（化学工程专业论文）氧化铝柱层析分离纯化磷脂的工艺优化.pdf

摘要 高纯度磷脂作为一种优良的表面活性齐j 和乳化剂已经被广泛应用于食品、 医药、化妆品等行业。目前国内高纯度磷脂产品尚依赖进口，对其需求也在逐 年增加。因此，迫切需要开发出适合我国国情的高纯度磷脂的制备方法。针对 我国鸡蛋资源非常丰富但是利用率低下的现状，本课题组一直致力于高纯度蛋 黄磷脂的制各研究并且取得了较大的进展。 本文在课题组已有研究的基础上，以“氧化铝柱层析分离纯化磷脂的工艺优 化”为目标，考察了不同洗脱条件对磷脂在氧化铝柱上的洗脱特性的影响，并进 一步进行了氧化铝再生以及工艺连续上样的实验研究，建立并且优化了氧化铝 柱层析分离纯化卵磷脂( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，简称p c ) 和脑磷j 自( p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ，简称p e ) 的完整工艺。 系统考察了甲醇一氯仿：甲醇氯仿一三乙胺；甲酵一氨水；和甲醇一氯 仿一氨水洗脱体系对氧化铝分离纯化磷腊工艺的影响。得到最佳的洗脱液组成 为甲醇：氯仿：氨水- - - - - 8 0 ：1 2 0 ：1 0 ( v v ) 。在此条件下，p c 和p e 的回收率均 达到9 8 以上，理论产量分别为o 3 1 9 ，g 吸附剂和o 0 4 9 g 吸附剂。 对不同洗脱条件下氧化铝的再生以及工艺的连续上样进行了实验研究。结 果表明：在洗脱液为甲醇：氯仿= l ；4 ( v v ) 的条件下，p c 和p e 回收率分别 。达到9 9 8 和8 6 8 ，理论产量分别达到o 3 2 e g g 吸附剂和o 0 3 9 g 吸附剂，再 次上样量和三次上样量分别达到首次上样量的8 0 2 和7 9 7 ，并可同时得到 纯度大于9 5 的p c 产品和纯度大于8 0 的p e 产品。在有机溶剂和碱组成的 洗脱液体系中，再生和连续上样效果最佳的是甲醇：氯仿：氨水= 8 0 ：1 2 0 ：1 0 ( v v ) 的洗脱液。在此条件下，再次上样量为1 0 8 5 9 ，达到首次上样量的9 4 7 。 对磷脂在不同溶剂中的稳定性进行了研究。研究结果表明，磷脂在氨水或 者三乙胺存在的有机溶剂中是不稳定的。 本文的研究建立了氧化铝柱层析分离纯化高纯度磷脂的完整工艺，该工艺 具有分离效果好、工艺简单、投资少、处理量较大等优点。研究结果为高纯度 卵磷脂和脑磷腊的制备工艺工业化提供了重要的基础数据。 关键词：卵磷脂；脑磷脂；氧化铝；洗脱；再生；稳定性 i l l a b s t r a c t h i g h - p u r i t yp h o s p h o l i p i d sa l ew i d e l yu s e di nt h ef i e l d so ff o o d ，p h a r m a c y , c o s m e t i ca n ds oo nb e c a u s eo ft h es p e c i a ls u r f a c ea c t i v i t ya n de m u l s i f i c a t i o n a t p r e s e n tm o a to ft h i sp r o d u c t i o ni si m p o r t e di nc h i n aa n dt h er e q u i r e m e n te n h a n c e s e v e r yy e a r s oi ti sn e c e s s a r yt od e v e l o pt h ep r e p a r a t i o no f h i g h - p u f i t yp h u s p h o l i p i d s t h er e s e a r c hh a sb e e nd o i n ga n dg r e a tp t o e e s sh a sb e e nm a d ei no u t - l a b a i m i n ga tt h ep r o c e s so p t i m i z a t i o nf o rs i m u l t a n e o u sp u r i f i c a t i o no fp ca n dp e b ya l u m i n ac o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , t h ee f f e c to fd i f f e r e b te l u l s o np h a s eo nt h e e l u t i o nc h a r a c t e r i s t i c o f p c ( p h o s p h a t i d y l e h o l i n e ) a n d p e f p h o s p h a t i d y l e t h e n o l a m i n e ) o na l t m f i n i u mo x i d ee o l u n mw a qs t u d i