等贫氧环境中，能够合成透明颤菌血红蛋白( i q t r e o s c i l l ah e m o g l o b i n ， v h b ) ，v h b 是原核生物中迄今为止发现的唯一一种血红蛋白。利用v h b 在 发酵菌株中的表达，能够有效地解决好氧微生物发酵过程中的供氧问题，这 一发现受到了国内外学者的广泛关注。 1 1 1 透明颤菌 1 8 7 0 年，c o h n 描述了一类无色、滑动、细菌状的微生物。直到1 9 4 9 年， 才由egp r i n g s h e i m 培养、描述并命名这种菌为一个新的菌科，即： f i t r e o s c i l l a c e a c e ，并于1 9 5 1 年以菌体藻丝尺寸、形态结构及生长特性等为依 据分类描述了六种透明颤菌( p r i n g s h e i m ，1 9 5 1 ) 。此后，多位研究者对透明颤 菌的菌落形态、结构及特性等方面进行了细致的研究，并取得了大量的成果。 随着研究的深入，透明颤菌属划归为b e g g i a t o a c e a e 科。1 9 8 6 年wrs t r o h l 等指出，所有透明颤菌的细胞壁均包含相应于细胞质膜、肽聚糖层和脂多糖 层的层次结构，因此属于革兰氏阴性菌( s 们1 1 le ta l ，1 9 8 6 ) 。 1 1 2 透明颤菌血红蛋白的结构及特性 d a l eaw e b s t e r 等在1 9 7 4 1 9 7 7 年从透明颤菌中提取并纯化得到了一种可 溶性物质，命名为细胞色素o ( c y t o c h r o m eo ，c y o ) 。通过研究显示，它 在不同环境条件下可呈现三种不同的状态，即：氧化态、还原态以及氧合态， 并可以相互转化。其中，还原态c y o 是生理活性态，两氧合态c y o 则是呼吸 细胞中最重要的稳定形式。细胞色素o 在4 2 0 n m 、5 4 4 n m 和5 7 7 n m 处有最大 吸收峰，若向溶液中鼓入c o 气体，则可形成c y o c o 复合物，在4 2 0 h m 、 5 3 5 n m 和5 6 6 n m ，呈现特征吸收峰( w e b e re ta l ，1 9 8 8 ) 。 直到1 9 8 6 年，人们才认识到从透明颤菌中提取的可溶性c y o 实际上是透 明颤菌血红蛋白( w a k a b a y a s h ie ta l ，1 9 8 6 ) ，它是由两个完全相同相对分子量：白 1 5 7 7 5k d 的蛋白亚基组成的同型二聚体( t r y e e & w e b s t e r , 1 9 7 8 ) ，每个亚基含 有1 4 6 个氨基酸残基( k h o s l a & b a u k y ，1 9 8 9 ) ，并含有两个b 型血红索。研究 表明v h b 与其它的血红蛋白( h b s ) 具有很高的同源性，尤其是与羽扇豆血 红蛋白的同源性高达3 4 。 第一章文献综述 表1 - 1 不同来源血红蛋白的同源性 t a b l ei - 1 c o m p a r i s o no f h o m o l o g yb e t w e e nd i f f e r e n ts o u r c e so f h e m o g l o b i n 注：表内数字为相同氨基酸在序列中的百分比( ) v h b 上的血红素通过与之相连的f e 与其它的配体( c o 、0 2 、c n - ) 结合， 从而发挥作用。透明颤菌细胞中血红素的含量常常受到培养基溶氧高低的影 响，当大气饱和度的1 0 0 降至1 0 时，血红索含量可增加5 0 倍，但当细胞 完全处于无氧状态时，血红素含量比正常含量下降1 5 ( b o e r m a ns & w e b s t ? r d a ，1 9 8 2 ) 。这主要因为血红素生物合成过程中的关键酶一6 一氨基一y 酮 戊酸合成酶在贫氧状况下表达量增加，而在氧气充足时，此酶受氧的抑制。 同时，由于血红素分解代谢途径需要氧化酶的催化氧化，因此溶氧过高只有 利于血红素的分解，而只有在低溶氧的条件下才有助于血红素的合成。但如 果细胞处于完全无氧状态，则又不利于血红素合成过程中的另一关键酶 粪卟啉合成酶的作用，该酶作用时需要氧气的参与，无氧状态也会降低血红 素的量。 