（食品科学专业论文）黑木耳多糖的提取及分离纯化.pdf

摘要 摘要 以经过预处理的黑木耳为原料，采用双酶水解法提取黑木耳多糖，确定最佳酶解条 件；对粗多糖进行精制，去除色素及蛋白质杂质；通过一系列分离纯化过程得到几种木 耳多糖组分。 以多糖提取率为指标，通过单因素实验确定果胶酶及纤维素酶单独酶解的最佳工艺 条件。以此为基础进行双酶单因素实验，由此确定双酶酶解的最佳工艺条件；通过对比 几种脱色及除蛋白方法，优选出最佳的精制工艺；先后采用季铵盐沉淀法、离子交换纤 维索柱层析法、凝胶柱层析法分离纯化，得到木耳多糖组分。 双酶酶解的最佳工艺条件：浸提剂倍数5 0 ，p h 值5 0 ，温度5 0 ，时问6 0 m i n ， 酶加量为1 8 ，纤维素酶与果胶酶的配比为2 ：1 ，在此工艺条件下，黑木耳多糖 的提取率达5 8 2 ；采用大孔吸附树脂a b - 8 进行脱色处理，中性蛋白酶脱蛋白，取得 良好的效果；经过季铵盐沉淀、离子交换纤维素柱层析、凝胶柱层析分离纯化，得到四 种多糖组分a a p s l i 及a a p s l i i 、a a p s 2 一i 和a a p s 3 - i 。 本文采用酶解与水提相结合的方式提取黑木耳多糖，成功地获得了黑木耳的有效成 分，为丌发黑木耳功能性保健食品及对黑木耳资源的充分利用提供了一条新的途径。所 得黑木耳多糖经后续加工可作为一种天然、营养、多功能的食品添加剂，还可以制作成 口服液、胶囊等用来满足人们对健康的多种需求。木耳多糖经分离纯化后，得到四种多 糖组分，为进一步研究多糖的结构及其单糖组成奠定了物质基础。 关键词：黑木耳，多糖，纤维素酶，果胶酶，分离纯化 a b s t r a c t a b s t r a c t a u r i c u l a r i aa u r i c u l ap o l y s a c c h a r i d e sw e r eg o tf r o mp r e t r e a t e da u r i c u l a r i aa u r i c u l a rb y b i e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，a n dt h eo p t i m u me n z y m a t i cc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d t h e nr e f i n e t h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d e sb yd e c o l o r i n ga n dp r o t e i nr e m o v i n g t h e s ep o l y s a c c h a r i d e sw e r e s e p a r a t e da n dp u r i f i e db yas e r i e so f m e t h o d s 。 t h eb e s te n z y m a t i cc o n d i t i o n so f p e c t i n e xa n dc e l l u a s ew e r es t u d i e dr e s p e c t i v e l yb ym o n o f a c t o r i a le x p e r i m e n t sa c c o r d i n gt ot h ep o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t i o nr a t e a f t e rt h a t ，b i e n z y m a t i c h y d r o l y s i sm o n o f a c t o r i a le x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u t ，a n dt h eb e s tb i e n z y m a t i ch y d r o l y t i c c o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d t h eo p t i m u mr e f i n i n gp r o c e s s e sw e r ed e t e r m i n e db yc o m p a r i n g d i f f e r e n td e c o l o r i n ga n dp r o t e i nr e m o v i n gm e t h o d s s e v e r a la u r i c u l a r i aa u r i c u l ap o l y s a c c h a r i d e s w e r eo b t a i n e db yq u a t e r n a r ya m m o n i u n as a l td e p o s i t i o nm e t h o d ，d e a e c e l l u l o s ed e - 5 2c o l u m n a n d g e lp e r m e a t i o nc o l u m nc m o m a t o g r a p h y t h eb e s tb i e n z y m a t i ch y d r o l y t i cc o n d i t i o n sw e r ef o u n dt ob ea tt e m p e r a t u r e5 0 。