e d t h er e g e n e r a t i o no f a l u m i a n o x i d ea n dt h ee o n t i u n o u sl o a d i n go f t h ep r o c e s sw e r ee x p e r i m e m a d t h ep r o c e s sw f l s d e v e l o p e da n do p t i m i z e da b s o i n t e l y t h ee l u t i n ne f f e c to fc h l o r o f o r m - m e t h a n o l ，m e t h a n o l - e b l o r o f o r m ：a i e t h y l a m i n e ， m e t h a n o b a m m o v 2 aa n dm e t h a n o b c h l o t o f o r m - a m m o n i ao nt h e p r o c e s s f o r s i m u l t a n e o u sp u r i f i c a t i o no fp ca n dp eb ya i n m i n ac o l u m nc h r o m a t o g r a p h yw a s s t u d i e d t h eo p t i m i z e dp r o p o r t i o no fe l u t i o np h a s ei sm e t h a n o l ：c h l o r o f o r m ： a m m o u i a = 8 0 ：1 2 0 ：1 0 ( v f v ) a n d r e a d e r t h i s c o l a d k i o n t h er e c o v e r i e s o f p c a n d p e 、日eb o t h b e y o n d 9 8 a n d t h e t h e o r e t i c a l o u t p u t o f p ca n d p e w e r e 0 3 t g ，gs o r b e n t m a do 0 4 魄s o r b e n t t h er e g e n e r a t i o na n dc o n t i n o u sl o a d i n gw c l e e x p e r i m e n t e da n du n d e rt h e c o n d i t i o no fe l u t l o np h a s e8 0 c h l o r o f o r m - m e t h a n o lt h er e c o v e r i e so fp ce n dp e w e r e9 9 8 a n d8 68 ；t h et h e o r e t i c a lo u t p u t sw e r e0 3 2g ，gs o r b e ma n do 0 3g ，g s o r b e n t , t h e8 e e o u da n dt h i r dl o a d i n ga n a o u n tw e r e m u c h t h e8 0 2 a n d7 9 7 o ft h ef i r e tl o a d i n ga m o u n t p ca n dp e 、聃t l lp u r i f i e so v e r9 5 a n ds 0 c o u l db e o b t a i n e d u n d e rt h ee l u t i o nc o n d i t i o no f m e t h a n o l ：c h l o r o f o r m ：a m m o n i a = 8 0 ：1 2 0 ： i 、， 1 0 ( v ，v ) ，t h es e c o n dl o a d i n ga m o u n tw a s1 0 8 5 9w h i c hw a s9 4 7 o f t h ef i s tl o a d i n g a 士n o u n t b a s e do nt h ef o r m e rr e s e a r c h ，t h ee f f e c to ft h ed i f f e r e n te l u t i o np h a s e so n l e c i t i o ns t a b i l i t yw s t u d i e d ，e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tp ca n dp ew e r e u n s t a b l ei nt h es o l v e n tw i t l la m m o n i ao rt r i e t h y l a m i n e t h er e s u rw a sv a l u a b l ef o r t h ef o l l o w i n gw o r ka