（食品科学专业论文）酪蛋白非磷肽的制备及其ACE抑制活性的研究.pdf

摘要 摘要 酪蛋白中富含多种生物活性肽，酪蛋白磷酸肽( c p p s ) 是酪蛋白生物活性肽中被研究 和开发最早的一种，具有结合矿物质的作用。一般在工业化生产c p p s 过程中，有近8 0 的蛋白质副产物酪蛋白非磷肽( c n p p s ) 未被合理利用，作为饲料或废物弃去。本论 文中，在制备c p p s 的同时回收其副产物c n p p s ，并研究了大孔吸附树脂对它的脱盐效果 及其中的血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制肽，为c n p p s 的丌发利用提供了理论基础。 论文首先研究了a l c a l a s e 水解酪蛋白生产c p p s 和c n p p s 的工艺条件，实验结果表明， a l c a l a s e 对酪蛋白作用的最佳条件是：底物浓度5 ( w v ) ，加酶量o 0 3m l g o 蛋白质，温 度6 0 。c ，p h 值9 0 。乙醇的浓度和酪蛋白的水解度( d h ) 对c p p s 和c n p p s 的得率以及 c p p s 的n p ( 摩尔比) 均有影响。当乙醇浓度7 0 ( v v ) ，d h 值达到1 8 时，c p p s 释放并 沉淀完全，得率达到最高，为2 3 9 4 ，n p ( 摩尔比) 是9 6 1 ，c n p p s 得率为7 6 0 6 。 c p p s 和c n p p s 的相对分子质量分布在2 0 0 - 5 0 0 0 之间，其中低于7 0 0 的肽含量最高，分别 为6 1 5 2 和6 7 2 6 。c n p p s 中的疏水性氨基酸含量远高于c p p s 。 由于在酪蛋白水解以及c p p s 的沉淀过程中引入了大量无机盐，导致c n p p s 产品的灰 份含量高达2 0 8 8 ，影响了对它活性的研究，更影响了它的品质，必须去除c n p p s 中的 无机盐，所以论文研究了大孔吸附树脂对c n p p s 的脱盐效果。使用d a 2 0 1 c 型大孔树脂 对c n p p s 脱盐简便可行，6 0m g m l 1 的c n p p s 溶液上柱，用紫外检测器检测流出液的 a 2 2 0 帅，以a 2 2 一0 5 为透过点，水洗后用7 0 ( v v ) 乙醇解吸，流速为1 4 0 m l h 1 。c n p p s 经大孔树脂处理后，脱盐率为9 5 4 0 ， a c e 抑制活性的i c 5 0 从o 3 5m g m l 以降低到0 2 1 m g m l ，而且多肽的回收率可以达到8 5 以上，同肘该过程还伴随着明显的纯化作用。 经体外消化实验发现，c n p p s 经消化道酶作用后a c e 抑制活性有所提高，说明在消化酶 作用下，c n p p s 中部分肽键被打断，成为更短的肽，短肽有益于抑制a c e 活性。肽谱分 析显示出c n p p s 中肽的种类和组成非常复杂，这使得a c e 抑制肽的分离纯化和结构鉴定 成为一项比较困难但很有意义的工作。 为了充分了解c n p p s 作为降血压功能因子的潜力，本论文利用凝胶过滤色谱和 r p h p l c 从c n p p s 中分离得到一种a c e 抑制肽c n p p s 8 2 。采用l c e s i m s 结合氨基酸 分析证明c n p p s 8 ，2 相对分子质量为2 9 1 1 ，推测其一级结构氨基酸序列为s e r t i p 。测定 该组分的a c e 抑制活性，其i c 5 0 为9 2 8 pm 0 1 l 1 。 关键词：酪蛋白；酪蛋白非磷肽；大孔吸附树脂；酶水解；a c e 抑制肽 a b s t r a c t a b s t r a c t t h e r ea r em a n yb i o a c t i v ep e p t i d e si nc a s e i n ，a m o n gw h i c hc a s e i np h o s p h o p e p t i d e s ( c p p s ) w a sr e s e a r c h e da n dd e v e l o p e de a r l i e r i nt h ec o u r s eo ft h ei n d u s t r i a l i z i n gp r o d u c t i o no fc p p s ， n e a r l y8 0 c a s e i nb y p r o d u c t - c a s e i nn o n - p h o s p h o p e p t i d e s ( c n p p s ) c a l ln o tb eu t i l i z e dw i t h r e a s o n ，o n l ys e r v i n ga sf e e d s t u f fa n dw a s t e i nt h i sd i s s e r t a t i o n c n p p sw a sr e c