（食品科学专业论文）猪血球中卟啉铁的提取方法及血红素修饰技术的研究.pdf

堕垒壁生! ! 堕壁塑堡娶查鎏墨堡垒室堡塑垫查塑堕塞 摘要 畜血是屠宰场的副产品主要用作饲料，只有一小部分用于食品。由于其含有丰 富的蛋白质和微量元素，而利用程度较低，因此，在世界范围内受到人们的普遍关注一 本文分别利用冰醋酸和丙酮提取猪红血球中的卟啉铁，并对提取方法的可行性工艺以 及与之相关的理论进行了研究与探讨。本研究的另一个方面，对血红素用n o 进行修 饰，用作食品色素，这为畜血的开发利用提供了理论依据。具体的研究结果如下： 1 研究了冰醋酸法提取猪血球中的卟啉铁。结果表明，提取卟啉铁的最佳工艺为： 冰醋酸与血球的比例为4 4 ：1 。温度为1 0 5 、时间为4 0 分钟、氯化钠添加量为血球 的1 5 ：此时，提取的粗卟啉铁含量大约在5 0 左右。 2 对丙酮法提取猪血球中卟啉铁的工艺进行了改进，采用先加乙酸钠再调p h 的 方法，便于操作。结果表明，提取卟啉铁的最佳工艺为：丙酮与血球的比例为6 ：l ， 2 m 乙酸钠添加量为溶血球的2 ，p h 值为5 0 ：此时，提取的粗卟啉铁含量大约在 6 0 左右。 3 用n o 对血红素进行修饰，得到亚硝基亚铁血色原( n f h ) 色素并研究了 p h 值与还原剂对n f h 色素制备的影响。结果表明，对于n f h 色素的制备，最佳p h 为6 4 ；还原荆以抗坏血酸钠最好，连二亚硫酸钠次之，抗坏血酸最差。 ， 4 研究了亚硝基亚铁血色原( n f h ) 色素的稳定性7 结果表明，随着温度的升高， n f h 色素吸光度略有减少；随着加热时间的增加，色素的吸光度仅缓慢下降，说明色 素对热的稳定性相对较好。 随着贮藏时问的延长，n f h 色素吸光度下降：在本试验的条件下，n f h 色素的 贮藏稳定性以p h 值7 为最好。p h 值4 为最差；不同p h 值的贮藏稳定性为：p h 7 p h 6 p h 8 p h 5 p h 4 。光照稳定性与贮藏稳定性相类似。 5 在n f h 色素微胶囊化的过程中，本试验选择麦芽糊精、b c d 、阿拉伯胶作 为制造n f h 色素的壁材，确定其最佳组合为：麦芽糊精5 5 、8 - c d 2 5 、阿拉伯胶 2 0 。心材与壁材的适宜比例为l ：5 0 ，高压均质可有效地提高乳化液的稳定性，其 最佳均质压力为3 0 m p a ：经综合分析比较，微胶囊型n f h 色素的最佳喷雾干燥造粒 中国农业大学博士学位论文 工艺条件是：进风温度为2 0 0 、出风温度为8 0 、进料流量为5 0 m l m i n 。 关键词：猪血球：卟啉铁；提取；血红素：修饰 2 猪血球中卟啉铁的提取方法及血红素修饰技术的研究 a b s t r a c t a n i m a l b l o o di sab y p r o d u c to f t h em e a ti n d u s r y 1 t sm a j o ru s ei sa saf e e d s t u 仃，a n d o n l yam i n o rp o r t i o ni su s e df o rh u m a nf 的d a sp r o t e i na n dt r a c ee l e m e n ti sa b u n d a n ti n a n i m a lb l o o d ，b u tj ti sm r e l yu s e d ，s ot h eu t i l j z a t i o no fa n i m a lb l o o dh a sa r o u s e dg e n e r a l c o n c e mi nt h ew o d i nt h i sp a p e li tw a ss t u d i e dt h a te x t r a c t i o no fi r o n - p o r p h y r nf r o m p o r c i n eb l o o dc o r p u s c l eb yg l a c - a 1a c e t i ca c i da n da c e t o n e ，a r i dt h ef e a s i b l et e c h n i q u e a n d r e l a t i v et h e o e sw e r ei n v e s t i g a t e da n de v a j u a t e d o nt h eo t h e rh a n do ft | l i ss t u d y h e m e w a sm o d i 疥e db yn i tr i co x i d eg a sa saf o o dp i g m e n t i ts u p p l i e dt h e o r e t i c a lb a s i st om a k e f b l lu s eo f a n j m a lb 】o o d t h ec o n c f e t er e s u l t sw e r ea sf b l l o w ： 1 i tw a ss t u d i e di nas