n di n d u s t r i a lp r a c t i c e t h ep r o c e s sf o rs i m u l t a n e o u sp u r i f i c a t i o no fp ca n dp eb ya l u m i n ac o l u m n c h r o m a t o g r a p h yw a sd e v e l o p e da n do p t i m i z e dw h i c hh a ss a t i s f i e de f f e c t , s i m p l e t e c h n i q u e s ，l e s si n v e s t m e n ta n dl a r g ea l l l o u t l tl o a d i n g t h ew o r kw i l lp r o v i d e i m p o r t a n tb a s i cd a mf o r i n d u s t r i a lp r e p a r a t i o no fh i g h - p u r i t yp h o s p h o l i p i d sw i t h a l u m i n ac o l u m nc h r o m a t o g r a p h y k e yw o r d s ：p h o s p h a t i d y lc h o l i n e ；p h o s p h a t i d y le t h a n o l a m i n e ；a l u m i n i u mo x i d e ； e l u t i o n ；r e g e n e r a t i o n ；s t a b i l i t y v 1 j l 日u 舌 磷脂普遍存在于动植物细胞的原生质和生物膜中，对生物膜的生理活性和机 体的正常代谢有重要的调节功能，同时它具有良好的乳化性和抗氧化性，因而被 广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。卵磷脂和脑磷脂是其中两种重要的磷脂， 化学名称分别为磷脂酰胆碱( p h o s p h o f i d y l c h o l i n c 简称p c ) 和磷脂酰乙醇胺 ( p h o s p h a t i d y le t h a n o l a m i n e ，简称p e ) 。高纯度磷脂产品具有无异味、乳化性能 强等特点，应用更为广阏，国内外需求量在逐年增加。目前纯度太于9 5 的磷脂 产品我国尚依赖进口，2 0 0 2 年卵磷脂及其它磷氨基类脂进口在化学原料药进口 额排比中名列第1 9 位，达到1 2 5 1 2 2 万美元。2 0 0 3 年则上升至1 7 位，高纯度蛋 黄卵磷脂的生产将替代进口产品，节约大量外汇。 目前我国鸡蛋主要为食用加工率低又不便于运输，造成大规模禽蛋饲养地 如东三省的鸡蛋供过于求，价格偏低，加上近年来饲料价格上涨，使一些企业出 现亏损。每个鸡蛋中大约含有6 9 磷脂且只存在于卵黄中，总卵黄干物质中至少 6 6 的脂肪，因此卵黄被认为是极具潜力的重要磷脂来源。同时卵黄卵磷脂具有 高收集率、稳定性好，具有大豆卵磷脂所不具各的一些优点。因此开发出适合我 国国情的高纯度蛋黄磷脂制各方法具有重要的意义。 国内外对磷脂精制方法的研究较多，其中柱层析法由于具有分离效果好、工 艺简单、投资少、处理量较大等优点，因而成为磷脂精制的重要方法。本文对氧 化铝柱层析同时分离纯化p c 和p e 工艺过程进行了系统的研究，包括洗脱工艺 条件优化、吸附剂再生和工艺连续上样等，国内外未见类似的报道。本文的工作 建立并优化了氧化铝柱层析法同时分离纯化卵磷脂和脑磷脂的工艺为该工艺工 业化提供了重要的基础数据。 第一章文献综述 1 8 1 1 年，v a u g u e l i n 用乙醇从脑组织萃取物中第一次观察到磷与脂肪酸结合 物，1 8 4 6 年g o b l e y 从蛋黄中也分离出磷脂，由于从卵黄中得来。所以把它称之为 卵磷脂( k i t l i i n ) 。后经大量研究，发现磷腊并不是一种单纯物质，而是一种混合 物，t h u d i c h u m 证明磷脂化学结构，分离并分析出磷脂中磷与氮比例，从而鉴定 磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e - p c ，当时称l e c i t h i n ) ，磷脂酰胆胺( p h o s p h a t i d y l 。 e t h a n o l a m i n e p e ，当时称c e p h a l i n ) 和神经鞘磷脂( s 砷i n g o n l y c l 妫f i 3 1 。至今，人 们已发现磷脂几乎存在于所有机体细胞中，在动植物体重要组织中都含有较多磷 脂。 磷脂研究3 0 年代始于德国，6 0 年代以来在发达国家已实现工业化生产，2 0 世 纪7 0 年代以来美国把卵磷脂用于保健食品，其总销量仅次于复合维生素和维生素 e 。f a o w h o1 9 8 5 年对卵磷脂a d i ( 每曰摄取量) 不作限制规定。