o v e r e di nt h e s a m et i m eo fc p p sp r e p a r a t i o n m e a n w h i l e ，t h ee f f e c to fd e s a l t i n gc n p p su s i n gm a c r o p o r o u s a d s o r p t i o nr e s i n ，t h ea n g i o t e n s i n - c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t o r ya c t i v i t yo fc n p p sw e r e r e s e a r c h e d ，w h i c hw o u l dg i v et h et h e o r e t i c a lf o u n d a t i o n sf o ru t i l i z a t i o no fc n p p s i n i t i a l l y ，t h ec o n d i t i o n so fc p p sa n dc n p p sp r e p a r a t i o nu s i n ga l c a l a s e2 4lw e r e r e s e a r c h e d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o ra l c a l a s e2 4l h v d r o l y s i sw e r e s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o no f5 ( w v ) ，t h er a t i oo fe n z y m eo f0 0 3m l g p r o t e i n ，t e m p e r a t u r eo f 6 0 a n dp h9 0 t h er e c o v e r yo fc p p sa n dc n p p sa n dn p ( m o l m 0 1 ) o fc p p sw e r ea 1 1 i n f l u e n c e db ya l c o h o lc o n c e n t r a t i o na n dt h ed ho fc a s e i n c p p sw a sc o m p l e t e l yr e l e a s e da n d p r e c i p i t a t e de n t i r e l yw i t hd h18 a n da l c o h o lc o n c e n t r a t i o no f7 0 ( v v ) r e s p e c t i v e l y t h e r e c o v e r yo fc p p sw a s2 3 9 4 ；n p ( m o l m 0 1 ) o fc p p sw a s9 6 1 ；t h er e c o v e r yo fc n p p sw a s 7 6 0 6 t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to fc p p sa n dc n p p sw e r ei nt h er a n g eo f2 0 0 5 0 0 0 a n d t h ep e p t i d e sw i t hr e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h tu n d e r7 0 0r e p r e s e n t e d61 5 2 a n d6 7 2 6 r e s p e c t i v e l y c n p p sc o n t a i n e dm o r eh y d r o p h o b i ca m i n oa c i dt h a nc p p s b e c a u s eal o to fs a l t sw e r ei n t r o d u c e di n t oc n p p si nt h ep r o c e s so fc a s e i nh y d r o l y s i sa n d c p p sp r e c i p i t a t i o n , t h ec o n t e n to fa s hw a sa sh i g ha s2 0 8 8 蹦sc o u l di m p a c tt h er e s e a r c ho f c n p p sa c t i v i t i e sa n di t sq u a l i t y 。