y s t e m a t i cw a yt h a ti r o n - p o r p h yr i nw a se x t m c t e df r o mp o r c i n e b l o o dc o r p u s c 】eb yg l a c j a la c e t i ca c d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s f o rt h ee x t r a c t i o nt e c h n i q u e so f i r o n p o r p h y r i nw e r er e a c t i o ns o l u t i o nc o n t a j n i n g9 1 a c i a i a c e t i ca c i da n d b l o o dc o r p u s c l ea ta4 4 ：1 ( v ：v ) r a t i o ，s o d j u mc h l o r i d ea n db 1 0 0 dc o r p u s c l e a ta0 0 1 5 ：1 ( v ：v ) r a t i o f o r4 0 m i na t1 0 5 t h ec o n t e n to f i r o n - p o r p h ”i n w a sa b o u t5 0 w i t h o u tf u r t h e rp u r 讯c a t i o n 2 t h ep r o c e d u r eo fe x t r a c t i n g i r o n p o r p h y r i n f r o mp o r c i n eb l o o dc o f p u s c l eb y a c e t c i ew 笛i m p r o v e d t h e 佗s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ee x t r a c t i o n t e c h n i q u e s o f i r o n - p o r p h y r n w e r er e a c t i o ns o l u t i o n c o n t a j n i n g a c e t o n e柚db i o o d r o r p u s c l e a ta 6 ：l ( v ：v ) r a t i o ， 2 ms o d i u ma c e t a t ea n d h m o l y s i s s o l u t i o na ta 00 2 ：l ( v ：v ) r a t i oa tp h5 0 t h ec o n t e n to f i r o n _ p o r p h y r i nw a sa b o u t6 0 w 泔l o u tf u r t h e r p u r i n c a t i o n 3 h e m ew a sm o d i 疗e d b y n i t r i co x i d e g a s a n dt h en f hp i g m e n t ( n i t r o s y l f e n d h e m o c h r o m e ) w 船p r e p a r e d t h ee f r e c to fr e d u c t a n t sa n dp ho nt h ep r e p a r a t i o no f t h en f h p i g m e n tw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e 叩t j m u mp hw a s6 4 o nt h e p r e p a r a “o no f t h en f h p i g m e n t a m o n g r e d u c t a n t su s e d ，s o d i u m 船c o r b a t ew a st h em o s t e f f 色c t l v e s o d i u md i t h i o n n ec a m es e c o n d a s c o r b i ca c i dw a st l ct h i f d 4 t h es t a b i j j t i e so fn f hw e r es t u d i e d 1 飞er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea b s o r b a n c eo f n f hd e c r e a s e dw h i l et h e t e m p e r a t i i r e m s e w i t ht h e i n c r c a s i n go fh e a t i n gt i m e ，t h e a b s o r b a n c eo f n f hd e c r e 私e ds l o w l y i tp r o