（食品科学专业论文）塔格糖的生物制备及L阿拉伯糖异构酶性质研究.pdf

江南大学博士学位论文 摘要 塔格糖( d - t a g a t o s e ) 属于稀有糖，是一种在自然界中存在较少的单糖，其甜味类 似于蔗糖，而热量值较低，同时还具有抗氧化、降低血糖、益生元及防龋齿的功能特性。 塔格糖的生物转化主要利用l 阿拉糖异构酶( l - a r a b i n o s ei s o m e r a s e ，a i ) 异构化半乳糖。 本论文主要研究：筛选高产a i 的乳酸菌；优化乳酸菌发酵产灿的工艺参数；乳酸菌 灿的分离纯化和酶学性质；a j 酶活性部位的化学修饰；渗透乳酸菌细胞生物转化塔格 糖的工艺条件。 利用半胱氨酸一咔唑法、薄层层析法快速筛选得到产灿的乳酸菌l a c t o b a c i l l u ss k - 2 ， 根据细胞形态、生化特性，结合1 6 sr d n a ，判定l a c t o b a c i l l u ss k - 2 属于植物乳酸杆菌， 命名为l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u ms k - 2 ，g e n b a n k a c c e s s i o n n u m b e r ：d q 4 8 0 5 3 1 对lp l a n t a r u ms k - 2 发酵产酶条件优化及a i 产生机理探讨，结果表明，5g l 葡萄 糖、玉米浆为碳源和氮源时，甜酶活最高；有机氮源效果优于无机氮源；发酵条件优 化结果：发酵初始p h7 0 ，培养温度3 7 0 c ，接种量3 ，培养时间1 2h ；l - 阿拉伯糖是 趟产生的最适诱导物。 经过溶菌酶处理、超声波破碎、硫酸铵沉淀、d e a e s e p h a r o s e c l - 6 bf a s tf l o w 离子 交换色谱和s e p h a r o s ec l - 6 b 凝胶过滤等步骤，纯化得到l p a i ( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m s k - 2a i ) ，s d s p a g e 呈现单一条带，h p l c 检测纯度达9 6 ，比酶活升高2 l 倍，达到 2 5 3u m g ，回收率1 1 。由s d ；- p a g e 得到l p a i 相对亚基分子质量为5 9 6k ，而凝胶 过滤色谱求得l p a i 的相对分子量约为1 7 2 3k ，因此，推断l p a l 分子内有3 个亚基， 是一种三聚体酶。 纯化的l p a i 最适反应温度为5 0o c ，最适反应p h 为7 0 。稳定性实验表明，在5 0 。c 条件下保温2h ，酶活保持1 0 0 ：在p h4 5 8 5 环境( 5 0 。c ) 保存1h 后测定残余酶活 在8 0 以上，表明酶在p h 4 5 8 5 范围内稳定。 a 1 3 + ，k ? 和n a + 对酶活几乎没有影响，而m u 2 + ，f e 3 + ，f e 2 + ，c a 2 + ，b a 寸和z e 2 + 增 强了酶活，m n 2 + 增强酶活最大，添加2 0m m o l f l i v l n 2 + 酶活力最高；e d t a 、c u 2 + ，c 0 2 + ， a g + ，p b 2 + 和m 9 2 + 则分别对酶产生了不同程度的抑制作用，而 谚+ 完全抑制了酶活。 l p a l 最适底物为l 阿拉伯糖，其次为d 半乳糖，另外，l p p d 对海藻糖、木糖和果 糖也具有催化作用；不同糖醇对l p a i 均产生了抑制作用，木糖醇、甘露糖醇抑制作用 较弱，而l 阿拉伯糖酵则完全抑制了酶活。采用l i n e w e a v e r - b u r k 作图法，求得l p a i 作用于d 半乳糖和l 阿拉伯糖的特征常数分别为k 。1 1 9m m o l l ，v 。5 6p m o l m i n l 和3 0m m o v l ，3 5 2 7 , u m o l m i n l 。 纯酶n 端结构前十个氨基酸残基连接依次为：m l s v p d y e f w ，发现与l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m 、l a c t o b a c i l l u sp e n t o s u s 来源的灿一致；进化同源性表明乳酸菌来源的a i 氨基酸序列高度保守。 l p a i 在不周p h 环境下紫外一可见扫描发现，在2 8 0n m 吸收峰主要是色氨酸残基， 摘要 随p h 增加，2 8 0 皿吸收峰强度增加，且吸收峰波长有轻微红移，表明色氨酸基团有可 能从豌水区移动或翻转到酶蛋白分子外部。 a p o l p a i ( 脱除m n 2 + ) 加入1 0m b tm n 2 + 时，l p a i 酶活又恢复到原来的水平。 h o l o l p a i ( 原酶) 和a p o l p a i 进行差示扫描量热分析表明，h o l o l p a i 热稳定性高于 a p o l p a i ，因此认为l p a l 分子中结合的m n 2 + x i j - 维持酶活力至关重要，而且其与酶蛋白 结合形成的特殊构象对酶的热稳定性也起着重要作用 l p a j 荧光分析表明，激发光波长为2 9 5 皿时，最大发射荧光强度为3 3 5n e 1 。对 荧光产生贡献的色氨酸残基可能位于一个疏水区环境中，除了在3 3 5n m 处有一发射峰 外，在3 7 7 n m 处也有个小峰。 圆二色性分析表明，h o l o l p a i 脱除m n 2 + 后，蛋白质的二级结构发生了显著变化， 其中，d 折叠由1 4 8 减少为0 ，回转结构由0 变为1 7 4 。随着结构变化，h o l o l p a i 中更稳定的b 一折叠减少，导致a p ol p a i 具有较低活性，耐热性变差。 