i tw a st h e nn e c e s s a r yt or e m o v et h es a l t sf r o mc n p p s t h e e f f e c to fd e s a l i n a t i o no fa 岬p sw a sr e s e a r c h e d i tw a ss i m p l ea n da v a i l a b l et od e s a l tc n p p s u s i n gd a 2 0 1 一cm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n 6 0m g m l _ c n p p ss o l u t i o nw a sc a r r i e do u tt o d e s a l tu s i n gad a 2 01 一cc o l u m n , t h eo u t f l o ww a sd e t e c t e db yu l t r a v i o l e td e t e c t o ri nt h e w a v e l e n g t ho f2 2 0m n ，r e g a r d e da 2 2 0 = 0 0 5a st h et h r o u g hp o i n t t h e nt h ec o l u m nw a se l u t e d u s i n gw a t e r ，a n dc n p p sw e r ed e s o r b e du s i n g7 0 ( v e t h a n 0 1 h ed e s a l t i n gr a t i oo fc n p p s r e a c h e d9 5 4 0 a n dt l l er e c o v e r yo fp e p t i d e sw a sm o r et h a n8 5 m o r e o v e r a c ei n h i b i t o r y a c t i v i t yw a se n h a n c e da ss e e nf r o mi t si c 5 0v a l u ed e c r e a s e df r o m0 3 5m g m l t o0 2lm g m l 一 f r o md i g e s t i v ee x p e r i m e n ti nv i t r o ，i tc o u l db ef o u n dt h a ta c e i n h i b i t o r ya c t i v i t yo fc n p p s i n c r e a s e da f t e rb e i n gd i g e s t e db yd i g e s t i v ee n z y m e s b e c a u s eo ft h ee f f e c to fd i g e s t i v ee n z y m e s ， c n p p sw e r eh y d r o l y z e dt os m a l l e rp e p t i d e s ，w h i c hw e r em o r ee f f e c t i v et o w a r d sa c e i n h i b i t o r y a c t i v i t y p e p t i d e sm a ps h o w e dt h a tt h ec o m p o n e n t so fc n p p sw e r ec o m p l i c a t e d , s os e p a r a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o nap u r ea c ei n h i b i t o r yp e p t i d eb e c a m ead i f f i c u l tb u tu s e f u lw o r k i no r d e rt or e a l i z et h ep o t e n t i a le f f e c to fc n p p st od e c r e a s eb l o o dp r e s s u r e ，t h i s d i s s e r t a t i o nm a n a g e dt oi s o l a t eap u r ec o m p o n e n tm a r k e da sc n p p s 一8 2w i t hh i 幽e s ta c e i n h i b i t i n ga c t i v i t yf r o mc n p p sb yg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h ya n ds e m i p r e p a r a t i v er e v e r s e d p h a s eh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p h p l c ) ，n l ei d e n t i f i c a t i o nb ya m i n oa c i d c o m p o s i t i o na n a l y s i sa