从图卜1 可以看出，v h b 不像真核生物的血红蛋白那样形成完整的8 个 螺旋区，而是每个亚基形成6 个螺旋区a 、b 、e 、f 、g 、h ( d i k s h i te t a l ，1 9 9 8 ；t o s h ie ta l ，1 9 9 8 ) 。大多数种类的血红蛋白都有一个末端h i s ( e 7 ) 残基，该h i s 残基与被束缚的氧结合形成氢键来稳定血红蛋白的氧化态。 d i k s h i t ( 1 9 9 8 ) 通过定点突变实验确定，v h b 的结构与大多数血红蛋白不同， 它有一个独特的端口囊( 该端口囊是结合配基的位点) ，并且在e 7 位置的氨 基酸残基不是h i s 而是g l n ，又由于在v h b 中多肽片段p h e - 4 3 ( c d l ) 到 l e u 一5 7 ( e 1 1 ) 之间没能形成a 螺旋( d 螺旋区) 的构象而使得g l n - 5 3 ( e 7 ) 离开 了血红素囊，这样g i n 一5 3 ( e 7 ) 就不能与被束缚的氧形成氢键。因此，v h b 与 被束缚的氧亲合力减弱，氧的解离常数增大，从而使氧的传递速度更快 沈阳农业大学博士学位论文 ( d i k s h i te ta l ，1 9 8 8 ；d i k s h i te ta l ，1 9 9 8 ；y o s h ie ta l ，1 9 9 8 ) 。 c d l e 7 m l d q q ! 丝l k 丛y y l k 曼h g y ! ! i y k 垒世k h p e v r p l f d m g r q e s l e q p k ab e 1 1 a l 鱼l mi y l q n i e n l p a i 址a v k k i a v k 旦q a g v a a a h y pl y 鱼q 基l ! ! ，鱼 efg 些星y l g d a a t d q q ! l 旦型q k a y gy l 旦y el q y 曼旦! 丛q 垒y 垦 h 图卜1v h b 的氨基酸序列和d 螺旋 f i g 1 1t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f v h ba n d t h eas p i r a lp a r t 注：c d l 为核糖体结合位点；a 、b 、e 、f 、g 、h 分别为空间结构中的6 个a 螺旋区 1 1 3 透明颤菌血红蛋白的生理功能 k h o s l a 和b a i l e y ( 1 9 9 0 b ) 用二维电泳分析了v h b 表达前后菌体蛋白的组 成，并未发现有明显差异，这说明v h b 对细胞的促进作用是该蛋白自身的功 能，而不是细胞在基因水平上的二次应答。研究还发现v h b 可与氧结合生成 十分稳定的氧合态，氧合态的形成是v h b 发挥生理功能的必需条件。因此 有人将v h b 的生理功能笼统地描述为v h b 蛋白以氧合态形式直接参与细胞的 生理过程。 针对v h b 在细胞内的生理功能，出现了不同的假说来解释它的具体行为。 早期研究中最为流行的是扩散促进假说( k h o s l a & b a u k y ，1 9 8 9 b ) ，此假说认为 v h b 与氧结合增加了氧在细胞周质空间的传递量。1 9 8 8 年k h o s l a 等在研究中 发现：在大肠杆菌中表达的v h b 有3 5 4 5 分泌到周质空间中( k h o s l a b a i l e y , 1 9 8 8 a ) 。碱基及氨基酸序列分析表明v h b 的n 端功能域信号肽效果不 强，还有大部分v h b 留在细胞质内。此外，大肠杆菌的好氧呼吸器位于细胞 内膜，带有一个朝向细胞质膜的氧结合位点，v h b 正处于氧气来源( 培养基) 和氧的消耗处之间，v h b 的存在促进了氧气扩散进入细胞的作用，提高了氧 气传递到终端氧化酶的传氧通量。v h b 的n 端功能域具有弱输送前导肽的功 能，从而使v h b 分布在细胞周质空间和细胞质内，这一研究结果从一定程度 上支持了扩散促进假说。 第一章文献综述 o r i i 和w e b s t e r 在19 8 6 年指出，v h b 可能作为氧气的载体和贮存物而起 作用，v h b 具有运输氧和传递电子的功能。