（食品科学专业论文）樱桃蕃茄中果胶酯酶的基因克隆及在毕赤酵母中表达的初步研究.pdf

樱桃蕃茄中果胶酯酶的基因克隆 及在毕赤酵母中表达的初步研究 食品科学专业 研究生葛英亮指导教师马力 摘要： 低甲氧基果胶在食品、医药等行业有着比高甲氧基果胶更为广泛的作 用。果胶酯酶( p e c t i ne s t e r a s e ，p e c t i nm e t h y le s t e r a s e 。p e c t i nd e m e t h o x y l a s e o rp e c t i nm e t h o x y l a s e ，e c 3 1 1 1 1 ) 是果胶复合酶的一种，作为一种高效 的生物催化剂，不同来源的果胶酯酶可以迅速的从果胶分子的还原性末端 或者邻近的游离羧基开始，定向攻击甲氧基，进行去甲基化反应，从而达 到将从植物中提取的含量较高的高甲氧基果胶转化为低甲氧基果胶的目 的。果胶酯酶的存在广泛，不但存在于大量的植物中，在一些霉菌和细菌 中也可以分离出果胶酯酶，将其运用在低甲氧基果胶的生产中避免了酸 法、碱法、酰胺化法生产果胶带来的污染大，成本高、循环性差的弊端， 因此，酶法生产低甲氧基果胶成为研究低甲氧基果胶生产方法的热点。 目前，有很多果胶酯酶研究的相关报道，并有在柑桔、蕃茄、豆芽等 生物中成功提取并克隆出果胶酯酶基因的先例，但都并未进一步的分析。 本研究是选取自种原产于南美洲的樱桃番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 不 同成熟阶段的果实、项尖嫩叶和花蕾提取樱桃蕃茄的总r n a ，通过特异 性引物进行r t p c r 反应，扩增出含有著茄果胶酯酶基因全长的c d n a ， 并将其与载体链接，进行序列分析，构建重组表达质粒p p i c z a a ，转化毕 赤酵母细胞，对毕赤酵母中的外源基因进行甲醇诱导表达，验证转化毕赤 酵母分泌的果胶酯酶的活性，其研究主要过程如下： 1 樱桃番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ) 果实、顶尖嫩叶和花蕾中的 总r n a 提取和鉴定。 2 采用r t - p c r 法：将樱桃蕃茄果胶酯酶的m r n a 反转录成为e d n a 第一链并设计特异性引物进行p c r 扩增，获得樱桃蕃茄果胶酯酶基因片 断。 。 3 构建测序载体p t - p e m ，提取质粒经过酶切及p c r 分析和序列测 定，证明樱桃蕃茄果胶酯酶基因提取成功。 4 构建p p t c z a a - p m e 重组质粒，转化毕赤酵母g s 1 1 5 ，在含有 z e o c i n t m 的选择性y e p d 平板中筛选到重组酵母，并提取重组酵母的d n a 进行p c r 反应，确定重组酵母基因中含有果胶酯酶基因片断。 5 对毕赤酵母中外源基因进行甲醇诱导表达，对发酵上清液的果胶 酯酶活性进行测定。 在樱桃蕃茄果胶酯酶基因克隆和在毕赤酵母中表达的试验中，我们 得到了一条长为1 9 4 2 b p 的果胶酯酶基因，酶切、电泳、测序，将所得基 因序列提交美国国家生物技术信息中心( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c l m o l o g y i n f o r m a t i o n ，n c b i ) 中的n r ( 核酸数据库h t t p ：w w w n c b i h i m n i h g o v b l a s t ) 做b l a s t 同源性检索与参照序列b t 0 1 3 3 6 4 1 和x 7 4 6 3 8 1 序列一致，将 此基因片段与质粒p p i c z x t a 链接构建了重组质粒p p i c z a a - p m e ，并转化 毕赤酵母中得到重组酵母，对重组毕赤酵母进行甲醛诱导表达，对发酵上 清液进行果胶酯酶活性测定，发现我们表达出来的蕃茄果胶酯酶并不具有 果胶酯酶的活性。 关键词；果胶酯酶基因克隆毕赤酵母表达研究 t h e p r e l i m i n a r ys t u d yo n t h eg e n e c l o n i n g o fp e c t i ne s t e r a s eo ft h el y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u ma n di t sg e n ee x p r e s s i o ni nt h e p i c h i a p a s t o r i s a b s t r a c t ： f o o ds c i e n c e a u t h o r ：g e 强n g l i m gs u p e r v i s o r ：m al i l o w m e t h o x y lp e c t i ni sm o r ew i d e l yu s e di nt h ef o o d , m e d i c a la n do t h e r i n d u s t r yt h a nt h eh i g hm e t h o x y lp e c t i n b e i n ga k i n do fp e c t i nc o