v e dt h a ti t ss t a b i l i t yt oh e a tw a sb e n e l w i t ht h ei n c r e 船i n go f s t o r i n gt i m e ，t h ea b s o r b a n c eo f n f hd e c r e a s e d ，i t ss t a b i l i t yo f s t o r i n gw a s t h eb e s ta tp h 7 ；i tw 鹅t h ew o r s ta tp h4 t h es t a b i l i t i e so f s t o r i n g a td i f 诧r e n c 3 p hw e r ea sf o l l o w s ：p h7 p h 6 p h8 p h5 p h 4 a n dt h es t a b j l i t i e st ol i g h tw e r e s i m i l a rt ot h o s eo f s t o r i n g 5 i nt h ec o u r s eo fm i c r o e n c a p s u l a t i o no fn f hm l ss t u d ys e l e c t e dm a l t o d e x t r p ， b - c y c l o d e x t r i n 拍da m bg u ma sw a l l - m a t e r i a l s ， t h e i r o p t i m u mc o m p o s i t i o n w a s m a l t o d e x t r i n 5 5 ，b - c y c l o d e x 仃i n2 5 a n da r a bg u m 2 0 t h es u i t a b l eh o m o g e n i z i n g p 陀s s u r e w a s3 0 m p a t h r o u g | lc o m p r e h e n s i v ea n a i y s i s ，t h eo p t i m u ms p r a yd r y i n g c o n d i t i o n sf o rm i c r o e n c a p s u i a t i o no fn f hw e r e ：i n l e t2 0 0 ：o u t l e l8 0 ： f e e dn o w 5 0 m v m i n k e y w o r d 辩p o r c i n eb 1 0 0 dc o r p u s c l e ：l r o n - p o r p h y r i n ；e x t m c t i o n ；h e m e ；m o d i 行c a t i o n 4 堕些堡史坠堕壁塑堡娶杰鎏垦垒丝童堡塑垫查塑竺塞一 第一章文献综述 l 立题意义及研究目的 我国猪血资源十分丰寓。自1 9 9 3 年以来，我国肉类产量一直处于世界第一，其 中生猪产量接近世界总量的二分之一，是世界上的养猪大国。据资料报道，我国每年 可得猪血25 3 亿公斤( 车振明。2 0 0 0 ) 。然而，我国大多数肉类屠宰场中，猪血利用 率极低：只有少数屠宰场用猪血浆制作血豆腐等，猪血球基本上被废弃。由于猪血球 没有很好地被利用，这造成血产品的成本较高，因此猪血综合利用问题的焦点集中 在血球的开发上，本课题的目的就是将这部分被废弃的血球利用起来。 一方面，猪血球中的卟啉铁是一种良好的补铁剂，可治疗缺铁性贫血。据资料报 道贫血症占世界人口的3 0 ( p a l i a r e s ，1 9 9 6 ) ，而缺铁性贫血( 简称i d a ) 是世界上 最常见的营养缺乏症之一( n a d i g e l1 9 8 0 ；h a l | b e t _ g ，1 9 8 】；p o l l i t 1 9 8 6 ；l e b r u n ，1 9 9 8 ) 无论发达国家还是发展中国家都普遍存在着这种营养缺乏症。发达国家由于供给的 食物经过多次精加工，以及铁制饮具应用的减少，使膳食中铁量不足，据估计，约有 l o 一2 5 的人口受缺铁影响而发展中国家，尤其是贫困地区，食物结构大都以植物 性食物为主，动物性食物为辅，而来自植物中的铁有9 0 不能被人体吸收因此，铁 缺乏高达3 0 、4 0 。缺铁性贫血主要威胁少年儿童、育龄妇女，尤其是孕妇和乳母， 它使人体红细胞减少，血红蛋白含量下降，工作效率降低认知和行为能力变差，抗 病力下降，因而对人类健康构成了巨大威胁。这是因为铁在人体内承担着运送氧气并 完成生物氧化的重要功能。正常成人体内含铁量约为3 5 克，约l j i 体重的0 0 0 4 ( 顾 奎琴，1 9 9 7 ) ，它是人体各种含铁蛋白质如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素酶体系、 过氧化氢酶等的重要成分( 郭殿文1 9 9 2 ) 。缺铁不仅影响血红蛋白的形成，而且影 响细胞体内一系列酶的活性，使d n a 合成发生障碍。