（食品科学专业论文）有机相脂肪酶催化合成L抗坏血酸月桂酸酯的研究.pdf

摘要 摘要 l 一抗坏血酸脂肪酸酯在食品、化妆品、医药等领域的应用非常广泛，目前在 工业上采用化学方法合成。酶法合成由于其条件温和、产物安全性高而逐渐受到 重视，但是由于底物在有机溶剂中的溶解度有限导致酶法合成效率低下，工业化 生产前景不明朗。本课题主要对l 抗坏血酸脂肪酸酯管路式酶法合成生产工艺 进行研究，寻求一种可进行工业化生产的管路式生产方法，努力提高单位时间生 产产量。因此本研究对于推广更加绿色、更加安全的酶法合成脂肪酸酯方法具有 重要的学术意义和应用价值。 论文首先通过间歇反应合成l 抗坏血酸月桂酸酯，以丙酮作为反应介质， 在5 0 下利用脂肪酶( n o v 0 4 3 5 ) ，在月桂酸与l 一抗坏血酸摩尔比为4 ：1 条件 下酶催化合成，分别通过有机溶剂萃耿法、硅胶柱分离法和制备液相法分离纯化 得到纯品，纯度分别达到了8 6 5 、9 0 4 和9 5 5 。利用h p l c 、m s 和n m r 对合成产物进行结构鉴定，确证其为i ，抗坏血酸月桂酸酯。 在此基础上，论文详细研究了l 抗坏血酸月桂酸酯的管路式酶法合成工艺 及装置。自行搭建了一套管路式合成l 一抗坏血酸月桂酸酯的填充床装置，着重 研究了管路式酶催化合成的影响凼素，如底物溶液流速、底物摩尔比、有无加分 子筛等。在此基础上，确定了管路式合成的最佳工艺参数为：5 0 下，月桂酸与 l 抗坏血酸的摩尔比为6 ：1 ，流速为0 3 7 m l m i n ，经过5 个柱体积后反应液中 产物浓度即可达到最高的2 4 2 m m o l l 并稳定，产量达到了4 。6 2 ( l d ) 。乖装置 还适用于l 抗坏血酸其它脂肪酸酯以及脂肪酸糖酯等的管路合成。 最后，测定了l 抗坏血酸月桂酸酯的溶解度以及临界胶束浓度，并重点比 较了l 一抗坏皿酸及其脂肪酸酯淬灭自由基和蝥合金属离子能力的差异，结果表 明，l 。抗坏血酸月桂酸酯和l 抗坏血酸棕榈酸酯淬灭醇溶性自由基d p p i t 的能 力优于l 一抗坏血酸，并具有显著性差异，而淬灭水溶性自由基a b t s + 和螯合铜 离子能力并无显著性差异。 关键词：l 抗坏血酸月桂酸酯，酶催化合成，填充床反应器，管路式合成 a b s t r a c t a b s t r a c t l a s c o r b y lf a t t ya c i de s t e r sa r eu s e dw i d e l ya sn a t u r a la d d i t i v e si nf o o d sa n d c o s m e t i c sd u et ot h e i ra n t i o x i d a n ta c t i v i t y c u r r e n t l y , t h es a t u r a t e da s c o r b y lf a t t ya c i d e s t e r su s e di nt h ei n d u s t r ya r ea l l c h e m i c a l l ys y n t h e s i z e d b yc o n t r a s t ，e n z y m e c a t a l y z e ds y n t h e s i sc o u l db ep e r f o r m e du n d e rm i l d e rc o n d i t i o n ss u c ha sa tl o w e r t e m p e r a t u r e s h o w e v e r , d u et ot h el o ws o l u b i l i t yo ft h er e a c t i o ns u b s t r a t ei no r g a n i c s o l v e n t ，t h ei n d u s t r i a l i z a t i o no ft h ee n z y m ec a t a l y z e ds y n t h e s i so fl a s c o r b y lf a t t y a c i de s t e r sw a sl i m i t e d i nt h i ss t u d y , t h et e c h n i q u ef o rc o n t i n u o u sl i p a s e c a t a l y z e d s y n t h e s i so fl a s c o r b y lf a t t ya c i de s t e r sw a