超微结构研究显示，v h b 合成一f 细胞质中并聚集在细胞膜附近，在限氧条件下能够捕捉氧，并协助氧传递到 生命力旺盛的呼吸膜上( d i k s h i te ta l ，1 9 8 8 ：t o s h ie ta l ，1 9 9 8 ：r a m a n d e ee t a l ，2 0 0 1 ) 。 由于在细胞周质空间也含有大量的v h b ，推测v h b 的n 一末端序列可能是 作为该蛋白的输出信号( d i k s h i te ta l ，1 9 8 8 ) 。v h b 的起始位置有一个由1 6 个 氨基酸残基构成的信号肽，但其n 一末端序列不符合通常的信号肽特征，在运 输过程中它不能被切除，而且也不像大多数运输信号，它对蛋白质的作用是 非常重要的。它的前1 6 个氨基酸残基是构成a 螺旋区的一部分，并且缺乏 n 一末端前1 4 个氨基酸残基的v h b 突变菌株不能结合血红素( d i k s h i te t a l ，1 9 8 8 ) 。这些现象说明，v h b 的n 一末端序列不仅可以作为输出信号，而且 在蛋白质中还具有一定的功能。 针对v h b 对细胞代谢的影响研究者们也做了大量的工作。1 9 9 4 年k a l l l o 和b a i l e y 测定了氧限条件下大肠杆菌中几种能量参数与v h b 的关系，实验中 发现，表达v h b 的细胞中h + 0 、跨膜p h 和a t p 浓度分别是原大肠杆菌的 1 5 、1 6 、和2 倍。进一步利用末端氧化酶c y o 和细胞色素d ( c y a ) 的缺陷 型宿主进行实验，发现在含有活性c y o 而缺失c y d 的菌株中v h b 的促进功能 最为显著( k a l l i oe ta l ，1 9 9 4 ) 。同年c h e n 和b a i l e y 针对v h b 对酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 代谢的影响进行了研究，并且提出了新的见解。 他们认为v h b 可能直接作用于与氧有关的代谢途径如呼吸链，在氧限条件下 碳流分配选择线粒体的乙醛歧化途径，从而促进细胞生长( c h e ne ta l ，1 9 9 4 ) 。 此外，吴交等还提出了末端电子受体假说( 吴奕，1 9 9 5 ) ，他们认为氧合态 v h b 作为末端电子受体参与了大肠杆菌呼吸链的末端氧化过程，并根据这一 假说迸一步定量研究了v h b 对大肠杆菌能量代谢的影响。 到目前为止，尽管我们还没有完全了解v h b 蛋白在分子水平上的作用机 制，但毫无疑问，v h b 与氧结合形成氧合态，并且介入细胞与氧有关的代谢 途径，从而改变了氧限条件下细胞的原有代谢方式。 总而言之，v h b 的作用机制归纳起来有以下几种： 1 、作为电子传递链的一部分接受电子，使氧气还原，产生膜内外电化学梯度， 提高a t p 的合成量，起到末端氧化酶c y o 和c y d 的作用； 2 、增加c y o 和c y d 的含量与活性，使它们更有效地传递电子； 3 、提高有效溶氧，使c y o 发挥更大作用，增加电子传递效率，提高电化学梯 沈阳农业大学博士学位论文 度，产生高量a t p 。 由于透明颤菌中含有与大肠杆菌类似的c y o 和c y d ，因此v h b 在透明颤 菌中可能也起到同样的作用。 1 1 4 透明颤菌血红蛋白基因的克隆、表达和调控 1 9 8 8 年d i k s h i t 和w e b s t e r 测定了透明颤菌血红蛋白基因( i 疆t r e o s c i l l a h e m o g l o b i ng e n e ，v g b ) 的氨基酸序列，并进行了一系列实验。结果发现，w ：6 位于1 4 k b 的h i n di i i s a li 片段上，且此v g b 片段携带内启动子( p v h b ) ，雨 不受载体启动子的控制( d i k s h i t & w e b s t e r ，1 9 8 8 a ) 。同年，k h o s l a 和b a i l e y 进行了一系列v g b 的克隆实验，指出v g b 位于约1 1 k b 的h i n dy t i - s p hi 片段 上，且当馏6 在重组丈肠杆菌中表达时，通过有无i p t g 诱导的对比，同样得 出v g b 由自身启动子启动表达的结论( k h o s l a & b a i l e y , 1 9 8 8 b ) 。 