（食品科学专业论文）玉米蛋白和大豆蛋白合成类蛋白的研究.pdf

摘要类蛋白反应通常认为是酶水解的逆反应，是指在一定条件下，通过蛋白酶的催化作用将高浓度的蛋白质水解物与蛋白酶一起加热处理，生成一种类似高分子蛋白质物质的反应。通过类蛋白反应合成的类似蛋白质的物质，可提高蛋白质的营养功能和加工特性以及蛋白产品的附加值，从而满足食品工业对蛋白质的功能特性和营养价值日益提高的要求。玉米蛋白是玉米加： 的副产物，大部分以粗饲料或者当作“三废”处理直接排放，不仅极大浪费了资源，经济效益低，而且造成了极大的浪费和环境污染。玉米蛋白中大约6 0 是蛋白质，所以对玉米蛋白的回收再利用对充分利用现有生物起源起着重要作用。但是玉米蛋白中的氨基酸含量除蛋氨酸外，其他必需氨基酸含量均偏低。大豆蛋白是一种优良的植物蛋白，但只有蛋氨酸含量较低，所以本试验通过玉米蛋白与大豆蛋白合成类蛋白反应，在回收玉米蛋白的同时，改善玉米蛋白和大豆蛋白的氨基酸组成，提高其功能性质。研究了f e 3 0 4 磁性壳聚糖固定化a l c a l a s e 酶的固定化条件：壳聚糖浓度，2 ：戊二醛浓度，2 0 ；磷酸缓冲溶液p h 值，8 o ；给酶量，1 m l ：放置时间，8 h 。此时的酶回收率约为2 5 5 。f e ，o 。磁性壳聚糖固定化木瓜蛋白酶的固定化条件是：壳聚糖浓度，2 ：戊二醛浓度，2 0 ；磷酸缓冲溶液p h 值65 ：给酶量，l o o m g ：放置时间，8 h 。此时的酶回收率约为4 4 8 。通过旋转回归设计证明 e 】 s 、p h 、温度三因素是影响a l c a l a s e 水解玉米蛋白的主要因素，三个因素对蛋白水解度的贡献率为：温度 e 】， s p h 。在所建立的二次旋转模型条件下，最高的水解度可达到3 3 4 0 ，但作为类蛋白反应得底物，水解度要求在3 0 。实际所选条件p h 值= & 0 ，温度= 6 0 c ， e 】【s 】_ 4 5 时，水解度达到3 0 1 8 ，完全满足类蛋白反应的底物要求。通过旋转回归设计证明 e 】 s 、温度、反应底物浓度比三因素是类蛋白合成的主要因素三个因素对类蛋白合成的贡献率为： e l s 】 p h 底物比。通过二次旋转建立的类蛋白合成方程可得，当p h = 5 6 ，f e l f s 】- 2 ，底物浓度比为1 3 时，类蛋白合成率约为9 0 。通过s d s 聚丙酰胺电泳和s e p h a d e x 凝胶测定大豆水解物、玉米蛋白水解产物及合成类蛋白物质的肽分子量分布，结果表明：肽分子的分布都是连续的，水解物的分子量分布在4 0 0 1 4 0 0 d 之间，这正是合成类蛋白反应所要求的最佳底物的分子量，而合成类蛋白物质的多肽分子量分布在6 5 0 0 1 4 0 0 0 d 之间，多肽的分子量有明显的增加。通过对水解物和类蛋白的氨基酸分析，可以推断出：在以玉米蛋白和大豆蛋白合成类蛋白的反应过程中，生成的是一种不同于玉米蛋白水解物和大豆蛋白水解物的新的类似蛋白质的物质。通过对大豆蛋白和玉米蛋白以及类蛋白的功能性质测定可以得出：类蛋白反应可以回收玉米中的蛋白质，与此同时大大提高了大豆蛋白和玉米蛋白的功能性质，如起泡性、乳化性、溶解性、凝胶性等，从而使玉米蛋白和大豆蛋白更适合食品9 n s 。由此可见合成类蛋白的研究扩展了蛋白质的应用领域，对新的蛋白质资源的开发、调整膳食结构、发展新食品资源具有重要意义。关键词：类蛋白：酶水解：固定化酶；玉米蛋白：大豆蛋白a b s t r a c ts t u d i e so np l a s t e i ns y n l 翻匣s i sb yc o r np r o t e i na n ds o yp r o t e i nt h ep l a s t e i nr e a c t i o ni sc o n s i d e r e dt oi n v o l v et h ef o r m a t i o no fp o l y p e p t i d e sb yar e v e r s a lo ft h eu s u a lp e p t i d eb o n dh y d r o l y s i st op r o d u c e “r e s y n t h e s i z e d ”p r o t e i no rp o l y p e p t i d e sf r o mah y d r o l y s a t eo fp r o t e i n i tc a r ii m p r o v eb i o l o g i c a lv a l u ea n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so ff o o dp r o t e i n sb e c a u s eo f i t sp r o c e s st om e e td e m a n d so f m o d e mf o o di n d u s t r yc o mp r o t e i ni sb y p r o d u c t i o no fm a i z ep r o c e s s i n g ，w h i c hi su s e di nc r u d ef e e d s t u f fo rd i s c h a r g e