c ， e n z y m a t i ch y d r o l y t i ct i m e6 0 m i n , t h ee n z y m a t i c a d d i t i v eq u a n t i t yw a s1 8 ，p h5 0 ，t h er a t i o o fc e l l u a s et op e c t i n e x = 2 ：1 ，t h er a t i oo fb u f f e rl i q u o rt or a wm a t e r i a lw a s5 0 u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s ，t h ep o l y s a c c h a r i d e se x t r a c t i o nr a t ew a s5 8 2 t h eb e s td e c o l o r i n gm e t h o dw a s d e t e r m i n e dt ob ew i t hm a c r o p o r o u sa d s o r b e n tr e s i na b 一8a n dt h ep r o t e i nr e m o v i n gb y e n z y m a t i cm e t h o dw a sc h o s e n ，a n db o t h m e t h o d sh a v ea c h i e v e dg o o dr e s u l t s f o u r a u r i c u 缸r ma u r i c u l ap o l y s a c c h a r i d e sa a p s l i ，a a p s l i i ，a a p s 2 - ia n da a p s 3 一1w e r e o b t a i n e db yq u a t e r n a r ya m m o n i u ms a l td e p o s i t i o nm e t h o d ，d e a e c e l l u l o s ed e - 5 2c o l u m n a n dg e lp e r m e a t i o nc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h ea u r i c u l a r i aa u r i c u l a rp o l y s a c c h a r i d e sw e r eo b t a i n e db yb i e n z y m a t i ch y d r o l y s i s t o g e t h e rw i t l lw a t e rd i s t i l l i n gi nt h i st h e s i s t h ef u n c t i o n a lf o o do fa u r i c u l a r i aa u r i c u l aw a s e x p l o r e db yt h ee x t r a c t i o no fa u r i c u l a r i aa u r i c u l ap o l y s a c c h a r i d e s t h em e t h o dc a nb e r e g a r d e da st h ep r o d u c t i o no ft a k i n gf u l la d v a n t a g eo fa u r i c u l a r i aa u r i c u l a ，t h ea u r i c u l a r i a a u r i c u l ap o l y s a c c h a r i d e sw eg o tc a nb eu s e dt op r o d u c ef u n c t i o n a lf o o ds u c ha so r a ll i q u i d a n dc a p s u l e s oi tc a nm e e tt h en e e do fp e o p l et og e tm o r en u t r i t i o na n dh e a l t h p u r i f i e d a u r i c u l a r i aa u r i c u l a rp o l y 7 s a c c h a r i d e sw e r eo b t a i n e db ys e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，a n dm a d e a b s t r a c t i t p o s s i b l e t o c a r r yf u r t h e r s t u d i e s o nt h es t r u c t u r ea n dt h e c o m p o s i t i o no ft h e i r m o n o s a c c h a r i d e s k e y w o r d s ： a u r i c u l a r i a a u r i c u a p oy s a c c h a rd e s ， c eiu a s e p e o tin e x ， s e p a r a t i o na n dd ur i f i c a t i o n i i i 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目： 墨主墨垒生 鱼望翌堡壅鱼查! 