n b s 、p m s f 和d e p c 化学修饰造成酶活下降，说明构成l p a j 活性中心的必需氨基酸 残基有色氨酸、丝氨基酸和组氨酸。n b s 滴定表明该酶含有9 个色氨酸残基，进一步用 l e v y 法分析化学试剂修饰后残余酶活力与时间、修饰剂浓度的关系，计算出活性中心必 需色氨酸残基数目为2 ，组氨酸残基和丝氨酸残基均为1 个。 底物保护试验证明：色氨酸残基、丝氨酸残基处在与底物结合部位。组氨酸不处在 底物结合位点，可能位于催化活性部位 酶的荧光淬灭研究发现，加入3m g m l 半乳糖，酶的发射光谱峰红移至3 4 5n r n ，峰 的强度降低，导致荧光淬灭。同样加入1 0 0 9 m o l l n b s 时，且最大吸收峰红移至3 4 0 n n l ， 导致荧光淬灭 酶经n b s 修饰后，螺旋从7 0 2 下降到2 9 8 ，b 折叠则完全消失，回转则从0 增加到3 2 6 。n b s 修饰色氨酸残基造成酶活力下降，从二级结构的变化可知，修饰导 致底物结合部位的色氨酸残基周围环境发生明显改变，从而造成与底物结合能力下降。 渗透细胞生物转化半乳糖生产塔格糖的工艺：采用5 0m g n 1 l 湿细胞，底物浓度为1 2 0 g l ，反应温度5 0 0 c ，转化时间9 6h ，转化率达n 4 2 6 。 。 通过h p l c 分离酶反应产物，进一步采用红外光谱鉴定，证明生物转化半乳糖得到 的产物是塔格糖。 关键词：d 塔格糖，l 阿拉伯糖异构酶，植物乳杆菌s k 2 ，分离纯化，生物转化 江南大学博士学位论文 a b s 仃a c t d - t a g a t o s ei sar a r es u g a r , w h i c hi sn e a r l y 笛s w e e ta sb m c r o s e d t a g a t o s eh a sb e e n p r o p o s e df o ru s i n g 嬲a na l t e r n a t i v es w e e t e n e rb e c a u s ei th a sal o w e rc a l o r i f i cv a l u e ，n o g l y c e m i ca n di n s u l i n e m i ce f f e c t s ，a n di ti sh y p o a e i d o g e n i ci nt h ed e n t a lp l a q u e d - t a g a t o s ei s b i o t r a u s f o r m e df r o md g a l a c t o s eb yl - a r a b i n o s ei s o m e r a s e ( a d i nt h i ss t u d y , a ip r o d u c i n gl a e t i ca c i db a c t e r i as t r a i n sw e r es c r e e n e d f e r m e n t a t i o n p a r a m e t e r sw e r eo p t i m i z e df o rt h eh i g h e rc 1 1 z y l n ea c t i v i t y a 1w a sp u r i f i e da n d c h a r a c t e r i z e d a 1w a se a o d i 丘e dc h e m i c a l l yt os t u d yi t se n z y m es i t e t h ec o n v e r s i o no ft a g a t o s e 丘o m g a l a c t o s ew a sa l s os t u d i e db yp e r m e a b i l i z e dc e l l s b yd e t e r m i n i n gt h ef o r m e dp r o d u c t su s i n gt h ec y s t e i n e - c a r b a z o l et e s ta n dt h i nl a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( t l c ) t h es t r a i ns k - 2w a st h eb e s tp r o d u c e ro f 灿1 1 l es k 2s t r a i nw a s i d e n f i f i e d a sl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m s k - 2 ，a c c o r d i n g t o c o l o n y , e e l lm o r p h o l o g y , m e t a b o l i s mc h a r a c t e r sa n d1 6 sr i ) n j lt h eg e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ri sd q 4 8 0 5 3 1 f e r m e n t a t i o np r o c e s sw a so p t i m i z e df o rp r o d u c t i o no fa if r o mlp l a n t a r u ms k - 2 1 1 把 r e s u l t ss h o w e dt h a tf g , l l z y m ea c t i v i 够w a st h eh i g b e s ti nm e d i u mc o n t a i n i n g5g lo fg l u c o s e a n dc o ms y r u p w h e nlp l a n t a r u ms k - 2w a sc u l t u r e da t3 7 。