si n v e s t i g a t e db yd e s i g n i n gap a c k e d b e d r e a c t i o ns y s t e mi no r d e rt or a i s et h ey i e l d l - a s c o r b y ll a u r a t ew a ss y n t h e s i z e di na c e t o n es o l v e n tc a t a l y z e db yl i p a s en o v o 4 3 5a t5 0 w i t has u b s t r a t e sr a t i o ( 1 a u r i ea c i d ：l a s c o r b i ca c i d ) o f4 ：1 t h e s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h es y n t h e s i z e de s t e rw a sc a r r i e do u tb yo r g a n i cs o l v e n t e x t r a c t i o n ，s i l i c ag e lc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , a n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，r e s p e c t i v e l y t h ep u r i t i e so ff i n a lp r o d u c t ss e p a r a t e db y t h e s et h r e em e t h o d sw e r e8 6 5 ，9 0 4 a n d9 5 5 ，r e s p e c t i v e l y t h ep u r i f i e dp r o d u c t w a st h e ns u b j e c t e dt om a s ss p e c t r o m e t r y ( m s ) a n dn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ( n m r ) a n a l y s i s f o rl a r g e s c a l ep r o d u c t i o ni ni n d u s t r y ，ac o n t i n u o u sr e a c t i o nw o u l db ep r e f e r r e d i nt h iss t u d y , ap a c k e d b e dr e a c t i o ns y s t e mw a sd e s i g n e dt oc o n t i n u o u s l ys y n t h e s i z e l - a s c o r b y ll a u r a t e t h ei n f l u e n c e so ft h ef l o wr a t eo fs u b s t r a t es o l u t i o n ，t h em o l a r r a t i oo fs u b s t r a t e s ，a n dt h ea d d i t i o no fm o l e c u l a rs i e v e sw e r ee m p h a t i c a l l ys t u d i e di n d e t a i l t h eo p t i m i z e dr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w ：f l o wr a t eo 3 7m l m i na t 5 0 w i t ht h ei n i t i a lm o l a rr a t i o no fs u b s t r a t e s6 ：1 a tt h e s eo p t i m i z e dr e a c t i o n c o n d i t i o n s ，t h ep r o d u c tc o n c e n t r a t i o nc o u l db ea sh i 。