n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y | e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y ( l c e s i - m s ) s h o w e dt h a tt h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h t so fc n p p s 8 2w a s2 91 1 i t sa m i n o a c i ds e q u e n c ew a s s e r - t r pp r o b a b l e l y ，a n di t si c s 0 ( a c ei n h i b i t i n ga c t i v i t y ) w a s9 2 8ut o o l l i i a b s t r a c t k e yw o r d s ：c a s e i n ，c a s e i nn o n - p h o s p h o p e p t i d e s ，m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i n ，e n z y m a t i c h y d r o l y s i s ，a n g i o t e n s i n - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 第一章绪论 第一章绪论 自然界赋予很多食物具有保健和治疗的功能。由于我们在分子水平上对食物成分进行 分析和测试的能力不断提高，因此，对食物的分子结构与功能的关系及它们对人体的作用 已经了解得越来越多。生物技术的发展以及在食品加工中的应用导致越来越多的保健品的 出现，即功能性食品。在西欧、日本和美国已有各种商品化产品。其中，蛋白质除营养功 能外的其它功能特性及应用是近年来研究的热点。蛋白质是人体所需的重要营养素之一， 但是即使是非常易于降解的蛋白质在动物肠道内消化时，也有相当数量不可降解片段( 肽) 形成。近年来的研究发现非单一氨基酸形式的小肽类( 2 7 个氨基酸) ，在人体内的代谢 方面具有重要的生理功能，它在体内的消化吸收明显优于单一氨基酸。这些肽依其来源和 结构不同，具有多种生物活性。目前研究最广泛的生物活性肽来源于酪蛋白。 1 1 酪蛋白与其酶解产物生物活性多肽 1 1 1 酪蛋白的来源、成分和结构 酪蛋白( c a s e i n ，c n ) 俗名又称干酪素，是从牛乳中提取出的一种蛋白质。酪蛋白占 牛乳蛋白的8 0 8 2 ，主要包含1 酪蛋白、0 t s 2 - 酪蛋白、p 酪蛋白和k 酪蛋白四种成分，其 比例为3 4 ：8 ：3 3 ：9 。不同酪蛋白的相对分子质量在1 9 ，0 0 0 - 2 4 ，0 0 0 之间，它们的一级结构已被 精确确定。酪蛋白是典型的含磷蛋白质，磷元素与丝氨酸残基结合( s e r - p ) 以磷酸酯键的 形式存在。1 酪蛋白、啦酪蛋白和b 酪蛋白中均具有高度的磷酸化区域，含有成簇存在 的磷酸丝氨酸。例如在魄l - 酪蛋白中，集中在4 0 8 0 号的残基中；在1 3 酪蛋白中集中在n 端。 这些磷酸化的氨基酸结构对酪蛋白的性质和功能具有重要的作用【l - z 】。 酪蛋白比多数其它蛋白质的疏水性强【3 】，分子中疏水性残基所占的比例高达6 0 以上 【4 】，其中的疏水和亲水性残基分布很不均匀。l - c n 含有3 个强的疏水区域，即残基1 4 0 ， 9 肚11 0 和1 3 0 - 1 9 9 之间。a 。2 c n 是酪蛋白中最亲水的组分，在残基9 0 - 1 2 0 之间含有一个强的 疏水性羧基末端和一个较弱的疏水性段。1 3 - c n 是酪蛋白中疏水性最强的组分，除具有较强 的负电荷n 末端，其余的分子没有静电荷而富含疏水性残基，1 3 - c n 中含有明显分开的亲水 和疏水的区域范围。r - c n 中的副k c n 具有较高的疏水性p j 。酪蛋白中的亲水性区域，即磷 酸丝氨酰基集中的区域，主要是酪蛋白磷酸肽( c a s e i np h o s p h o p e p t i d e s ，c p p s ) 片段，而 疏水性区域就是酪蛋白非磷肽( c a s e i nn o n o p h o s p h o p e p f i d e s ，c n p p s ) 集中的区域。 1 1 2 酪蛋白水解物与功能性食品 酪蛋白是人类膳食蛋白的重要来源，是优质的全价蛋白。酪蛋白的基本功能是为生物 提供氨基酸和氮源。但是，很久以来人们并没有注意到酪蛋白还是生物活性肽的主要来源。 自1 9 7 9 年有人报道从喂食了牛乳酪蛋白酶解物的豚鼠的小肠中发现了具有类吗啡活性的 短肽以来，酪蛋白源生物多肽研究进展迅速，其生理功能越来越引起人们的重视，日益成 为乳品领域研究的热点。研究表明，牛乳酪蛋白的分子肽链中存在着具有多种生物活性的 片段，这些活性多肽都以非活性状态存在于蛋白质长链中，当用酶特定水解后，他们的活 性就被释放出来。