竖 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 召) ，保密期至年月日为止。 学生签名：兰纽导师签名：茜钯搬学生签名：圭红导师签名： 刍笙! ! 坠 秒咿 1 年u 月g 日 第一章文献综述 1 1 引言 第一章文献综述 近几年来，随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ，p s ) 与蛋白质、核酸一样是涉及生命活动本质的三类生物大分子之一。多糖是一类具有广泛 生物活性的生物大分子物质，又称为多聚糖。多糖不仅是人体生命必需的成分，而且存 在于一切细胞膜结构中，并参与多种生命活动【”。 多糖具有广泛的生物活性，在开展多糖资源的开发、结构分析、药理作用等的研究 方面，人们做了大量的工作。目前，多糖的研究以日本、美国、德国、俄罗斯等国处于 领先地位，我国的科学家们也做了不少工作。 人们对多糖类化合物的认识，最初只是看作食物中能量和纤维素的来源。近年来， 对多糖的研究进入迅速发展与空前活跃阶段。通过研究，人们发现，由于多糖具有多方 面的生物活性，其抗病毒作用不同于核苷、萜类、生物碱等小分子化合物，除了具有提 供能量、参与组织结构等作用外，多糖及其缀合物( 糖蛋白、糖脂等) 还参与了细胞各 种生命现象的调节，在细胞的生命活动中起到重要的作用。它能激活免疫细胞，提高机 体的免疫功能，能够与病毒形成复合物，干扰其与细胞受体的结合，而对正常细胞没有 副作用。因此，多糖作为抗肿瘤、治疗艾滋病等抗病毒药和抗衰老药物在临床上加以使 用，并且显示出越来越广泛的应用前景。 目前，真菌多糖因具有某些独特的生理功能而成为一个很热门、很活跃的研究课题。 我国是历史上栽培食用菌最早的国家，早在唐代就有史料、己载f 2 。很多研究表明，存在 于灵芝、香菇、金针菇、银耳、黑木耳、猴头菇等大型食用或药用真菌中的某些多糖组 分，具有通过活化巨噬细胞刺激抗体产生从而达到提高人体免疫能力的生理功能。这些 多糖由于具备比从动物血液中提取的免疫球蛋白更大的实用性而日益受到人们的重视， 此外，其中大部分还有很强烈的抗肿瘤活性，对癌细胞有很强的抑制力。因此，真菌多 糖是一种很具开发潜力的功能性食品基料瞄j 。 第一章文献综述 1 2 多糖 121 多糖的定义 多糖是由多个相同或不相同的单糖基以糖苷键相连而成的聚合度超过1 0 的高聚物。 其基本结构是一种或多种单糖，由一个糖的还原性端基与另个糖的c 2 ，c 3 ，c 。或c 6 的o h 彼此脱水缩合而成的大分子化合物，结构复杂，不具有原来单糖的性质。多糖还 原性小，有旋光性，分子量一般较大，不溶于有机溶剂4 1 。其分子量通常在数万至数百 万之间，多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。 1 2 2 多糖的来源和组成 迄今为止，人类对核酸和蛋白质的研究取得了重大进展，推动了生命科学及相关科 学领域的发展，多糖将成为最后一类有待攻破的生物活性大分子。多糖的来源大致分为 植物来源多糖、动物来源多糖和微生物来源多糖，即细菌多糖和真菌多糖1 5 j 。 多糖是一种具有合成高分子所没有的特殊生物活性的物质，因其化学结构中的糖基 数量相对单糖和双糖为多而得名。在自然界中多糖的种类繁多，它们在动物、植物、微 生物中均有存在且履行一系列不同的功能。微生物产生的多糖可以分为胞内多糖、细胞 壁多糖和胞外多糖三类。根据多糖化学结构中糖基的种类，又可将其分为同聚多糖和杂 聚多糖，前者为相同单糖所组成，如阿拉伯胶、淀粉等，后者为一种以上单糖所组成， 如半纤维素，粘多糖等【6 1 。其中食药用真菌多糖是微生物多糖的重要组成部分。食药用 真菌多糖在国际上称为“生物反应调节剂”( b i o l o g i c a lr e s p o n s e m o d i f i e r ，b r n ) ，它 已成为目前医药保健品开发的热点。 1 2 3 多糖的理化性质 1 23 1 溶解度 多糖溶于水是其发挥生物学活性的首要条件，如从茯苓中提取的多糖组分中，不溶 于水的组分不具有生物学活性，水溶性组分则具有突出的抗肿瘤活性，如具有p l ，3 - d 一 葡聚糖结构的多糖，不溶于水，部分羧甲基化后，水溶性提高，同时显著提高了抗肿瘤 活性【7 1 。降低分子质量是提高多糖水溶性，从而增加其活性的重要手段，向多糖引入分 支可在一定程度上削弱分子间氢键的相互作用，从而增加其水溶性。有些含有疏水分支 2 第一章文献综述 的多糖不溶于水，经过氧化还原成羟基多糖后才溶于水，从而产生生物学活性。由此可 见，降低分子质量、引入支链或对支链进行适当修饰，均可提高多糖溶解度，从而增强 其活性。此外，m e e h y e 鼬m 【8 】报道水溶性多糖有助于改善肠道的生态结构，从而可以改 善肠道的生理功能。 