m p l e x e n z y m e s ，a n da sah i g l l e f f i c i e n c yb i o c a t a l y s t , p e c t i ne s t e r a s e ( p e e t i nm e t h y l e s t e r a s e ，p e c t i nd e m e t h o x y l a s eo rp e c t i nm e t h o x y l a s e ，e c 3 1 1 1 1 ) ，w i t h d i f f e r e n to r i g i n s ，c a na t t a c kt h em e t h o x yf r o mt h er e d u c e de n do fp e c t i no r f r o mt h ea d j a c e n tc a r b o x y l ，ad e m e t h y l a t i o nr e a c t i o nt h a tt r a n s f o r mt h eh i 【g h m e t h o x y lp e c t i nt ot h el o wm e t h o x y lp e c t i n p e c t i ne s t e r a s ec a l lb ee x t r a c t e d f r o ms o m el e a f m o l da n db a c t e r i a , a sw e l la sf r o maw i d ev a r i e t yo f p l a n t s i t s u t i l i z a t i o ni nt h ep r o d u c t i o no fl o wm e t h o x y lp e c t i ns a v e ss o m ed i s a d v a n t a g e s s u c ha sh e a v yp o l l u t i o n , h i 曲c o s t sa n dp o o rc i r c u l a r i t ys e e ni nt h em e t h o d so f a c i d i z a t i o n , a l k a l i f y i n gp r o c e s s a n d a m i d a t i o n t h e r e f o r e ，u s i n g e n z y m e - m e t h o dt op r o d u c et h ep e c t i nh a sb e c o m eah o ts p o ti nt h er e s e a r c ho f l o wm e t h o x y l p e c t i n s of a r , t h e r eh a v eb e e nm a n yr e p o r t so nt h er e s e a r c ho fp e c t i ne s t e r a s e ， s o m eo fw h i c hh a v eb e e ns u c c e s s f u l l yu s e di nt h ec l o n i n go ft h e p e c t i n e s t e r a s ef r o ms a t s u m ao r a n g e ，t o m a t o ，b e a n s p r o u ta n do t h e rb i o l o g i c a l o r g a n i s m b u tn o n eo ft h e mw a sg i v e nf u r t h e ra n a l y s i s t h ep r e s e n tr e s e a r c h c h o o s e st h e f r u i t s ，y o u n g l e a fa n db u di nd i f f e r e n tm a t u r a t i o ns t a g eo f l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mg r o w ni n s o u t ha m e r i c af o rt h ee x t r a c t i o no ft h e t o t a l r n a , a n dt h e nu s e ss p e c i f i cp r i m e r sf o rr t - p c rr e a c t i o n , t h u s a m p l i l y i n gt h ef u l ll e n g t he d n ao f p e c t i ne s t e r a s eg e n e w h i c hi sl i n k e dt ot h e p l a s m i d v e c t o rf o r s e q u e n c ea n a l y s i s t h er e s e a r c h a l s oc o n s t r u c t st h e r e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i