dd i r e c t l ya sw a s t e s ，i ti sag r e a tm a s so fw a s t ea n dp o l l u t i o nf o re n v i r o n m e n t t h es i x t yp e r c e n to fc o r np r o t e i ni sp r o t e i n ，s ot h er e c l a i mp r o t e i nf o r mc o r np r o t e i ni si m p o r t a n tt od e v e l o pf o o di n d u s t r ya n dp r o t e i ni n d u s t r y t h ec o n t e n t so fa m i n oa c i da r eh i g h e rt h a nn o r m a lp r o t e i n si nc o r np r o t e i ne x c e p tf o rm e t h i o n i n e s o yp r o t e i ni sak i n do fe x c e l l e n tp r o t e i n ，b u tt h ec o n t e n t so fm e t h i o n i n ei sl o w s os y n t h e s i sp l a s t e i nb yc o r np r o t e i na n ds o yp r o t e i nc a nr e c y c l ec o mp t o r e i na n di m p r o v et h ef u n c t i o n a lp r o p e r c i e so f c o mp r o t e i na n ds o yp r o t e i n am e t h o do fi m m o b i l i z ea l c a l a s ea n dp a p a i np r o t e i n a s eb yf e 3 0 4m a g n e t i cc h i t o s a nw a ss t u d i e dt h er e s u l t ss h o w e d ：t h ec o n d i t i o n so fi m m o b i l i z ea l c a l a s ei s ：c o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n ，2 ；c o n c e n t r a t i o no f g l u t a r a l d e h y d e ，2 0 ；p h ，8 0 ；q u a n t i t yo f a l c a l a s e ，1 m l ；t i m eo f d e p o s i t , 8 h t h er e c y c l i n gr a t eo fp r o t e i n a s ei s2 5 5 t h ec o n d i t i o n so fi m m o b i l i z ep a p a i ni s ：c o n c e n t r a t i o no fc h i t o s a n ，2 ；c o n c e n t r a t i o no fg l u t a r a l d e h y d e ，2 0 ；p h ，6 5 ；q u a n t i t yo fp a p a i n ，1 0 0 m g ；t i m eo fd e p o s i t 8 h t h er e c y c l i n gr a t eo f p r o t e i n a s ei s4 4 8 c o r np r o t e i nh y d r o l y z e db ya l c a l a s ep r o t e i n a s ew a ss t u d i e d t h er e g n e s s i o nr e v o l v i n go r t h o g o n a la n dt r o p i c a ld e s i g nw a sa d o p t e dt os t u d yt h ee f f e c t so f f a c t o r so nd e g r e e so f h y d r o l y s i s( d h ) a n dam a t h m a t i c sm o d l ew a sb u i l t f - t e s tt - t e s ta n da p p l i c a t i o nt e s tw e r eu s e dt ov e r i f yt h em o d l e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h et e s t i n gg o o d n e s so f f i t t h ec o n t r i b u t i o no f t h r e ef a c t o r st od hw a st e m p e r a t u r e e 】【s 】 p