同时卵磷脂还 是一种天然乳化荆，广泛应用于食品、化妆品、医药、纺织、皮革等工业。 目前成立的国际卵磷月目研究集团每年都举行一次国际性聚会互通科研、生 产应用及销售方面的信息。从近几年看，国外许多公司都致力于高附加值磷脂产 品的开发及其应用技术的研究。从磷脂市场的结构来看，目前已逐渐由传统的低 级粗制品向高级精制品或酶改性精制品以及复合制品转变f 4 t 。 1 1 卵磷脂简介 1 1 - 1 卵磷脂的结构与组成 磷j 僭( 1 e c i t h i n ) 是一种从植物或动物中通过物理加工方法提取出来的磷脂混 合物，一般用卵磷脂来统称这种混合物。其主要成分是卵磷脂( 磷脂酰胆碱，p c ) 、 脑磷脂( 磷脂酰乙醇胺，p e ) 、肌醇磷脂( 磷脂酰肌醇，p i ) 、磷脂酸( p a ) 及 丝氨酸磷脂( 磷脂酰丝氨酸，p s h 狭义的卵磷脂就是磷脂酰胆碱p c ，是由甘油、 胆碱、磷酸、饱和及不饱和脂肪酸组成的一种含磷脂类物质【6 j 。其各组成成分的 结构式如下： 2 盹x ：1 c b r 戈c h ，) 】 p bx = _ 3 妊h # 巍 c 棚r l 0 1 1 1o i h 呦毫j 一。 例r 俨严卜x ” o i 跨x ；c h r ，口一孙3 e 删 结构式中r i 和r 2 代表脂肪酸的羟基，其中一个( r 1 ) 是饱和的，另一个是 不饱和的( r 2 ) 。常见的有硬腊酸，软脂酸，油酸，亚油酸，娅麻酸及花生四烯 酸等”j 。本文主要研究的是卵磷脂p c 和脑磷脂p e 。 1 卵磷脂 卵磷脂分子结构的特点是一个脂酰基被磷酸胆碱基所取代，而磷酸胆碱所连 接的碳位置不同又产生n 、b 两种异构体，磷酸胆碱基连接在甘油基的3 碳位上 称为* 型，连接在2 碳位上则为8 - 型。自然界存在的卵磷脂为l 一一卵磷脂， 郎r 2 - c o 基处在甘油碳链的左边为l 一型。卵磷脂分子中不同碳位上所连接的脂 肪酸也不同，a 位上连接的几乎都是饱和脂肪酸，而d 位上连接的通常为亚油酸、 亚麻酸和花生四烯酸等不饱和脂肪酸。 2 脑磷脂 脑磷腊其分子结构和卵磷脂相似，只是以氨基乙醇代替了胆碱，具有、8 两种异构体。脑磷脂水解后可得到甘油、脂肪酸、磷酸和乙醇胺。脑磷脂以动物 脑组织中含量最多，约占脑干物质总量的4 - - 6 。 1 1 2 卵磷脂的来源 至今，人们已发现磷脂几乎存在于所有机体细胞中。在动植物体重要组织中 都含有较多磷脂。动物磷脂主要来源于蛋黄、牛奶、动物体脑组织、肝脏、肾脏 及肌肉组织部分。植物磷脂主要存在于油料种子，且大部分存在于胶体相内，并 与蛋白质、糖类、脂肪酸、醇、维生素等物质毗结合状态存在，是一类重要的油 脂伴随物1 6 1 。 表i1 常见的动植物组织中含有的磷脂( 干重) 不同来源磷脂其组成是不同的，如大豆磷脂与鸡蛋磷脂虽都是磷脂，但其磷 脂组成及其脂肪酸组成都具有较大差别。见表1 2 ，表1 3 及表1 4 表1 2 大豆磷脂与蛋黄磷脂的组成差别川 表l ，3 大豆磷脂脂肪酸组成1 8 用 4 表1 4 鸡蛋卵黄磷脂肪酸组成r - 州 由表可见，蛋黄磷脂含有较多p c ，一般在7 0 左右，而大豆磷脂p c 含量 较低，一般在2 3 5 之间。此外组成大豆磷脂的腊肪酸主要为亚油酸，而鸡 蛋磷脂含较多棕榈酸，所含饱和酸也比大豆磷脂高。 虽然蛋黄中卵磷脂的含量比大豆高，但要在工业上成功地从蛋黄中提取高纯 度的卵磷脂，仍是具有较大难度的。其纯化过程复杂，产量少而且价格昂贯，因 此多为医药用途。蛋黄卵磷脂较其他动物性来源的卵磷脂具有含量高、萃取容易、 容易取得及价格优势，其产量较高，因此市售动物性来源的卵磷脂多为蛋黄卵磷 脂。 大豆既是油脂的重要来源，也是蛋白质的重要来源，占其营养成分的6 0 以上，其它有碳水化合物，维生囊和无机物等。与蛋黄卵磷脂相比，大豆卵磷脂 具有不含胆固醇的独特性能，以不饱和脂肪酸为主，如油酸，亚油酸，亚麻酸等， 约占脂肪酸含量的6 0 左右，因此易于氧化，也易于阻止胆固醇在血管中的沉积。 所以现在，市售的卵磷脂产品多数是以大豆为原料的。 近年来研究表明，酸枣仁，桑寄生，林芝，麦芽，决明子，蛤蚧，黄精，枸 杞，徐长卿，何首乌白花蛇等具有降胆固醇，血糖和血压作用的中药中均含有 丰富的卵磷脂成分。 1 1 3 卵磷脂的理化性质 磷脂易溶于很多有机溶钠，如氧仿，乙醚、石油醚、苯、乙醇等，但不溶于 丙酮和乙酸甲醋。纯净脑磷脂难溶于乙醇，而粗制脑磷脂能部分溶于乙醇。磷脂 牧有清晰熔点，随着温度升高，其软化成液滴，2 0 0 以上才具有清晰液面，但 此时已分解。磷脂能溶于动植物油脂，矿物油及脂肪酸中，不溶于冷的动植物油 脂。磷腊加入脂肪酸，可使塑性磷脂软化或液化，成为流态状磷脂。不同磷脂其 性质也有差别嘲： ( 1 ) 磷脂酰胆碱：白色蜡状固体，低温下可结晶，易吸水变成棕黑包胶状物， 不溶于丙酮，溶于乙醚及乙醇，在水中成胶状液，熔点1 6 0 c 。 ( 2 ) 磷脂酰乙醇胺和磷脂_ 酰丝氨酸：不溶于丙酮及乙醇，溶于乙醚。 ( 3 ) 缩醛磷脂：溶于热乙醇，k o h 溶液，不溶于水，微溶于丙酮和石油醚。 ( 4 ) 鞘氨醇磷脂：白色晶体，对光和空气稳定，不溶于丙酮，乙醚，溶于热乙 醇，与c d c l 成加合物，在水中形成乳状液，有两性解离性质。 ( 5 ) 糖脂：也可称含糖磷脂( 也有不含磷糖脂) 包括脑苷脂( 脑糖脂) ：白色粉状 物，呈蜡状，不溶于水，乙醚、石油醚：溶于热乙醇、热丙酮、砒啶及苯，稳定， 不被碱皂化，有旋光性。神经节营脂( 神经节糖腊) ：不溶于乙醚，丙酮，微溶于 乙醇，易溶于氯仿和乙醇混合液，可水解。磷脂还有个重要性质，即两亲性。在 磷脂分子中含有磷酸、胆碱等亲水部分，又含有脂肪酸链疏水部分，为表面活性 物质，具有一系列界面和胶体性质如界面吸附、形成胶团、脂质体和乳化作用 等。磷脂分子中含有不饱和脂肪酸，受阳光照射或在空气中极不稳定，易氧化酸 败而色泽变深。 磷脂为带电分子，因此它对离子环境具有敏感性，盐浓度超过2 ，啦低 于4 时磷脂的功能性明显降低。磷脂的电解常数及其偶极距的大小已有测定，磷 脂的极性高于甘油酶，而不局磷黯组分的偶极距在1 0 - - 2 5 x 1 0 2 3 k g m 之间。同时 磷脂分子的末端特征结构也对磷脂的性质，如溶解度、水解特性产生影响。 由磷脂的结构可见，磷脂分子具有亲水和疏水双重性，疏水部分是脂肪酸的 烃基，而亲水部分是磷酸、胆碱。其等电点为p h = # i 。由于这种两性表面活性 剂特征，磷脂被广泛用作乳化剂、稀释剂等。磷脂的h l b 值通常为9 1 0 。磷脂 中各组分含量的多少对其乳化性能有一定影响，例如p c 含量高，有利于形成 o a r 型乳化体系，而p i 含量离有利于形成w o 型乳化体系。 磷脂与酸、碱、酶作用可发生水解，得到各自不同的水解产物。如卵磷脂水 解得到脂肪酸磷脂甘油和胆碱，磷脂甘油在生物体内通过磷酸脂酶水解，释放出 胆碱，产生磷脂酸。 由于卵磷脂在体内不能合成，只能从食物中摄取。放在日常膳食中应多食 些含卵磷脂车富的食品以补充机体所需。但事实上，大量地食用含丰富卵磷脂的 6 食品也未必有用。因为，卵磷脂只有在5 2 5 c 下最有效、若温度超过5 0 1 2 后， 卵磷脂活性就会大部分丧失，营养作用也就谈不上了。 1 1 4 卵磷脂的生理功能 卵磷脂不仅是人体所有的细胞膜、核膜、肉质网膜、线粒体膜等生物膜的基 础构成物质，主要集中在大脑、神经系统、免疫系统及心、肝、肾、生殖腺等重 要器官内，丽且是胆碱和必需脂肪酸的一个来源，它对维持生物膜的生理活性和 机体的正常代谢起关键作用。就整个入体来说，卵磷脂的含量几乎占人体总重量 的l ，尤其是在大脑中，卵磷脂的含量高达3 0 。 卵磷脂是保持细胞活力与荐生机能的基本动力，它对人体细胞的生存、活化、 脏器功能的维持，肌肉与关节的活动及脂肪的转化和代谢都起着其它物质不可替 代的作用【5 l 。下面主要从以下几方面论述卵磷嚣的保健功能。 1 卵磷脂的健脑作用 卵磷脂经人体代谢的产物一胆碱，是神经传递的重要物质，乙酰胆碱对改善 记忆力，提高反应能力都有直接作用。 2 保护肝脏，防止出现脂肪肝和肝硬化 磷脂是合成脂蛋白代谢脂肪的生物活性物质。磷脂中胆碱对脂肪代谢有重要 的作用。磷脂酰胆碱以合成脂蛋白形式运输到肝外，被其它组织利用储存。所以， 适当补充磷脂可以阻止脂肪肝，促进肝细胞再生，防止肝硬化，恢复肝功能。 3 降血脂作用和心血管疾病的治疗 磷脂为天然降血脂药，具有显著的抗氧化，降血腊作用。磷脂具有良好的乳 化特性，能促进胆固醇和蛋白质分子结合成复合体而存在于血液中，从而阻止胆 固醇在血管内壁的沉积并清除部分沉积物，同时改善脂肪的吸收和利用，可降低 血液粘度，改善血液供氧循环，延长细胞生存时间并增强造血功能。 4 抗衰老和抗疲劳作用 对中老年人来讲，随着年龄的增大，生物膜将出现老化特征，磷脂相对减少， 服用磷脂可以重新修饰生物膜，溶解和清除老化的过氧化脂质，因而可以活化脑 细胞，调节内分泌，延缓衰老。 5 美容。健美作用 磷脂能促进汗腺分泌，促进皮肤组织生长和皮肤细胞再生，可改善皮肤营养， 减少老年斑，消除青春痘和皮肤色素沉着。其乳化和降低表面张力的能力使皮肤 细嫩，是天然化妆品。 6 对神经系统的作用 磷脂类化合物是生物膜神经组织的重要组分，具有增强神经组织的作用，并 能调节高级神经活动，是青少年在青春发育中特别重要的物质。 1 1 5 卵磷脂的应用 磷脂作为乳化剂，具有脱模、分散、润湿、消泡、稀释等作用，已在食品、 医药、化妆品、农业等行业得到广泛的应用( i l 】，如在食品行业中用于烘烤食品、 奶制品、糖果着色剂等方面；在医药行业中，目前主耍用作静脉注射乳化荆和脂 质体，占医药需求量的8 0 。在临床上更为重要的用途是：可用于治疗动脉粥样 硬化、脂肪肝、神经衰弱、营养不良及静脉注射脂肪乳的乳化剂、胆固醇结石的 防治药物及作为肺表面活性剂治疗新生儿呼吸窘迫综合症。 1 卵磷脂在医药工业中的应用 直接应用于医药，高纯度卵磷腊比普通磷脂乳化性能更好，作用的p h 值更 宽，可辅助治疗降低胆圆醇及神经紊乱，以及作为脂肪注射液中的乳化剂。卵磷 脂可配合其他材料用于制作脂质体：具有某些碳链的卵磷腊还有抗癌活性。如十 六烷基磷脂酰胆碱。磷脂酸核苷酸可作为抗癌药，磷脂酰唾液能延长药物的半衰 期。某些溶血卵磷脂也具有抗肿瘤功能。而某些9 日磷脂还有抗病毒活性或增加抗 病毒药物的效力，如2 - 氧- 十六烷基- 甘油磷脂酰胆碱就有抗病毒的效力 磷脂脂质体适宜体内降解，无毒性，无免疫源性。