cf o r1 2 h , a n dt h ei n i t i a lp hw a s a d j u s t e dt o7 0 i 珏em e c h a n i s mo fp r o d u c i n g9 1 1 z y m ew a sa n a l y z e d 功er e s u l t ss h o w e dt h a t l - a r a b i n o s ew a st h eb e s ti n d u c t i v es u b s t a n c ef o rl p a ia c t i v i t y a 1w a sp u r i f i e df r o ml p l a m a r u ms k 一2c e l l s ( l p a 0 t h ep u r i f i c a t i o np r o c e d u r e i n c l u d e dl y s o z y m i ct r e a t m e n t , s o n i c a t i o n , a m m o n i u ms u l f a t ef r a c f i o n a t i o n , d e a e s e p h a r o s e c l - 6 bf a s tf l o wc h r o m a t o g r a p h ya n ds e p h a r o s e c l - 6 bg e lf i l t r a t i o n p u r i f i c a t i o nh a s i n c r e a s e dt h es p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t yb y2 1 一f o l da n dr e a c h e d2 5 3 u r a gw i t hay i e l do f1 1 as i n g l eb a n dw a so b s e r v e df r o ms d s - p a g e , w h i c hc o n f i r m e dt h eh o m o g e n e i t yo fp u r i f i e d e n z y m e t h em o l e c u l a rw e i g h to f 删w a sf o u n d t ob e5 9 6kb ys d s p a g ea n d1 7 2 3kb y g e lc h r o m a t o g r a p h y t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d t h a tl p a im i g h tb eo f t h r e es u b u n i t sf o r m t h ep u r i f i e dl p a is h o w e di t sm a x i m a la c t i v i t ya t5 0 0 ca n dp h7 0 1 1 1 e 既l z y m e 哪 s t a b l ea t5 0 0 cf o r2ha n dh e l db e t w e e np h4 5a n d8 5f o r1he n z y m ea c t i v i t yw a s s t i m u l a t e db ym n 2 + , f e 3 + f e 2 + a n dc a 2 + ，b u ti tw a si n h i b i t e db ye d 瓯c u 2 + ，a g + ，h 9 2 + a n d p b 2 + h 矿i n h i b i t e dl p a ia c t i v i t y c o m p l e t e l y ，w h i l ec 0 2 + ，a i ”，k + a n dn 矿h a dn oe f f e c to n i t sa c t i v i t y m n 2 + i o nw a st h em o s te f f e c f i v em e t a l l i ci o ns i t u a t i n ge n z y m ea c t i v i t y m m a x i m a la c t i v i t yo f l p a io c c u r r e da t 2 0m m o l lo f m n 2 d g a l a c t o s ea n dl a r a b i n o s eu s e da ss u b s t r a t e sw e r ei s o m e r i z e dw i t hh i g ha c t i v i t y d - f u c o s e ，d x y l o s ea n dd - f r u c t o s ew e l ei s o m e r i z e dw i t hs l i g h ta c t i v i 职av a r i e t yo fs u g a r a l c o h o l sw e r et e s t e df o rt h e i ra b i l i t yt oi n h i b i tl p a la c t i v i t y x y l i t o l ，m a n n i t o l ，e r y t h r i t o la n d d u l c i t o lw e r ew e a ki n h i b i t o r s ，w h i l el a r a b i t o