（食品科学专业论文）番茄Gr基因的表达及作用机制研究.pdf

摘要 植物激素乙烯影响植物的生长和发育而对于呼吸跃变型果实，乙烯对于果实的成熟、衰老 作用十分重要，被称为成熟激素。植物的乙烯反应是通过乙烯信号转导途径来实现的。本论文以 番茄成熟突变体g r e e n - r i p e ( g r ) 为研究材料，探讨伢基因的功能和作用模式，进一步完善番 茄的乙烯信号转导理论本论文主要做了以下工作： ( 1 ) 伢基因的克隆及原核表达：通过r t - p c r 方法从绿熟期番茄果实中克隆臼基因，p c r 产 物被亚克隆到原核表达载体p e t - 3 0 a 上，在大肠杆菌b l 2 1 中筛选到含有目的基因的重组质粒， 并采用o i m m l 的i p t g 诱导3 小时表达外源蛋白。 ( 2 ) g r 蛋白纯化及多克隆抗体的制各：应用n i - n t a 亲和层纯化回收g r 蛋白，当洗脱液中 咪唑浓度达到4 0 m m l 时，能够很好的洗脱外源蛋白，表达蛋白纯度可以达到9 6 。采用纯化的 蛋白免疫兔子制备抗g r 蛋白的多克隆抗体，经检测多克隆抗体的效价大于1 0 0 0 0 ，经过d e a e - 5 2 离子交换柱纯化抗体，可以得到纯度较高的抗体。w e s t e r nb l o t t i n g 检测表明，抗6 r 蛋白的多 克隆抗体具有免疫特异性。 ( 3 ) 伢基因表达模式的研究及细胞定位研究：研究伢基因在番茄各组织器官中的表达模式， 并研究外源乙烯处理对伢基因表达的影响。在r n a 水平上，采用r t - p c r 的方法，证明伢基因 的表达具有组织特异性，在种子、花及绿熟期番茄果实中表达量明显高于其他部分。而外源乙烯 能够明显引起花和绿熟期番茄果实中臼基因的表达，说明这种乙烯诱导的白基因表达量的降低 同样具有组织特异性。在蛋白水平上，采用w e s t e r nb l o t t i n g 的方法，利用制各的g r 蛋白的多 克隆抗体检测g r 蛋白的表达情况研究表明g r 在蛋白水平的表达情况与在r n a 水平的表达情况 基本一致。 ( 4 ) 酵母双杂交法研究g r 蛋白与乙烯受体蛋白之间的作用模式：通过采用酵母双杂交的方 法，将白基因与乙烯受体基因片段分别构建双杂交载体p g a d - w 及p g g k - t 7 上，同时转化酵母菌 a h l 0 9 。采用滤纸显色反应并检测p - g a l a c t o s i d a s e 酶活，研究结果表明，g r 蛋白与番茄乙烯受 体蛋白在酵母菌a l l l 0 9 中都能够稳定的表达，并且g r 蛋白与番茄乙烯受体家族的5 个蛋白之间 都能够发生直接的结合作用，结合能力基本相似。 ( 5 ) 酵母双杂交法研究番茄乙烯受体与c t r 蛋白之间的作用模式：通过采用酵母双杂交的方 法，将番茄乙烯受体基因片段与番茄l e c t r l 和l e c t r 4 基因片段分别构建双杂交载体p g a d - - t 7 及 p g b k - t 7 上，同时转化酵母菌a b l 0 9 。采用滤纸显色反应并检测p - g a l a c t o s i d a s e 酶活，研究结果 表明，番茄乙烯受体蛋白与c t r 蛋白之间都能发生直接的结合作用，但是结合能力之间存在明显 的差异。并且，受体蛋白的反应调节区对于这种结合作用并不是必须的。 关键词：番茄，乙烯，信号转导，酵母双杂交 a b s t r a c t e t h y l e n ei sa l le n d o g e n o u sp l a n th o r m o n e t h a ti n f l u e n c e sm a n ya s p e c t so f p l a n tg r o w t ha n d d e v e l o p m e n t f o rt h ec f i m a o e f i cf r u i t , a st h em a t u r eh o r m o n e , e t h y l e n ei sv e r yi m p o r t a n tf o r t h em a t u r e a n ds e n e s e e n c ：eo f f r u i t t h ee t h y l e n er e s p o n s ei sc o n d u c t e db ye t h y l e n es i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yi n t h ep l a n t i nt h i sp a p e r , t op e r f e c tt h et h e o r yo fe t h y l e n es i g n a lt r a n s d u c t i o n , t h et o m a t om u t a n t g r e e n - r i p e ( g f ) w a s u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e f u n c t i o n a n d p a