到目前为止，已经发现了十几种具有重要生理功能的生物活性肽【5 j 。如： 矿物质结合肽酪蛋自磷酸肽( c a s e i np h o s p h o p e p t i d e s ) 、类吗啡肽( o p i o i dp e p t i d e s ) 、 江南大学硕士学位论文 免疫活性肽( i m m u n o p e t i d e s ) 、降血压肽( a n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e s ) 、抗血栓肽 ( a n t i t h r o m b o t i cp e p t i d e s ) 等等，见表1 。l 。酪蛋白生物活性肽因其源于天然食物蛋白以及功 能的多样性，己成为引人注目的研究热点，在膳食补充剂、保健食品及医药领域显现出很 好的发展趋势。 表1 - 1 牛乳酪蛋白酶解产生的几种生物活性因子及其生理活性 t a b 1 1as e r i e so fb i o a c t i v ep e p t i d e sd e r i v e df r o mc a s e i na n dt h e i rb i o a c t i v i t i e s 生理活性肽 蛋白前体 生理功能 酪蛋白磷酸肽 ( c a s e i np h o s p h o p e p t i d e s ) 免疫活性肽 ( 1 m m u n o p e p t i d e s ) 类吗啡肽 ( o p i o i d p e p t i d e s ) 酪激肽( c s a o k i n i n s ) 乳啡肽( l a c t o r p h i n s ) * ，p 一酪蛋白 m ，p 酪蛋白 幽，b 一酪蛋白 衅，b 酪蛋白 a 酪蛋白 促进钙、锌、铁吸收，抗蛀牙提高动物受 精能力，调节血压 激活免疫系统，特别是激活巨噬细胞和t 淋 巴细胞 增加小肠对水分和电解质的吸收增加胃肠 传送时间，抗腹泻 激活免疫系统，调节神经信息传递 和类吗啡肽功能相似 1 1 3 牛乳酪蛋白活性肽产品的开发和应用现状 c p p s 是酪蛋白生物活性肽中被研究和开发最早的一种，具有结合矿物质的作用。研究 者们陆续研究出了一些工业化生产c p p s 的方法。目前在市场上有日本的太阳株式会社、 荷兰的d m v 公司以及我国广州轻工业研究所生产的c p p s 产品。 表1 - 2c p p s 的应用 t a b 1 2p o t e n t i a la p p l i c a t i o n so fc p p s c p p s 具有促进钙吸收的作用，它的应用范围非常广泛，如快餐、糕点、奶制品、巧克 力、果汁、运动饮料、蛋黄酱和断奶食品等【3 6 1 。添加c p p s 的商品早己在日本面市，如几 童咖喱饭、液体营养食品、冷饮和口香糖等 7 1 。c p p s 可以增加牙齿牙菌斑上磷酸钙的含量， 有助于防止牙釉质的去矿化，所以它也可以添加到牙膏和漱口水中防止一些口腔疾病【8 1 们。 我国生产的黑妹牙膏率先将c p p s 应用其中。c p p s 的应用见表1 - 2 1 6 1 。 此外，酪蛋白中的阿片肽具有镇静和促进睡眠的作用，现在欧洲已推出了p n t 2 0 0 天 然镇静肽胶囊产品。 2 第一章绪论 1 2 高血压 、 高血压是最常见的心血管疾病，它不仅患病率高，而且常引起严重的心、脑、肾并发 症，是脑卒中、冠，t b 病的主要危险因素【】。高血压被称为人类健康无形的杀手，因为在高 血压的早期阶段无明显症状，少数人有头痛、头晕、心悸、四肢麻木等症状，晚期将引起 心、脑、肾等器官的病变。 1 2 1 高血压的分类 医学上，根据高血压的发病原因，将其分为原发性高血压和继发性高血压两大类。原 发性高血压是指发病原因不明的高血压，约占高血压病人的9 5 以上，大多数病人有家族 遗传史。继发性高血压是因全身性疾病引起的高血压，病因明确。最多见的是由肾脏疾病、 内分泌疾病引起，其次是脑部炎症、肿瘤、外伤引起的高血压。某些药物也可导致高血压， 如激素、避孕药、甘草浸膏等。按血压水平可分为高血压前期，一级高血压和二级高血压。 高血压前期是指收缩压在1 2 0 1 3 9m m h g 之间和( 或) 舒张压在8 0 9 0m m h g 之间；一级高 血压是指收缩压在1 4 0 , - , 1 5 9m m h g 之间和( 或) 舒张压在9 0 9 9m m h g 之间；二级高血压是 指收缩压大于或等于1 6 0m m h g 和( 或) 舒张压大于或等于1 0 0m m h g 1 2 | 。根据脑、心、肾 等重要器官损害程度，高血压可分为三期，一期高血压患者临床上无脑、心、肾等重要器 官损害的表现；二期出现脑、心、肾损害，但功能和代谢状态正常；三期有脑出血、心力 衰竭、肾功能衰竭等f l 引。 1 。2 。2 高血压的危害 高血压是心血管病的决定因素，与心血管病发生的危险性呈正相关，其主要危害是造 成脑、心、肾等重要器官的损害，脑卒中和冠心病是高血压最严重的并发症。