h v a l u e ，t h eo p t i m u mo f c o n d i t i o nw a sb a t t e n e d ，t6 0 ；f e l s 】，4 5 ；p h ，8 0 ，a n dd hi s3 018 ，w h i c hi sc o n t e n tf o rp l a s t e i nr e a c t i o n p l a s t e i ns y n t h e s i sw i t hc o mp r o t e i nh y d r o l y s a t e sa n ds o yp r o t e i nh y d r o l y s a t e sb yp a p a i np r o t e i n a s ew a ss t u d i e d t h er e g n e s s i o nr e v o l v i n go r t h o g o n a la n dt r o p i c a ld e s i g nw a sa d o p t e dt os t u d yt h ee f f e c t so f f a c t o r so np l a s t e i np r o d u c t i v i t ya n dam a t h m a t i c sm o d l ew a sb u i l t f - t e s tt - t e s ta n da p p l i c a t i o nt e s tw e r eu s e dt ov e r i f yt h em o d l e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h et e s t i n gg o o d n e s so ff i t t h ec o n t r i b u t i o no ft h r e ef a c t o r st op l a s t e i np r o d u c t i v i t yw a s e 【s p h c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e t h eo p t i m u mo fc o n d i t i o nw a sb a t t e n e d ，p h ，56 ； e 【s ，2 ；c o n c e n t r a t i o nr a t i oo fs u b s t r a t e 1 1 3a n dp l a s t e i np r o d u c t i v i t yi s9 0 i i t h em o l e c u l a rw e g h t ( m w ) o f h y d r o l y s t e sa n dp l a s t e i nw a sa l s od e t e r m i n e db ys d s p a g ea n ds e p h a d e xg e lc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l bi n d i c a t e dt h a tt h eq u a t i t yo fs m a l lp e p t i d em o l e c u l e si nh y d r o l y s a t ew a sl o w m o s to fi t sm wi s4 0 0 1 4 0 0 d w h i l et h em wo fp l a s t e i ni sa b o u ta sh i g ha s1 4 0 0 0 d t h ea n a l y s i so fa m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fp l a s t e i ns h o w e dt h a tt h ep l a s t e i nw a san e wf o r mp r o t e i n s o m em a j o rf u n c t i o n a lp r o p e n i e so fp l a s t e i nw e r es t u d i e d ，w h i c hi n c l u d e ds o l u b i l i t y ,a d s o r p t i o n ，f a ta b s o r p t i o n ，f o a m i n ga n df o a ms t a b i l i t y , e m u l s i f i c a t i o na n de m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t y s o m ef a c t o r se f f e c t i n go np l a s t e i np r o p e r t i e sw e r ea l s od i s c u s s e d t e s tr e s u l ti n d i c a t e d ：p l a s t e i ns y n t h e s i sw i t hc o i t ip r o t e