目前常用的补铁剂为非卟啉铁， 吸收率低，并有一定的副作用( h u s s a n 1 9 6 5 ；h a l l b e 唱，1 9 7 2 ：b j o m ，1 9 7 4 ；c o o k ，1 9 7 6 ； l a v r i s s e 1 9 7 8 ) 。而从血球中提取的卟啉铁，无毒无害，吸收率高一般不受膳食因 中国农业大学博士学位论文 素的影响( b i o m ，1 9 7 4 ；w h b y ，1 9 8 1 ；m o m s ，1 9 8 3 ) ，可望取代目前常用的补铁剂 另一方面，猪血球中的血红素经修饰后，可作为理想的食品着色剂。目前，我国 许多食品，尤其是肉制品的发色，主要用亚硝酸盐作为发色剂，使得食品中的亚硝酸 根含量较高，而亚硝酸根被人体吸收后，易与人体内蛋白质代谢过程产生的中间产物 仲胺发生反应，生成具有致癌作用的亚硝胺类物质。所以，近年来许多国家都在呼吁 控制或取缔亚硝酸盐作为食品发色剂。一些人工合成色素也有潜在的毒性，许多国家 对此加以控制因此，开发安全无毒的食品色素成为当务之急。一些已经研究出的食 品色素，由于原料来源不足，工艺设备复杂，生产成本高，产品稳定性差，故得不到 广泛使用。然而，随着食品工业发展迅速，对色素的需求量日益增加，亚硝酸盐作为 发色剂，国内还普遍在使用。因此，血红素经修饰后，作为良好的食品着色剂，具有 广阔的发展前景。 目前，国外对血球中卟噼铁的提取及血红素修饰技术的研究报道较少；而我国在 这方面的研究尚处于起步阶段，尤其对卟啉铁提取及血红素修饰的基础理论体系的研 究还处于空白。鉴于上述几方面原因，开展本项研究对充分利用猪血资源，提高产鼎 附加值具有重要意义。 本论文的研究目的就是分别利用冰醋酸和丙酮提取猪血球中的卟啉铁，对提取方 法的可行性丁= 艺以及与之相关的理论进行探讨。并对血红素用n o 进行修饰，得到亚 硝基亚铁血色原食品色素，为畜血的利用开发了一条新的途径。 2 国内外研究现状 2 1 血液概况 血液对动物体十分重要，在体内流动时为其它器官和组织提供氧和营养物质，同 时携带并排除代谢废物。血液含有丰富的蛋白质和微量元素，以及适量的矿物质、维 生素、激素、酶和其它一些生物活性物质。由动物血管抽出的血液，及时用抗凝剂处 理后，就称为抗凝血。抗凝血经过离心( 静置) ，能明显地分为上下两层。上层颜色较 浅( 橙红色) 为血浆：f 层颜色较深( 深红色) ，不透明，为血球。血浆约占总量的 6 5 ，其中8 为蛋白质，血浆蛋白质一般分为血清白蛋白、血清球蛋白和血纤维蛋白 三种：剩余的3 5 为血球。其中3 6 为蛋白质，主要是血红蛋白，而血红蛋白是由血 红紊和珠蛋臼组成。如图卜l 所示。 6 猪血球中卟啉铁的提取方法及血红素修饰技术的研究 图1 _ 1 血液的组成 f i g 卜1t h ec p o s i t i o no fb l o o d 动物血液的总量一般为体重的5 1 1 但由于动物的种间差异而有所不同。同一 种动物其血量的多少又受动物的年龄、性别、肥瘦、营养状况、活动程度、泌乳及外 界环境等因素的影响。 2 2 采血方法( 陈曾三，1 9 8 8 ：w i s m e r ，1 9 7 9 ) 一般来说，活畜经过检验后认为没有疾病或异常现象其血液才能被利用。日本、 瑞典等国早在二十世纪6 0 年代到7 0 年代，就使用空心刀采血。目前，在我国屠宰场 中，很少采用空心刀来采集食用、医疗和制药用的畜血。因此，采集的畜血不卫生， 不宜作食用、医疗和制药用的原料，并且畜血在贮藏加工过程中易被微生物污染，导 致腐败变质。如果采用空心刀采血，就能获得卫生质量较高的血液，从而改善了取血 的卫生条件。 空心刀采血的方法是用空心刀刺穿牲畜的颈动脉。通常，一头猪平均取血3 千克， 为防l p 污染，最初流出的l 千克左右的血液先废弃，实际利用的猪血每头约为2 千克。 日本发明的采血刀可直接从动物体内采血，采血装置包括采血刀移动机构和抗凝剂供 给机构。采血刀随着屠畜所在的位置同步移动在采血的同时，自动地向血液内添加 抗凝剂血液从采血刀进入采集罐。 7 秦 白 红 蛋 血 珠 厂，、lil 中国农业大学博士学位论文 丹麦和前西德等研制出符合卫生标准的真空采血系统，在这样的系统内，可以使 畜血在密闭的环境中进行冷却、分离等一系列处理，把血球加工成饲料，把分离血球 后的血浆加工成食用血蛋白真空采血系统由真空采血刀、真空缓冲罐、贮血罐、真 空罐、血浆分离机、冷却器等组成。按作用可分为采血、抗凝、分离、冷却和消毒五 个部分。 2 3 铁缺乏的危害 缺铁性贫血是世界性的营养问题，是严重危害人类健康的最常见的一种营养性疾 。 病全世界约有5 6 亿人患铁缺乏症。我国营养性贫血患者中有9 5 6 5 为缺铁性贫血： 7 岁以下小儿缺铁性贫血患病率约为2 0 7 0 ( 吴斌，1 9 9 7 ) 。发病原因主要由于食物 中铁含量不足和铁的来源绝大多数是植物性食品，吸收利用率低( f r a n k ，1 9 9 3 ) 。 食物中的铁有两种存在形式：一类是离子铁，主要以f e ( o h ) 。络合物的形式存在 于植物性食物中，这类铁在食物中尽管含量较高，但难于吸收。另一类是衄红素铁， 又称卟啉铁。 