由于血压长 期维持在较高的水平上，加重心脏负荷，早期发生代偿性左心室肥厚，随着病情发展心脏 继续扩张，最后可能发生心力衰竭及严重心律失常；长期血压升高可促进动脉粥样硬化的 形成，尤其是冠状动脉硬化的发展，也可使小动脉硬化易于破裂出血或痉挛而导致脑血栓 的形成。肾脏入球和出球小动脉痉挛、硬化、退变导致肾脏缺血、缺氧，肾实质纤维化。 高血压晚期多伴有进行性肾功能减退，同时血压长期升高使得视网膜动脉发生玻璃样变 化。随着人们生活水平的不断提高，平均寿命不断延长，社会逐步步入老年化，高血压的 患病率也逐步上升【l 钔。因此治疗和防治高血压病是当今社会研究的一个热门课题。 1 3a c e 与高血压 1 3 1a c e 血管紧张素转换酶( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m e ，a c e ) 是一种含锌的二肽羧肽酶【l 5 1 ， 存在于肺、肾、脑、眼球、小肠、胎盘等组织的血管内皮细胞或上皮细胞i 睁1 7 】及血浆、尿 等体液中，正常情况下以肺组织含量最高1 8 】。a c e 也是一种血管内膜细胞核膜糖蛋白【1 9 】， 人肺组织和血清q b a c e 相对分子质量为1 4 0 ，0 0 0 1 5 0 ，0 4 0 1 2 0 】。该酶能被金属鳌合剂、重金属 盐和特定肽类所抑制。最有效的抑制剂是e d t a ，溴化镉、血管紧张素转化酶i i 舒缓激肽 等【2 1 1 。已证实a c e 有较宽的底物专一性，除作用于血管紧张素i 外，还与含不同c 末端氨 基酸的肽底物起反应，如舒缓激肽、p 物质、脑啡肽、l h r h ( 促黄体生成素释放激素) 等。 但该酶仍具有肽键专一性，需要阴离子催化，其中氯离子是最有效的激活剂。a c e 虽然有 3 江南大学硕士学位论文 较宽的底物，、但最重要的天然底物是血管紧张素i 和舒缓激肽，a c e 对它们的作用都产生 血管收缩活性，引起血压升高 2 2 j 。 1 3 2a c e 对血压的调节作用 a c e 在人体肾素血管紧张素系统( r e n i na n g i o t e n s i ns y s t e m ，m s ) 和激肽释放酶一激肽 系统( k a l l i k r e i n k i n i ns y s t e m ，k k s ) 中，对血压调节起着重要的作用，见图1 1 。r a s 系统是 体内重要的血压调控系统。人体的肾脏可以分泌一种特异性的蛋白酶，即肾素，肾素能将 血管紧张素原水解释放出血管紧张素i ，血管紧张素i 是a c e 的底物，通过a c e 作用能使其 从c 末端去掉h i s l e u 生成血管紧张素i i ( 八肽d r v y i h p f ) 1 2 孓2 4 】。血管紧张素i i ，是肾素 血管紧张素系统中最强的血管收缩剂，它作用于血管壁上的受体使周围小动脉、血管平滑 肌收缩，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对n 矿，k + 的重吸收，引起钠贮量和血容量 的增加，使血压升高。激肽释放酶。激肽系统中的激肽如舒缓激肽的主要作用是扩张毛细血 管和增加其通透性，达到舒张血管的目的，使血压下降。而a c e 在该系统中，能作用于舒 缓激肽使其失去c 末端的p h e a r g 或s e r p r o ，从而使激肽失活，引起血压升高【2 5 】。r a s 和k k s 在血压调节方面是一对相互拮抗的体系，其平衡协调对维持正常血压有重要作用，这两者 的平衡失调被认为是高血压发病的重要因素之一。a c e 在这两者系统中起重要作用，a c e 活力升高破坏了正常体液中升压和降压体系的平衡，使得血管紧张素i i 生成过多，而体系 中扩张血管物质舒缓激肽和前列腺素合成减少，此三种因素共同存在使血压升高。抑制 a c e 活性对降低血压有积极的影响，因而研究开发有效的a c e 抑制剂引起人们极大的关注 f 2 2 ，2 6 1 。 圆圆 血管紧张素原 激肽原 卜- 冁涨辙酶叫 血管紧张素i激肽 卜觚上 血管紧张素i i 无活性片断 血压升高 图1 - 1a c e 对血压的调节作用 f i g 1 - 1t h er e g u l a t i o na c t i o no fa c eo nt h eb l o o dp r e s s u r e 1 4a c e 抑制肤 食品蛋白质经消化产生的肽类除了具有营养作用外，还具有多种生物活性，包括阿片 肽和阿片拮抗肽活性及免疫调节、抗血压、抗血栓、抗菌抗病毒、促进矿质元素吸收、防 止腹泻等作用【2 7 - 2 8 。其中a c e 抑制肽是最重要的一种生物活性肽，它的主要作用是对原发 性高血压人群具有降压作用。但严格上区分，a c e 抑制肽和降血压肽并不完全一样，降血 压肽强调对人体的作用，能够使高血压患者的血压降低，而a c e 抑制肽只是在体外对a c e 4 第一章绪论 具有抑制作用，它不能保证经口服后一定具有降血压的作用。这是由于这些肽类物质经过 人体消化道时会被体内的蛋白酶水解，一些具有较高a c e 抑制活性的肽会被水解成抑制活 性较低或几乎没有活性的小片段，也可能被水解成抑制活性更高的片段。