t t e r n0 f g r g e n e s o m e w o r k s h a v e b e e n d o n ea sf o l l o w s ： ( 1 )c l o n i n g o f g r g e n ea n d e x p r e s s i n g i n p r o k a r y o t i c ：r t - p c r w a s u s e d t oa m p l i f y t h eg f g e n e f r o mg r e e nr i p et o m a t of r u i tt h ep c rp r o d u c tw a gs u b c l o n e di n t op r o k a r y o t i cp r o t e i ne x p r e s s i o n v e c t o r sp e t - 3 0 at og e n e r a t er e c o m b i n a n tp l a s m i d si ne c o i lb l 2 1 a n dt h ep r o t e i nw a si n d u c e db y 0 1 m m l i p t gf o rt h r e eh o u r s ( 2 ) p u r i f i c a t i o n o fg f p r o t e i n a n d p r e p a r a t i o n o f p o l y c l o n a l a n t f o o d i e s ：t h eg r p r o t e i n w a s p u r i f i e d b y n i - n t a a g a r o s ec o l u m n w h e n t h e i m i d a z o l e o f w a s h i n g b u f f e r w a s 4 0 m m l , t h e g f p r o t e i n w a s p u r i f i e dp e r f e c t l y a n dt h ep u r i f i c a t i o nl e v e lw a s a b o u t9 6 t h ea n t i - c as e r u mw a so b t a i n e db y i m m u 丑i z i n g r a b b i t s , a n d t h e t i k 口, o f t h e a n t i - c a s e u m w a sa b o v e l 0 0 0 0 p u r i f i e d b y t h e d e a e - 5 2 i o n - c o l u m n , t h eh i g hp u r i f i c a t i o nl e v e lo fa n t i - c ap o l y c l o n a la n t i b o d yw a so b t a i n e d i d e n t i f i e db y w e s t e mb l o t t i n g , t h ea n t i - c ap o l y c l o n a la n t i b o d yh a ds p e c i 丘ci m m u n i z a t i o nf u n c t i o n ( 3 ) t h ee x p r e s s i o np a t t e r na n dt h el o c a l i z a t i o no f c a ：t os t u d yt h ee x p r e s s i o np a t t e r no f g r 缸 t o m a t o ，a n d t h e i n f e c t i o n o f t h ee t h y l e n e r t - c p r w a s u s e d i n t h e r n a l e v e l t o d e m o n s t r a t e t h a t t h e e x p r e s s i o n o f g r w a gs p e c i a l i z e d 缸l n c c u l t u r e s e x p r e s s i o n l e v e l o f g f w a s h i g h e r i ns e e d , f l o w e r a n dg r e e nr i p ef r u i tt h a no t h e r s , a n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lw e r er e d u c e db ye t h y l e n ei nt h ef l o w e ra n d g r e e nr i p ef r a i lt h ew e s t e r nb l o t t i n gw a s u s e dt oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o