铁是人体重要的微量元素之一，肌体缺铁时可出现缺铁性贫血，表现为食欲减 退、乏力、面色苍白、头晕等。我国规定铁的供给量标准如下表卜1 所示( 顾奎琴， 1 9 9 7 ) 表卜1 我国铁的供给量标准 t a b kl - lt h e s u p p l ys t a n d 4 一o f i r o n nc h i n a 人群供给耸( m 日) 婴儿及儿童( 1 0 岁以下) 儿童( 1 0 1 2 岁) 青少年男性 青少年女性 成年男性 成年女性 孕妇及乳母 老年人 铁在自然界分布广泛，地壳中约含铁4 7 ，我国营养学普查表明，食物中并不缺 2 m ” 加 佗 体 勰 挖 猪血球中卟啉铁的提取方法及血红素修饰技术的研究 铁，但我国儿童贫血患者较多，其中大多为缺铁性贫血( 简称i d a ) 。这说明铁吸收率 低下乃是i d a 的主要原因。铁虽然广泛存在动、植物体内，但各种食物中铁的吸收率 却差别极大，如表卜2 所示。 表卜2 部分动物性和植物性食物铁吸收率的差别 t a b l e1 2t h ed i f f e r e n c eo f i r o na b s o r p t i v i t y b e t - e e ns o m ea n i 眦la n dp l a n tf o o d 铁的吸收率( ) 食物种类 血红蛋自 蛋 角 小麦 莴苣 菠菜 大米 正常成人体内含铁量约为3 5 克，约占体重的o 0 0 4 ( 顾奎琴，1 9 9 7 ) ，它是人 体各种含铁蛋白质如血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素酶体系、过氧化氢酶等的重要原 料，见表卜3 所示( 郭殿文，1 9 9 2 ) 。 铁缺乏是当今世界上最普遍的营养问题。铁缺乏通常不易察觉出来，如像苍白、 无神和疲乏这些仅有轻微症状的小毛病没有被认为会危及生命。然而，铁缺乏具有多 种后果，共至会导致死亡。研究人员发现，成年人体内铁的含量过低，其工作效率受 到影响，并由于免疫系统受到损害而增加生病机会。 加利祸尼亚大学的e r n e s t o 等( 1 9 8 2 ) 研究发现，轻度缺铁儿童在一套行为测验 中成绩比铁状态正常的儿童差。在泰国，e r n e s t o 等对2 0 0 0 个儿童所作的研究发现， 铁缺乏对认知能力的不利影响是不可逆转的，并且铁水平、智商和泰语成绩测验之间 有显著相关性：铁的含量水平越高。成绩越好。世界上其它各地的研究，包括印度、 印度尼西亚等国都一致地发现了类似的联系。 9 挖 3 5 4 7 1 ! 里壅些查兰坚主兰丝丝壅 表卜3 标准人体内舍铁化合物的功能极其分布 t 8 b l el 一3t h ef u n c t i o n sa n dd i s t r i b u t i o no ff e r r o u sc o m p o u n d 1 nn o r m 8 ln u m a 砷 _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ - - 。_ 。一 含铁化合物功能含铁化合物量( g ) 含铁量( g )占全身总铁量 ( ) 2 4 卟啉铁的研究进展 2 4 1 卟啉铁简介 ：一( = 1 1 ：v ：一a 卜a l ：p ：一c ：c r f ：“叼f 图卜2 血红素的结构 f ；g 卜2t h es t r u c t u r eo fh e m 6 血红素是哺乳动物血液、肌肉中的红色色素，它的基本结构是由四个吡咯环通过 亚甲桥相互连接而成卟吩带有侧基的卟吩形成卟啉，卟啉和一分子亚铁相结合形成 卟啉铁化合物血红索。因此，血红素又称卟啉铁化合物，它可以治疗缺铁性贫血。 猪血球中卟啉铁的提取方法及血红素修饰技术的研究 2 4 2 卟啉铁的特点 卟啉铁是指与血红蛋白和肌红蛋白中的卟啉( p o r p h y r i n ) 结合的铁。由于卟啉 铁能直接被肠粘膜上皮细胞所吸收，然后在粘膜细胞内分离出铁并与脱铁蛋白结合形 成铁蛋白。所以，卟啉铁的吸收与非卟啉铁相比具有以下特点： a 吸收无障碍：卟啉铁因直接被肠粘膜细胞吸收，因此不受植酸盐、草酸盐、 磷酸盐和碳酸盐的影响，甚至与咖啡、茶等一起摄入，其吸收也不会受丝毫干扰。 b 吸收率高：卟啉铁因无需在肠道内分离出亚铁离子，因此不受胃酸分泌状态 的影响，其吸收率可达1 5 一2 5 左右。 c 摄食后无副作用：非卟啉铁( 如常用补铁剂：f e s 0 。) 摄食后有时会出现恶心、 腹胀、腹泻、便泌等症状( b j o r n 。1 9 7 4 ：w 1 b y ，1 9 8 1 ：m o r r i s ，1 9 8 3 ) 。而卟啉铁不 会产生这些症状。 2 4 3 卟啉铁( 血红素) 的疗效及安全性 治疗缺铁性贫血主要用口服铁剂。近年来，铁剂的剂型开发顺序为无机态型一有 机态型一生物态型，即硫酸亚铁一葡萄糖酸亚铁、柠檬酸亚铁一铁肝粉、血红素铁( 唐 敏，1 9 9 0 ) 。传统上治疗缺铁性贫血的常用药物如硫酸亚铁、富马酸亚铁等都是无机 铁或植物铁这些药物的疗效是肯定的。但它们在体内的利用率低，需要服用的铁剂 量较大，导致胃肠道反应严重：而且，有特殊的金属铁锈味，难以持续治疗。