i nh y d r o l y s a t e sa n ds o yp r o t e i nh y d r o l y s a t e sb yi m m o b i l i z ep a p a i np r o t e i n a s ei sf e a s i b l ea n dp e r f e c t ，w h i c hc a nr e c y c l ec o r np r o t e i na n di m p r o v ef u n c t i o n a lp r o p e a i e so fs o yp r o t e i na n dc o r np r o t e i n t h ep l a s t e i nr e a c t i o na l s op r o v i d e sam e t h o dt oe x p l o i tn e wf o o dr e s o u r c e sa n dr e b u i l do t h e rp r o t e i n s k e yw o r d s ：p l a s t e i n ；e n z y m eh y d r o l y s i s ；i m m o b i l i z e de n z y m e ；t o mp r o t e i n ；s o yp r o t e i ni p o s t g r a d u a t e ：z h o uz u n l a is p e c i a l i t y ：f o o ds c i e n c es u p e r v i s o r ：v i c e p r o f f a n gz h i b i a o独创声明本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：用、日期：如弗年石月，影日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者躲同踅耙日期阳年再细一球斗魄州嗍细1 前言1 1 引言蛋白质是组成人体的主要物质，是人体生命活动的物质基础。如果人们的膳食中蛋白质的摄入量不足，就会使人消瘦，引起各种疾病，特别是儿童，将造成发育不良，智力低下。目前世界蛋白质资源分配不均，发达国家的蛋白质资源丰富，而一些发展中国家和落后国家蛋白质资源匮乏，蛋白质资源远远满足不了人们的需要。由于我国人口众多，每年都要大量进口大豆和鱼粉等蛋白质资源，而与此同时，许多人由于膳食中动物性食品比重过大而出现营养过盛，产生一系列健康问题。蛋白质资源的缺乏和人们对高质量蛋白质需求的矛盾越来越明显。综合利用蛋白质资源，提高蛋白质的营养价值和功能性质是解决这一矛盾的有效方法。近年来，一些营养专家为此发出呼吁大力开发植物蛋白质资源来解决蛋白质缺乏问题。大豆蛋白是植物蛋白中的佼佼者，而且我国是大豆的故乡，至今已有几千年的历史，大豆的生产有着巨大的潜力与优越的条件。据联合国经济服务组织( v w d ) 的资料，中国大豆产量约占世界总产量的1 1 ，居世界第三。大豆蛋白是一种优质的植物蛋白质，除蛋氨酸外，其余7 种必需氨基酸的含量均符合w h o 的要求，可以与鱼、肉、乳蛋白质相媲美，较一般的植物蛋白配比合理( 见表1 1 ) ，且没有动物性蛋白的副作用，如引发肥胖症、心血管病、高胆固醇症等( 李哲敏，2 0 0 0 ) 。作为食品蛋白，大豆蛋白还有以下几个优点：( 1 ) 纯天然植物蛋白，不含胆固醇，符合人体的健康需要：( 2 ) 具有较高的功能特性，能充分改善食品品质和质构，提高其功能特性和货架寿命：( 3 ) 价格相对低廉。表卜1 ：大豆与几种食物中的必需氨基酸含量的比较( 郝征红，1 9 9 8 )( m 1 0 0 9 )t a b 1 - 1c o m p o s i t i o no f e s s e n t i a la m i n oa c i d si ns o y b e a na n do t h e rf o o d s大豆蛋白虽然为改善我国人民的食物结构提供了一种优质廉价的蛋白质来源，但它的某些性质及特点也限制了它的充分利用，如：大豆蛋白含有腹胀因子、胰蛋白酶抑制剂、血球凝聚素、大豆皂角菅等抗营养因子；含硫的必需氨基酸含量较低；有的大豆蛋白产品有豆腥味；部分人群对某些的大豆蛋白产品过敏等，使大豆蛋白的应用受到限制。另外，在加工过程中，大豆蛋白的溶解性差；在加： 过程中易受温度、酸碱度、辐射、挤压等外界环境影响而变性，这些缺陷都限制了大豆蛋白在食品中的应用。为了进一步满足食品工业对大豆蛋白的功能特性和营养价值日益提高的要求，利用酶对大豆蛋白的改性研究己成为近年来的热门研究课题。但仅仅用酶水解大豆蛋白存在诸多缺陷，蛋白质水解后通常必需氨基酸有较大地损失，且由于大豆蛋白质的本身蛋氨酸含量较低，因此从营养学性质上看，对大豆蛋白质水解物的应用有较大的限制，这也正是食品化学家努力解决的问题。在追求高质量的蛋白质的今天，大豆蛋白中必需氨基酸的缺乏，难以满足其在现代化食品深加工的要求。玉米是世界三大粮食作物之一，又是重要的饲料，由于其单产高，增产潜力大，在农业生产中占有重要的地位。根据联合国粮农组织( f a o ) 报道，世界玉米种植面积为1 3 5 1 0 9 k m 2种植面积较大的是美国、中国、巴西、墨西哥和南非，分别占世界种植面积的2 23 ，1 5 1 ，9 ，8 和5 2 。