d sp p i c z a a ，a n dt r a n s f o r m st h e i n t a c ty e a s t c e l l sf o rt h ee x p r e s s i o no fe x o g e n o u sg e n e st ot e s t i 母t h ea c t i v i t yo fp e c t i n e s t e r a s ee x c r e t e df r o mt h et r a n s f o r m e dy e a s tp i c h i ap a s t o r i s t h er e s e a r c h m a i n l yi n c l u d e s ： 1 e x t r a c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft h et o t a lr n ao ft h ef r u i t s ，y o u n g l e a v e sa n db u d so f l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m 2 r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n o fm r n af r o mt h e p e c t i n e s t e r a s eo f l y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u mi n t ot h ef i r s t s t r a n de d n aa n dt h e d e s i g no f s p e c i f i cp r i m e rf o rp c ra m p l i f i c a t i o n , t h u so b t a i n i n gt h eg e n ef r a g m e n to f t h et o m a t op e c t i ne s t e r a s e 3 c o n s t r u c t i o no fv e c t o rp t - p e m ，e x t r a c t i o no fp l a s m i d , a n dd o u b l e r e s t r i c t i o ne n z y m e ，p c rr e a c t i o na n ds e q u e n c ea n a l y s i st ot e s t i f yt h es u c c e s s o f t h eg e n ee x t r a c t i o nf r o mt h ep e c t i ne s t e r a s eo f l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m 4 c o n s t r u c t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i c z a a - p m e ；t r a n s f o r m a t i o n o fp i c h i ap a s t o r i sg s 115 ；s c r e e n i n gt h er e c o m b i n a n ty e a s tc e l lf r o mt h e s e l e c t i v ey e p ds o l i dc u l t u r em e d i u mc o n t a i n i n gt h ez c o c i n t m ，a n de x t r a c t i n g t h ed n ai nr e c o m b i n a n tp l a s m i df o rp c rr e a c t i o nt od e t e r m i n et h eg e n e f r a g m e n to fp e c t i ne s t e r a s ec o n t a i n e di nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dg e n e 5 e x p r e s s i o ni n d u c e db yc a r b i n o lf o rt h ea l i e ng e n eo f p i c h i ap a s t o r i s ； t e s t i n gt h ea c t i v i t yo f p e c t i ne s t e r a s ei nc u l t u r es u p e m a t a n t t h r o u g ht h ee x p e r i m e n t s ，w eg e tap e c t i ne s t e r a s eg e n ew i t h1 9 4 2 b pl o n g a f t e re n d o n u c l e a s ed i g e s t i o n , c a t a p h