血红素 铁是吸收率最高的生物态铁剂( c o n r a d ，1 9 6 7 ：l y n c h ，1 9 8 5 ：t a n g ，1 9 9 0 ) ，不会产 生任何消化道刺激症状，已成为人类迄今所知最为理想的抗贫血药物。美国食品药物 管理局( 简称f d a ) 已于1 9 8 3 年7 月正式批准雅陪公司的血红素作为药品使用。 血红素作为一种优良的铁强化剂及抗贫血药，已被药理及临床所证实徐玉秀报道 ( 1 9 9 0 ) ，应用血红素治疗3 0 例成人缺铁性贫血，各种贫血症状明显改善。血液检验 指标明显好转，而且，无胃肠道刺激作用，患者愿意服用，总有效率达9 0 。游开绍 等( 1 9 9 6 ) 州血红素按每曰9 3 m g k g 、1 6 8 m g k 9 1 和3 0 0 m g k 9 1 治疗失血 性贫血大鼠，并与葡萄糖酸亚铁( 3 0 0 m g k g 1 d 1 ) 治疗组、仅给水组比较，2 4 小时内对2 0 只小鼠给血红索6g 蝇1 灌胃以观察小鼠的急性毒性反应，对8 0 只 大鼠连续3 个月分别给血红素o 6 5g k g 一d 、1 3g k g d - 1 和2 6 9 k g d _ 1 灌胃观察大鼠的长期毒性反应。结果发现无法测出血红素的口服半致死量；进行 限度试验，2 4 小时内给血红素6g k g1 灌胃，无任何毒副作用。长期毒性试验发现， 中国农业大学博士学位论文 对大鼠进行灌胃。大鼠活动仍然正常，食欲怠好，体重继续增长，进行肝肾功能检查 及脏器组织检查等未见异常，说明长期使用血红素是非常安全的，无任何毒副作用。 并且血红素治疗大鼠失血性贫血优于葡萄糖亚铁。张志峰等( 1 9 9 8 ) 的研究也得出 类似的结果。因此，可以认为食用血红素是安全的，且抗贫血疗效显著。 2 4 4 卟啉铁( 血红素) 的提取方法 目前血红素的提取方法主要有以下几种方法： 2 4 4 1 冰醋酸法 俄国学者s c h a l f e j e f f ( 1 8 8 5 ) 用冰醋酸、氯化钠和血共热得到的血红素结晶，这 是实验室内最早分离、提取血红素的方法。目前，实验室内大量制备血红素的方法仍 以冰醋酸为基础，传统的冰醋酸结晶法在工业上仍被应用( 陆导仁，1 9 9 2 ) 。 2 4 4 2 酸性丙酮法 1 9 7 5 年l i n d r o o s 等人提出使用酸性丙酮提取血红素的方法。即向血球中加入适 量的酸性丙酮，使蛋白质凝固，血红素溶于丙酮液中，再碱化提取血红素沉淀部分 的蛋白质可作食品添加剂用( l i n d r o o s ，1 9 7 5 ) 。其基本原理为：血红蛋白是由4 分 子血红素和1 分子璩蛋白结合而成的，在p h 值酸性条件下，血红素和珠蛋白的结合 较为疏松，此时加入有机溶剂丙酮，使珠蛋白变性凝固，血红素溶于丙酮中，在上述 丙酮液中加入适量的乙酸钠，可得到血红素结晶。 此方法原料消耗少、不需加热、且血红素损失少，提取率较高。 2 4 4 3c m c 法 1 9 8 3 年芬兰专利介绍了一种颇为新颖的提取血红素的方法。即血液中的红血球溶 血后，若调节p h 值在3 o 左右，加入c m c ( 羧甲基纤维素) 阳离子交换剂，血红素可 被c m c 吸附，然后过滤，就可以分离出血红素。c m c 既可吸附血红素，又能用作药物赋 形剂。利用这种羧甲基纤维素后不需洗脱，将血红素和c m c 直接作原料压片闱作抗贫 血药( f i n np a t e n t ，1 9 8 3 ) 。 1 9 9 8 年，印韵芝等对此法提取血红素的工艺进行了简要的报道，工艺流程如下： 鲜猪血一抗凝一离心分离一血球一加水溶血一酸化一加羧甲基纤维素一静置一离 心分离一血红素 此方法 艺简单，成本低，但提取的血红素含量较低，因此，应用受到一定限制。 1 2 猪血球中卟啉铁的提取方法及血红素修饰技术的研究 2 4 4 4 甲醇法 1 9 7 9 年，欧洲专利介绍了使用甲醇或甲醇、乙醇混合溶剂提取血红素的工艺。甲 醇【艺是以血球干粉为原料。每公斤干粉以2 0 升甲醇在酸性条件下提取两次，沉淀 部分为灰白色的蛋白质，上清液蒸馏浓缩得到血红素( e pp a t e n t ，1 9 7 9 ) 。 但甲醇对人体有剧毒，食入一定量可导致人永久性失明，此法不宜使用。 2 4 4 5 乙醇冷冻提取法 有学者报道，在冷冻条件下用乙醇提取、分离血红素。 此法乙醇的用量太大，在终产物中不易除去，且在低温条件下进行，因此，难以 用于工业生产。 2 4 4 6 蛋白酶水解法 此法是在血液中加入柠檬酸钠，离心分成血浆和血球，在血球中加水和碱性蛋白 酶进行水解，上清液为球蛋白，其残渣便是血红素。然后，将血红素水洗、过滤、干 燥，制得粉末状产品。具体方法是：将2 0 0 毫升4 0 柠檬酸钠溶液加到2 0 升畜血中， 充分搅拌后再分离成血浆和血球，血球中加入3 倍水，使血球溶血，再加入4 碱性 蛋白酶，每升溶血液添加量为0 6 升，p h 值8 5 ，温度保持在5 5 ，再用标准盐酸将 溶液p h 值调整到4 0 ，再通过离心沉降分离出血红素，经水洗、过滤、干燥，得血红 素制品然而，由于此法的成本较高应用受到了一定的限制。 