实验数据证明。磷脂脂质 体作为药物载体可提高药物治疗指数，降低药物毒性，减少药物副作用，减少药 物剂量并对人体酶系统的作用亦有功效。所以磷脂脂质体在生物技术、生物医 学、免疫调节、遗传工程等领域的应用前景广阔。 2 卵磷脂在保健和食品工业中的应用 卵磷脂的诸多保健功能使其成为一种倍受人们注目的新型保健食品，美国 f d a 将卵磷脂列为公认安全物质，联合国粮食组织( f r o ) 和世界卫生组织m 啊0 ) 专家委员会报告中规定对卵磷脂的摄取量不作限制要求。 作为乳化剂，卵磷脂以多种形式存在于食品乳化滚中，通常与其他乳化剂， 稳定剂相结合而起到乳化作用。另外卵磷脂的抗油脂氧化作用目前已在油脂生产 中得以应用，实验表明，卵磷脂在油中含量 o 2 ，可以明显提高菜籽油，葵花籽 油鱼油等抗氧化作用。卵磷脂也可作为食用香料的微胶囊壁材，风味物质可以 与脂质体柔和而稳定地形成微胶囊。 3 卵磷脂在纺织工业中的应用 卵磷脂可用作纺织油乳化液中的乳化剂，铺展剂和渗透剂也用于洗涤脱胶 丝光处理染色漂白和整理等工序。在用料配方中，还可用作印染中颜料和沉淀 色料的分散剂。 4 其他工业中的应用 卵磷脂还广泛应用于鱼类饲料，水果花卉的保鲜剂，农作物的杀菌剂，蚊 子的防除剂，油墨乳化剂，石油产品等其它工业。 1 1 6 国内外的开发现状 据统计，美i 虱化学文摘( c a ) 所列有关磷脂的专题文献；1 9 7 2 1 9 7 6 年闻 为9 0 0 多篇；1 9 7 7 1 9 8 1 年期间增至8 0 0 0 多篇，其中生物学研究占7 0 5 ，分 析方法占3 5 制取研究占1 2 ，特性研究占1 6 5 ，反应研究占2 4 ，应用 研究占4 7 ，伴随物研究占1 o ；1 9 8 2 - - 1 9 8 6 年期间为1 9 0 0 多篇。可见7 0 年 代束至8 0 年代初是世界上对磷脂研究最为活跃的时期。 磷脂在国外倍受人们喜爱。在日本。每年对磷脂产品的需求量在7 0 0 0 8 0 0 0 吨左右，其中8 0 用于食品工业。日本目前已经开发出3 0 多个磷脂品种，生产 公司主要有赤田善、旭化成、味之素、小川香料、川内化成、光洋商会等；美国 食品工业磷脂的消费量估计在2 0 0 0 0 吨左右，目前其生产和消费基本保持平衡。 主要生产厂家有a r c h e rd a n i e t sm i d l a n d ( a d m ) 公司，a m e r i c a nl e c i t h i n 公司 等；在欧洲最先把卵磷脂做商业化应用的是英国的l u c a s m a y e r 公司。其它从事 卵磷脂生产的厂家有荷兰的c e n t r a ls o y ao v e r s e a 公司，德国的n a t t c r m a n p h o s p h o l i p i dg m b h 公司等f 1 2 ，。 国际市场上精制卵磷脂年需求量为5 0 0 0 吨左右，而实际生产供应量为2 0 0 0 吨左右，供需缺口较大。我国有丰富的磷脂资源，浓缩磷脂的潜在产量达2 5 万 吨，按粉末磷脂计算的产量达8 ，0 5 万吨。仅大豆磷脂的潜在产量即分别为浓缩 磷脂4 6 6 万吨和粉末磷脂2 g 万吨。目前，国内大豆磷脂的生产主要有上海、天 津、黑龙江和山东等数个厂家，产品规格有浓缩磷脂、粉末磷脂、卵磷脂、精制 磷脂( 注射用) 、改性磷脂等。 但是，我国磷脂的生产及研究仍未能得到有力发展与国外相比，存在产品 含量低、生产规模小、资源利用率低、功能性欠佳、产品质量检测手段落后等问 题。因此，磷脂的精制与分离、分析检测及改性等都是研究的热点。开发出适合 我国国情的高含量卵磷脂制备方法，具有重要的经济和社会价值。 1 2 卵磷脂的分析方法综述 2 0 世纪9 0 年代以前，国外分析测定p c 含量方法中。t ic 法是一种较为普 通和准确的的分析手段。但随着h p l c 的普及，最近1 0 年中n c 法在国外已经 极少使用，取而代之的是更少受人为因素影响的i - i p l c 检颢方法。但i - t p l c 设备 价格昂贵，对于国内许多科研机构企业来说，普及尚有很大困难，所以较为廉价 的t l c 仍有一定价值。除了常用的t l c 和h p l c 分析磷脂外，研究者们还尝 试引入其它技术来分析，如核磁共振技术( n m r ) ，质谱( m r ) ，傅立叶转变红 外光谱( f t i r ) 及超临界流体色谱技术等。这里简要介绍一下t l c 和h p l c 法。 1 2 1 1 1 l c 法 t l c 法由于简便易于操作，应用极为广泛。磷脂各组分( p c 、p e 等) 由于 极性、溶解度等的差异，在硅胶板上被硅胶吸附。在一定极性的展开剂作用下， 磷脂各组分因其吸附能力的差异，在板上移动了不同的距离，根据其位移值可确 定磷脂各组分。该法在h p l c 法出现之前在磷脂分析检测技术中占据着很重要的 地位，它具有方便、快速、直观、灵敏以及分离效果好等优点，至今，仍被广泛 使用。 展开剂有碱性体系氯仿无水乙醇三乙胺水【i s 和氯仿甲醇水或醋酸盐缓冲 液或氨水1 6 j 两大类，分离获得的纯品用h p l c 、化学和红外分析确定含量。