np a t t e r no fg ri np r o t e i n l e v e l t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f g fi np r o t e i nl e v e lw a s c o m p i l e dw i t ht h e e x p r e s s i o ni nr n a l e v e l ( 4 ) t h e 咖d y o f t h e p a t t e m b e t w e e n t h eg f p r o t e i n a n d e t h y l e n er e c e p t o r p r o t e i n s b y y e a s t t w o - h y b r i da s s a y ：b y t h e m e t h o d o f y e a s t t w o - h y b r i da s s a y , t h e o r a n d t h ee t h y l e n er e c e p t o r g e n e s w e r es u b c l o n e di nt oy e a s tt w o - h y b r i dv e c t o rp g a d - t t a n dp g b k - t 7r e s p e c t i v e l ya n dt r a n s f o r m e d i n t o a h l 0 9 b y t h e y e a s t t w o - h y b f i da s s a y t h e r e s u l t ss u g g e s t e d t h e g f a n de t h y l e n er e c e p t o r p r o t e i n s e x p r e s s e de f f i c i e n t l yi nt h ey e a s t , a n dt h eg rp r o t e i na s s o c i a t e dp h y s i c a l l yt ot h ee t h y l e n er e c e p t o r sw i t h s i n a i l a ra b i l i t y ( 5 ) t h es t u d y o f t h e p a r e m b e t w e e n t h e e t h y l e n er e c e p t o r p r o t e i n s a n d c t r p r o t e i n s b y y e a s t t w o - h y b r i da s s a y ：w es u b e l o n e dt h ee t h y l e n er e c e p t o r sa n dc t rg e n e si n t ot h ey e a s tt w o - h y b r i d v e c t o r p o b k o t 7 a n d p g a d - t t r e s p e c t i v e l y , a n d t r a n s f o r m e d t h e y e a s t a h l 0 9 t h er e s u l t s o f f i l t e r a s s a ya n dt h ea c t i v i t yo f1 3 - g a l a c t o s i d a s ed e m o n s t r a t e dt h ee t h y l e n er e c e p t o rp r o t e i n sa s s o c i a t e d p h y s i c a l l yt ot h ed o w ns t a i rl e c t r la n di e c r r 4p r o t e i n si n a h l 0 9 , a n dt h ea s s o c i a t i o na b i l i t i e sw e r e d i f f e r e n t m o r e o v e r , t h er e s p o n s ed o m a i n so ft h ee t h y l e n er e c e p t o rp r o t e i n sw e r en o tn e c e s s a r yf o rt h e a s s o c i a t i o n k e yw o r d s ：t o m a t o , e t h y l e n e ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n , y e a s tt w o - h y b r i d 1 1 1 插图、附表清单 图1 - 1 乙烯生物合成途径和蛋氨酸循环 f i g 1 1b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo f e t h y l e n ea