而我国的玉米加工主要是提取淀粉，只利用了玉米的5 0 6 0 为商品淀粉，其余的大部分以粗饲料或者当作“三废”处理和排放，不仅极大浪费了资源，经济效益低，而且造成了极大的浪费和环境污染。我国的玉米年人均只有9 0 埏，所以必须对我国不太富裕的玉米资源进行综合开发利用。在以玉米为原料的工业企业，实行食品和饲料的联产，可以更好的提高玉米产业的经济效益，并进一步促进玉米生产的发展。其中玉米面筋粉( c g m ，俗称玉米渣) ，是玉米淀粉生产中提取淀粉后的主要副产物，在我国，每年随废液排走的玉米蛋白质每年高达8 万多吨。玉米面筋粉中大约6 0 是蛋白质，其中主要是玉米醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白( 氨基酸组成见表1 - 2 ) 。但是由于玉米蛋白的组成复杂、口感粗糙、水溶性差，在食品工业中的应用较少。从营养学的角度考虑，玉米的胚芽部分蛋白质中的白蛋白和球蛋白分别含3 0 ，应该是一种生物学价值较高的蛋白质( 尤新，1 9 9 9 ) 。但除玉米的胚芽部分，玉米的蛋白质含量不高，而且从营养学的角度考虑，也不是人类理想的蛋白质资源，因此简单的酶水解无法满足食品加工的需要。表1 2 玉米蛋白粉的氨基酸组成t a b 1 2c o n t e n t so f a m i n oa c i d si nc o r np r o t e i n大豆蛋白中蛋氨酸含量低，而玉米蛋白中的蛋氨酸含量较高，大豆蛋白和玉米加工的副产物玉米黄粉为原料，探索在固定化酶催化作用下合成类蛋白。这种方法不仅可改善大豆蛋白的氨基酸组成，提高大豆蛋白的生物效价，还可提高大豆蛋白的功能性质并改善蛋白质水解物的风味：同时还可以对玉米资源进行综合利用。此领域的研究将对充分利用现有蛋白质资源，解决蛋白质资源的缺乏问题和满足人们对高质量蛋白质的需求提供可靠的研究基础。1 2 类蛋白的研究历史及现状类蛋白反应通常认为是酶水解的逆反应，是指在一定条件下，通过蛋白酶的催化作用将高浓度的蛋白质水解物与蛋白酶一起加热处理，生成一种类似高分子蛋白质物质的反应。在类蛋白反应过程中，大分子量物质并没有明显的增加。而且从热力学角度，蛋白质的重新合成是不可能的。但通过类蛋白反应合成的类似蛋白质的物质，可提高蛋白质的营养功能和加工特性，提高蛋白产品的附加值，满足食品工业对蛋白质的功能特性和营养价值日益提高的要求。利用类蛋白反应来改造蛋白质具有较大的实际意义，并己引起生物化学家及食品科学学家的极大兴趣。1 2 1 类蛋白反应机制的研究类蛋白反应通常分为三步，第一步是将目标蛋白质用酶部分水解，获得分子量大约1 0 0 0 d a 的多肽：第二步是将水解后的产物浓缩到3 0 4 0 ；第三步是再利用酶调节p h 值后进行类蛋白反应。但最主要的第三步的反应机制一直在激烈的讨论中，大量的研究表明此反应可能有多个反应机制。早期的观点一般认为类蛋白反应只是一个简单的动力学上推动的蛋白质水解成肽的逆反应，其反应是蛋白酶催化的凝聚过程中形成的一种“新”的高分子的蛋白质( mf u j i m a k ie ta 1 ，i 9 7 1 ：m t a m a s h i t ae ta l ，1 9 7 3 ) 。而有些人认为在类蛋白反应中，转肽在类蛋白合成起着主要作用( mf u j i m a k ie ta l ，1 9 7 1 ：pl o z a n oe ta 1 ，1 9 9 1 ) 。还有些报道认为在反应过程中有新的共价键生成并通过物理作用力，例如疏水键和离子键，它们起着推动类蛋白反应的主要作用( b v o nh o f s t e ne ta 1 ，1 9 7 6 ；g s u k a ne ta 1 ，1 9 8 2 ；a ta n d r e w se ta 1 1 9 9 0 ) 。k u l l m a n n ( 2 0 0 1 ) 等则认为浓缩反应起主要作用。l o z a n o ( 2 0 0 3 ) 认为反应机制是浓缩及肽基转移作用，且浓缩作用较小，肽基转移作用是主要的。最近对类蛋白研究利用了先进的核磁共振和电喷射质谱技术，结果认为水解作用、凝聚作用、转肽作用和物理聚集作用在不同的条件下起着不同作用。在小肽的环境中，转肽和凝聚起主导作用，而凝聚可以产生大量的不溶性沉淀产物，由此得出疏水性肽键参与了反应并起着主导作用。而凝聚作用导致了共价键的形成，亲水性肽键和一部分较k 的肽链与水解产物混合，其混合物抑制了内切蛋白酶的活性。因此，动力作用、凝聚作用或转肽作用并不显著，而物理的聚集作用在类蛋白反应中是最重要的，随着外肽酶的作用，一定的转肽作用也会对类蛋白反应有一定的推动作用( d es t e v e n s o ne ta l ，1 9 9 9 ) 。1 2 2 类蛋白反应条件的研究尽管类蛋白反应的机制仍在激烈的讨论中，但大多数的研究者更关心类蛋白反应的条件，如酶的选用，p h 值，温度，浓度等。东北农业大学工学硕士学位论文1 2 2 1 蛋白酶对类蛋白合成的影响常用于合成类蛋白反应的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶及a l c a l a s e 等。不同蛋白酶的催化合成效果不同。从产率上看，木瓜蛋白酶及胃蛋白酶比其他的蛋白酶催化类蛋白合成反应更有效，可得到更多的类蛋白物质。