1 2 3 2 分子质量 多糖分子质量越大，分子体积越大，越不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体 内发挥生物学活性，但也并不是多糖分子质量越低越好，因为分子质量过低，无法形成 产生活性的聚合结构，这说明存在满足多糖活性的最佳相对分子质量范围，不同的多糖 产生生物学活性的最佳相对分子质量的范围不同【9 j 。 1 2 3 3 粘度 多糖的粘度主要是由于多糖分子间的氢键相互作用产生，还受多糖分子质量大小的 影响，它不仅在一定程度上与其溶解度呈正相关，还是临床上药效发挥的关键控制因素 之一。如果粘度过高，则不利于多糖药物的扩散与吸收。通过引入支链破坏氢键和对主 链进行降解可降低多糖粘度，提高其活性【l “。 1 2 3 4 结构 从黑木耳子实体中提取的黑木耳多糖，m w 为1 5 5 x 1 0 4 ，含岩藻糖、阿拉伯糖、甘 露糖、木糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸。对小鼠肉瘤s 1 8 0 抑制率为4 2 6 ，可明显促进机体 免疫功能，对组织细胞损伤有保护作用。从黑木耳子实体中分离出一种酸性杂多糖和两 种b 葡聚糖。酸性杂多糖组成为木糖、甘露糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸，其主链为p 一( 1 3 ) 糖苷键连接的甘露聚糖，通过c 3 或c 6 分支点连接有木糖、葡萄糖或葡萄糖醛酸作为支 链，其生物活性未予报道，两种d 葡聚糖的一种水溶性p 葡聚糖，由p ( 1 3 ) 糖苷键 连接的葡聚糖作为主链，平均每3 个葡萄糖残基通过c 6 分支点连接有一个葡萄糖残基 作为侧链。这种多糖对小鼠移植性肉瘤s 1 8 0 有很强的抑制活性。另一种具有p - ( 1 3 ) 葡聚糖主链和c 6 位单个糖基，但因有高度分支的侧链，基本上没有抑制肿瘤活性“”。 此外，还有研究者报道”l ，黑木耳多糖的一级结构主链主要为由旺( 1 3 ) 糖苷键 连接的甘露聚糖，冬虫夏草多糖主链主要为由a 一( 1 2 ) 糖萤键连接的甘露聚糖，灵芝 多糖主链主要为由a ( 1 4 ) 糖苷键连接的甘露聚糖。至今多糖的结构与功能的关系还 不十分明确，但普遍认为高级结构对功能的影响比一级结构明显。关于多糖异构体类型 第一章文献综述 与其生物活性的关系，还尚待进一步研究。 1 2 4 多糖的药理活性 国内外研究表明：活性多糖是理想的新型免疫药剂，它的特点是对人体的毒性很 小，通过强化特异性或非特异性免疫功能，从而增强人体本身防御机制，即提高人体 免疫力 1 4 】。 多糖具有抗病毒、抗炎症、抗放射、抗凝血等功效【”1 “，同时还具有护肝、抗衰老、 降血糖、降血脂等保健功划1 ”。近几年来，在艾滋病防治药物筛选中，各国专家对天然 活性物质进行了不少研究和探索，发现硫酸化多糖如硫酸葡聚糖、夏枯草硫酸化多糖等 对艾滋病毒有抑制作用【1 8 】。t a d a s h ik i h o 等从银耳中分离出一种酸性杂多糖，其降血 糖作用可能是由于加速肝脏的代谢。有文献报道 2 0 】，枸杞多糖能够显著降低血糖及血浆 总胆固醇的浓度；研究表明，多糖具有明显的抗辐射作用，能显著延长辐射损伤机体存 活时间，提高生存率，其机理可能与抗免疫损伤、保护造血系统、清除自由基等方面有 关f 2 ”。九里香多糖和蛋白多糖具有抗生育功能，对机体受内外因素所致的损伤具有一定 的保护和修复作用 2 2 o 综上所述，多糖的生理活性，尤其在抗肿瘤、增加机体免疫力方面表现更加突出。 多糖作为药物应用具有广阔前景，而且资源丰富。正如科学家所预言的那样“今后数十 年，将是一个多糖的时代”。因此，研究和开发利用多糖类化合物有着非常重要的价值。 1 2 5 真菌多糖 近年来，随着食品研究从营养型的传统食品向生理调节型的功能食品转变，功能性 食品越来越受到重视。食用菌类食品以其丰富的营养和天然、安全的保健功能赢得了越 来越多人的青睐。随着食用菌类食品药用价值与营养成分不断被揭示，其食用价值和药 用价值更加受到重视，但目前对它的认识和开发仍需进一步加深1 2 。 多糖类化合物具有广泛的生物活性【2 ”，真菌多糖主要来自其细胞壁，是一种由许 多单糖分子通过糖苷键相连的高分子化合物，这类化合物对癌细胞没有直接杀伤作用， 它的作用在于刺激抗体的形成，即通过恢复和提高患者的免疫功能而发挥其抗癌活性。 它与化学药物联合使用，还可减少或降低化疗药物的毒副作用，从而增加疗效【2 ”。水溶 性d 葡聚糖有抗肿瘤活性，特别是那些直链的、无过长直链的多糖，不易被人体内d 一 葡聚糖酶很快水解，而非水溶性多糖糖原、淀粉、糊精无活性，可能与它们有过长的支 4 第一章文献综述 链，易被酶解有关 2 “。食用菌因其神奇作用而成为现代新兴的保健资源，但有的食用菌 有苦味或其它异味、质地坚韧、粗纤维多，让很多人难以接受；特别是其有效成分多糖， 多存在于较厚的细胞壁中，一般的加工方式如煮制、研磨等很难将其有效利用。随着现 代高新技术的发展，对食用菌多糖的充分利用变为可能。将食用菌子实体经生物酶解、 发酵，再经机械研磨或超声波粉碎，使纤维裂解，细胞壁破碎，可以有利于人体消化、 吸收及利用。 真菌多糖为主要存在于菌丝体细胞壁内并分泌于细胞外的高分子糖类化合物，一般 由1 0 个分子以上的单糖通过糖苷键连接而成高分子多聚物。