o r e s i s ，s e q u e n c ea n a l y s i s ，a n db l a s t h o m o l o g yr e t r i e v a l i n n r ( h t t p ：w w w n c b i n i n l n i h g o v b l a s t ) o f n c b i ( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t c c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ) ，i ti so ft h es a m ew i t ht h e r e f e r e n c es e q u e n c e b yl i n k i n gt h eg e n es e g m e n tw i t ht h ep l a s m i dp p i c z a a , w e g e t r e c o m b i n a n t p l a s m i dp p i c z a a - p m e a f t e rt r a n s f o r m i n g t h e 、 r e c o m b i n a n ty e a s t , a n di n d u c e i n gi t , a n dt e s t i n gt h ep e c t i ne s t c r a s ea c t i v i t yo f s u p e m a t a n tf e r m e n t ，w ef i n dt h a tt h e r ei s n oa c t i v i t yi no u re x p r e s s i o no f s o l a r i u mp e c t i ne s t e r a s e k e y w o r d s ：p e c t i n e s t e r a s e ，g e n ec l o n i n g ，p i c h i ap a s t o r i s ，e x p r e s s i o n ， r e s e a r c h 西华大学硕士学位论文 缩略词 p m 匝，p e d e d m d a p g p l e c h r s c r h i s a s p m o p s d e p c y e p d e b s d s o d r t p c r p c r e d t a d 匝 a 口 棚钔限 a m v r t 符号注释 英文全称 p e c t i n e a t e r a s e ，p e c t i nm e t h y o l e s t e r a s e d e g r e eo f e s t e r i f i c a t i o n d e g r e eo f m e t h o x y l a t i o n d e g r e eo f a m i d a t i o n p l o y g a l a c t u r o n a s e p e c t a t el y a s e e c h r y s a n t h e m i a l l ；h a - a m i n o - b e t a - h y d r o x y r p r o p i o n i c a c i d ；s c r i n e h i s t i d i n e a s p a r t i ca c i dl - a s p a r t i ca c i d 3 - ( m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d d i e t h y p y r o c a r b o n a t e y e a s te x w a c tp e p t o n ed e x t r o s em e d i u m e t h i d i u mb r o m i d e s o d i u md o d y l s u l f a t e o p t i c a ld e n s i t y r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n e t h y l e n e d i a m i n e t e w a a c e t i ca c i d ，。 n ，n - d i m e t h y l f o r m a m i d e a m p i c i l l i n d e o x y - r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e a v i a nm y e l o b l a s t o s i sv i r u sf e v e r s et r a n s e r i p t a s e 中文名称 果胶( 甲基) 酯酶 酯化度 酯化度 酰胺化度 多聚半乳糖醛酸酶 果胶裂解酶 菊欧氏菌 丝氨酸 组氨酸 天门冬氨酸 3 吗啉基丙磺酸 焦碳酸二乙酯 酵母浸出粉胰蛋白胨 右旋葡萄糖培养基 溴化乙锭 十二烷基硫酸钠 光密度 反转录聚合酶链式反应 聚合酶链式反应 乙二胺四乙酸 甲基甲酰胺 氨苄青霉素 