g ha s2 4 2 m m o l l ，a n dt h e p r o d u c t i v i t yc o u l dr e a c h4 6 2 9 ( l d ) f u r t h e r m o r e ，t h er e a c t i o ns y s t e mw o u l db e s u i t a b l ef o rt h e c o n t i n u o u ss y n t h e s i so ft h eo t h e ra c y ll a s c o r b a t e sa n ds u g a re s t e r sa s w e l l t h ec m co fl a s c o r b y ll a u r a t ed e t e r m i n e db yd un o u yr i n gm e t h o dw a so 1 m m o l l f i n a l l y , t h ed e t e r m i n a t i o no fd p p h a n da b t s + f r e er a d i c a ls c a v e n g i n g a b i l i t ys h o w e dt h a tt h e r ei ss i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nd p p t t f r e er a d i c a l s c a v e n g i n ga b i l i t yo fl - a s c o r b y ll a u r a t e ，l a s c o r b y lp a l m i t a t ea n dl a s c o r b i ca c i d w h i l et h ea c y ll a s c o r b a t e sw e r eb e t t e rt h a nl - a s c o r b i ca c i d b u tt h e r ei sn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a sf o u n db e t w e e na b t s + f r e er a d i c a ls c a v e n g i n ga b i l i t ya n d m e t a l ( c o p p e ri o n ) c h e l a t i n ga b i l i t yo f t h e s ec o m p o u n d s k e y w o r d s ：l - a s c o r b y ll a u r a t e ，l i p a s e c a t a l y z e ds y n t h e s i s ，p a c k e d b e dr e a c t o r ， p i p e l i n es y n t h e s i s i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 芬彤旅日期：沙扩，“z6 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 0 者，彤放 日期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 立题背景和意义 氧化是除微生物之外引起食品变质的另一个重要原因。油脂及含油食品在储 存过程中，由于温度、光照、湿度等外部因素容易引起自动氧化或热氧化而引起 酸败，这是一个越来越受到关注而又不能很好解决的问题。目前，在实际生产应 用中，最经济、最有效的预防办法还是添加抗氧化剂。抗氧化剂是指能够阻止或 延缓食品氧化以提高食品稳定性和延长保质期的一类物质，按溶解性可分为水溶 性和脂溶性抗氧化剂两大类。目前实际应用较为广泛的为脂溶性抗氧化剂，如 4 叔丁基茴香醚( b h a ) 、2 , 6 二叔丁基对甲酚( b h t ) 、叔丁基对苯二酚( t b h q ) 、 维生素e 等。而有很多的长期动物实验结果对这些人工合成的抗氧化剂如b h a 、 b h t 、t b h q 等的安全性提出了质疑i l 】。因此包括欧共体( e e c ) 所属的国家已 经对t b h q 施行禁用，美国食品药物管理局( f d a ) 于1 9 7 7 年删去了b h t 的 认可使用，日本也于1 9 8 3 年对b h t 、b h a 限制使用或暂停使用。基于对人工合 成抗氧化剂安全性的考虑和人们消费和健康观念的转变等原因，用天然抗氧化剂 代替人工合成抗氧化剂将成为今后发展的趋势。而由于目前的天然抗氧化剂如： 维生素c 、e 、a 、b 。胡萝卜素等，另外还有果蔬和植物中的多酚和黄酮类物质 等，火都水溶性差或者油溶性差，因而限制了在各个领域巾的应用。