早在2 0 世纪5 0 年代b r a d n e r 等就提取了酵母多糖，2 0 世纪6 0 年代日本对1 0 0 多种真菌进行了筛选，7 0 年代我国开 展了大量研究，目前对真菌多糖的研究与利用已成为一个“热点”。如今我国发现有重 要价值的真菌多糖有近3 0 种，真菌多糖对生命科学、医药科学的研究与发展具有重要 意义”。 真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出来的、可以控制细胞分裂分化、 调节细胞生长衰老的一类活性多糖。真菌多糖作为药物研究始于5 0 年代，在6 0 年代以后 成为免疫促进剂而引起人们兴趣。真菌多糖具有很强的抗肿瘤活性，对癌细胞有很强的 抑制力。有关它的研究，国内外已有很多报道，涉及到生化、药理、临床等各方面，阐 明了它的结构、功能以及构效关系，对中药创新药的研制等方面具有十分重要的意义， 而目前我国在这方面的研究尚处于起步阶段【5 j 。 1 2 6 食用菌多糖 真菌是我国天然药物和中草药资源的一个极为重要的组成部分。1 9 5 1 年美国人 r e i l l y 首次发现担子菌有抑瘤活性。在真菌多糖方面，日本研究的较深入，并且有数种 多糖应用于临床。截至1 9 7 7 年，在专利文献中可查到，人们已试验筛选出1 6 9 种担子菌 的多糖有抗癌活性。如今国内研究比较多的有：香菇多糖、灰树花多糖、茯苓多糖、奇 果菌多糖、灵芝多糖以及木耳多糖、虫草多糖、酵母葡聚糖等等1 2 “。 多糖普遍存在于动物、植物和食用菌等的组织细胞中。主要由多个单糖分子以苷键 结合的方式而形成大分子化合物，如植物中的淀粉、纤维素等：动物中的糖原、粘多糖： 食用菌中的云芝多糖、灵芝多糖、香菇多糖、木耳多糖等。一般存在于动物或植物中的 多糖没有生理活性，因为淀粉类多糖多以q l ，4 苷键连接为链状结构，纤维素多糖是以 b 一1 ，4 苷键连接为绳索状长链，结构单位均为d 一葡萄糖。存在于食用菌中的多糖大多具 5 第一章文献综述 有生理活性，这与其特殊结构密不可分1 2 8 1 ，主要是由于这些多糖多数是出b 1 ，3 葡萄糖 苷键结合的直链与b 一1 ，6 葡萄糖苷键结合的支链组成，并具有立体构型的螺旋结构体。 食用菌多糖在提高机体免疫力及抑瘤活性 2 9 】方面显示出重要的作用，有些制品在临 床上已有相当疗效，应用亦愈加广泛，从而为抗癌药物的寻找展示了良好的前景。在抗 衰老、解除机体疲劳等方面的研究同样揭示出其作用。大型食用真菌多糖类物质的研究 不仅有着重要的学术价值，还有着良好的经济开发前景 6 j 。很多研究表明【3 0 】，存在于灵 芝、香菇、金针菇、银耳、黑木耳、猴头菇等大型食用或药用真菌中的某些多糖组分， 具有增强机体抗感染【3 1 、抗病毒、抗肿瘤【3 3 35 1 、降胆固醇、降血压、抗辐射及抗衰 老的作用，还可提高机体免疫力 3 6 】。有文献报道【3 7 】，食用菌多糖具有清除超氧自由基 及o h 自由基的能力，糖蛋白中的蛋白质有助于增强多糖清除自由基的能力。 这些多糖由于具备比从动物血液中提取的免疫球蛋白更大的实用性而日益受到人 们的重视。因此，食用菌多糖由于其结构特殊，因而具有很好的生理活性，它对人体保 健和治病有着非常重要的作用，已成为当前的研究和开发应用的热门。专家预言，本世 纪将是食用菌多糖深入研究和广泛应用的时代。 1 3 多糖的研究进展 1 3 1 多糖的提取 天然多糖主要是从自然界中的植物或农副产品中提取分离得到的，常用的提取方法 有：热水浸提法 3 8 4 1 、酸浸提法h 2 棚 、碱浸提法 4 州6 1 、还有酶法等，其中前三种为化 学方法，酶法为生物方法。 热水浸提法是多糖提取的传统方法，用水作为溶剂浸取多糖，在恒温水浴上回流浸 提，过滤后得滤液和滤渣。滤渣反复浸取几次合并滤液，经浓缩、乙醇醇沉、离心，干 燥即得到粗多糖。 酸浸提法的浸提过程是在酸性条件下完成的，向原料中加一定量酸性溶液，然后在 恒温水浴中浸提一定时间，用碱中和后过滤，滤渣用酸液反复浸提几次，最后合并滤液， 浓缩、醇沉、分离、洗涤脱水、干燥得粗多糖。 碱浸提法是向原料中加一定量的碱溶液，然后在恒温水浴中浸提一定时间，用酸中 和后过滤，滤渣用碱液反复浸提几次，最后合并滤液，浓缩、用乙醇沉淀、分离、洗涤 脱水、干燥即得粗多糖。 6 第一章文献综述 酸浸提法和碱浸提法虽然也可以提高多糖得率，缩短提取时闻，但由于酸、碱在 浓度因子难以控制的情况下，容易使部分多糖发生水解，从而破坏多糖的活性结构，降 低多糖得率。而且酸提取法会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用；碱法提取后 的溶液粘度大，过滤困难。 酶法从原理上不同于前面三种方法，该法是向溶液中加入一定量的酶制剂，然后再 从溶液中浸提多糖。将原料和水按一定比例配成溶液，调整适当的p h 值，加入酶制剂， 置于恒温水浴中酶解一定时间，然后过滤、浓缩、醇沉、离心、洗涤脱水，干燥即得粗 多糖。 相对于酸碱浸提法及热水浸提法，采用酶法提取多糖具有条件温和、杂质易除和提 高得率等优点。酶法浸提全程分为酶促反应和高温浸提两个阶段。第一阶段主要作用 是酶解细胞表面结构及胞间连接物，并伴有少量多糖溶出。第二阶段通过提高温度后， 既具有灭酶作用，同时使可溶于热水的胞内多糖溶出率增加。在酶法工艺中两个阶段同 样重要。 