三磷酸脱氧核( 糖核) 苷 禽类成髓细胞瘤病毒反 转录酶 西华大学硕士学位论文 m o l o n e y m u r i n el e u k e m i av i r u sr e v e t s e m m l v r t t r a n s c r i p t a s e i p t g i s o p r o p y l 一1 3 - d - t h i o g a l a e t o s i d e r n a s e a l b x 如a l c t 4 h i s b r c l n 0 6 p e g 3 3 5 0 y e p d t e m o p s r i b o n u c l e a s ea l u r i a - b e r t a im e d i u m o p t i c a ld e m i t y 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 3 - i n d o l y l 1 3 - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e p o l y e t h y l e n eg l y c o l y e a s te x t r a c tp e p t o n ed e x t r o s em e d i u m h s e d t ab u f f e r 3 4 m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d 5 5 莫洛尼鼠类自血病病i 反转录酶 异丙基b - d 硫代半 糖苷 核糖核酸酶a l b 培养基 5 一溴_ 4 一氯- 3 一吲哚一b e 半乳糖苷 聚乙二醇 酵母培养基一种 e d t a 缓冲液 3 - 吗啉基丙磺酸 西华大学硕士学位论文 独创性申明 本人申明所呈交的论文是我个人在导师马力教授指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，r 论文中不包含其他入已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得西 华大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 研究生虢彩炳帆少7 年r 月，扩日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解西华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意西华大学可以用不同方 式在不同媒体上发布、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：菇灸祗时间：7 年，月p 罗日 导师签名： 。，蜘。 时间：年月日 o ：到。夕 西华大学硕士学位论文 1 总论 很早以前，人类就开始在生活中自觉或不自觉地利用果胶类物质，随 着工业科技的发展，果胶被更广泛的应用于药品、食品、印刷、日用化妆 品等各个领域，为了更好的利用和开发果胶，人们开始对转化高甲氧基果 胶和低甲氧基果胶的果胶酶进行了日益深入的研究。早在二十世纪三十年 代，人们就开始对果胶酶进行研究应甩，迄今为止已有七十余年的历史。 果胶酶是能够分解果胶质的酶的总称，可以生产果胶酶的生物非常多，动 物、植物、原生生物等均可生产果胶酶，目前对黑曲霉果胶酶的生产研究 比较深入，但对采用生物技术进行果胶酯酶基因克隆的方法进行果胶酯酶 生产的相关报道还很少。本研究是选取原产于南美洲的樱桃番茄( y c 印p r - si c o ne s c u l e n t u m ) 的成熟果实、顶尖嫩叶和花蕾进行的果胶酯酶基因的提 取、克隆和表达的初步研究，使果胶酯酶基因可以在巴斯德毕赤酵母进行 甲醇诱导表达，从而为采用基因工程技术工业化生产具有活性的果胶酯酶 奠定基础。 1 1 果胶简述 果胶是一种广泛应用于各种行业的基础性物质，早在1 8 2 5 年，法国人 b r a c e n n o t 首次从胡萝卜肉根中提取出一种物质，能够形成凝胶，他将提取 物命名为 p e c t i n ， 中文译为“果胶”。【”果胶( p e c t i n ) 作为细胞的一种结 构性的碳水化合物分布在几乎所有高等植物的细胞中【2 棚，在植物体内果 胶是一种构成细胞壁的主要成分，沉积于初生细胞壁( p r i m a r yc e l lw a l l ) 和细胞间层( m i d d l el a m e l l a ) ，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维 素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋( e x t e n s i n ) 结合在一起。【4 】 果胶也是细胞膜的主要构成成分之一 5 】。果胶具有较为复杂的结构。 对果胶结构由很多不同的观点：一种观点认为它以a 1 ，4 糖苷键链接了半乳 糖醛酸和鼠李糖醛酸，其既具有同源半乳糖醛酸的平滑结构，又具有鼠李 葡萄糖昔的多链结构区域1 6 j ；还有一种观点认为：果胶是一种高分子碳水 化合物，分子的结构单元是半乳糖醛酸甲酯和半乳糖醛酸，认为果胶可以 西华大学硕士学位论文 由他们缩合而成，因此，它的主要成份是多缩半乳糖醛酸甲酯。