lw a st h es t r o n g e s tc o m p e t i t i v ei n h i b i t o ro f l p m t h ea p p a r e n tm i c h a e l i s - m e n t e nc o n s t a n t ( k ) f o rd g a l a c t o s ea n di , - a r a b i n o s ew a s 1 1 9m m o l la n d3 0m m o l l ，a n dt h er e a c t i o nr a t e ( v m 曲w a s5 6l u n o y m i n la n d3 5 2 7 g m o y m i n l , r e s p e c t i v e l y n ef i r s t1 0n - t e r m i n a la m i n oa c i d so f t h ee n z y m ew e r ed e t e r m i n e d 鹊m l s v p d y e f w ， a n dt h i ss e q u e n c ei si d e n t i c a lt ot h a to f l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m h o w e v e r , c o m p a r e dw i t ht h e o t h e rk n o w nl a c t o b a c i l l u sa is e q u e n c e s ，l p a lw a sf o u n dt oh a v er e l a t i v e l yh i g hs e q u e n c o a b s t r a e t s i m i l a r i t y 。 a b s o r b a n c es p e c t r ao fl 蹦s h o w e do p e a ka t2 $ o n m ，w h i c hc o r r e p o n d st ot r p a b s o r b a n c es p e c t r a w h e nt h ep hw a sr i s e n , t h ep e a ki n c r e a s e di n t e n s i t ya t2 8 0 r i m ，a n dt u r n e d t or e d 1 1 1 er e s u l t ss u g g e s tt r pi nt h ei n n e ro fe d z y l n em i g h tb eg o m eo u to rt u r nf r o m h y d r o p h o b i ct oh y d r o p h i l i cr e g i o n p r o p e r t i e so fh o l o l p a ia n da p e l p a jw e r ei n v e s t i g a t e d h o l o l p a js h o w e da c t i v i t y w h e r e a sa p o l p a ih a do n l y2 0 a c t i v i t yo fh o l e u 蚍。h o w e v e r , a p o l p a ir e c o v e r e d e l l z y m ea c t i v i t yw h e n1 0m m o l i 。o f m n 2 + w a sa d d e d 1 1 1 ed s co f h o l o l p a ia n da p o l p a i i n d i c a t e dt h a th o l o l p a iw a sm o r es t a b l et h a na p o l p a i t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tm n z + b i n d st ot h ee n z y m ea n dp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nb o t ht h ee n z y m ea c t i v i t ya n ds t a b i l i t y t h ee n z y m eg a v em a x i m a lf l u o r e s c e n c ee m i s s i o na t3 3 5 衄a n ds h o w e das m a l lp e a ka t 3 7 7w h e ne x c i t e da t2 9 5n l n n l i ss u g g e s t st h a tt h et r po f 删，w h i c hc o u l di n d u c e f l u o r e s c e n c ee m i s s i o n , m i g h tl o c a t ei nah y d r o p h o b i cr e g i o n c do f t h ee n z y m es h o w e dt h a tt h es e c o n d a r ys t r u c t u r ec h a n g e ds i g n i f i c a n t l yd u r i n gt h e e n z y m et r a n s f o r m a t i o nf r o mh o l o l p a jt oa p o l p ：a j r a t i o so f0 - s h e e ta n dt u r ns t r u c t u r ew a s 1 4 8 ，o f o rh o l o l p a ia n do ，1 7 4 f o ra p o l p a i ，r e s p e c t i v e l y d e c r e a s eo fp s h e e t , a m o r es t a b l es 旺u c t 它r e s u l t e di nd e c r e a s i n gt h ea p o l p a ia c t i v i t ya n dt h e r m o s t a b i l i t y t h em o d i f i c a t i o no fn b s p m s fa n dd e p cr e s u l t e di nag r e a tl o s so fl p ：甜a c t i v i t y , s u g g e s t i n gt h a tt r p , s e ra n d h i sa r e i n v d v e di nt h ea c t i v es i t eo fe n z y m e t h en u m b e ro ft r p w a s 懿- t i m a t e da tn i n ei n t h ea m eu s i n gn b st i t r a t i o n t h er e l a t i o n s h i pb , f f w e e nt h e r e s i d u a li e - q l z y m ea c t i v i t ya n dt h ee f f e c to f t i m e a n dm o d i t i e rc o n c e n l r a t i o nw a sa n a l y z e du s i n g l e v ym e t h o dw h e ne n z y n l ew a sm o d i f i e db yc h e m i c a lr e a g e n t 1 1 1 er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h e n u m b e ro ft r p ，s e ra n dh i sw e r et w o ，o n ea n do n e ，r e s p e c t i v e l y s u b s t r a t ep r o t e c t i o na g a i n s t m o d i f i c a t i o ns h o w e dt h a tt r ya n ds e rw e r ei nt h e s u b s t r a t eb i n d i n gs i t ea n dh i si nt h e c a t a l y t i cs i t e t h ef l u o r e s c e n tq u e n c h i n go fl p a lw s t u d i e da t2 9 5n r n nt h ee n z y m ew a s a d d e di n t o3m g m io r1 0 0l m a o l lo fg a l a c t o s ea n dn b s ，t h ep e a ki n t e n s i t yd e c r e a s e da n d m o v e dt o3 4 5n l na n d3 4 0n m , w h i c hm i g h tb ei n d u c e db yq u e n c h i n go f t h e 唧f l u o r e s c e n c e o f e n z y i n e ， c do f 也ee n z y i n em o d i f i e db yn b ss h o w e dt h a tr a t i oo fa - h e f i x , b s h e e ta n dt u r n s t r u c t u r ew a sc h a n g e df r o m7 0 2 ，1 4 8 a n do t o2 9 8 ，0 a n d3 2 6 ，r e s p e c t i v e l y t h em o d i 五c a t i o no ft r pr e s u l t e di nl o s so fe n z y m ea c t i v i t y , w h i c hs u g g e s tt h a tt h e m o d i f i c a t i o nm i g h tc a u s ea l le n v i r o n m e n t a lc h a n g ei nt h es u b s t r a t eb i n d i n gs i t ea n dd e c r e a s e t h es u b s t r a t eb i n d m ge f f i c i e n c y 1 1 1 et e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r sw e r ed e t e r m i n e df o rb i o w a n s f o r m a t i o no fd g a l a c t o s et o d - t a g a t o s eu s i n gp e r m e a b i l i z e dc e l l s i tw a so p t i m i z e dw i t h1 2 0g lo fd g a l a c t o s e ，5 0 m g m io fp e r m e a b i l i z e dc e l l sa t5 0 。