显色 剂除常用的碘蒸气外还有茚三酮、苯甲醛f 1 7 等。各种磷脂的定量可采用薄层定量 扫描仪计算积分值，也有用标准曲线法定量的，如a o c s o f f i e i a l m e t h o dj a 7 8 6 法1 1 9 1 。 用t i , c 法定性迅速，简便；定量需用薄层定量扫描仪计算积分值，但是其 干扰因素多，必须严格控制实验条件，重复性差。 1 2 2h p l c 法 h p l c l 3 0 - 2 1 法能使菲挥发性的、热敏感的磷脂在常温得到分离。它的封闭系 统减少了磷脂在分析过程中被氧化的可能性，确保能实现p c 的快速、灵敏、准 确的定量分析，因此是一种经常采用的大豆磷脂分析方法。高效液相色潜法分离 分析磷脂。目前普遍采用等度洗脱体系，要得到各种不同的卵磷脂成分，需采用 梯度洗脱程序。 紫外可见光检测器( u v ) 是常用的高效渡相色谱检测器。分析卵磷脂时， 检测波长一般定在2 0 5 r i m 左右，由于波长较低，限制了一些溶剂的使用。此方 法中，在p c 有最大紫外吸收的波长2 0 5 r i m 下，得到的结果很容易受到脂肪酸组 成及波长的微小变化的影响，使得到的p c 含量偏大。另外，磷脂的紫外吸收较 弱，而且紫外检测器不能用于梯度洗脱程序，此时可用示差折光检测器或蒸发光 散射检测器来代替。 h p l c - r i 法分析卵磷脂，则不会受到p c 中脂肪酸组成、纯度及卵磷脂种类 和来源的影响，适用于一切p c 样品。但r i 检测器易受到温度变化的影响，基 线稳定性较差，容易漂移，所以必须保证温度的恒定不变。 用h p l c 方法进行分析时。常用的固定相有：正相柱( 如l i c h r o s o r bs i6 0 ) ； 反相柱( 如p - ec 1 8 柱) 等。流动相一般有乙腈一甲醇体系( 乙腈一甲醇一水，乙 腈一甲醇一冰乙酸或乙腈一甲醇一磷酸等) 和正己烷一异丙醇体系( 正己烷一异 丙醇一醋酸或正己烷一异丙醇一磷酸等) 。以乙睛一甲醇为流动相时，p c 、p e 的保留时间十分接近，两种组分无法分离；以正己烷一异丙酵一醋酸盐缓冲液作 为流动楣时，配制的流动相易出现结晶，不宣使用；以乙睛一8 5 磷酸一甲酵 ( 1 0 0 ：0 8 ：1 0 ) 的混合溶液作为流动相时，对混合标准溶液进样分析，p e 、p c 分离良好 上海中医院大学的壬智华等人采用反相离子对高效液相色谱( r p 口h p l c ) 法分离分析了不同种类的磷脂酰胆碱( p c ) ，色谱柱为p e r k i n - e l m e r i - i s 一5c 1 8 柱，流动相为甲醇乙腈水( 7 0 ：2 2 ：8 ，体积比) ( 内含1 5 m m o l l 四甲基磷酸 铵离子对试剂，p h7 ) ，流速2m l m i n ，在2 0 8m 波长处检测，该法成功地分 离了7 种p c 口o 】。 改进的h i r o s h i m ae ta l 方法将样品溶于氯仿一甲酵( 2 ：l ，v v ) ，然后注入 s h i m a z u1 0 a 色谱系统( 东京，日本) 的l i c h r o s p h e r c 硅胶柱( 1 5 0 m r n x 4 6 m m ， m e r c k ，g e n n n y ) 中，流动相为正己烷一异丙醇和正己烷一异丙酵一水，进样 1 0 m i n 后正己烷一异丙醇一水的比例由原来的6 0 到1 0 0 ，用e l s d 检测器进 行检测”。 日本的t o s h i h i k o 等人以l i c h r o s o r bs i6 0 为固定相，以正已烷一异丙醇一水 ( 1 ：4 ：1 ，v v ) 为流动相，定性分析含磷脂酰胆碱的样品，收到较满意的效果。 1 3 卵磷脂的提取精制方法综述 我国卵磷脂资源丰富，但加工技术落后，只能生产粗制品，降低了卵磷脂的 使用率和价值，造成了资源的极大浪费。近年来制各高纯卵磷脂的方法主要有五 种：溶剂萃取法、柱层析法、超临界流体萃取法、酶催化精制法及膜分离法等。 1 3 1 溶剂萃取法 镕女u 萃取法凹川一种工业上常用的制各高纯卵磷脂的方法，它具有生产能力 大，周期短，便于连续操作，容易实现自动化等优点，其原理是利用各磷脂组分 在某些溶荆中的溶解度不同，将卵磷脂与其它组分进行分离。如p c 可溶于乙醚、 氯仿、正己烷等低极性溶剂及低级醇中，微溶于苯，几乎不溶于丙酮、乙酸乙酯； 而p e 不易溶于乙醇。一般的方法是将溶解和沉淀两种手段结合使用，即用合适 的溶剂将p c 抽提出，再加沉淀齐j ( 如丙酮) 将p c 从杂质中沉淀分离出来。所 用的溶剂一般为c 1 - 4 的低级醇、正己烷、石油醚、乙醚、乙酸、乙酯、氯仿等， 在进行萃取时，必须控制好温度、溶剂用量、溶剂浓度、p h 值、萃取次数等条 件和因素。有机溶剂从提取方式上分为单一溶剂提取法合混和溶剂( 如氯仿一甲 醇、氯仿一乙醇等) 提取法。 单纯用溶剂萃取制各高纯卵磷脂时所得产品p c 含量不高，可用于卵磷脂的 粗提。如果在萃取过程中加入酸、碱或盐类物质，利用金属离子或酸、碱对磷脂 分子的选择性，可以使p c 含量大大提高。 