目前，有化 学和酶催化两种方法对天然抗氧化剂进行改性，改善其溶解性。化学法虽然得率 较高，但反应条件伴随高温、高压等和加入浓硫酸为催化剂，会生成不期待的副 产物，对后期的分离纯化不利，而酶法反应条件温和，特异性强，不易产爿j 较多 副产物，分离纯化方法简单，有机溶剂消耗少且可以回收利用。尽管如此，最近 的相关研究还只是停留在间歇反应，由于底物在有机溶剂中的溶解度有限导致反 应效率低，囚此尽管酶法合成已经有2 0 多年的研究历史，到目前为止工业化前 景不明朗。 本课题选取来源和应用都很广泛的l 抗坏血酸( l a s c o r b i ca c i d ) ，利用酶法 催化合成方法对其进行改性，主要对管路式生产工艺进行研究，寻求一种可进行 工业化生产的管路式生产方法，努力提高单位时间生产产量。管路式生产相比间 歇生产，降低了间歇反应的中控制水分的困难，可明显提高生产效率，降低生产 成本，通过工艺研究可以很好地控制管路式反应过程，最大程度提高产量。凶此 本研究对于推广更加绿色、更加安全的酶法合成脂肪酸酯方法具有重要的学术意 义和应川价值。 江南人学硕士学位论文 本课题来源于汀苏省创新人才摹会课题“乳状液中抗氧化剂抗氧化机理研 究”( b k 2 0 0 6 5 0 3 ) 以及“十一五”国家科技支撑计划“食品功能因子高效分离 与制备关键技术的研究”( 2 0 0 6 b a d 2 7 8 0 3 ) 支持。 1 2 国内外的研究进展 根据反应的操作方式，合成过程可分为问歇式和连续式。目前对l 抗坏血 酸的改性研究中，国内外主要集中在间歇式反应，且研究内容大部分只局限在脂 肪酶种类、水分含量、有机反应介质、底物摩尔比、温度等条件对转化率的影响 【2 】【3 】f 4 】f 5 】f 6 】。这些研究对于间歇合成反应最佳二【= 艺条件的选择和优化，以及反应过 程的控制，具有很强的指导意义。然而，间歇式合成很难实现工业化生产，最近 出现了利用填充床反应器( p a c k e d b e dr e a c t o r ) 【_ 7 】和连续搅动反应器( c o n t i n u o u s s t i r r e dt a n kr e a c t o r ) 8 1 连续生产l 一抗坏血酸脂肪酸酯的报道，同时也有报道这 两种反应器用来连续合成糖酯【9 】【1 0 】【l l 】和甘油酯【12 1 。虽然目前关于连续化合成的研 究为工业化生产提供了一定的基础，但存在着几个很难解决的问题，比如底物( 如 糖、l 抗坏血酸等) 在有机溶剂中的溶解度太低，反应过程中不断生成的水导致 脂肪酶的催化反应往水解方向进行，有机溶剂的连续性脱水等。由于受到以上几 个因素的影响，连续化合成产物的产量普遍很低，这在工业二对反应底物、反应 溶剂的回收以及产物的分离纯化带来困难，增加生产成本。 1 2 1 酶催化反应的影响因素 1 2 1 1 脂肪酶的选择 脂肪酶( l i p a s ee c 3 ，1 ，1 ，3 甘油酯水解酶) 是一类特殊的酰基水解酶， 具有对油一水界面的亲和力，并在界面上表现最大活力【l3 1 。它能在油水界面上催 化酯水解、酯合成【2 】【5 1 、酯交换【14 1 、多肽合成【j 5 】、酰化16 1 、高聚物合成【1 7 】等有机 合成反应，因此在工业上应用广泛。由于酶催化底物反应的专一性，在催化不同 底物时酶的活性相差很大，即使来源相同但固定化方法彳i 同都会导致脂肪酶活力 的差异。目前已经实现商品化且应用7 “泛的有丹麦诺维信( n o v o ) 公司生产的 l i p o z y m e 。 恰当地选择脂肪酶的种类对催化反应的效率至关重要。汤鲁宏等【l8 j 利用了不 同脂肪酶在不同溶剂中催化合成抗坏血酸棕榈酸酯，并对反应的动力学进行了研 究，结果表明，在l o g p 值处于0 和2 之间的溶剂中，n o v o z y m e 4 3 5 比其它三种 脂肪酶m m l 、l i p s l a s e 和p p l 的催化效率更高，而叔戊醇作为反应介质时效 果最佳。 1 2 1 2 水分活度的影响 微量的水份在酶维持其结构和构象方面起着很重要的作用。酶蛋白分子周围 紧密结合着一层必需水，在绝对无水体系中的酶不表现催化活性。然而，反应体 系中水的存在会影响酶的活性，由于不同体系中水与底物、介质的作用不同，相 第一章绪论 刚的含水量所起的作用术必相同，因此般用水分活度来更真实的反映体系中水 和其他组分之间的关系。 水分活度是影响酶催化反应活性和反应平衡的最大因素。