s t e f a nf r e i m u n d 【4 ”等入采用酶法从酿酒酵母细胞壁中提取出了l ，3 6 一d 葡聚糖，避免 了酸、碱对多糖的降解作用。此外，还有人采用超声波萃取法 48 提取得到多糖，取得良 好效果。 1 32 多糖的分离 粗多糖中往往混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质，必须分别除去。 1 32 1 除蛋白质【4 9 1 s e v a g 法：根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，用氯仿与戊醇( 或正丁醇) 的混合物剧烈振摇，蛋白质与氯仿戊醇( 正丁醇) 生成凝胶物质，离心分离，分去水层和 溶剂层交界处的变性蛋白质。此法条件温和，处理后多糖性质不变，缺点是效率不高， 一般要重复5 次左右方能去尽蛋白质。 三氟三氯乙烷法：向多糖溶液中加入定比例的三氟三氯乙烷，在低温下搅拌一段 时间，离心得上层水层，水层继续用上述方法处理几次，即得无蛋白质的多糖溶液。此 法效率高，但溶剂沸点较低，易挥发，不宜大量应用。 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加三氯醋酸溶液，直至溶液不再继续混浊为止，低 温放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖溶液。 7 第一章文献综述 1 3 2 2 除色素 活性炭吸附法：多糖溶液中加入适量活性炭，水浴保温，搅拌一段时间，去除活性 炭。活性炭是最常用的脱色方法，它依靠范德华力将色素吸附到活性炭表面，活性炭的 颗粒愈小，其表面积愈大，吸附能力愈强。活性炭无毒、无味，具有脱色、脱臭的作用， 可以反复使用。对于动物、植物等提取得到的天然多糖，一般情况下，避免用活性炭脱 色处理，因为活性炭会吸附多糖，造成多糖损失。 树脂脱色法：利用树脂脱色是新发展起来的一种脱色方法，其脱色效果好，适合于 处理量小、粘度小、色素含量较小的体系，否则易造成树脂污染，再生困难。离子交换 树脂脱色主要通过吸附作用和对带电色素分子的交换作用来实现。 氧化脱色法：主要采用过氧化氢作为氧化剂。过氧化氢是一种无色无臭的液体，可 与水以任何比例混合，它氧化性较强，其脱色作用是依靠它在水溶液中电离出的过氧氢 根离子h 0 2 去进攻色素的结果。 1 3 23 除杂质 通过透析除去低聚糖等小分子杂质。 1 3 3 多糖的纯化 1 3 。3 1 分部沉淀法 此法是利用生化物质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异而将其分离。沉淀的多 糖是由分子量大小不等的多糖组分组成，分子量大到十几万，小到几千，用不同浓度乙 醇可将不同分子量的多糖组分分离开来，乙醇浓度越低，沉淀多糖的分子量越大，乙醇 浓度越高，沉淀多糖的分子量越小m5 ”。常用的沉淀剂有甲醇、乙醇和丙酮。 1 3 3 2 季胺盐沉淀法 一些多糖的沉淀剂，除了较多地使用乙醇外，十六烷基三甲基季胺盐的溴化物 ( c t a b ) ，十六烷基氯化吡啶( c p c ) 等阳离子表面活性剂也是用于分离粘多糖的有效 沉淀剂。 多糖分子中可电离基团有羟基及硫酸基，立体结构位置及硫酸基相连的基团不一， 不同的羟基及硫酸基的p k 值又有微小不同。多糖分子上的阴离子能与十六烷基氯化吡啶 季胺基上的阳离子生成不溶于水的盐，但可以溶于某种浓度的无机盐溶液中( 临界电解 8 第一章文献综述 质浓度) ，利用这种性质可达到纯化的目的。用季铵化合物沉淀多糖，是分级分离复杂 粘多糖混合物的最有用的方法之一。 1 33 3 盐析法 根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质，加入不同盐析剂使不同多糖 逐步析出。常用的盐析剂有硫酸铵、氯化钠、氯化钾、醋酸钾等。 1 33 4 金属络合物法 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。 133 5 柱层析 纤维素柱层析；常用不同浓度乙醇水溶液由高丽低进行洗脱，将各种多糖分离_ 了丁来。 纤维素离子交换柱层析：纤维素离子交换剂又称为离子交换纤维素，是以微晶纤维 素为基质，再引入电荷基团构成的。根据引入电荷基团的性质，也可分为强酸性、弱酸 性、强碱性及弱碱性离子交换剂。多糖在柱上的吸附力与其结构有关。吸附力一般随分 子中酸性基团的增加而增大。对于线性分子，分子量大的比小的易吸附，直链多糖比分 支多糖易吸附5 m 。由于多糖具有酸性基团如糖醛酸羧基，在溶液中以聚阴离子的形式存 在，所以可用不同的阴离子交换剂进行交换吸附，常用的交换剂为d e a e 纤维素、 e c t e o l a 纤维素和羧甲基纤维素。此法适合于分离各种酸性、中性多糖及粘多糖，用 不同离子强度的洗脱液将各种多糖依次洗脱。另外，杂质还能吸附于柱上端而达到部分 纯化。 凝胶柱层析：常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶，以及d e a e s e p h a d e x 等，展 开剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，其离子强度不应低于0 0 2 m o l l 。 