d i k s h i t 和w e b s t e r ( 1 9 8 8 a ) 将克隆的v g b 与透明颤菌的总r n a 进行杂交， 实验结果最终确定了咖的专一性转录产物( v h b ) ，他们发现在透明颤菌中 只存在单拷贝的馏6 ，其m r n a 长度为4 5 0 - 5 0 0 n t ，共编码1 4 6 个氨基酸残基。 同时，在重组大肠杆菌中表达的v h b 的存在状态与透明颤菌中v h b 的存在状 态相一致。这就说明，v h b 重要的功能状态是活性氧合态( o x y h e m o g l o b i n ) ， 缺氧时则转化为还原态( - - 价铁) 。进一步的研究表明，v g b 是编码该转录产 物的唯一基因( d i k s h i t w e b s t e r ，1 9 8 8 a ) 。实验显示，在上述细胞中v h b 般以具有生理活性的亚铁形式存在，而n a d h 高铁血红蛋白还原酶( n a d h 2 m e t h b ) 则是使该状态得以存在的保证( k h o s l a & b a i l e y ，1 9 8 8 b ) 。1 9 8 9 年， d i k s h i t 等人对v h b 表达过程中最重要的两种酶的活性及功能进行了细致的研 究及讨论：一是血红素合成过程所必需的6 2 氨基一2 y 酮戊酸合成酶( a l a s ) ， 二是保持v h b 生理活性亚铁状态所必需的n a d h 高铁血红蛋白还原酶 ( d i k s h i te ta l ，1 9 8 9 ) 。 d i k s h i t 等的进一步研究表明，该基因的表达在转录水平上受氧的调控 ( d i k s h i te ta l ，1 9 9 0 ) 。当哪启动子部分缺失时，它在任何培养条件下都不 能得到表达。实验表明，当v g b 结构基因处于t a c 启动子下游时，其表达受i p t g 诱导( k h o s l ace ta l ，1 9 8 9 ；d i k s h i te ta l ，1 9 9 0 ) 。而v g b 基因的启动子与其它报 告基因( r e p o r t e rg e n e ) 如c a t 、x y e 融合时，这些报告基因的表达也受氧的调 控( d i k s h i te ta l ，1 9 9 0 ) 。 1 9 8 9 年k h o s l a 和b a i l e y 对v g b 做了进一步的研究。研究显示，在重组大 肠杆菌中，y 加启动子的调控处于转录水平且受调控，而v 曲基因上游两个启 动子的存在则表明它在总体表达水平上涉及很多因素。同时，从喈6 中分离到 第一章文献综述 的启动子可以用于好氧菌中克隆基因产品的高水平表达，且不需要昂贵的诱 导剂以及温度突变( k h o s l a & b a i l e y ，1 9 8 9 a ) 。1 9 9 0 年k h o s l a 等又指出，相对 于将内启动子控制下的v g b 基因插入染色体的单拷贝而言，v g b 的多拷贝数并 不能提供更大的生长增量，且单拷贝菌具有更实际意义上的基因稳定性 ( k h o s l ae ta l ，19 9 0 a ) 。 v g b 基因的表达在转录水平上受氧的调控，当溶氧低于1 0 大气饱和度时， 它便被诱导表达( b o e r m a ne ta l ，1 9 8 2 ) 。但溶氧并非直接作用于咏6 启动子上， 而是由f n r 或其相关蛋白作为转录激活因子介入了氧调控的基因表达( t s a ie t a 1 1 9 9 5 ) 。 竺嘉等( 1 9 9 4 ) 也认为细菌应答厌氧环境的调控子f n r 蛋白介入了v g b 基因调控。当细菌处于微氧环境时，f n r 蛋白自身的氧化还原敏感区感应激 活( s h a r r o c k se t a l ，1 9 9 1 ；s p i r oe t a l ，1 9 9 0 ) ，对v g b 启动子具有正调控作用。 实验表明在f n r 缺陷型宿主中v g b 的表达量比普通宿主低几十倍；而这种 f n r 缺陷型宿主在同时表达外源f n r 和v h b 时，v g b 的表达量得到恢复。研 究p 1 上游序列时发现了一段中心对称的反向重复序列t t g a t a ：兀a a ，这段 典型的d n a 结合蛋白的识别序列与f n r 蛋白的识别序列 ( t t g a t a a t c a a ) 仅相差一个碱基。