h u m e a u 等【3 1 通过 控制反应体系水份活度的恒定，进而研究了体系中水的活度对脂肪酶 n o v o z y m e 4 3 5 催化活性，结果表明在7 0 c 下，水份活度从0 0 7 到0 9 7 ，酶活力 和底物转化率逐渐降低，其他的研究结果也与此趋势相似【4 1 【5 】【1 9 】【2 0 】。酯化反应过 程、有机溶剂和底物本身等都会带来一定的水，过多的水会严重影响脂肪酶的催 化合成。s g a y o t 等1 2 0 j 研究了底物的预先干燥( 柚皮苷和棕榈酸) 、反应介质的脱 水、酶的脱水以及反应过程添加分子筛等操作对转化率的影向。目前降低体系水 分活度的方法是在反应前和反应过程添加分予筛，然而过低的水分活度会降低酶 的催化效率，这可能是因为过低的水分活度会剥夺酶表而的必需水化层。k o k u w a b a r a 等1 5 j 通过在不同摩尔比( 脂肪酸：l 抗坏血酸= l ：1 和5 ：1 ) 的底物 中添加含量不同的分子筛，结果表明添加量为2 0 9 l 时转化率最高，大于时转化 率都下降，而且随着反应的进行，反应体系变黄变褐，可能是由于过量的分予筛 使得l 抗坏血酸和产物变成了具有颜色的化合物。另外他们还发现分子筛的加 入会导致产物l 抗坏血酸油酸酯的吸附和降解。 另外，不同反应时问下加入分子筛会影响催化效率，比如反应前和反应过程 中添加分子筛的效果是不一样的。d u a n ，y 等【2 1 】在用n o v o z y m 4 3 5 催化芦丁硬脂 酸酯反应研究中，研究了不同时间点( 自反应开始后5 、1 8 、2 4 、3 1 、4 4 小时) 添加分予筛对转化率的影响，结果发现在反应2 4 小时后添加分子筛得到的产率 最高，为4 6 。因此，分子筛加入时间是一个与分子筛加入量同样重要的参数。 b r a d o os 等1 2 z j 研究了每隔6 小时( 自反应开始的第6 、1 2 、1 8 、2 4 小时) 加入 5 的分予筛，对l 抗坏血酸棕榈酸酯转化牢的影n 向，结果表明5 一2 0 的分子 筛加入量对酯化速牢没有影响，而反应开始就加入分子筛则达不到9 2 的最高转 化率，这是因为酶分子需要微量的水来维持它的活性结构1 2 引。 由此可以看出，恰当控制反应体系的水分活度与酶的活性和催化反应效率密 切相关。 1 2 1 3 反应介质的影响 脂肪酶催化合成反应一般是在有机溶剂中进行，其活力主要受溶剂极性的 影响。必需水的含量与溶剂的极性也有：直1 接的关系，比如疏水的非极性溶剂不容 易夺取酶分子周围的必需水。有机溶剂的选择要综合考虑如下因素：对酶活的影 响、底物和产物的溶解性、挥发性、毒性及反应后处理等。 ? 酶活与反应体系的性质密切相关，一般用极性( 疏水性) 即分配系数的对数 i o g p 来定量描述。g o r m a nl a ，等【2 4 l 认为，有机溶剂会影【4 血酶反应过程。 | 底物和产 物的扩散，会作用于酶微环境的水化层而剥夺表面必需水，另外还会破坏维持酶 蛋白活性的氢键、疏水键、静电作用和范德华力等。l a n n e 等【2 5 j 研究了溶荆l o g p 江南大学硕：l ：学位论文 值与酶活的经验关系：l o g p 2 ，有机溶剂强烈破坏酶的必需水化层，酶无活性； 2 l o g p 4 ，有机溶剂不 破坏酶的必需水化层，酶活较高。目前大多数脂肪酶有机合成中用到的有机溶剂 为：丙酮、叔戊醇、叔丁醇等，因为酶在其中的活性相对较高。 反应体系的极性除了与有机溶剂性质有关外，溶解的底物本身也会对极性产 生影响，进而对酶催化活性产生影响。c h u m e a u 等【3 1 研究了底物棕榈酸甲酯的 不同加入量对体系l o g p 值的影响以及与j ? 化率之问的关系，结果表明随着棕榈 酸甲酯摩尔比的增加，酶催化活性升高，而加入疏水性溶剂使体系达到同一l o g p 值时并无升高，这是因为前者底物浓度上升的缘故。 1 2 1 4 底物摩尔比的影响 底物的摩尔比和浓度都对酶促反应产生影响。底物摩尔比影响反应平衡，而 底物的浓度则直接影响到酶的催化活，因此确定合适的底物摩尔比和浓度十分重 要。 高浓度的底物会提高酶的催化活性【3 】，而过高时会导致底物在介质中的溶解 分散性差的问题【1 9 】。 使底物摩尔比过量是提高反应速率和转化率的常用途径，一般是将其中某一 底物( 大多为酰基供体) 过量，使反应更好向合成方向进行。m a r e ka d a m c z a k 等瞄j 利用c h i r a z y m el 一2 ，c 2 来催化l 一抗坏血酸和油酸甲酯的反应，研究发现当 l 抗坏血酸和油酸甲酯摩尔比由1 ：2 提高到1 ：1 4 时，其转化率由3 3 提高到 6 3 ，且当摩尔比为1 ：4 及更高时，转化率基本趋于恒定；b a r b a r ar e j a s s e 等1 1 9 】 研究发现，在不同的底物浓度下，随着视黄醇和己二酸的摩尔比的提高，转化率 逐渐升高，达到1 ：5 时最高，而更高的摩尔比则导致转化率的下降，这可能是 因为过量的己二酸使反应介质成为了非均相状态，影响了传质效率，或者是己二 酸将酶的活性部位饱和的原因。 