1 4 黑木耳 1 4 1 黑木耳的营养成分 据史料记载，人类最早栽培的蕈菌是木耳，1 0 0 0 多年前起源于中国【5 3 。 黑木耳别名为木耳，黑木耳，细木耳等，属真菌门、担子菌亚门、担子菌纲，本耳 目，木耳科，木耳属【5 4 1 。木耳属又分为黑木耳、皱木耳、琥珀褐木耳、角质木耳、毡盖 木耳、盾形木耳、美饰木耳、薄木耳、毛木耳等多种。我国人工栽培的种类主要为黑木 9 第一章文献综述 耳、褐毛木耳两种。 黑木耳为我国珍贵的药用和食用的胶质真菌，最早见于神农本草经，历代中医 药典藉多有记述，明代李时珍本草纲目记载黑木耳“益气不饥，轻身强志，断谷治 痔”，具有凉血、活血、益气强身等功效。现代研究也表明：它对人体消化系统具有良 好的消毒作用，能清肺润肺，减少血液凝块，缓和冠状动脉粥样硬化及降低血栓等功能。 黑木耳营养丰富，是世界公认的保健食品，从营养学分析【5 5 1 ，木耳含有较高蛋白质 ”叫及氨基酸，高铁、高钙，富含糖类与多种维生素和微量元素等，被誉为“素中之肉”， 是营养价值很高的保健食用菌【5 7 】。黑木耳中铁的含量比肉类高1 0 0 倍，钙的含量是肉类 的3 0 7 0 倍。黑木耳的高铁、高钙使其成为婴幼儿及体弱病患者补铁、补钙的最佳食品。 黑木耳的矿物质含量比一般米、面、蔬菜高4 1 0 倍。因其含有丰富的胶质，对消化系 统有良好的润滑作用，多为采矿、纺织、理发等特殊行业人员食用。据现代资料表明， 黑木耳多糖具有调节人的生理活性、抗多种疾病作用，作为黑色食品，它将越来越受到 世界各国人们的青睐。随着对它研究的深入，有关黑木耳的特殊保健作用，也将逐步为 人们所认识p 。 关于木耳中其他成分的报道，还有麦角甾醇、二氢麦角甾醇、卵磷脂、脑磷脂和鞘 磷脂等 5 9 】。 1 4 2 黑木耳多糖的保健功效 黑木耳是我国珍贵的药用和食用的胶质真菌。黑木耳多糖为黑木耳的重要活性成 分，生物活性越来越受到重视。 m a r ks h a m t s y a n 6 0 】等人证明了木耳多糖具有显著的抗癌作用。水溶性黑木耳多糖具 有明显的抗瘤作用，碱溶性黑木耳多糖也有一定的抗肿瘤作用，而碱不溶性黑木耳多糖 则无抗肿瘤作用，这提示了水溶性黑木耳多糖是一种很有前途的癌症辅助治疗药物。 实验研究表明，黑木耳多糖具有明显的抗凝血作用。s e o nj o oy o o n1 6 1 j 等人从黑木 耳中分离得到具有抗凝血作用的多糖，其抗凝血机理可能是由于葡萄糖醛酸是抗凝血作 用中不可缺少的部分，因此黑木耳多糖可以作为合成抗凝血、抗血栓物的原料，用于治 疗脑梗塞。实验证明，木耳多糖有显著的降低胆固醇作用 6 2 1 。p e t e r c k c h e u n g 6 3 1 用试 验证明，黑木耳能有效降低血浆总胆固醇浓度。黑木耳多糖的降血脂作用确切，尤其是 实验性高血脂f 6 4 。木耳多糖、银耳多糖和银耳孢子多糖具有显著降血脂、降低血液粘度 的作用，黑木耳多糖可缓解动脉粥样硬化。 1 0 第一章文献综述 有研究报道，黑木耳多糖有明显的增强体液免疫和细胞免疫功能。陈志强【6 5 】等人从 木耳中分离纯化得到木耳多糖，并证明了产物具有抗辐射作用。 对小鼠血糖的影响实验表明，黑木耳多糖对糖尿病小鼠血糖有降低作用【6 6 。6 ”。 黑木耳多糖可明显清除超氧阴离子，具有较强的体外抑制0 2 一生成、抗氧化及保 护线粒体作用。因此具有明显的延缓衰老作用，是较理想的抗衰老的药品。 以黑木耳多糖与铁作用形成了稳定的配合物a p c 。a p c i 匏被食物中的还原剂还原， 尔后被体内吸收，效用研究表明，a p c 在人体内维持较高浓度时间长，有利于机体吸收【6 。 黑木耳多糖对人类的健康有特殊疗效和保健作用，可作为许多药物和保健品的有效 成分，而且对人体无毒副作用，所以天然黑木耳多糖的提取和应用领域将具有广阔的开 发前景。随着研究技术方法的不断发展，人们对黑木耳多糖的重要生物活性和应用价值 必将有更加全面和深入的认识。 14 3 黑木耳多糖研究进展 1 9 8 2 年所分离的黑木耳多糖含量约7 1 6 9 1 ，后经夏尔宁7 田等采用凝胶柱层析技术再反 复精制，得多糖纯品。分子量为1 5 0 0 0 ，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖 和葡萄糖醛酸组成，摩尔比为0 1 4 ：0 1 4 5 ：0 1 7 ：1 0 0 ：0 6 1 ：o 4 4 ，并证明木耳多糖是黑木 耳的主要活性成分。 日本东北大学的三嘉喜等人曾研究过其多糖结构与抗肿瘤活性，据报道，他们从黑 木耳子实体中分离出一种酸性杂多糖和两种6 葡聚糖。酸性杂多糖是由木糖、甘露糖、 葡萄糖和葡萄糖醛酸等组成，其摩尔比为1 ：4 1 ：1 3 ：1 3 ，其主链是由( 1 3 ) 键连接的 甘露聚糖，通过c 2 或c 6 分支点连接有木糖、葡萄糖或葡萄糖醛酸作为侧链。两种p 一葡 聚糖中有一种能溶于水，是由b ( 1 3 ) 键连接的葡聚糖作为主链，平均每3 个残基通 过分支点连接有一个葡萄糖残基侧链。这种多糖对小鼠移植性肉瘤s 1 8 0 有很强的抑制 活性。另一种虽然也具有b ( 1 3 ) 葡聚糖主链和c 6 位单个残基，但因它具有高度分支 的侧链，故基本上没有抑制肿瘤活性【7 “。 l i n az h a n g 删等人从黑木耳中分离得到三种d 葡聚糖( a 、c 、e ) 及两种酸性多糖 ( d 、b ) ，并对其结构及分子量分布进行了分析测定。