f n r 介入的氧调控模式可由图1 2 表示( k h o s l ae ta l ，1 9 8 ) ，由此发展的基因结构数学模型定量模拟了v g b 启 动子对溶氧变化的应答过程，模拟结果在应答速率、表达强度等方面与实验 值良好吻合( 吴奕等，1 9 9 5 ) 。 0 沈阳农业大学博士学位论文 v , e b 启动f n r 结合序列 a c t i v e 有效结合 a c t i v e ，转录起始复合物 l 合成v g bm r n a 活性v h b 蛋白 q 2 ， 图l - 2 厌氧环境下调控子f n r 蛋白介入v 咖基因调控的机制 f i g 1 - 2t h em e c h a m i s mo f f n r r e g u l a t i o no f v g b i nr e s p o n s et oo x y g e n 。l i m i t e d f n r 蛋白是细菌应答厌氧环境的一个调控子。在缺乏办r 的大肠杆菌突变 体中，p v h b 不能被低氧条件激活。而在f n r 缺陷性大肠杆菌中表达外源办r 与v e , b 时，v h b 的量得到恢复。t s a i 等也证明p v h b 被f n r 激活( t s a ij t a l ，1 9 9 5 ) 。 由此可知，p v h b 是由氧调控的启动子，这种调控作用需要一些胞内因子 的参与。所有这些都说明v g b 基因是其自身启动子在转录水平上受氧调控的结 果。 第一章文献综述 p 2 7 a a g c t t a c a g g a c g c t g g g g t t a a a a g t a t t t g a g t t t t g a t g t o g a t t a p l a g t l 丁t a a g a g g c a a t a a a g a t l l a t a a t a a g t g c t g c l l a c a c c a t a c t g a t g l a t g g c a a a a c c a t a a p 汀a a t g a a c t t a a g g a a g a c c c t c a t g t t a g a c c a g c a a a c c a t t a a c a t ca ，r c a a a g c c a c t g t t c c t g t a t t g a a g g a g c a t g g c g l l a c c a t t a c c a c g a c t t t t t a l h a a a a c t t g t r r g c c a a a c a c c c t g a a g l a c g t c c l l t g t t t g a t a t g g g t c g c c a a g a a t c t t t g g a g g c a 0 c c t a a g g c it 丁g g c g a t g a c g g l 、a 丁丁g g c g g c a g c g c a a a a c a t t g a a a a c a t t g a a a a t t t g c c a g c t a t l l t g c c t g c g g t c a a a a a a a 下t g c a g t c a a a c a t t g t c a a g c a g g c g t g o c a g c a g c g c a t t a t c c g a t t g t c g g t c a a g a a t t g t t g g g t g c g a t t a a a g a a g l ：a t t g g g c g a t g c c g c a a c c g a t g a c a t l l t g g a c g c g t g g g g c a a g g c t t a 甲g g c g t g a t t g c a g a t g t g t t t a t t c a a g t g g a a g c a g 汀t t g t a c g c t c a a g c g g 盯g