1 2 1 5 反应温度和时问的影响 温度不但影响酶的催化活性、操作稳定性，也影l i l _ l 。物的状态以及产物和产 物的传质速度，其中温度对酶的热稳定性和催化活性影响很大。虽然温度越高， 反应速度越快，底物溶解度好，有利于反应的进行，但高温会加速酶活的损失， 因此确定某一反应体系的最适温度必须综合考虑各种因素。 为了得到尽可能多的产物，延长反应时间是最为简便经济的方法。然而，当 反应进行到一定时问时，转化率慢慢由高趋于恒定1 3 1 1 5 】【2 6 j 。随着反应的进行，底 物的减少和产物的增加同时影向酶的活性。 1 2 1 6 其他因素的影响 实际上，影响酶催化效率的因素很多，因素之间也互有联系，在控制主要影 响因素前提下，关注其他次要因素也是必要的。比如，摇床震荡速度关系到外扩 散限制，即底物通过有机溶剂和酶分子j 剐的“必需水”层| 、f q 的界而到达酶颗粒 笙二兰堑堡 表面时所受到的限制，通过加快振荡速度可以减小或克服；加酶量关系到反应的 经济性，有必要找到达到最高催化率时加酶量的下限。 1 2 2 连续反应的影响因素 1 2 2 1 连续式反应器的种类 连续式反应器中的反应过程大都属于稳态过程，即以不断的补充加入新反应 物，来不断获得反应液，整个系统连续稳定的进行反应。反应装置可大致分为填 充床反应器( p a c k e d b e dr e a c t o r ) 和连续搅动反应器( c o n t i n u o u ss t i r r e dt a n k r e a c t o r ) 。图1 1 为k u w a b a r a ，k 等【7 】设计的填充床反应器，图1 2 为q i a o y ul i u 等【2 7 1 设计的连续搅动反应器。目前这两种反应器均适用于糖酯、甘油酯等脂肪酸 连续酯化反应。 图1 - 1 连续式填充床反应器示意图 f i g 1 1s c h e m a t i co fap a c k e dr e a c t o rf o r t h ec o n t i n u o u ss y n t h e s i s 1 进料瓶；2 恒流泵；3 预热管；4 l 一抗坏血酸柱；5 固定化酶柱；6 恒温系统； 收集瓶 l ：f e e dr e s e r v o i r ；2 ：p u m p ；3 ：p r e h e a t i n gc o i l ；4 ：c o l u m np a c k e dw i t hl a s c o r b i c a c i d ；5 ：c o l u m np a c k e dw i t hi m m o b i l i z e dl i p a s e ( n o v 0 4 3 5 ) ；6 ：t h e r m o r e g u l a t e d c h a m b e r ；7 ：e f n u e n tr e s e r v o i r 江南人学硕士学位论文 图1 - 2 连续搅动反应器示意图 f i g 1 - 2s c h e m eo fc s t rf o r t h ec o n t i n u o u ss y n t h e s i s a ：进料瓶；b ：恒流泵；c ：固定化酶；d ：反应底物；e 、f ：磁力搅拌器；g ：水循环 系统；h ：水浴；i ：收集瓶；j ：蠕动泵 a ：f e e dr e s e r v o i r ；b ：p u m p ；c ：c o l u m np a c k e dw i t hi m m o b i l i z e dl i p a s e ( n o v 0 4 3 5 ) ；d ：b a s k e t p a c k e dw i t hi m m o b i l i z e dl i p a s e ；e & f m a g n e t i cs t i r r e r ；g ：w a t e rc i r c u l a t i n gs y s t e m ；h ：w a t e rb a t h ； i ：e f f l u e n tr e s e r v o i r ；j ：p e r i s t a l t i cp u m p 1 2 2 2 连续式反应器反应的影响因素及存在问题 不管采取哪种连续式反应器，反应器内流体的流动状态、底物的摩尔比、反 应介质的水分含量等都会影响到底物的转化率，因此控制好因素就可以尽可能的 提高反应器的产量。 