此外，还 有人认为果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以a 1 ，4 糖苷键聚合而成， 在其侧链还有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖等多种碳水化合 物，其游离的羧基部分可以与游离的羧基部分或者全部都可以与钙、钾、 钠等金属离子，特别是与一些硼化物结合在一起而形成凝胶类物质【7 一。 因此果胶可以具有很大的支链以及具有很大的分子量，通常认为果胶类物 质的分子量约为5 0 ，0 0 0 3 0 0 ，0 0 0 。 商品果胶为白色、浅米黄色或黄色粉末，无异味，略带果香味。果 胶具有代表性的结构示意式如下： 露彗。 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f p e c t i n 1 虱1 - 1 果胶p e c 血( p o l y g a l a c t u r o n i c a c i d ) 结构式 另一种从结构上说明的果胶复杂结构的示意图如下： $ 髓“， 目拽戗幢a 穗 3 辩甘露串柚l 嚣睛抽l 鬈研岫1 z 纛基 群r f i g 1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ep r i 娜s t r u c t u r eo f p e c t i n s 图卜2 果胶结构简图 2 毋 西华大学硕士学位论文 果胶并不是一种单一的聚合物，通常以原果胶( p r o t o p e c t i n ) 、果胶 酸( p e c t i ca c i d ) 以及果胶( p e c t i n ) 的形式存在于植物的果实之中，这三 种果胶类物质的区别除了其带有的功能性基团不同外( 如羧基) ，还与其 甲酯含量及酯化度有着重要的关系，通常采用d e 值( d e g r e eo f e s t e r i f i c a t i o n ) 或d m 值( d e g r e eo f m e t h o x y l a t i o n ) 定义果胶的酯化度：果 胶中每百个半乳糖醛酸残基的c 6 上带有甲氧基( 以甲酯化) 形式存在的百 分数。美国食品与化学药典( f c c ) 上这样规定：d e 值高于4 2 9 ( 甲 氧基含量高于7 ) 的果胶被成为高甲氧基果胶( h m p ，h i g h m e t h o x y p e c t i n ) ；反之，d e 值低于4 2 9 ( 甲氧基含量低于7 ) 的果胶被称为低 甲氧基果胶( l m p ，l o w m e t h o x yp e c t i n ) ，因此，果胶通常被分为高甲氧 基果胶( 高酯果胶) 、低甲氧基果胶( 低酯果胶) 、酰胺化低甲氧基果胶， 通常认为酰胺化低甲氧基果胶也属于低甲氧基果胶的大类。 目前果胶的生产主要来源于植物提取物如：柑桔皮、柠檬皮等，无毒 无害，有良好的胶凝、增稠、稳定、乳化和悬浮等作用，在食品工业中果 胶主要以食品添加剂的方式出现，如在国标g b 2 7 8 6 - - 6 0 作为中果胶作为 食品的增稠剂而允许使用，除此果胶还可作为胶凝剂、乳化剂、稳定剂等。 其广泛应用于果酱果冻、水果制品、糖果、面包、奶酪、果汁饮料、酸奶 饮料、酸奶及乳制品等食品加工中。通常从自然界中直接获得的果胶主要 为高甲氧基果胶，因此目前的果胶产品多以高甲氧基果胶或者高甲氧基果 胶和低甲氧基果胶的混合物为主。高甲氧基果胶和低甲氧基果胶最重要的 应用就是凝胶化，可应用于食品、医药 1 0 , 1 1 】、化工、印刷等工业。 果胶因其甲酯化度不同其需要的凝胶条件也有很大的不同【12 】，从而导 致其在食品和其他工业上的应用有所不同，在凝胶过程中，高甲氧基果胶 ( h m p ) 需加入一定浓度的蔗糖和酸( 如苹果酸、柠檬酸、酒石酸等) 调节凝胶的p h 值为2 6 3 4 可形成凝胶，这样不可避免的导致食品中会含 有一定的糖，不宜于特殊人群( 糖尿病等患者) 的食用，其凝胶过程的低 p h 值对生产操作也提出了较高的要求；低甲氧基果胶( l m p ) 只要有多 价金属离子加入，例如钙、镁、铝等离子的存在，即可形成凝胶，主要应 用在工业中的是钙离子。相比之下，低甲氧基果胶还具有以下优点：( 1 ) 3 西华大学硕士学位论文 其形成的凝胶具有热可逆性，而且选择不同酯化度( d e 值) 的低甲氧基 果胶可满足不同产品体系中对钙含量的要求，从而生产不同类型的产品； ( 2 ) 低甲氧基果胶的胶凝能力更强，在高钙离子浓度和高p h 条件下仍能 胶凝，不易脱水，可克服高甲氧基果胶产生的预凝胶现象，还可使凝胶有 很好的风味释放能力；( 3 ) 低甲氧基果胶生产使用量低，更经济；( 4 ) 在 医药行业中低甲氧基果胶可用作治疗腹泻的药物组分，其还具有促进伤口 愈合，降低血浆中胆固醇浓度【b 】等功效。低甲氧基果胶的凝胶条件简单、 容易调节操作、成胶几乎不需要糖等优点使其在食品工业中有更好的应用 前景，此外，低甲氧基果胶分子量在1 5 3 0 万，由大量的半乳糖醛酸组成 可以和大量金属离子形成网络结构而形成凝胶，且能与铅等重金属形成不 溶解且不被人体吸收的复合物沉淀，其对铅有强大的亲和力，它对铅的选 择性络合力均大于其它元素，对人体代谢所必需的元素作用极小，可作为 很好的排铅食品防止铅中毒的发生，目前研究表明低甲氧基果胶对铅中毒 具有很好的缓解和治疗作用。