a a t a a a g l v t t c a g g c c g c l l t c a g g a c a l a a a a a a c g c a c c a t a a g g t g g t c t t t t t a 图1 - 3v g b 基因的主要核苷酸序列 f i g 1 - 3t h ep r i m a r yn u c l e o t i d es e q u e n c eo f v g bg e n e 启动予p 2 的一1 0 序列 f n r 结合区域启动子p 1 的- l o 序列 核糖钵结合区( r b s )起始密码子终止密码子 终止子序列典型的不依赖于p 因子的特征序列 图1 3 列出了v g b 的一级核苷酸序列。在v g b 的上游存在着一强一弱两个 启动子p 1 和p 2 。在p l 起始点上游1 0 个碱基处有一个t a t a a t 的1 0 顺序， 与e c o l i 启动子的p r i b n o w 盒完全一致；p 2 起始点上游6 个碱基处也有一个 t t a a a a 的- 1 0 序列，薅个启动子都缺少一3 5 序列，但有一个核糖体结合位点 在p 1 的1 0 序列上游有一段与e c o l i 中l a c 启动子上c a p 结合位点高度同源 的序列( d i k s h i te ta l ，1 9 8 8 a ) 。在p 1 起始点上游3 9 4 9 个碱基之间还有一个 f n r 结合位点( t t g a ) ( g u e s t ，1 9 9 2 ) 。在v g b 的3 端还存在着一个终止子序 列a c c a l a a g g t g g t ，该序列可形成茎环结构，其后接有一段t t t t t a 序 1 2 ” m m”朽如弱 沈阳农业大学博士学位论文 列，这是典型的不依赖于p 因子终止子的特征。 v g b 的表达直接受到溶氧浓度的调控，n o r t h e r n 杂交发现：生长在5 大 气饱和度的e , c o l i ( v h b + ) ，其m r n a 的含量比生长在2 0 大气饱和度的e c o l i ( v h b 一) 的m r n a 要高得多。但如果在v g b 的上游用t a c 启动子来取代v g b 自 身启动子，那么在任何氧浓度下，v g b 的m r n a 的量都差不多，而且v g b 的 表达仅受到i p t g 的诱导。一般认为，v g b 的表达受到多种机制的调控。 f n r 调控系统是在研究多效性突变时发现的，由于这种突变菌株在无氧 呼吸时不能以延胡索酸、亚硝酸盐、硝酸盐为末端电子受体，因此这种延胡 索酸和硝酸盐还原反应( f u m a r a t ea n dn i t r a t er e d u c t i o n ) 缺陷型基因称为疖r ， 其表达的蛋白称为f n r 。f n r 是金属结合的单体蛋白，在它的n 端富含半胱 氨酸，五个半胱氨酸形成一个“口袋”，与f e 结合可以感受细胞内的氧化还 原状态，是一令感受器。n 端还有8 个b 一卷曲，f n r 的c 端有一个典型的螺 旋一折叠一螺旋结构，是谗多调控蛋白都具有的特征，可与d n a 结合，这一区 域所识别的d n a 顺序是一个a - a t t g a t a t c a a t 的回文结构。一般认 为，f n r 的n 端感受区的f e 在0 2 浓度商时，处于氧化的f e 3 + ，这时f n r 不具有活性，而一旦0 2 浓度下降，f d + 还原成f e 2 + ，使f n r 蛋白构象变化 成为有活性的蛋白，进而识别并结合特定的d n a 区域，调控转录。在v g b 的 上游有一个f n r 识别的序列，因此氧浓度可通过f n r 来调控v g b 的表达。 c a m p - c a p 是普遍存在于原核生物中的一种调控手段。c r p ( c a t a b o l i t e a c t i v a t o rp r o t e i n ) 是c a m p 受体蛋白，可以缓和由葡萄糖引起的分解代谢阻遏 作用。c r p 是一个同型二聚体蛋白，每分予c r p 可与2 分子c a m p 结合并引 起构象变化，在它的c 端也同样具有螺旋一折叠一螺旋结构，可与d n a 结合。 