底物溶液流速的影响。流速关系到底物溶液在固定化酶柱中的停留时问，从 而影响到产物的生成状况。可以知道，流速越低，产物浓度越高，反之则越低。 加长固定化酶柱，增加底物溶液流速，可以适当提高反应液的产物浓度。 底物摩尔比的影u 向。在同一流速下，随着底物摩尔比的提高，产物的摩尔浓 度提高，达到一定比例后趋于稳定。因此选择适当的底物摩尔比有利于后期的产 物纯化。 反应介质水分含量的影响。随着反应的进行，反应介质中的水含量逐渐升高， 引起脂肪酶的活力变化，及时除去微揖的水是很有必要的。目前，有机溶剂脱水 的常用方法有：干燥剂脱水法、渗透汽化膜分离方法、萃取和共沸精馏等【2 引。 长期以来，一直困扰着连续式反应器产量不高的问题是：底物( 如糖) 在有 机溶剂中的溶解度太低、脂肪酶活力刘微量水分敏感等。高红霞【2 9 l 对苯基硼酸在 糖酯合成的影h 向过程进行了深入的研究，研究结果表明苯基硼酸的加入明显提高 了葡萄糖的溶解度和反应的专一性。而及时除去水分是尽量保持脂肪酶活力的最 好办法。 6 第一章绪论 1 3 课题研究的目的以及主要内容 l 一抗坏血酸( l a s c o r b i ca c i d ) 本身是一种常用的天然抗氧化剂，其分子中 具有活性的连烯二醇结构，很容易受到光线和温度等外界因素影响而氧化，从而 形成强抗氧化能力。当l 抗坏血酸分子的羟基通过酯化接入亲油性的长链脂肪 酸摹团后，其油溶性增加，成为一种兼具抗氧化性和乳化性的新型食品添加剂。 其结构式如图1 3 所示。 o h 图1 3l 一抗坏血酸脂肪酸酯 f i g 1 3l a s c o r b y lf a t t ya c i de s t e r s l 一抗坏血酸脂肪酸酯作为抗氧化剂主要应用在：油脂f 3 0 】 3 i 】、奶伟1 。1 。( 3 2 1 、以 及化妆品等领域。在各种食用油中的抗氧化性明显优于其他人工合成抗氧化剂； 可延长喷雾干燥奶粉的保质期5 0 7 0 ；另外还可以防止皮肤结缔组织疾病和 抑制癌症等【3 5 】1 3 4 1 。由此可以看出，l 抗坏血酸脂肪酸酯的应用前景将十分美 好。然而目前市售的棕榈酸酯纯度不高，且用化学法合成，不符合当前的绿色发 展潮流。而酶催化合成条件温和，产物分离简单，绿色环保，因此越来越受到人 们的关注。在提高产是的基础上，设计一种管路式合成的途径，将非常有利于工 业化生产。 本论文以l 一抗坏血酸分子为改性对象，设计f 填充床管路式反应器，探讨 了管路式合成过程的影响闪索，并对分离纯化方法进行研究，还比较了改性前后 抗氧化性质的差异，对今后工业化生产具有一定的指导意义。 论文的主要研究内容如下： 1 建立了l 抗坏血酸月桂酸酯检测、分离、制备的方法； 2 研究了管路式生产过程中，底物摩尔比、底物溶液流速、是否加入分予筛等 因素对l 一抗坏血酸月桂酸黼合成的影响。努力提高管路式反应装置荦位时间 的产量。 3 对比研究了l 抗坏皿酸、l 一抗坏m 酸月桂酸酯、l 抗坏血酸棕榈酸酯淬灭自 由基能力和金属螯合能力的差异。 第二章l 。抗坏j f i l 酸月桂酸酯的问歇武酶法合成及产物器定 第二章l 抗坏血酸月桂酸酯的间歇式酶法合成及产物鉴定 2 1 引言 分离、纯化及分析鉴定对合成工业至关重要。对合成产物进行分析，是对合 成工艺进行优化的必要前提。l 抗坏血酸月桂酸酯的酶法合成体系很简单，反应 液由丙酮、少量l 抗坏血酸，一定量的l 抗坏血酸月桂酸酯和月桂酸组成。l 抗坏血酸月桂酸酯的分子结构类似于糖酯，凶此可借鉴糖酯的分析检测和分离纯 化方法。 本章主要探讨了l 抗坏血酸月桂酸酯的间歇式酶法合成，比较了有机溶剂萃 取法、硅胶柱法和h p l c 制备法对反应体系中l 一抗坏血酸月桂酸酯的分离效率。 最终对合成产物进行了结构鉴定。 2 2 实验材料及方法 2 2 1 实验材料 l 抗坏血酸、月桂酸、丙酮、正己烷、甲醇( h p l c 级) 以上均为分析纯 上海i = 回药集团化学试剂有限公司 分子筛( 4 a )钠a 型上海恒业分子筛有限公司 硅胶( 1 0 0 2 0 0 目)分析纯青岛海洋化工有限公司 2 2 2 实验方法 2 2 2 1l 一抗坏血酸月桂酸酯的酶法合成 参考y o u c h u ny a n 等人的研究【4 】，准确称取l 抗坏血酸固体粉末0 4 4 9 ( 2 5 m m 0 1 ) 和月梓酸2 0 0 9 ( 1 0 m m 0 1 ) ( 摩尔比为1 ：4 ) 置于2 5 0 m l 具塞予锥 形瓶中，加入5 0 m l 脱水的丙酮，然后加入1 0 0 0 m g 脂肪酶( n o v 0 4 3 5 ) ，丁5 0 。