我国对低甲氧基果胶排铅的研究很深入【1 4 1 并形成了系列产品，如冲剂、粉剂排铅药品和保健食品等，低甲氧基果胶 的需求与日俱增，而相对来讲我国低甲氧基果胶的生产工艺远不及高甲氧 基果胶那样成熟，亟需进一步开发来源或进行转化研究，以增加其产量。 低甲氧基果胶的生产方法有很多，多以高甲氧基为原料进行去甲基化 进行生产，目前主要采用碱法、酸法和酶法3 种方法；现简单介绍碱法和 酶法两种。据资料报道：采用碱法生产低甲氧基果胶是把果胶浓缩液放入 不锈钢锅中，加氢氧化铵调p h 至1 0 5 ，1 5 下恒温保持3 h ，再加等体积的 9 5 酒精和适量盐酸，使p h 降至5 左右。搅拌后静置1 h ，滤出沉淀果胶， 榨干，再分别用5 0 和9 5 酒精各洗涤1 次，压干后摊于烘盘上，在6 5 真空干燥器中烘干，取出磨细、包装即得成品，产率大约为果胶总量的 9 0 ；酶法生产低甲氧基果胶即用果胶脂酶脱脂转化高甲氧基果胶，生产 低甲氧基果胶：【”】广东省果树研究所蔡长河等( 1 9 9 6 ) y g 功研制出采用酶法 从柚皮中提取低脂果胶的工业化生产技术。与传统碱法和酸法相比，其具 有工艺易于控制、产品质量高、节省能耗和降低成本等优点，酶法生产低 甲氧基果胶的优势无可比拟。 1 6 1 上述方法有些已经成熟的应用到工业生产 4 西华大学硕士学位论文 中，但是都无可避免的会遇到一个相同的问题环境污染，由此而引发 的工业发展与环境保护的矛盾也日益加重，因此我们研究果胶酯酶就是为 了采用生物工程的方法，通过食品生物技术的手段达到将高甲氧基果胶低 成本、快速无污染的转化为低甲氧基果胶，以满足各个行业生产的需要。 1 2 果胶酶简介 果胶酶( p e c t i n a s e ) 上是一种复合酶体系，它同纤维素酶( f i b r o l y t i c e n z y m e s ) 等酶一样广泛存在于自然界，并被应用于果汁等食品生产中。 构成果胶酶的群体中包括：多聚半乳糖醛酸酶( p l o y g a l a c t u r o n a s e ，p g ) 、 果胶甲基酯酶( p e c t i n e s t e r a s e ，p m e ) 和果胶裂解酶( p e c t a t e l y a s e ，p l ) 以及原果胶酶，这些酶通过不同的方式作用于果胶质“”。因此，果胶酶的 重要分类依据就是其对底物的不同作用方式，如：聚半乳糖醛酸酶( p g ) 能分解半乳糖醛酸中的d 一1 ，4 糖苷键；果胶裂解酶( p l ) 能按照b 消去 反应来裂解a - 1 ，4 糖苷键：而果胶甲基酯酶( p m e ) 则可以将高甲氧基果 胶脱酯催化成为果胶酸或低甲氧基果胶，这个脱酯反应被众多学者日益重 视“m ，目前大量通过生物酶水解技术进行高甲氧基果胶脱酯的研究正在进 行，然而采用生物酶技术进行脱酯反应需要大量的果胶酯酶，果胶酯酶的 生产成为酶法生产低甲氧基果胶的瓶颈，果胶酯酶生产的开发和研究成为 高、低甲氧基果胶转化生产的关键环节。 果胶酯酶作为果胶酶的一种，几乎分布在所有的高等植物中，尤其是 在成熟过程中的果实和新鲜叶片及根冠中含量最多，在大量的致病的真菌 及细菌以及霉菌中也含有果胶酯酶，果胶酶在果实的成熟过程中起到重要 的作用。植物的果胶酶几乎都参与到植物组织中的果胶糖的转化反应当 中，它在果胶质的三种状态( 原果胶、果胶酸、果胶) 转化中起着重要的 作用，果胶酯酶能够分解果胶和果胶酸盐( 或酯) ，并且参与到植物的成熟 阶段保护植物免受真菌感染的机制当中“”。 果胶酶的用途很多，不但可以使植物果实软化，并释放出被果胶质固 定的结合水，使得果实多汁，可被应用到大量果汁饮料的生产过程中，还 可以保护植物果实在成熟阶段免受真菌的感染。现在研究比较多的黑曲霉 5 西华大学硕士学位论文 果胶酯酶就是其中一种，本研究就是采用樱桃蕃茄的不同成熟阶段的果 实、嫩叶和花蕾进行的果胶酯酶的基因克隆和表达研究。 1 3 果胶酯酶的酶学特征及生产低甲氧基果胶的作用机理 果胶酯酶( e c 3 1 1 1 1 ) ，英文为p e c t i n e s t e r a s e ，又称为p e c t i n m e t h y l e s t e r a s e 、p e c t i nd e m e t h o x y l a s e 以及p e c t i nm e t h o x y l a s e ，具有酶的所 有特征，如：具有较强的催化活力，在一定的p h 值下，不同来源的果胶 酯酶可以迅速的从果胶分子中的还原性末端或者邻近的游离羧基开始定 向攻击甲氧基：使果胶形成对二价阳离子c a 2 + 异常敏感的游离半乳糖醛酸 域，因此易与c a 2 + 结合成不溶物【2 0 】，而且果胶酯酶具有高度的专一催化能 力，其对聚半乳糖醛酸甲酯具有高度的专一催化作用，果胶酯酶能够分解 水溶性果胶分子中的甲氧基( - o c h 2 ) 与半乳糖醛酸之间的酯键，形成半 乳糖醛酸和甲醇；而对聚甘露糖醛酸甲酯等其他聚合甲酯不起任何作用， 这个专一的催化作用使高甲氧基果胶迅速脱去甲氧基转化为低甲氧基果 胶。