m a e n o 等f 2 9 】报道 了具有l y s v a t l e u p r o v a l p r o g l n 序列的合成肽( 能在p 酪蛋白中找到) 表现出强烈的抗 高血压活性，但很有趣的是这种肽表现出较低的a c e 抑制活性，经过胰液消化，抑制活性 增加，当然大多数肽经消化后，不会受消化道蛋白酶作用，其抑制活性并没有大的变化【3 啪。 除非特别指明，在本论文中降血压肽和a c e 抑制肽代表同一意思。 1 4 1 降血压机理 a c e 抑制肽指的是一类具有a c e 抑制活性的多肽物质，这些多肽的氨基酸序列和肽 链长度各有不同，但都具有类似的功能。a c e 具有两个活性作用位置，分别命名为n - 区、 c 区，这两个活性区域具有几乎相同的功能，只是对不同底物的亲和力有所不同。a c e 抑 制肽与血管紧张素i 的结构相似，会一起竞争a c e 的作用位点，两者成为a c e 的竞争性 底物，阻止血管紧张素i i 的生成而形成竞争性抑制，起降血压作用f 3 w 2 1 。a c e 抑制肽的活 性强弱以i c 5 0 值表示，是指抑制5 0 的a c e 活性所需抑制剂的浓度。 1 4 2 结构与功能关系 来源于食物蛋白质的a c e 抑制肽活性与特异的多肽结构密切相关。c h e u n g 等人经研 究认为a c e 抑制肽的抑制活性主要取决于c 端氨基酸，c 端氨基酸为芳香族氨基酸和脯 氨酸时其抑制活性较高。另外，n 端为疏水性氨基酸或碱性氨基酸的肽与a c e 的亲和力较 强，抑制活性较高【3 3 1 。s u e t s u n a 等分析了来源于1 5 种鱼贝类a c e 抑制肽的氨基酸组成， 发现来源于鱼类抑制肽含有丰富的a s p ，g l u ，a r g ，p r o ，i l e 和l y s ，来源于贝类的则富含 a s p ，g l u 和l y s 3 4 1 。另外通常认为a c e 抑制肽主要集中在相对分子质量较小的部分( 1 5 0 0 以下) ，这表明除肽的氨基酸序列外，肽的分子大小对其活性也是一个影响因素。但是a c e 抑制肽的氨基酸组成和结构与其抑制活性的具体关系尚未研究透彻，有关机理尚不清楚， 因为不同氨基酸结构的a c e 抑制肽与a c e 的活性中心有着不同亲和力。 1 4 3 源于酪蛋白的a c e 抑制肽 m a r u y a m a 用胰蛋白酶水解酪蛋白首次从酪蛋白中获得了具有抑制a c e 活性的三种肽 p r o p r o 、a l a - p r o 和a l a h y p ，之后乳及乳制品来源的抗高血压活性肽的研究成为乳品研究 的新热点【3 5 - 3 8 】。s a i t o 等人从g o u d a 干酪中分离出了具有抑制a c e 活性的两种肽 a r g p r o l y s h i s p r o i l e l y s 。h i s g i n 和t y r p r o p h e p r o g l y p r o i l e 。p r o a s n 3 9 】y a m a m o t o 等人从l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u sc p 7 9 0 发酵的酸奶中分离得到了一种具有较强抑制a c e 活 性的肽聊r o t 4 0 。n a k a m u r a 等人从酸奶中分离得到一种具有抑制a c e 活性的二肽【4 h 2 1 。 y a m a m o t o 等人用l a c t o b a c i l l u sh e l v e t i c u sc p 7 9 0 水解酪蛋白 4 3 1 、i e c l e r c 等人用l a c t o b a c i l l u s h e l v e 疗c u sr 2 1l 和r 3 8 9 两株菌发酵富含酪蛋白的奶制品均获得了具有抑制a c e 活性的肽 4 4 j 。p i h l a n t o l e p p a l a a 等人利用不同种类的乳酸菌发酵乳清蛋白和酪蛋白，随后再用不同 种类的蛋白酶水解这两种发酵液，发现这两种蛋白质的水解物都具有抑制a c e 的活性， 但是酪蛋白水解物的抑制活性高于乳清蛋白水解物【3 2 1 。 5 江南大学硕士学位论文 1 4 4 源于其它食品蛋白质的a c e 抑制肽、 对食物降血压肽的研究开始于o s h i m a 等1 9 7 9 年报道的从明胶酶解液中提取的六种 a c e 抑制肽【4 5 】。研究表明抑锘i j a c e 活性的大部分主要集中在分子量较小的部分( 1 5 0 0 d a 以下) ，这表明除肽的氨基酸序列外，肽的分子大小对其活性也是个影响因素。这是第 一次用体外蛋白酶降解得到的由食品蛋白质产生的活性肽，为后来研究生产食品蛋白质 a c e 抑制肽打下了基础。