2 5 血红素修饰技术研究进展 2 5 1 血红素修饰技术研究的必要性 2 5 1 1 亚硝酸盐在肉制品加工中的危害 亚硝酸盐作为传统肉制品的腌制剂成分之一，有着多种功能。它可与肌肉中蛋白 质( 如肌红蛋白) 反应，产生腌肉制品特有的颜色( f 0 x ，1 9 6 6 ) ，赋予腌肉制品典型 的风味( h a d d e n ，1 9 7 5 ) 具有抗氧化特性，并且抑制肉毒梭状芽胞杆菌的生长，防 止毒素的形成( p i e r s o n ，1 9 8 2 ) 。 然而，亚硝酸盐与肉中胺和氮基酸反应可产生亚硝胺( g r a y ，1 9 7 6 ) 。动物实验 表明，一些亚硝胺物质，比如，n 一亚硝基二甲胺和n 一亚硝基吡咯烷具有致癌、致畸和 诱变性( m a g e e ，1 9 6 7 ) 。科学家们研究发现在煮熟的腌制培根中残留着n 一亚硝基吡 咯烷，而n 一亚硝基二甲胺更广泛地残留于腌肉中，即使它们的残留量在1 0 亿分之几 3 垦窒些盔兰堡主堂堡堡塞 的范围内，对人们也造成较大的危害。 有致癌作用，而且一次摄入足够的量， 2 5 1 2 血红素颜色的不稳定性 研究结果表明：不仅长期小剂量摄入这些物质 也有致癌作用。 有研究表明，血红素不仅作为良好的补铁剂，治疗缺铁性贫血，还可用作食品的 色素，在肉品行业中可部分代替发色剂亚硝酸盐等，减少亚硝酸盐的致癌作用，但是， 血红素的颜色呈现不稳定性。 血红蛋白是由四个分子的血红素和珠蛋白结合而成，其呈色部分为血红素，珠蛋 白本身并无颜色血红素因具有易消化吸收的铁，而具有极高的营养价值。但也因为 具有铁，易与空气中的氧发生反应使其颜色表现出极大的不稳定性。血红素中的铁原 子具有配位能力，配位数为6 ，其中有2 个共价键和四个配位键，如图卜3 所示。 n 0 i j l n 圆嘴羽 ： i 殊蛋白 图卜3 血红素铁的两个共价键和四个配位键 血红蛋白在高氧分压时，产生氧合血红蛋白，呈现鲜红色。血红蛋自之所以具有 与氧可逆结合与解离的特性，是由于血红素的二价铁离子和氧结合为配位键，在结合 与解离时二价铁离子和氧之问并无电子的得失，即二价铁离子并未发生价数的改变， 所以称为氧合( h h b ) ，而不是氧化。氧合反应是可逆的，随氧分压的高低而出现一种 特定形状的“s ”形解离曲线。氧分压低时，氧合血红蛋白会迅速脱去氧而使血红素 处于还原状态，而足稍暗的紫红色。当氧分压降到一定程度时，氧化则起主导作用， 使血红蛋白中血红素的二价铁离子被氧化成三价铁离子，从而形成灰褐色的高铁血红 蛋白( 肼b ) ，其颜色变化及反应式如下： 4 猪血球中卟啉铁的提取方法及血红素修饰技术的研究 l | b 0 2 ( 鲜红色) = 二二二h b ( 紫红色) m b ( 灰褐色) 据资料报道，在血红蛋白中血红素处于一个疏水环境( 大约由6 0 个疏水氨基 酸残基包围而形成) ，这一环境可以防止二价铁离子氧化为三价铁离子。当血红素与珠 蛋白分离时。这个环境遭到破坏，血红素失去这种保护作用，血红素的二价铁离子就 很容易氧化为三价铁离子，呈现出灰褐色。因此，有必要对血红素进行修饰，使血红 素的颜色保持稳定。 2 5 2 血红素修饰技术的研究现状 食品的色泽是构成感官质量的重要因素赋予及保持食品以良好的色泽是需要研 究的重要课题。由于合成色素有程度不等的毒性，某些甚至有致癌性，因而人们越来 越重视对天然色素的研究应用。其中以卟吩环为结构的吡咯类色素是最受到重视的天 然色素。天然毗咯类色素有两大类，即动物组织中的血红素和植物组织中的叶绿素， 血红素在溶液中呈红色1 9 6 2 年，伢l a d g i s 报道煮熟的腌肉粉红颜色是由于亚硝基亚 铁血色原色素产生的。由于血红素不稳定，为了使它保持鲜艳的红色并保持稳定，传 统的作法是添加适量的亚硝酸盐，使血红素形成亚硝基亚铁血色原。但由于亚硝酸盐 有潜在的致癌危害，1 9 7 3 年日本专利介绍了以猪血血红素制成亚硝基亚铁血红素供食 品着色用的方法即亚铁血红素与一氧化氮结合后生成鲜桃红色的亚硝基血红素，这 种亚硝基血红素在加热后仍保持鲜红添加这种色素食品可长期保持鲜桃红色。l e e 等人( 1 9 7 6 ) 和r e n e r r e 等人( 1 9 7 9 ) 也发现腌肉在加热时，肌红蛋白中的球蛋白变 性，并与血红素分离，这时可以添加n o 对血红素进行修饰，制得亚硝基亚铁血色 原色素。这个色素中所结合的n o 只相当于亚硝酸钠的o ，0 0 0 2 ，因此，不可能形成 亚硝胺( s h a i l i d i 。1 9 8 5 ) 。s h a i i i d i 等人( 1 9 8 5 ) 用n o 对血红素进行修饰，制得亚硝 中国农业大学博士学位论文 基亚铁血色原色素。他们的研究发现，p h 值、还原剂对亚硝基亚铁血色原色素的制备 影响较大。目前，国内这方面的研究报道甚少。 2 6 微胶囊技术研究概况 2 6 1 微胶囊化的基本原理 微胶囊化的基本原理是针对不同的芯材和用途，选用一种或几种复合的壁材进行 包覆其制备方法大致可分为物理化学法、化学法和物理法 2 6 1 1 水相分离法 水相分离法适用于芯材是非水溶性的物质，壁材是水溶性的聚合物。