这可能是由于不同的酶对类蛋白反应的第一步水解及第二步转肽反应催化效果不同引起的。1 2 2 2p h 值对类蛋白合成的影响不同的反应中，由于所用的蛋白酶不同，其最佳p h 值范围也不同。而且蛋白酶对肽键的水解和再合成反应过程的最适p h 值是不同的，如a l c a l a s e ，在p h = 7 5 时可高效催化蛋白质分解，而p h = 8 5 时，则可催化肽键的再合成反应。但无论何种蛋白酶，在催化合成类蛋白反应中，其最适p h 值都接近底物肽链的等电点或等离子点( r j h w i l l a m se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。1 2 2 3 温度对类蛋白合成的影响一般情况下，温度高反应速度快，但过高温度会引起蛋白酶的失活，类蛋白反应中最佳温度一般为3 0 5 0 c 。a n d r e w ( 1 9 8 2 ) 将含有胃蛋白酶的肽样品在不同温度下保温处理，在温度为6 5 c 时类蛋白迅速生成，但其产量比在3 t c 及5 0 2 时所得的产量低。正如所预期的，在室温下保温( 约2 0 c ) 类蛋白量几乎能达到6 5 时的水平，但形成速度太慢。综合考虑，反应最适温度应控制在3 t c 。1 2 2 4 肽浓度对类蛋白合成的影晌p _ l o z a n o ( 1 9 9 1 ) 发现，合成类蛋白产量与底物浓度之间关系是极为密切的。在底物浓度为8 或更低时，合成类蛋白的产量为负值，表明此时肽链的水解反应强于合成反应。而当底物浓度高于4 0 时，合成类蛋白产量呈现下降趋势。这可能与酶的添加量或水解物中肽链移动速度有关。一般肽类浓度在2 0 4 0 之间类蛋白产量可得最大值。而高于或低于它类蛋白率都会急剧下降。此结果与包含疏水相互作用的熵推动反应机制而非一般的动力推动机制相一致。此外，还有一少部分报道认为盐分对类蛋白形成也有一定的影响( s y t a n i m o t oe ta l ，1 9 7 5 ) 。在类蛋白反应中是否有大分子生成( 合成类蛋白反应的标志) ，观点有所不同，大部分的实验都证明有大分子的蛋白质生成，但仍有少数试验没有获得大分子物质( b y o nh o f s t e ne ta 1 ，1 9 7 6 ) 。这可能与反应所选的底物和酶有关，尤其是酶的选用，由于酶对蛋白质结构上水解的程度不同，如果在反应过程中水解蛋白质所用的酶和类蛋白反应所用的酶的水解特性相差很大，很可能在类蛋白反应过程中先对蛋白质继续水解而后再合成，从而影响了合成后蛋白质的特性。无论是对类蛋白反应的机制还是对反应条件的研究对于食品工业来说都是非常重要的，如果对类蛋白的反应机制或合成条件得到充分认识后，可以更好的预见和控制产品的质量，简化反应过程，使类蛋反应的合成效率提高，降低成本，可更好地应用于食品工业。1 2 3 类蛋白反应在食品中的应用类蛋白反应可以提高蛋白质的生物效价、改善蛋白质水解物的风味和蛋白质的功能性质，并能以该反应来提供新的蛋白质资源。1 23 1 提高蛋白质的生物效价用必需氨基酸来补充低生物效价的蛋白质是一种比较理想的提高蛋白质的营养价值的方法。对类蛋白反应的动力学研究表明类蛋白反应是疏水性氨基酸的一个富集过程，疏水性氨基酸如l e u 、l i e 、m e t 、v a l 及p i l e 等都是必需氮基酸，而非必需氨基酸如a s p a s n 、g l u g l n 、l y s 及a r g 都是亲水性氨基酸。r jh w i l l a m s ( 2 0 0 1 ) 首次用菌蛋白肽来合成类蛋白，经氨基酸分析后发现，在反应前这些疏水性氨基酸与亲水性氨基酸的比为o 7 1 ：1 ，而形成类蛋白小球后比值变为】6 5 ：1 ，即通过反应疏水性氨基酸( 大部分为必需氨基酸) 的量明显增加。由此可见，低生物效价的蛋白质则可用类蛋白反应所形成的必需氨基酸来补充。大豆是最早应用在类蛋白反应的食品蛋白，大豆蛋白有良好功能性质，除了缺少含硫氨基酸外，其他氨基酸的含量均高于世界食品卫生组织的要求，因此利用类蛋白反应向大豆中导入必需氨基酸，如蛋氨酸，就可以使大豆蛋白成为优质蛋白，以满足现代化食品深加工的要求。m y a m a s h i t a ( 1 9 7 1 ) 等是第一次利用类蛋白反应来提高大豆蛋白生物效价的，他们向大豆蛋白中成功的导入了含硫氨基酸，使其含量明显增加。a s h l e y ( 1 9 8 3 ) 证明，利用类蛋白反应向大豆蛋白中导入的色氨酸和蛋氨酸，对于刚出生的小鼠其吸收率与游离氨基酸是相同的。之后也有很多研究者们也成功的导入了其他的必需氨基酸( c j u l i oe ta 1 ，1 9 7 9 ；s a r a i ，1 9 8 1 ) 。h a j o s 和h a l a s z ( 1 9 8 2 ) 利用类蛋白反应将l 蛋氨酸导入到酪蛋白中，使其成为功能“完整”的蛋白质。乳清蛋白的氨基酸含量是完全高于世界卫生组织的要求的，所以单纯的导入必需氨基酸是没有什么意义的。但乳清作为奶酪的主要副产品，对其回收利用是有很大的经济意义的。简单地利用乳清合成类蛋白就可以提高乳清的凝胶性( v s c i a n c a l e p o r ee ta 1 ，1 9 8 8 ) ，同时导入特定氨基酸，进一步改善其相应功能特性也是其他改性方法无法相比的。