证实了其中的三种葡聚糖主链由 葡聚糖残基以b 1 ，3 键连接而成。其中两种酸性多糖由d 木糖、d 甘露糖、d 半乳糖、 d 一葡萄糖、d 葡萄糖醛酸组成。五种多糖的平均分子量分别为：1 1 7 1 0 4 、1 4 4 x 1 0 4 、 2 0 0 1 0 4 、3 0 x 1 0 4 、5 0 1 0 4 。 第一章文献综述 1 5 本文的主要研究内容 从黑木耳中提取的生物活性多糖可作为口服液和其它功能性食品有效成分。传统木 耳多糖提取采用水体系，木耳细胞粗大、壁厚，多糖难以从胞内扩散出来，所以需要多 次浸提，操作时间长，收率低。酸浸提法和碱浸提法由于酸、碱在浓度难以控制的情况 下，容易使部分多糖发生水解，降低多糖得率。酶法提取可以使工艺操作变得简易、省 时，提高多糖得率。因此本文采取了酶法与水提相结合的方法来提取黑木耳多糖，使提 取率大为提高，对于木耳的综合开发利用及提高其经济价值具有实际意义。 本文以黑龙江大兴安岭* 安有机食品有限公司提供的黑木耳为原料，采用纤维素酶 及果胶酶进行提取，在单酶水解的基础上确定了双酶水解工艺参数，并对工艺条件进行 优化，确定了双酶酶解最佳工艺条件。 对最佳条件下得到的粗多糖进行了精制，分别考察了几种脱色及脱蛋白方法的作用 效果，确定了最优的精制工艺。 分别采用了十六烷基氯化吡啶沉淀法、离子交换纤维素柱层析法和葡聚糖凝胶柱层 析法对精制处理后的多糖进行了分离纯化，得到了几种木耳多糖组分。 第二章材料与方法 2 1 实验材料 第二章材料与方法 2 1 1 实验原料 天然野生黑木耳黑龙江省大兴安岭兴安有机食品有限公司 2 1 2 酶制剂 a 果胶酶 b 纤维素酶 c 中性蛋白酶 d 木瓜蛋白酶 21 3 试剂与药品 苯酚 葡萄糖 浓硫酸 乙醇( 9 5 ) 无水乙醇 磷酸氢二钠 柠檬酸 果胶 硫代硫酸钠 无水碳酸钠 碘 碘化钾 可溶性淀粉 伊e c t i n e x ) ( c e l l u a s e ) f n e u t r a s e ) ( p a p a i n ) 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 优级纯 分析纯 天津市佳益酶制剂新技术有限公司 上海伯奥生物试剂厂 广西南宁庞博生物工程有限公司 广西南宁庞博生物工程有限公司 沈阳市试剂五厂 东北制药总厂一分厂 公主岭市化学试剂厂 天津市化学试剂四厂 天津市化学试剂四厂 广东金砂化工厂 北京化工厂 浙江衢州汇龙果胶有限公司 长春市化学试剂厂 天津市塘沽化学试剂厂 蓬莱高成海藻工业有限公司 北京化工厂 中国彭县军乐化工厂 第二章材料与方法 酒石酸钾钠分析纯 氢氧化钠分析纯 醋酸 分析纯 醋酸钠分析纯 丙三醇分析纯 亚硫酸钠分析纯 重铬酸钾分析纯 盐酸分析纯 丙酮 分析纯 磷酸 分析纯 牛血清清蛋白电泳纯 考马斯亮蓝g 2 5 0s t a n d a r df l u k a 过氧化氢分析纯 2 一羟基，3 ，5 二硝基苯甲酸化学纯 氯仿 分析纯 异戊醇分析纯 s e p h a d e xg 一1 0 0 d e a ee e l l u d o s ed e 5 2 2 14 主要仪器与设备 旋转蒸发器 循环水式真空泵 数显恒温水浴锅 电子分析天平 冰箱 电热鼓风干燥箱 离心机 分光光度计 粉碎机 台式保温培养箱 r e 5 2 a s h z d ( i i i ) h h 4 a b 2 0 4 _ n b d b 2 h h b 1 1 5 0 0 l d 4 2 7 2 2 s i f m 一1 0 0 p w 1 0 0 0 2 武汉化学试剂厂 沈阳市亚东化学试剂厂 沈阳市联邦试剂厂 沈阳市第三十六中学化工厂 大连无机化工厂 天津市塘沽新新化工厂 天津市天大化工实验厂 公主岭市化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 沈阳市联邦试剂厂 北京红兴化学试齐分装厂 上海化学试剂厂 丹东市塑料助剂一厂 北京金龙化学试剂有限公司 上海化学试剂公司 天津化学试剂有限公司 p h a r m a c i a w b a t m a n 上海亚荣生化仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 江苏省金坛荣华仪器制造有限公司 m e t t l e r - t o l e d oi n s t r l t d 海尔集团电冰箱厂 天津实验仪器厂 北京医用离心机厂 上海第三分析仪器厂 日本1 w a t a n i 重庆试验设备厂 第二章材料与方法 数显电热培养箱 旋涡混合器 自动电位滴定计 滴定装置 电子恒速搅拌器 甘汞电极 电子调温万用电炉 自动部份收集器 2 2 实验方法 2 2 1 原料预处理 3 0 3 3 a x w 8 0 a z d 一2 z d 1 g s l 2 2 3 2 c 2 0 0 0 w b s z 1 0 0 上海阳光实验仪器有限公司 上海精科实业有限公司 上海第二分析仪器厂 上海第二分析仪器厂 上海医械专机厂 江苏姜堰华扬水准仪器厂 龙口市先科仪器公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 剔除发霉、变质等不合格木耳及木屑、砂石、头发等杂质。将干木耳粉碎，过4 0 目筛，原料粉碎粒度越小越有利于多糖的提取。 2 22 提取工艺 称取一定量经过预处理的木耳，溶于一