聚合物的凝 聚相是从水溶液中分离出来形成微胶囊壁。水相分离法可分为复凝聚法和单凝聚法。 复凝聚法是由两种带有相反电荷的线性无规则聚合物材料作为壁材。将芯材分散在壁 材水溶液中，当聚合物离子间发生静电作用相反电荷的高分子材料相互交联后，体 系分为稀相和浓相，自溶液中凝聚出来实现复凝聚的必要条件是：有关的两种聚合 物离子的电荷相反，且混合物中离子数量在电学上恰好相等复凝聚微胶囊化技术由 下列3 步组成：芯材物质在聚电解质水溶液中扩散；加入带相反电荷的另一种聚电解 质水溶液，并在芯材周围形成沉析：凝聚层的凝胶与固化明胶- 阿拉伯树脂微胶囊的 制备是复凝聚微胶囊化技术中一种典型方法。单凝聚是以一种高分子材料为壁材，将 芯材物质分散到壁材中，然后加入凝聚剂由于水与凝聚剂结合致使壁材的溶解度 降低而凝聚出来，形成微胶囊。如选择适当温度、p h 值、溶剂或盐等条件，则任何聚 合物的水溶液都能发生单凝聚。明胶由于其成膜性能很强，对入体无害，其单凝聚产 品在食品微胶囊上多有应用。 2 6 1 2 有机相分离法 有机相分离法应用于水溶性或亲水性物质的微胶囊化。其原理是向作为壁材的聚 合物有机溶剂的均相溶液中，加入一种对该聚合物为非溶媒的液体，引发相分离形成 微胶囊。所分离出来的聚合物数量和状态取决于聚合物的浓度、沉淀剂用量及温度。 2 6 1 3 界面聚合法的原位聚合法 界面反应制微胶囊的过程包括：通过适宜的乳化剂形成油水乳液或水油乳液， 使被包囊物乳化；加入反应物以引发聚合，在液滴表面形成聚合物膜；微胶囊从油相 或7 r 相中分离。在界面反应制微胶囊时，影响产品性能的很重要因素是分散状态。乳 6 堕垒壁生! ! 堕堡塑堡里查鲨墨空塾墨堡堕堡查塑堡室一 化剂、分散剂、稳定剂的种类与用量和机械搅拌效果对微胶囊的粒度分布、囊壁厚度 等有很大的影响。 2 6 1 4 分子包囊法和辐射包囊法 分子包囊法是发生在分子水平的微胶囊法，它主要利用b 环糊精作为胶囊化的壁 材物质。一般有3 种方祛：把环糊精和芯材分子混合在一起，然后搅拌混合；把固体 环糊精与外来分子混合，加水制成糊状，在此过程中不用任何溶剂：把气体引入环糊 溶液中。辐射包囊法以聚乙烯或明胶为壁材，利用射线或电子束进行辐射后使壁材在 乳浊液状态发生交联，可得到球状实体微胶囊然后蒋微胶囊浸泡于含芯材的水溶液 中使其吸收芯材，待水分干燥后得到含有芯材的微胶囊产品。 2 6 2 壁材的性质 不同的应用条件对于微胶囊囊壁材料有不同的要求。食品工业中选择微胶囊囊壁 材料的条件是：能与芯材相配伍但不发生化学反应，能满足食品工业的安全卫生要求， 同时还具有适当的物理性质，如聚合物的熔点、渗透性、弹性、韧性、玻璃化温度、 溶解性及单体的性质等可以作为食品工业中微胶囊囊壁材料的物质有：天然高分子 材料( 明胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉、马铃薯淀粉等) 具有无毒、成膜性好的优点 缺点是机械强度差、原料质量不稳定；半合成高分子材料( 按甲基纤维素、乙基纤维 素、硝酸纤维素等) 的优点是毒性小、粘度大、成盐后溶解度增加，缺点是易水解、 不耐高温、耐酸性差；全合成高分子材料( 聚丁二烯、聚乙烯、聚乙二酵、聚乙烯酸 等) 其特点是成膜性好，化学性能、稳定性好以天然高分子为囊壁材料的微胶囊制 备方法有许多，其中以明胶为囊壁材料的最多。主要采用复凝聚法并进行了改进：在 油相中添加一种反应试剂；固化前加入抗絮凝剂，将明胶改性，采用其他固化剂以及 采用不同方法除去残余甲醛。乙基纤维素是适用于非水体系絮凝工艺；醋酸纤维素酯 既适用于非水体系絮凝工艺，又适用于水体系中单凝聚的工艺传统的微胶囊囊壁材 料成本较高，不利于推广利用，因此人们一直在研究用复合壁材替代经典壁材，黄原 胶以其特有的性质成为复合壁材的重要组分之一。 2 6 3 微胶囊化技术在食品工业中的应用 从1 9 5 4 年第一个微胶囊化产品( 无碳复写纸) 被开发以来，微胶囊化技术作为 一种有效的商品化方法被广泛利用，在食品工业中也得到迅速的发展。 应用微胶囊化技术对一些食品有效成分或添加剂进行包囊化将奶油香精微胶囊 中国农业大学博士学位论文 化，可避免香味物质直接受热、光的影响而引起氧化变质，避免有效成分的挥发，有 效控制香味物质的释放，提高奶油香精的稳定性，并使其转化成粉末；葱头油属琥珀 黄至琥珀橙色的挥发性精油具有葱头所特有的强烈辛辣香气和香味，也由于数量少、 价格贵，可做成粉状微胶囊再供使用，以满足人们对食品色香味营养保健的更高要求。 挥发性芥子油是十字花科类植物中所含黑芥子甙经水解而产生的挥发油，它挥发性极 强，具强烈的刺激性气味，所以用芥子油作为囊心物质而制成微胶囊化，具有一定的 代表性作用。利用微胶囊化技术可使传统液体产品固体粉末化。某些传统产品，诸如 香精香料、酒、油脂、酱油和食醋等，应用利用微胶囊化技术可将之变成相应的固体 粉末产品相比于液体产品，经转化的固体粉末产品不仅提高了在储藏、运输和使用 时的方便性与稳定性还可对其释放速率进行控制利用微胶囊化技术还可对细胞或 酶实现固定化通过大肠杆菌的包囊化可进行天冬氨酸的连续化生产；用甲壳质、甲 壳胺对n 糜蛋白酶、乳酸酶、葡萄糖转化酶、碱性磷酸酶