cf o r9 6k w h i c hr e s u l t e di nt h ec o n v e r s i o no f4 2 6 d g a l a c t o s e h p l ca n df i 二i rs p e c t r o m e t r yc o n f r r m e d t h a tl p a jm e d i a t e st h ei s o m e r i z a t i o n o f d - g a l a e t o s e , a n dt h a tt h eb i o c o n v e r s i o np r o d u c ti sd - t a g a t o s e k e yw o r d s ：d - t a g a t o s e ，l - a r a b i n o s ei s o m e r a s e ，l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ms k - 2 ，p u r i f i c a t i o n , b i o c o n v e r s i o n 缩略词表 a j n c b i l a b l p ：a i h o l o a i a p o a i 舭 p n c d k r f d s c t n b s p c p m s f n b s d e p c e d c 缩略词表 l a r a b i n o s ei s o m e r a s e n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t c c h n o l o g yi n f o r m a t i o n l a c t i ca c i db a e t c r i a l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u ms k - 2 a i h o l o l a r a b i n o s ei s o m e r a s c a p o l a r a b i n o s ei s o m e r a s e a n i u n o t h i a z o l i n o n e p h e n y l t h i o h y d a n t o i n c i r c u l a rd i c h r o i s m d e n a t u r et e m p e r a t u r e r e l a t i v em o b i l i t y d i f f e r e n f i a l s c a n a i n gc a l o r i m e t r y t r i n i t r o b e n z e n es u l f o n i ca c i d 4 - c h l o r l m e r e u r ib e n z o i ca c i d p h e n y lm e t h y ls u l f o n y lf l o r i d n b r o m o s u c c i n i m i d e d i e t h y p y r o c a r b o n a t e l - e t h y l - 3 - c a r b o d i m i d e l 广阿拉伯糖异构酶 美国国家生物信息中心 乳酸菌 植物乳杆菌s k 2l - 阿拉伯糖异构酶 完整【广阿拉伯糖异构酶 脱辅基l 阿拉伯糖异构酶 苯胺噻唑啉酮 苯乙内酰硫脲 圆二色性 变性湿度 相对迁移率 差示扫描量燕法 三硝基苯磺酸 对氯汞苯甲酸 苯甲基磺酰氟 n 挨代琥珀酰亚胺 焦碳酸二乙酯 碳二亚胺盐酸 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： i 生兰垡 日期：d 7 年岁月纠日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 八有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 。 ， 签名：2 丝星导师签名：三三主主 日期：d7 年；月a i 日 第一章绪论 1 1 。功能性稀有糖 1 1 1 稀有糖概念 第一章绪论 稀有糖是近年来国际上研究功能性甜味剂的一个热点。2 0 0 2 年，在日本香川大学主 办的第二届国际稀有糖会议上，国际稀有糖协会( i s r s ) 把稀有糖定义为“在自界存在 但含量极少的一类单糖”。在随后两届稀有糖国际会议上对稀有糖概念进一步拓展为“在 自界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物” 1 - 2 。 1 1 2 稀有糖研究现状 稀有糖生物转化主要利用d - t a g a t o s e3 - e p i m e r a s e 、a l o d o s er e d u c t a s e 、p o l y o l d e h y d r o g e n a s e 和a l d o s ei s o m e r a s e 等酶作为催化剂，通过对各种单糖( 主要是四碳糖、五 碳糖、六碳糖) 之间的相互转化而获得各种稀有糖。目前研究较多的是五碳和六碳稀有 糖。i z u m o r i n g 研究发现d t a g a t o s e3 - e p i m e r a s e 能催化所有五碳酮耱和六碳酮糖c 3 位上的 差向异构体，生成相应的酮糖【3 棚。同时还利用这种酶制备出大量不同稀有糖：从d 果 糖差向异构成d 阿洛酮糖【5 卅；把d 塔格藉转化成d 山梨糖，还可以催化l 山梨糖、【广 阿洛酮糖分别生成l 塔格糖和l 果群“阳a l o d o s er e d u e t a s e 能催化多元醇和酮糖之间的 相互转化，如以g a l a e t i t o l 为底物制备d - 塔格糖，而利用其逆反应，可以把d 塔格糖转化 成d 塔圉糖醇【9 d 0 】、d 阿洛酮糖氧化还原成d 蒜糖醇和d 塔圉糖醇 1 l - i ：z 、d 山梨糖则还 原d - 艾杜醇f l 习。