n dc y c l eo f m e t 图1 - 2 拟南芥乙烯信号转导途径 f i g a - 2e t h y l e n es i g n a lu a n s d u c t i o np a t h w a y i na r a b i d o p s i s ( 0 1 1 0e ta l ，2 0 0 4 ) 图1 3 番茄果实成熟突变体 f i g 1 - 3 t h em u t a n tf r u i to f t o m a t o 图2 - 1 破色期番茄果实总r n a 琼脂糖凝胶电泳 f i g 2 - 1 e t h i d i u mb r o m i d es t a i n i n go f t o t a lr n a f r o mb r e a k i n gt o m a t o 图2 - 2g r 基因r t - p c r 产物的凝胶电泳 f i g 2 - 2t h e a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f r t - p c r 图2 - 3 重组质粒p e t - g r 酶切鉴定电泳图 f i f p 2 - 3 t h ea g a m s eg e le l e c t r o p h o r e s i so fp r o d u c to fg fg e n ei d e n t i f i c a t i o no fr e c o m b i n a n tp l a s m i d p e t - g r 图2 - 3g r 测序结果 f i g 2 - 3 t h es e q u e n c eo fo r 图2 _ 4 不同浓度的1 p t g 诱导g r 蛋白的表达 f i g 2 4 t h ee x p r e s s i o no fi n d u c e dg rp r o t e i nb yd i f f e r e n ti p g t 图3 - lg r 蛋白纯化结果 f i g 3 1 p u r i f i c a t i o no fg rp r o t e i n 表3 1 抗g r 血清的效价 t a b l e 3 - 1t i t e ro fa n t i - g rs e l 3 1 m 图3 - 2 离子交换层析各管2 8 0 r i m 的吸收值 f i g3 - 2r e s u l to fi o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y 图3 - 3 抗g r 血清的w e s t e r nb l o t t i n g 检测 f i g 3 - 3a n a l y s i so f w e s t e r nb l o t t i n gf o ra n t i - g rs c i o n 图4 - 1 a 普通番茄总r n a 琼脂糖凝胶电泳 f i g 4 - 1 a e t h i d i u m b r o m i d es t a i n i n g o f t o t a l r n a f r o m t o m a t o 图4 - 1 b 乙烯处理番茄总r n a 琼脂糖凝胶电泳 f i g 4 - 1 b e t h i d i u m h r o m i d es m i n i n g o f t o t a l r n a f r o me t h y l e n e t r e a t e d t o m a t o 匣4 - 2 a 普通番茄国基因的表达 f i g , 4 - 2 a t h er e s u l to f r t - p c r f r o m t o m a t o 图4 - 2 b 外源乙烯处理番茄样品中g r 基因的表达 h g 4 - 2 a t h er e s u l to f r t - p c rf r o mt h ee t h y l e n et r e a t e dt o m a t o 图4 - 3 a 普通番茄中g r 蛋白的表达 v n f i g 4 - 3 a t h ee x p r e s s i o no fg rp r o t e i nf r o mt o m a t o 图4 - 3 b 外源乙烯处理番茄g f 蛋白的表达 f i g 4 - 3 b t h ee x p r e s s i o no fg rp r o t e i nf i o me l h y k n et r e a t e dt o m a t o 图“番茄g r 蛋白的膜定位 f i g 4 - 4l o c a t i o nt ot h em e m b e r a n e o fg rp r o t e i n 图5 - 1 绿熟期番茄果实总r n a 琼脂糖凝胶电泳 f i g 5 1 e t h i d i u mb r o m i d es t a i n 吨o f t o t a lp 啉a f l o r ag r e e n - r i p et o m a t o 图5 - 2 ag r 基因的p c r 扩增 f i 9 5 - 2 a c r a m p l j c a t i o no f g r 图5 - 2 bg r 双杂交载体的鉴定 f i g 5 - 2 b i d e n t i f i c a t i o no fg rv e c t o r 图5 - 2 cg r 基因测序结果 f i g 5 - 2 c t h e s e q u e n c eo f g r 图5 - 3 a 番茄乙烯受体的p c r 扩增 f i g 5 - 3 ap c ra m p f i c a f i o no f t o m a t oe t h y l e n er e c e p t o r s 图5 - 3 b 番茄乙烯受体重组载体的鉴定 f i g 5 - 3 bi d e n t i f i c a t i o n o fr e c o m b m a t e d v e c t o r o f t h ee t h y l e n e c c p i o m 图5 4滤纸显色反应 f i g 5 - 4 t h er e s u l to ff i l t e ra s s a y 图5 - 5 转化酵母中乙烯受体与g r 蛋白的表达 f i g 5 - 5 t h e e x p r e s s i o no f e t h y l e n er e c e p t o ra n dg fp r o t e i n si nt h et r a n s f o r m a n t s 图5 - 6 转化菌株的b 刊a c l i d a 靶活性检测 f i g 5 - 6 t h ea c t i v i i ) ro fb - g a l a c i o s i d a 辩i nt h et r a n s f o m 3 a n t s 图6 1 受体l e e t r lp c r 扩增及鉴定 f i g 6 - lp ( 疆a m p l i c a t i o na n dt h ei d e n t i f i c a t i o no f l e e t r l 图6 - 2 受体l e e t r 2p c r 扩增及鉴定 f i g 6 - 2 p g ra m p f i c a t i o na n dt h ei d e n t i f i c a t i o no fl e l 肫 图6 - 3 受体n r 的p c r 扩增及鉴定 f i g 6 - 3 p c r a m p l i c a t i o na n dt h ei d e n t i f i c a t i o no f n r 图6 - 4 受体l e e t r 4 的p c r 扩增及鉴定 h g 6 - 4p c ra m p f i c a t i o na n dt h ei d e n t i f i c a t i o no f l e e t r 2 图6 - 5 受体l e e l l 炻的p c r 扩增及鉴定 f i g 6 - 5p c ra m p l i c a f i o na n dt h ei d e n t i f i c a t i o no f l e e t r 5 图6 - 6i e c i r 1 和l e c t r 4 的p c r 扩增及鉴定 f i g 6 - 6 p c r a m p l i c a t i o na n dt h ei d e n t i f i c a t i o no f l 文x r la n dl e c t r 4 图6 - 7 滤纸显色反应 f i g 6 - 7t h er e s u l t o f f i l t c r a s s a y 图6 - 8 a 转化菌株中乙烯受体蛋白与l e c t r l 蛋白表达情况 f i g 6 - 8 a 图6 - 8 b f i 9 6 - 8 b 图6 - 9 a f i g 6 - 9 a 图6 - 9 b f i g 6 - 9 b t h ee x p r e s s i o no f e t h y l e n er e c e p t o ra n dt h ei d 田 1 1 1i nt r a n f o r m a n t s 转化菌株中乙烯受体蛋白与l e c r r 4 蛋白表达情况 t h ee x p r e s s i o no f e t h y l e n er e c e p t o ra n dt h ei c ( 了i r 4i nt r a n f o r m a n t s 转化菌株的b - g a l a c t o s i d a s e 活性检测 t h ea c t i v i t yo fb - g a l a c t o s i d a s ei nt r a n s f o r m a n t s 转化菌株的1 3 - g a l a c t o s i d a s c 活性检测 t h ea c t i v i t vo f1 3 - g a l a c t o s i d a s ei n 缸铂蓝f 咖a n 忸 i x 词语缩写 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e 