1 2 3 2 改善蛋白质水解物的风味许多研究表明，大豆、鱼、酪蛋白及许多蛋白质水解物有明显的苦味，这使酶法水解蛋白在食品工业上的应用受到了严重的限制。酶法水解蛋白产生苦味与否以及苦味的大小与蛋白质的种类、酶的类型、水解度及分离方法等因素有关。当疏水氨基酸由于肽键的形成居于肽链非端基( c 、n 端) 位置时，表现出苦味的最大值，当它居于c 、n 端时苦味较低，以游离氨基酸的形式苦味最低( 冯红霞，2 0 0 2 ：郭本恒，1 9 9 6 ：于国平，2 0 0 1 ) 。水解前疏水性氨基酸残基被包围在蛋白质的四级结构内，没有苦昧。水解后疏水性氨基酸残基的暴露使某些肽片段的疏水性增加而产生苦昧。蛋白质水解物的去苦味( d e b i t t e r i n g ) 方法主要有选择性分离、类蛋白反应、掩蔽和应用外肽酶四类方法。( 崔铁军，1 9 9 0 ；裘迪红，2 0 0 1 ；刘大川，1 9 9 8 ；刘洋，1 9 9 5 ) 特别是经过类蛋白反应后苦味会明显减轻或消失。这是因为类蛋白反应使得一些肽中疏水性氨基酸得以富集，这些疏水肽在水中很难溶解，经过凝聚形成颗粒而沉淀下来。同时，疏水侧链被包裹起来，不能和味觉细胞作用，从而达到了脱苦的目的。m r k i m ( 2 0 0 3 ) 指出大量初级结构的肽或游离氨基酸是产生苦味的原因。js y n o w i e c k i 等人( 1 9 9 6 ) 的报道中指出，在用木瓜蛋白酶催化的类蛋白反应所得的牛血红细胞水解物中游离氨基酸的量从1 86 m g g 减少到18 5 m g g ，此时牛血红细胞水解产物的苦味降低了约5 0 。因此，类蛋白反应是一种有效的改善蛋白质水解物苦味的方法。例如，我国的婴儿配方奶粉主要还是添加乳清粉，其来源也主要来源于进口，但进口的乳清粉品质参差不齐严重影响了奶粉的质量。直接对牛乳分离后再水解来制备优质的婴儿配方奶粉早有相关报道( 张嘉芷1 9 9 7 ) ，但酪蛋白一旦水解后就会出现不良气味，这严重影响了该技术的推广。早在1 9 7 0 年f u j i m a k i ( m y a m a s h i t ae ta 1 ，1 9 7 0 )等就提出类蛋白可以去除蛋白质水解物的苦味，e r i k s e n 等( 1 9 7 6 ) 从类蛋白反应中疏水键的包裹和隐藏解释了类蛋白去除苦味的作用。p e d e r s e n ( 1 9 7 9 ) 也指出类蛋白反应是去除蛋白质水解物苦味的有效方法之一。1 2 3 3 改善蛋白质的功能性质蛋白质的功能性质一般包括由亲水性、疏水性、表面相互作用及分子问相互作用引起的蛋白质特有的物理化学性质( a r u nk i l a r a ，d i n a k a rp a n y a m ，2 0 0 3 ) 。类蛋白反应可形成不透明的粘稠溶液，可用于食品的凝胶剂。蛋白酶通过类蛋白反应可使蛋白质发生交联，产生具有良好流变学性质的聚合物，这些性质在质构化食品中非常有用。通过产生粘稠溶液和凝胶，类蛋白反应能极大地改变蛋白质及蛋白食品的功能特性。d a n yd o u c e t ( 2 0 0 3 ) 等人通过对比酶诱导凝胶法和类蛋白反应法来测定凝胶所涉及的所有相互作用类型。通过脂肪酸酯的作用，类蛋白反应中通过疏水性共价键结合提高了蛋白质的溶解性，并产生了有效的蛋白表面活性剂。e d w a r dk o l a k o w s k i ( 1 9 9 7 ) 等以胰蛋白酶为催化剂来合成类蛋白，形成了鱼肉蛋白质的抗冻组织结构。随着研究的发展，同时导入多种必需氨基酸也成为了可能( a s h i m a d a e ta 1 ，1 9 8 4 ；m f u j i m a k ie ta 1 ，1 9 7 7 ) 。这使大豆合成类蛋白具有了更新的意义，不仅仅是合成功能完整的蛋白质，还可以利用导入的氨基酸的性质不同( 如疏水性不同) 来改善大豆蛋白的物化性质，s h i m a d a 和y a m a m o t o ( 1 9 8 4 ) 证明类蛋白反应可以提高蛋白质的粘度、乳化稳定性、起泡性。r e i m e r d e s 等( 1 9 9 0 ) 就利用类蛋白反应来提高牛乳的功能特性。c h e e s e m a n( 1 9 8 1 ) 利用脱脂乳作为底物合成类蛋白，提高其功能特性。m , l b r o w n s e l l ( 2 0 0 1 ) 等利用菌蛋白合成类蛋白，不但功能性质较原来的蛋白有了大幅度提高，更可以与许多优质的蛋白质相比。随着微生物学的迅速发展，利用菌蛋白合成类蛋白很可能成为类蛋白研究的主要方向。在简化类蛋白合成步骤上，a r a i 等( t 9 7 9 ) 提出了一步来合成类蛋白，并成功的将蛋氨酸导入大豆蛋白。而类蛋白在反应过程中是一个完全的酶的过程，所以可以说是一个“天然”的加工过程。反应过程中需要的温度低，能量要求低，溶剂大部分是水，而且添加试剂都是食品级的，这是许多利用化学方法对蛋白质改性无法相比的。这些都使类蛋白的工业化生产提供了可行性。s h i m a d a ( 1 9 8 4 ) 等人也通过类蛋白反应导入了脂肪酸酯，形成了新型的表面活性剂。可见通过类蛋白反应，食品蛋白的一些物理特性及功能性质如溶解性、乳化性、抗冻结性都得到了改善。6 1 2 3 4 提供新的蛋白质资源蛋白质摄入不足是困扰人类健康的一个难题。