1 3 2 柱层析法 上世纪6 0 年代以来，人们对柱层析法制备高纯度卵磷脂进行了广泛的研究， 这也是一种较常用的分离纯化高纯磷脂产品的方法。一般是采用吸附柱层析和离 子交换柱层析法。为了达到最佳分离效果，必须对柱层析条件如：柱的几何形状、 填充方法、填充物颗粒大小、温度、样品用盈、流速、洗脱液的组成等因素加以 选择和控制。选用的吸附剂一般为硅胶、氧化铝、二氧化硅等，洗脱液常选用氯 仿、低级醇等几种溶剂的混和物，也可采用梯度洗脱， 1 硅胶柱层析 硅胶柱能很好地分离纯化极性磷脂，分离效果主要取决于洗脱剂的选择，通 常选用氯仿、低级醇等几种溶剂的混合液。日本专利报道9 ”，将大豆粗磷脂溶于 氯仿，通过硅胶柱用甲醇一乙酸3 ：l ( v v ) 进行洗脱，可制得p c 含量高于9 8 的产品。 一 l e a 【2 ”等人于1 9 5 5 年开始尝试用硅胶柱梯度洗脱分离磷脂混合物，分离效果 良好，但特别耗时。另一些研究者用氯仿- 甲醇梯度洗脱或用含水乙醇作为洗脱 剂，得到了高纯度p c 产品。 2 氧化铝柱层析 氧化铝是另外一种较常用的吸附剂。s i n g l e t o n e s o l 氯仿一甲醇9 ：l ( v v ) d 洗脱剂，用氧化铝柱分离租磷脂，得到较高纯度的p c 产品。n i e l s e n i 等人先将 蛋黄磷脂与c d c l 2 形成络合物，以氧化铝为固定相，二氯甲烷9 2 5 m l 加甲醇7 0 m ! 加2 5 液态氨5 m l 为流动相，从五个蛋黄里提纯2 8 克产品，纯度可达化学纯标 准。 3 离子交换柱层析 离子交换树脂为另外一种常用的层析分离方法。由于溶质分子带有不同性质 豹电荷和不同电荷量，因而在固定相和流动相之间发生可逆交换作用使溶质移 动速度发生变化，从而达到分离目的。 b a n d i 、d o i 等人的研究结果表明，单纯的离子交换方法很难得到高纯度 的卵磷脂。, i u l a e j a 等人口1 l 介绍了一种大规模制各高纯度卵磷脂的方法：粗提磷脂 先用硅胶柱层析，得到二个主要部分。其中一部分为p c 大于9 8 豹卵磷脂，另 一部分含p c 、s m 、l p c ，这部分继续过离子交换纤维素柱，得到p c 含量大于 9 5 的卵磷脂产品。 1 3 3 超临界流体萃取法 超临界流体萃取是近年兴起的一种新型分离技术。它用超临界流体取代常 用的液体溶媒t 乖j 用超临界流体对不同的物质具有不同的溶解能力达到分离目 的。 s f e - c 0 2 法萃取磷腊是在c 0 2 环境中、接近常温条件下进行的。无氧及比较 温和的条件，对不稳定物质的萃取而言是十分理想的环境。磷脂分子中含大量不 饱和脂肪酸。它们与磷脂的生物学功能有密切关系。在有氧及高温条件下不饱和 脂肪酸易氧化，从而损伤磷脂生物学功能。采用s f e c 0 2 技术，可减少磷脂在 萃取过程中的氧化破坏，进而保证磷脂的质量。 化学法萃取磷脂使用了大量有机溶剂，尽管千方百计加以去除，磷脂中仍残 留有机溶剂。这样使临床应用和食用受到限制。而$ f e - c 0 2 技术，用c 0 2 为介 质，萃取物与介质极易分离，通过改变压力就可达到分离目的。萃取中使用的医 用乙醇经减压蒸馏，冷冻干燥便可去除。本法萃取的磷脂中，未检出残留乙醇。 因此，经s f e - - c 0 2 技术萃取的磷脂是一种十分安全的产品。 化学法使用的大量有机溶剂，有的易燃、易爆；而超临界法采用c 0 2 为萃 取剂，无引燃性和化学反应性。无毒、无害、无污染、无致癌性、沸点低、便于 清除、不会残留在产品中，对环境及实验人员都十分安全。 溶剂法去除大豆磷脂中油脂，磷脂酰胆碱会有一定程度的流失，造成卵磷脂 收率较低，且处理时间较长。但用单一超临界流体( 如c 0 2 ) 萃取粗磷脂只有 去油脂的作用，所得卵磷脂含量不是很高，可选用乙烷、丙烷等低级碳氢化合物 作萃取剂或在c 晚中加夹带剂( 如低级醇、丙酮、水，低级烷烃等) 以提高对 磷脂的分离效果。制备更高纯度的卵磷脂则需要与其它技术( 如溶剂萃取技术) 有机结合。 超i 临界流体萃取时，要通过实验对实验温度、压力及萃取时间等因素进行选 择和确定。印度的b e g a n 等人将粗大豆磷脂在3 2 m p a 、4 0 下用超临界c 0 2 进 行萃取，除去其中的油脂；然后将富集磷脂的部分在5 5 下用9 5 的乙醇处理 3 0 m i n ，得到含p c 为7 0 多的产物。 1 3 4 酶催化精制提取法 粗磷脂中的磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺和磷脂酸等磷脂，可采用磷脂酶将其 1 4 转化为磷脂酰胆碱，这样可大大提高磷脂酰胆碱含量，提高其有效成分纯度，或 将其转化成其他可利用的磷腊。 l c k h f 3 卸等人采用酶法来提高磷脂中磷脂酰胆碱的含量，所采用的酶为来源 于卷心莱中的磷雅酶，其研究结果将含磷脂酰胆碱为8 0 的大豆磷脂和含磷脂 酰胆碱为7 5 的蛋黄磷脂的磷脂酰胆碱含量分别提高为9 5 和1 0 0 。 1 3 5 膜分离法 膜分离过程的实质是物质通过膜的传递不同得到分离。其方法是：选择具有 定孔径的半透膜，将粗磷脂用溶剂溶解，该溶液加压通过半透膜。由于备磷脂 组分的分子量不同，它们通过半透膜的难易程度不同，可将卵磷脂