c l i p 对环境的感应来自于c a m p ，当以葡萄糖为碳源时，产生分解代谢物， 使c a m p 含量降低，不能与c r p 结合，则c r p 不能形成具有活性的构象， 也就不能识别、结合d n a ，调控基因的转录。在v g b 的上游存在着一个c r p 结合序列a a t g t g a t c a c a t t ，因此v g b 的转录可能也受到c r p 的调 控。研究表明以甘油为碳源表达v h b 融合蛋白时，目标基因的表达量比用葡 萄糖为碳源时高约3 倍( h u g h e se ta l ，1 9 8 9 ) 。 v g b 基因的表达调控是一个十分复杂的过程，有不少问题仍需进一步的实 验加以阐明。例如，无论是在透明颤菌中，还是在e c o l i 中，v g b 的表达量随 溶氧的变化不是单调上升和下降的，而是在某一溶氧值出现最大值。这是v g b 自身调控的结果还是在溶氧跌入某一极限值后另有调控机制介入还不得而 知。另外，v g b 自身的两个启动子以什么样的方式联合调控v 9 6 的表达也有待 墨二望茎塑堡垄 研究。 1 1 5 透明颤菌血红蛋白在工业上的应用 1 9 8 8 年，k h o s l a 和d i k s h i t 分别独立地将增6 从透明颤菌染色体中分离出 来并转入e c o l i 中。实验表明，转化后的e c o l i 中v h b 及血红素含量比透明 颤菌中高4 7 倍。透明颤菌血红蛋白在大肠杆菌中表达( w e b s t e re ta l ，1 9 7 7 ； d i k s h i te ta l ，1 9 8 8 ；k h o s l ae ta l ，1 9 8 8 a ) 所显示的功能，促使它越来越多地被 应用于微生物工业的多个领域，在短短二十几年中取得了明显的效果( k h o s i a e ta l ，1 9 8 9 a ) 。 由于v g b 基因调控机制在专性和兼性好氧菌中十分保守，目前它已成功地 在原核生物、放线菌、真菌、酵母等微生物中获得了表达( 表1 2 ) 。研究表明， v h b 与氧结合形成氧合态，并以这种方式介入细胞与氧有关的代谢途径中的 某些关键步骤或途径的分支点，从而改变限氧时细胞原有的代谢方式。在相 同的培养条件下，v h b 的表达可以加快细胞的生长速率，提高细胞的呼吸强 度，降低细胞的临界氧浓度。在大幅度的溶氧变化中保持恒定的呼吸率，从 而使细胞在低氧条件下仍然保持一定的生长优势( t y r e ee t a l ， 1 9 7 8 ) 。 表1 2v h b 在生物体中的表达及其作用 t a b l e1 2e x p r e s s i o no fh t r e o s c i l l ah e m o g l o b i ni nd i f f e r e n tb i o l o g i c a ls y s t e m sa n di t se f f e c t s o np r o d u c t i o n 带有v g b 的工程菌在处于低氧的条件下，可大量的合成v h b 蛋白，促使 细胞生长，并提高细胞培养密度和外源基因的表达。v h b 这一特性在耗氧量 沈阳农业大学博士学位论文 大，溶氧作为限制性因素的抗生素发酵工业和高密度发酵中具有良好的应用 前景。 1 5 1 1 细菌发酵 有人将v h b 应用于a 一淀粉酶生产中，发现细胞密度和a 一淀粉酶产率分 别提高了1 4 和3 3 倍( k h o s r a v ie ta l ，1 9 9 0 ) ；将v g b 基因转入青霉素酰化酶 ( p a c ) 基因工程菌中可以明显提高p a c 的表达量，青霉素酰化酶基因( 册f ) 的表达严格受氧的调控，并且表达时存在一个最适的溶氧水平，低于或高于这 一水平都会造成产物表达的明显下降；将含有哪的质粒p o k l 2 v h b 与空质 粒p o k l 2 进行对照实验，发现在低于最适通气量时，哪的加入可明显提高 p a c 的表达量，但在溶氧大于最适通气条件时，v g b 几乎没有作用( 吴奕，1 9 9 5 ) ； v g b 在维生素c 两步法生产中改善了欧文氏菌的生产状况，提高了维生素c 的产量，且在发酵过程中，通气状况越差，v h b 的效果越明显( 严光琳1 9 9 1 ：； 有人将v 9 6 引入产聚b 一羟基丁酸酯( p h b ) 的重组大肠杆菌中，不仅降低了重 组细胞的临界浓度，提高了发酵液的氧传递系数，而且提高了重组细胞的发酵 密度和p h b 的表达量，进而大大降低了p h b 的发酵成本( 于慧敏等，2 0 0 0 ) ： 将v g b 基因与编码d a o ( d a m i n oa c i do x i d a s e ) 的基因融合在一起，并在e c o l i 中表达出既具有v h b 活性，又具有d a o 活性的融合蛋白，固定化酶的转化实 验表明，由于v h b 的存在提高了溶氧浓度和氧的利用效率，使发酵产生青霉 素v 的催化效率提高了1 2 5 倍，同时酶的稳定性也提高了3 倍以上。 