也正是源于此，国际生化协会酶类委员会将其确定为果胶一果胶酰基 水解酶类。果胶酯酶定向去甲氧基的性质在果实的成熟、饮料和果胶等生 产中具有积极的作用。 有报道称，1 9 7 9 年日本i s h i l s 等人成功的在完全没有果胶解聚酶的黑 曲霉培养基上提取果胶酯酶，并用其完成了高甲氧基果胶到低甲氧基果胶 的转化反应，这将果胶酯酶的提取和应用推进了一大步。【2 1 】在我国，舒肇 等利用新鲜柑桔类果皮内未经提取的天然果胶酯酶制备低酯果胶，省去传 统技术先提取果胶酯酶后再用其脱除高酯果胶的甲氧基的工艺过程，简化 工艺，降低成本，节约时间。同时，与酸、碱或氨处理的方法比较，避免 了由于高温、强酸、强碱所引起的果胶中多聚半乳糖醛酸链过多破裂，而 造成品质下降的缺点。【2 2 】果胶酯酶和聚半乳糖醛脂酶酶解高甲氧基果胶的 作用方式如下图所示： 6 西华大学硕士学位论文 上 t 一一表示果胶酯酶的作用位置 一表示聚半乳糖醛脂酶的作用位置 f 培1 - 3e f f e c t so f p e c t i ne s t e r a s e0 1 1p e c t i nm o l e c u l a r 图1 - 3 果胶酯酶对果胶分子的作用 果胶酯酶的化学反应式如下： ：o 工舭o ：6 i 耕o + n h 。：，。：n m ，e 。t h a n 。+ p e c t i np e c t a t e f i g 1 - 4e n z y m er e a c t i o nf o re c 3 1 1 1 1 图1 - 4 果胶酯酶的酶反应 以上两图分别从果胶酯酶攻击果胶的酯键和分解出甲氧基以及果胶 酯酶酶反应的方式和产物等方面说明了果胶酯酶对果胶的基本酶反应、说 明了果胶酯酶是如何降低果胶的酯化度、如何将高甲氧基果胶转化为低甲 氧基果胶。 1 4 果胶酯酶的活性位及其结构性质分析 果胶酯酶的来源非常广泛，是一个多基因家族酶，不同的来源导致果 胶酯酶的酶学性质及分子性质有所差别，据统计，果胶酯酶的分子量大概 为2 0 ，0 0 0 6 5 ，0 0 0 。通常植物果胶酯酶的分子量要大一些，而且跨度也很 大。研究表明果胶酯酶大部分是糖与蛋白质以共价键连接的糖蛋白，但是 也有例外：马铃薯软腐病的致病菌之一菊欧氏菌( e c h r y s a n t h e m i ，简称 e 幽，) 中产生的果胶酯酶是脂蛋白酶。1 西华大学硕士学位论文 作为大分子蛋白质的酶类，果胶酯酶同样具有复杂的结构，国外研究 者通过现代化的技术手段如晶体衍射、核磁共振等研究得到了果胶酯酶蛋 白质的一级结构和晶体结构。阿】到目前为止，我们仅仅知道了一种由菊欧 文氏菌产生的果胶酯酶的三级结构【2 5 】。在几乎所有由细菌和真菌生产的果 胶酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸中都具有这种右手平 行的p 螺旋三级结构。 2 6 ，2 7 2 8 1 这种结构则体现了一种新的既不包括吖p 水解 结构，又不包括公认的以氢键结合网形成的s e t - h i s - a s p 催化三联体接触反 应的活性中心【2 9 】，果胶酯酶的活性中心与其他酶的活性中心相比有很大不 同，果胶酯酶的部分活性中心由两个天门冬氨酸残基构成的，以前也有研 究表明蕃茄果胶酯酶应该是一种丝氨酸酯酶，【3 0 】然而也有研究表明在果胶 酯酶活性中心丝氨酸和组氨酸残基并不一定是活性中心接触酶反应可能 的残基，在蕃茄和曲霉菌中含有的果胶酯酶组氨酸残基证明这些残基并不 具有酶活性位的功能，而是对果胶酯酶结构的稳定性具有重要的作用。p l 】 目前，k m t l lj o h a n s s o n , m u s t a p h ae i - a l i m a d 3 2 j 等人，通过基因重组的 方法从胡萝卜根部得到了胡萝卜果胶酯酶，并在1 7 5 a 下对其进行电子扫 描描绘出果胶酯酶三维立体结构模型，在这个结构模型中清楚体现了：在 果胶酯酶的立体结构中存在一个裂痕，这个裂痕应该就是果胶酯酶的活性 位点，能够束缚与之契合的蛋白质进行反应，从而间接验证了果胶酯酶的 催化机制。 f i g 1 - 53 - d p i c t u r eo f p e c t i n e s t e r a s ep r o t e i na n dl i n e a rm o l e c u l a rs w u a u r e 8 1 1 5 果胶酯酶蛋白三维立体图及线性分子结构图1 8 西华大学硕士学位论文 目前，人们在生产实践和科研过程中发现，通常果胶酯酶的活性可以 与其他酶的活性对比如下：1 单位p e c t i n a s e ( 果胶酯酶) 的活性大约分别 相当于1 0 单位c e u u l a s e ( 纤维素酶) 、1 8 单位x y l a n a s e ( 木聚糖酶) 、8 单位 1 3 - g l u c a n a s e ( b 一葡聚糖酶) ，由此可见，果胶酯酶具有极强的催化能力， 可以满足我们工业转化和生产低甲氧基果胶的需要。 1 5 果胶酯酶分子生物学层次研究浅析 果胶酯酶分子生物学层次的研究也随着分子生物学学科的前进而逐 步深入，如采用r t - p c r 以及高精度的链接酶和分解酶反应，对果胶酯酶 分子进行进一步的改造，在高效的表达载体中进行表达后克隆