1 - c a r b o x y l i ca c i d a c co x i d a s e a c cs y n t h a s e c o n s t i t u t i v et r i p l er e s p o n s e c a u l i 妇o w e f m o s a i cv i r u s c o m p l e m e n t a r yd n a d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d e t h y l e n eb m d m g p r o t e i n e t h y l e n ef o r m i n ge n z y m e e t h y l e n ei n s e n s i t i v e e t h y l e n er e s p o n s ef a c t o r e t h y l e n er e s p o n s e g l u c u r o n i d a s e k a n a m y c i n m e t h i o n i n e n o p a l i n es y n t h a s e n e v e r - r i p e o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p e o i n e s l e r a s e p o l y g a l a c t u r o n a s e r i b o n u c l e i c a c i d r e v e r s et r a n s e r i p f i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s - a d e n o s y l m e t h i o n i n e h y d r o x y - m e t h y i - a m i n om e t h a n e d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a c e f i ca c i d s o d i u md o d e e y ls u l f a t e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 i n d o l y l 6 - d - g a l a c t o s i d e g r e e nr i p e b o v i n ef i e i u ma l b u m i n x 1 一氨基1 羧基环丙烷 a c c 氧化酶 a c c 合成酶 组成型三重反应 花椰菜花叶病毒 互补d n a 脱氧核糖核酸 乙烯结合蛋白 乙烯合成酶 乙烯不敏感型 乙烯反应调节因子 乙烯耐受型 葡萄糖苷酸酶 卡那霉素 蛋氨酸 胭脂碱合成酶 永不成熟 光密度 聚合酶链反应 果胶甲酯酶 多聚半乳糖醛酸酶 核糖核酸 反转录聚合酶链反应 s - 腺苷蛋氨酸 三羟甲基氨基甲烷 焦碳酸二乙酯 乙二氨四乙酸 十二烷基磺酸钠 5 一溴一4 氯一3 _ 吲哚一b d - 半乳 搪 绿色成熟 牛血清白蛋白 慧=裟i|l|：=竺煞l|l|l|i|黧ll|：嚣j氯 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名；时间：一7 年厶心日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存，汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 一躲昂 导师签名：罗盏拈 3 时间：妒7 年多月f 死 帆川年多月f 咕 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 乙烯是影响植物生长发育的重要内源激素，它与植物细胞发育、果实成熟、细胞衰老和胁迫 反应都有密切关系( a b e l e s e t a ，1 9 9 2 ；s t o c k e ta l ，2 0 0 0 ) 植物组织产生内源性乙烯，通常乙烯 生成量很少，但在生长发育的某些阶段( 如种子萌发，果实成熟等) 及遭受各种逆境刺激时，乙 烯会大量产生，因而调节植物许多重要的生理过程。同时乙烯对植物在胁迫条件下，如机械损伤、 病虫害、旱、涝条件均有较强的相关反应( k i e b e r , 1 9 9 7 ；s t e p a n o v ae t a l2 0 0 0 ；l e l i e v me ta l ，1 9 9 7 ； g i o v a n n o n i , 2 0 0 1 ) 乙烯作为影响采后果蔬生理的最重要因子，同时又是控制果蔬衰老的关键所 在，一直以来也是人们研究采后生理及贮藏保鲜方面的重要课题。 