1 5 1 2 链霉菌发酵 在链霉菌( s t r e p t o m y c e s ) 发酵中，供氧矛盾更为突出，而且次级代谢产物 的合成对氧的供给相当敏感，因此v h b 的引入不仅可以成倍地提高细胞密度， 而且可以有效地促进次级代谢产物的生产，并减弱其对氧的敏感性。 将v 加在金色链霉菌( s a u r e o f a c i n s ) 中表达。结果带有v g b 的工程菌：涑 的菌体浓度比对照菌株提高了5 - 1 0 ，氯四环素( c t c ) 的产量提高了4 0 6 0 ， 金霉素( o x y t e t r a c y c l i n e ) 的产量提高了1 1 4 ( 孟春等，2 0 0 2 ) ；m a y n o l o 等将 v g b 通过质粒p u 6 9 9 转入天蓝色链霉菌( s c o e l i c o l o r ) 中，在限氧的条件下，不 仅使菌体生长量增加，而且使放线紫红素( a c t i n o r h o d i n ) 的产量提高了1 0 倍 以上( m a g n o l oe ta l ，1 9 9 1 ) ；文莹等将v g b 转入肉桂地链霉菌( s c i n n a m o n e n s i s ) 中，菌体细胞的生长提高了6 3 1 0 ，莫能菌素( m o n e n s i n ) 的产量提高了 1 0 7 2 7 9 ；1 9 9 6 年b a i l e y 等将v g b 转入龟裂链霉菌( s r i m o s u s ) 中，从而 使金霉素的产量提高了2 _ 2 倍。 第章文献综述 t 5 1 3 真菌发酵 在产d 一阿拉伯糖醇酵母菌中引入馏6 可以显著的提高d 阿拉伯糖醇的产 率，最高可达2 7 3 ( 贺鹃等，2 0 0 1 ) ；d e m o d e n a 等将v g b 在产黄支顶孢霉 臼c r e m o n i u mc h r y s o g e n u m ) 的丝状真菌中表达，头孢菌素( c e p h a l o s p o r i n ) 的产 量提高了3 2 2 倍，最高产量达4 e j l ，青霉素v 的产量在限氧的条件下提高， 5 倍( d e m o d e n a e la l ，1 9 9 3 ) ：c h e n 等发现在限氧条件下，v h b 的引入能显著 促进酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 细胞的生长，提高蛋白质合成能力， 增加目的产物的产量( c h e ne ta l ，1 9 9 4 ) 。 多数工业微生物的发酵生产都为好氧发酵，需要充足的氧气供应，但在标 准状况下空气中氧在纯水中的溶解度为0 2 5m o l m 3 ，而通常微生物生长的需 氧量是氧溶解度的7 0 0 多倍，因此距离菌种正常生长的需氧量相去甚远。面 供氧不足将会导致菌体生长不良和产物产量的下降。因此，氧气利用率问题 是困扰微生物发酵生产的重大问题。通常为了提高空气中氧气的利用率，生 产上常采用改良生物反应器搅拌装置的形状，增加挡板，增大通风量，增加 气液相比表面积，增大搅拌速度等方式来解决氧气不足的问题，但这样往往 对设备的要求较高，能耗也加大，同时菌群的活力下降，也有采用直接通入 纯氧的方法，但使生产成本大大增加。 利月透盟颤菌盘红蛋白基因的分子克隆，能够从缨胞水平上增强重组菌 株对氧的摄取和利用能力，从而在限氧条件下促进细胞生长和产物的合成， 实现细胞高密度培养和产品高产率发酵，解决传统发酵过程中由于氧传递而 导致的产率低下和成本高的问题，而且v h b 的应用还不需要附加的设备投资， 这更进一步地降低了发酵成本。可以说，v h b 的发现及研究进展为利用分子