1 9 8 8 年s u e t s u n a 等人用胃蛋白酶酶解1 5 种鱼贝类肌肉获得了不同 抑制活性的肽类【3 4 1 ，m i y o s h i 等从玉米醇溶蛋白酶解液中分离提取了多种强a c e 抑制活性的 肽类【4 6 】；k i n o s h i t a 和s a i t o 分别从酱油、日本清酒和酒糟中分离出a c e 抑制肽 4 7 4 8 】；福建大 学的张蓉真等则从福建老酒中分离出有a c e 抑制活性的物质【4 9 1 ，人们还从天然产物无花果 和大蒜中分离出a c e 抑制肽1 5 0 4 1 l 。第一次从酸奶中提纯、鉴定a c e 抑制肽的报道是在1 9 9 5 年。n a k a m u r a 等人从c a l p i s ( - - 种日本酸奶) 分离出两种a c e 抑制肽，发现原发性高血压的大 鼠长期服用可抑制血压上升p 2 1 。人们又相继从小麦胚芽、荞麦、鹰嘴豆的酶解产物中分离 出高活性的a c e 抑制肽 5 3 - 5 6 。n a k a s h i m a 等人首次报道了从家畜猪肌球蛋白的酶解产物获 得了具有令人满意的降压效果的肽【5 。这些研究表明能够抑带i j a c e 活性的物质在食品中广 泛存在。 1 5 立题背景及意义 功能性食品指对人体具有增强机体防御能力、调节生理节律、预防疾病和促进康复等 有关生理调节功能的加工食品【5 8 4 , o l 。生物活性肽由手其特殊的生理功能，利于消化吸收和 安全性高而易于被人们接受。生物活性肽类食品是国际保健品行业研究和开发的热点之 一，日本、美国和欧洲己率先推出具有各种功能的肽类食品及食品添加剂，形成了一种具 有极大商品化前景的产业。新型功能性食品的开发有助于减少和控制与饮食有关的慢性疾 病【5 9 1 。 近年来，人类钙营养不足的问题受到了广泛的关注。全世界尤其是发展中国家，钙缺 乏早已是普遍现象，其中最严重的是孕妇、儿童和老年人。孕妇缺钙会导致妊高症、胎儿 发育障碍；儿童缺钙会导致佝偻病、生长发育受阻；而老年人缺钙则会导致机体免疫力下 降，易发生骨质疏松和骨折。目前有研究表明，膳食中摄入充足的钙可以减少高血压的发 病率【6 1 - 6 2 。虽然目前人们已知道补钙很重要，但是对于钙的吸收情况却知之不多。影响人 体钙吸收的因素很多，除人体自身有吸收障碍问题外，更重要的是我国的膳食结构是以植 物性食品为主，动物性食品为辅的温饱型膳食类型，这种膳食类型会造成人体摄入钙不足。 人们一定要注意科学补钙，c p p s 是当之无愧的科学补钙的桥梁。此外，c p p s 同样具有结 合其它金属元素并促进它们吸收的能力，这更加增添了人们对c p p s 研究和开发的兴趣【6 】。 高血压是一种以动脉收缩压或舒张压升高为特征的临床综合症，它常伴有心脏、血管、 脑和肾等器官器质性病变，是引发心脏、脑、肾和眼等多种并发症和导致中风、冠心病的 一个重要危险因子。近年来，高血压在世界范围内成日趋严重的态势，已经成为生命“第 一杀手”，防治高血压成为全球医务界面临的一项艰巨任务。目前，普遍采用治疗高血压 的药物是巯甲丙脯氨酸( c a p t o p r i l ) ，新开发的药物哌哚普利( p e r i n d o p r i l ) 、群多普利 ( t r a n d o l a p r i l ) 6 3 】等也具有较好的疗效，这些都属于化学合成药物，高血压患者长期服用合 6 第一章绪论 成药会产生各种不适的副作用。随着人们对自身健康意识的不断增强，医务人员与患者更 青睐于非化学合成药物疗法。来自食物蛋白的降血压肽对高血压患者可起到降压作用，对 血压正常者则无降压作用，安全性极高，长期使用无副作用，特别适用于作为口服药剂或 功能性食品基料添加制成各种保健食品。因此，降血压肽已经成为目前研究的热点。日本 早在1 9 8 0 年代就对降血压肽进行了广泛深入的研究。他们采用玉米蛋白、大豆蛋白、鱼贝 类蛋白、清酒糟等廉价的蛋白质作为原料，研究开发了众多的a c e 抑制肽，制成片剂、口 服液或作为功能因子添加到各种食品中去，取得了良好的经济效益和社会效益。我国对降 血压肽的研究刚刚起步，但已经引起人们的重视，相信在未来几年里将会有大量的多肽药 物进入临床试验，部分将作为新药获准生产销售。我国有着丰富的蛋白类资源，尤其在农 副产品资源方面，每年都产生大量的副产品和废弃物。利用生物技术全价开发、充分利用 副产品及废弃物，变废为宝，提高其附加值，开发出安全性高的功能性食品或药物将有着 广阔的市场前景 6 4 1 。c n p p s 作为一种天然存在并且具有抑铝i j a c e 活性的物质，对高血压疾 病起到防治效果，无病人群食用可以有预防保健作用，有病人群食用起到非药物治疗的作 用。 酪蛋白中的生物活性肽种类很多，但是目前国外只有c p p s 和阿片活性保健品面市， 而国内也仅有c p p s 生产产品。一般在工业化生产c p p s 过程中，有近8 0 的蛋白质副产物 堋p p s 未被合理利用，作为饲料或废物弃去，因此c n p p s 的研究和利用既具有很大 的经济效益，也具有一定的社会效益。 1 6 本论文主要研究内容 本论文在优化酶解酪蛋白工艺条件的基础上同时生产制得c p p s 和c n p p s ，充分利用 酪蛋白资源，研究c n p p s 的脱盐方法以