类蛋白反应能合成出类似蛋白质的物质，提高蛋白质资源的利用率。用于类蛋白质合成的原料丰富，如植物蛋白、动物蛋白、微生物蛋白等都可作为类蛋白反应的底物。p e d r ol o z a n o ( 1 9 9 4 ) 等人以牛血清蛋白为底物用q 胰凝乳蛋白酶为催化物合成了类蛋白。通过此反应改变了原有蛋白质的营养价值及物理特性，而且从f a o w h o 标准看，反应后必需氨基酸中亮氨酸、缬氨酸及含硫氨基酸都是底物的二倍。类蛋白在鱼类蛋白中应用研究仅次于大豆蛋白。这主要来源于西方的饮食习惯。在西方，鱼的主要食用方法是做鱼酱，而大量的副产品被用于做饲料。因此对鱼类蛋白的研究主要有鱼类制品的改性和鱼类废弃蛋白质的回收再利用。e k o l a k o w s k i ( 1 9 9 7 ) 也利用了类蛋白反应来提高鱼酱的功能性质，实验表明该反应提高了鱼肉蛋白质的溶解性和热稳定性。s i k o r s k i等( 1 9 8 1 ) 利用鱼类蛋白合成类蛋白所得的“新”蛋白质可以与蔬菜分离蛋白相媲美，并且无异味，完全可以用来充当肉类添加剂。r a g h u n a t h 等( 1 9 9 1 ) 利用鱼做的饲料合成类蛋白，有效的将蛋白质从废弃的鱼制品中回收，并取得了预想的效果。把类蛋白反应应用于其他蛋白质，其主要目的是为了提供一条新的蛋白质资源，如海藻，微生物，叶蛋白。叶蛋白由于原料易获得而且几乎没有成本而被受关注。r o s a s ( 1 9 8 7 ) 利用木薯叶( 一种美洲热带灌木植物，以其块茎状、含淀粉的硕大根而广泛种植) 合成类蛋白，从中回收了浓度高达9 0 蛋白质。r o s a s ( 1 9 9 7 ) 研究了利用叶蛋白合成类蛋白功能特性和营养特性。微生物作原料具有成本低周期短，产量大等特点，利用微生物类蛋白合成类蛋白也有诸多的优点。以上这些都为获得新的蛋白质资源提供了新思路。1 3 磁性纳米材料固定化酶的研究现状1 3 1 固定化酶的定义及优点酶在水溶液中，一般很不稳定，作为催化剂，酶液只能一次性地起作用，若是用于医学或化学分析领域，酶必须很纯，如此一次性使用，必然耗资很大。为了克服这种缺点，人们开始探索将游离酶与不溶性载体联结起来使之成为不溶于水的酶的衍生物，同时又能保持或大部分保持原酶固有的活性，在催化反应中不易随水流失。这样制各的酶，曾被称为水不溶酶( w a t e r - i n s o l u b l ee n z y m e ) 、同相酶( s o l i dp h a s ee n z y m e ) 等。后来发现，一些包埋在凝胶内或置于超滤装置中的酶，本身仍是可溶的，只是被限定在有限空间不能自由流动而己。因此，在1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”( i m m o b i l i z e de n z y m e )这一名称。所以，固定化酶是指经过物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失，而又能发挥催化作用的酶制剂。酶是一类特殊的生物催化剂，能够催化构成细胞代谢的所有反应，生物体内的各种化学东北农业大学工学硕士学位论文反应均是在酶催化下进行的。同一般的催化剂相比，酶有以下几个特点：( 1 ) 催化效率高：( 2 ) 专性强：( 3 ) 反应条件温和；( 4 ) 酶的活性是可以调控的。虽然酶在生物体内能够催化许多化学反应，但用作工业催化剂仍存在缺陷。由于酶是由蛋白质组成，其高级结构对所处的环境十分敏感，所以一般情况下，对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不够稳定，在反应中易失活，而且酶中常带有杂蛋白及有色物质，造成产物分离提纯困难，限制了酶在酶促反应中的广泛应用。2 0 世纪6 0 年代发展起来的酶固定化技术既克服了上述不足，又在一定程度上保持了酶特有的催化活性，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。与游离酶相比，固定化酶具有下列优点( 禹邦超，1 9 9 5 ) ：( 1 ) 固定化酶可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高，因而单位酶催化的底物量大增，用酶量大减，亦即单位酶的生产力高。( 2 ) 固定化酶极易与底物、产物分开，因而产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。( 3 ) 固定化酶的反应条件易于控制，可以装柱( 塔) 连续反应，宜于自动化生产，节约劳动力，减少反应器占地面积。( 4 ) 比游离酶更适合于多酶反应体系。( 5 ) 辅酶固定化和辅酶再生技术，将使固定化酶和能量再生体系或氧化还原体系合并使用，从而扩大其应用范围。经过三十多年的研究和发展，固定化酶技术已取得了氏足的进步，先后开发了多种性能多样的载体材料，取得了丰硕的成果。1 3 2 磁性纳米粒子的研究现状磁性纳粒子是指粒径在5 1 0 0 n m 的粉末材料，应属于准零维范畴( 尺寸介如原子、分子与宏观固体间) 。磁性纳米粒子由于具有磁性与流动性两者合一的独特性质，因而在巨磁电阻、磁性液、磁记录、软磁、永磁、磁致冷、巨磁阻抗材料以及