1 1 乙烯的生物合成 乙烯的生物合成途径最早l i b e r m a n 于1 9 6 4 年首次在苹果上得到证实随后他们提出植物体 内乙烯生物合成的前体物是蛋氨酸，证明标记的i c 蛋氨酸在苹果组织内转变成为标记的| c 乙烯 ( ii b e m a nmc ta 1 ，1 9 9 6 ) 接下来，a d a m s 和y a n g 研究发现卜氨基环丙烷基羧酸( a c c ) 是乙 烯生成的直接前体，确定了植物体内乙烯生物合成的途径( y a n ga n d h o f f m a n ，1 9 8 4 ) 乙烯生 物合成途径如图1 - 1 所示，蛋氨酸在蛋氨酸腺苷转移酶催化下形成s 一腺苷一l - 蛋氨酸；s - 腺苷一l - 蛋氨酸在a c c 合酶( c s ) 作用下合成乙烯前体1 一氨基一1 一羧基环丙烷( a c c ) ，同时还形成5 一甲 硫腺苷( m t a ) a c c 在 c c 氧化酶作用下生成乙烯，而m t a 经过蛋氨酸循环最后形成蛋氨酸；蛋氨 酸中丁酸的4 个碳原子来自a t p 的核糖分子，蛋氨酸中的甲硫基被保留下来不断地在蛋氦酸循环 中反复利用，这是植物体内只含有少量蛋氨酸却可以合成大量乙烯的原因( l i uc f a l ，1 9 9 3 ； a n t h o n y e t a l ，2 0 0 0 ) p - q s w d nt - m - l r m 蠢t t t t 督露童# t 辱 雄1 - 1 - p _ 脚m 耐m _ 删d 1 1 1 a c c 合酶 a c c 含酶( a c s ) 是植物体内乙烯生物合成的限速酶，它在调节乙烯生成中起关键作用，最早 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 是在番茄的果皮组织中被发现的( y up t 日上，1 9 7 9 ) ，同年b o l l e r 等在对番茄组织的研究中， 首先证实了a c c 合成酶的活性。a c c 合酶存在于植物组织的细胞质中，并以a d o m e t 为底物，以磷 酸毗哆醛为辅基。a v g ( m i n o e t h o x y v i n y l g l y c i n e ，氨基羟乙基甘氨酸) 和a o a ( a m i n o o x y a c e t i c a c i d ，氨基氧乙酸) 是a c c 合酶的竞争抑制剂。细胞内a c c 合酶很容易失活，生物素处理的番茄果 实的a c c 合酶的半衰期仅为2 5m i n ( n a k a j i m ae tn 1 ，1 9 9 0 ) 。植物中a c c 合酶受到不同发育阶 段、外界环境和激素信号所调控。编码a c c 合酶的基因首先从西葫芦中分离出来，随后其它物种 如番茄( o e l l e re ta l ，1 9 9 1 ) 、拟南芥( l i a n ge ta l ，1 9 9 2 ) 、水稻( z a r e m b i n s k ie ta 上， 1 9 9 4 ) ，康乃馨( p a r ke t a 工，1 9 9 2 ) ，烟草( b a i l e ye t8 上，1 9 9 2 ) 、柑橘( w a n ge t n l , 1 9 9 9 ) 中编码a c c 合酶的基因相继被分离出来 v a n d e r s t r a e t e n 等( 1 9 9 0 ) 部分地纯化了a c c 合成酶。从成熟和伤诱导的番茄果实中纯化 的a c c 合成酶的差别较大，分别为4 5 k i ) ，5 0 k d 和6 7 l 【d ( b l e e c k re t a 1 ，1 9 8 6 ；v a n d e rs t r a e t e n e t a 1 ，1 9 9 0 ) ，其主要原因可能是a c c 合成酶的多态性。从不同的植物材料和在不同条件下的 同一材料中纯化的a c c 合成酶其l ( m 值、最适p h 等都存在很大的差别，这说明植物体内可能具有 多种a c c 合成酶同工酶。植物组织中a c c 合酶存在形式有单体、二聚体、三聚体之分。b l e e k e r ( 1 9 8 6 ) 等和r o t t m a n n 等( 1 9 9 1 ) 的研究发现，番茄果实中a c c 合酶是以单体形式发挥作用的 s a t o 等( 1 9 9 1 ) 研究发现i a a 诱导的西葫芦果实中纯f 匕a c c 合酶是一种有两条分子量为4 6 k d 的 亚基组成的二聚体而n a k a j i m a 等( 1 9 8 6 ) 在伤诱导的笋瓜果实中分离纯化得到了三聚体的a c c 合酶。番茄作为研究果实成熟的模式植物被广泛应用于a c c 合酶功能的研究。番茄绿熟期果实中 a 罐因表达量较低，在破色期果实中表达量开始增加，到果实红熟期时表达量达到最大b a r r y 等通过研究腑和栅茄突变体果实发现删嗍表达受乙烯调控并与系统乙烯形成相关，而 尉岱鲋和删圆g 并不受乙烯的调控( b a r r ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 1 1 2 a c c 氧化酶 乙烯生物合成途径中最后一个步骤是a c c 氧化生成乙烯，而此步骤由a c c 氧化酶( a c o ) 催化 完成。a c c 氧化酶以抗坏血酸和氧作为辅基，以f e ”和c 0 2 作为辅助因子，将a c c 氧化成乙烯。当外 源供给a c c 时，植物组织中乙烯生成量会相应增加，说明a c o 不是乙烯生成的限速酶。 