g 啪s 确m 【1 4 】等人分离纯化的d 木糖还原酶转化木糖为木糖醇，两且也 能还原d 和l 型阿拉伯糖、核糖和来苏糖；不同来源的a l d o s ei s o m e r a s e 转化六碳酮糖生 成相应的醛糖，b h u i y a n 1 5 - 1 6 1 等人利用l - 鼠李糖异构酶分别把d 阿洛酮糖、l 果糖转化 成d 一阿洛糖和l - 甘露糖；而p a s t i n e n ”】等人利用d 木糖异构酶转化d 阿洛酮糖为d 阿洛 糖和d - 阿卓糖；v u o l a n t o t l 8 】等人研究发现d 木糖异构酶对所有d 一和l 型四糖能进行异构 化反应生成各种稀有糖。h u w i g 和t a k e s h i t a 1 9 。2 0 】等人利用来自不同细菌g a l a e t i t o l d e h y d r o g e n a s e ，生产l 阿洛酮糖，并研究了l 阿洛酮糖在医药领域中的优良性质。 i z u m o r i n g 根据目前对稀有糖的研究资料，建立了各种稀有糖之间的相互转化及可能的生 产途径，即i z u m o r i n g 环型理论( 图1 1 ) ，包括四碳糖环、五碳糖环及六碳糖环【2 l 】。目 前主要研究了六碳稀有糖中的d 型，而大多数稀有糖的结构和功能仍没有研究清楚。 近年来科学家致力于研究的稀有糖主要有d 阿洛酮糖( d p s i c o s e ) 、d 阿洛糖 ( d - a l l o s e ) 、d 塔格糖t a g a t o s e ) 等。日本学者研究发现，d - 阿洛酮糖和d 阿洛糖具 有重要的生理功能，不但具有甜味剂效应，而且可以抑制肿瘤和保护肝脏，还能作为合 成医药的中间体。目前日本利用果糖通过微生物发酵生产阿洛糖和阿洛酮糖正迸行中 试，2 0 0 6 年，m o r i m o t o 等人使用连续生物反应器和分离系统，进行大规模制备d 阿洛 酮糖获得成功，相信不久将来工业化产品就能上市 2 2 创 江南大学博士学位论文 图1 1 六碳稀有糖之间的相互转化l f i g r - 1t h eb i o e o n v e r s i o no f t h eh e x o s e si nn i r es u g a r ，肛罐叫 i ) - f r u c t o s ed - g a l a c t o s e 第一章绪论 塔格糖环式结构 ： o - t a g a t o s e ( p y r a n o s e r o r m ) d t a g a t o s e ( f u r a n o s e f o r n 4 钐，0 * jj ， h f ，_ ? ，：，- 一j j 。f ，i ”“i7j；。 塔格糖是一种己酮糖，纯品为白色晶体，熔化温度1 3 3 1 3 7 0 c ，熔点1 3 4 。c ，玻璃 化温度1 5 0 c 。易溶于水，水溶液清澈无色，微溶于乙醇，溶于水后会引起沸点升高和 冰点降低，但并不吸热，因此不会产生清凉的口感在p h 3 7 范围内均可稳定存在容 易发生美拉德反应，在较低温度下即可发生焦糖化反应。甜味类似于蔗糖，而热量值只 有1 5 删g ，相当于蔗糖热量值的3 0 ；1 0 ( w w ) 浓度塔格糖甜度为蔗糖的9 2 ， 没有后味也不会产生任何不良风味，是f d a 批准的5 种低能量甜味剂中唯一一个口感、 甜度和蔗糖最相似的甜味剂 2 5 。相对而言，塔格糖的甜味刺激较蔗糖快，和果糖相似。 此外，塔格糖对强力甜味剂还有很好的协同增效作用，包括甜蜜素、糖精、阿斯巴甜、 安赛蜜、甜菊糖、纽甜和三氯蔗糖等 2 6 1 。 塔格糖首先发现于热带植物s t e r e u l i a ( - - 种常青树) 的树胶中，另外苔藓、地衣等低 等植物中也存在少量塔格糖，后来从加热过的牛奶、奶粉、酸奶、奶酪等奶制品中也检 测到塔格糖的存在( 2 8 0 0 r a g & g ) ，由于牛奶和奶粉在食品加工中普遍使用，因此塔格 糖也普遍存在于各类食品中【2 7 “。 1 2 2 塔格糖代谢途径及安全性 1 2 2 1 塔格糖代谢途径 在l a c t o b a c i l l ia n ds t r e p t o c o c c i 属微生物中，塔格糖以塔格糖6 磷酸途径进入半乳 糖途径代谢。塔格糖一6 磷酸进入三羧酸循环，在半乳糖6 一磷酸异构酶、塔格糖一6 磷酸 激酶以及二磷酸塔格糖醛缩酶作用下分解生成二羟基丙酮和三磷酸甘油，最后转化为各 种发酵产品。而在动物和人体内没有塔格糖一6 一磷酸代谢途径，研究发现在试验田鼠体内 塔格糖主要通过肝脏代谢，其代谢类似于果糖，但代谢速度只有果糖一半。目前有许多 假设推测塔格糖在人体肝脏中的代谢途径，假设认为塔格糖通过丙糖磷酸盐转化成6 - 磷酸果糖和6 一磷酸一葡萄糖，然后进行糖酵解和三羧酸循环( 图1 3 ) 。实验证明消化吸收 的塔格糖通过上述代谢途径进入人体，不会产生任何副作用，没有消化吸收的塔格糖进 入结肠发酵生成大量短链脂肪酸，改善了肠道卫生，促进了人体健康 2 9 - 3 ” 3 江南大学博士学位论文 。| l 7 l 7 ；7 ，甜种， ，：c i c 廿。 f ：7 ；7|，7：7i 一一：l卜愀* jt a g m o s e 一t a g - 6 p 、_ 、 7| 翔册- 一i 。： ： 。 l 埘岫，d h a pl | ，7 j ： ，：? o ，i d + pg “了“卜f d p ：7 ：； ：，；一7 - 叫t _ - +“； 聊础妇、t ， 7 ：= 。? ，i | ，| ，r 7 | ，! ，：，7 j | ，i ， j j ? i 。，t 警