c c 氧化酶 也是一种不稳定酶，经测定，苹果中a c c 氧化酶的半衰期为2 h ( h a m i l t o ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 影响 细胞膜功能的试剂，如c 0 ”，氧化磷酸化解偶联剂、自由基清除剂、多胺、t r i t o n x - 1 0 0 、渗透胁 迫、磷酸胆碱等都能抑制a c c 转变为乙烯。当植物受外界刺激乙烯合成增加时，a c c 氧化酶的活 性也相应升高。如果实成熟( d o n ge t a 1 ，1 9 9 2 ) ；花的衰老( w a n ga n dw o o d s o n ，1 9 9 1 ) ；伤 害反应( b a l a g u ee t a 1 ，1 9 9 3 ) ；对乙烯的反应( b a r r ye t a 1 ，1 9 9 6 ) 等。 h o l d s w o r t h 首先从番茄中筛选出编码 c c 氧化酶p t o n l 3 基因，但当时还不清楚p t o m l 3 基因的 功能( h o l d s w o r t he ta 1 。1 9 8 7 ) 1 9 9 1 年，h a m i l t o n 等从与番茄成熟有关的基因克隆中筛 选出克隆p t o m l 3 后，为了确认该基因编码的a c c 氧化酶，h a m i l t o n 等将t o t a l 3 基因转入酵母中， 酵母转入t o t a l 3 基因后，可将a c c 转化成乙烯，其特点与植物相似，而正常菌株则不具有这种功 能。这证明t o m l 3 是编码a c c 氧化酶的基因( h a m i l t o ne t a 1 ，1 9 9 1 ) 后来d a v i e s 等研究发 现，当番茄果实受到伤害时，p t o m l 3m r n 的表达量与乙烯生成量都会上升，并且m r n a 水平的上 2 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 升先于乙烯生成量的上升( d a v i e se ta 1 ，1 9 8 9 ) 除番茄以外从苹果、鳄梨、绿豆、矮牵牛、 香蕉和康乃馨中克隆到编码a c c 氧化酶的基因，这些基因与p t o m l 3 都具有高度同源性，在氨基酸 水平上一致性可以达到8 0 ( d o n ge ta 1 ，1 9 9 2 ；b a r r ye ta 1 ，1 9 9 6 ) 同a c c 合酶一样，这 些植物中a c c 氧化酶也为多基因家族所编码，这些基因在果实成熟和叶片伤害时能被差异表达 ( j i a n ge ta 1 ，2 0 0 0 ；j u r ge ta 1 ，1 9 9 5 ) 。b a r r y 等从番茄中分离得到的三个a c o 基因分 别为l e - a c o i ，l e - a c 0 2 和l e - a c 0 3 中，l e - a c o l 和l e - c 0 3 在花和成熟果实中表达，而l e - a c 0 2 只 在受伤叶片和花的发育过程中表达( s a r r ye t a 1 ，1 9 9 6 ) 。 1 2 乙烯的信号转导 1 2 1 拟南芥的乙烯信号转导途径 乙烯对植物的代谢调节可贯穿其整个生活周期。在种子萌发时，乙烯可引起下胚轴的膨胀变 租，使得幼苗容易破土而出；在植物成熟时，乙烯影响其性别的分化并促使果实成熟；当受到 如伤害、病虫侵害和各种胁迫因素刺激时，乙烯能够提高植物抗性( b l e e k e rp t 日上，1 9 8 8 ：g u z m a n a n de c k e r ，1 9 9 0 ) 植物体内乙烯的生物合成途径已经研究清楚，但对于植物体内通过乙烯信 号转导途径如何调节这些反应却不完全清楚。近年来研究发现，当乙烯处理拟南芥 ( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 后，其黄化幼苗对乙烯的“三重反应”不同，即下胚轴膨胀变短，茎杆偏 向水平生长和顶端钩状芽弯曲加剧( c h a n ge ta z ，1 9 9 3 ：e c k e r ，1 9 9 5 ：r o m a na n dl u b a r s k y ， 1 9 9 5 ) 。通过筛选拟南芥。三重反应”幼苗突变体能够分离乙烯反应突变体，进而有效研究乙烯 信号转导途径。目前人们利用三重反应作为筛选手段获得的拟南芥菜a r a b i d o p s i st h a l i a n a 乙 烯反应突变体主要分为两大类型：( 1 ) 乙烯不敏感型突变体，如乙烯不敏感突变体e i n 2 、e i n 3 、 e i n 4 、e i n 5 、e i n 6 、e i n 7 、a i n l 和乙烯耐受突交体e t r l 、e t r 2 、e r s 2 等。它们的黄化幼 苗在饱和外源乙烯存在下也不表现三重反应，表现为失去或降低对外源乙烯的吸收或反应能力。 与野生型植株相比，它们长势高大具有开放项钩( 2 ) 组成型三重反应突变体，如组成型三重 反应突变体c t r l 和乙烯产生过量突变体e t o l