c 水浴摇床下，避光振荡反应1 2 小时，然后加入l g ( 2 0 9 i 。) 活化的4 a 分子筛， 再继续反应1 2 小时停止。 2 2 2 2 有机溶剂萃取法分离纯化l 一抗坏血酸月桂酸酯 有机溶剂萃取法参考b r a d o os 等人的方法【2 2 1 ，具体步骤如下：反应拳i i 液_ 过滤( 除去脂肪酶、分子筛等，得到清滤液) _ 分别取】o m l 清滤液旋转蒸发除 去丙酮一分另uj j i l 不同体积比的正己烷于2 5 c 溶解，4 c 下静止3 0 m i n _ 于4 c 下， 5 0 0 0 r m i n 下离心10 分钟，得到沉淀- - d h 超纯水5 0 m l ，充分搅匀，离心得沉淀 _ 氮气吹干后得产品。 2 2 2 3 硅胶柱分离纯化法分离纯化l 一抗坏血酸月桂酸酯 用含5 异丙醇的正己烷浸泡硅胶，湿法装柱后( 用锡薄纸紧包柱外壁以避 光) 用正己烷沈1 2 个柱体积，再用含5 异丙醇的正己烷平衡1 个柱体积后上 样，用5 异丙醇的j f 己烷洗2 3 个柱体积并收集，然后用1 0 异丙醇的i e 己烷 9 江南火学硕士学位论文 洗脱，1 个柱体积后开始收集样品，1 个柱体积后停j e 收集。 2 2 2 4h p l c 制备法分离纯化l 一抗坏血酸月桂酸酯 h p l c 制备法：利用半制备h p l c ( w a t e r s l 5 2 5 ，美国w a t e r s 公司) 进行分 离，色谱柱为s u n f i r ec 1 8 ( 5 1 x m ，d1 0 0 木1 5 0 m m ) ，流速5 m l m i n ，进样量l m l ， 流动相为甲醇一水( 体积比7 5 ：2 5 ，水为0 2 甲酸溶液) ，检测器为双波长紫外 检测器( w a t e r s 2 4 8 7 ) ，检测波长为2 4 5 n m 。 2 2 2 5l 一抗坏血酸月桂酸酯纯度、得率的计算方法 纯度的检测采用分析h p l c ( l c 2 0 a ，日本s h i m a d z u 公司) 分析，色谱条 件同2 2 2 6 的分析条件，采用面积归一法定量。 纯度定义为：l 一抗坏血酸月桂酸酯质量( l 抗坏血酸月桂酸酯质量+ l 一抗坏 血酸质量+ 月桂酸质量) 1 0 0 ； 得率定义为：l 抗坏j n l 酸月桂酸酯质量原始反应液巾l 一抗坏血酸月桂酸酯 的含量x1 0 0 。 2 2 2 6l 抗坏血酸月桂酸酯的h p l c 分析 h p l c ( l c 2 0 a ，日本岛滓公司) 条件：色谱柱为s u n f i r ec 1 8 ( 5 p , m ，d4 6 冰1 5 0 m m ) ；流速：l m l m i n ；进样量：5 此；流动相为甲醇水( 梯度8 0 1 0 0 1 0 m i n ，恒流1 0 0 甲醇1 0 m i n ) ；柱温：3 0 ；检测器为蒸发光散射检测器( s e d e x 7 5 ，法闻迪玛公司) 。 2 2 2 7l 一抗坏血酸月桂酸酯的质谱( m s ) 分析 质谱条件：电喷雾电离( e s i ) ；正离予模式 m + n a 】+ ；毛细管电压：3 1 5 k v ；脱溶温度：2 8 0 ；源温：1 2 0 ；离子能量：0 5 e v ；倍增器电压：6 5 0 v ： 第一锥孔电压：4 5v ；第二锥孔电压：5v ；氮气流鼍：3 2 0l h ；分析真空度： 2 6 1 0 5 m b a r ；脱溶剂气温度：3 0 0 ；质龄范围：2 0 0 1 0 0 0 m z 。 2 2 2 8l 一抗坏血酸月桂酸酯分子结构的确定 采用核磁振分析来确定l 一抗坏血酸月桂酸酯的分子结构。 2 3 结果和讨论 2 3 1 有机相中l 一抗坏血酸月桂酸酯的合成 有机介质中，脂肪酶的催化具有专一性和特异性，催化l 抗坏向酸分子与 月桂酸分子直接进行酯化反应，生成一分子水，产物的分子量为3 5 8 。图2 1 所 示为酯化反应反应式。 1 0 第二章l 抗坏血酸月桂酸酯的间歇式酶法合成及产物鉴定 一一一 八 一 且。h + 1 l i ：嚣蛊：”曲r d i c a l i p a s eb 图2 - 1l 一抗坏血酸月桂酸酯的酶罐化反皿式 f i g 2 1r e a c t i o ns c h e m ef o rt h el i p a s e c a t a l y z e ds y n t h e s i so f l a s c o r b y ll a u r a t e 由图2 i 可知，反应液中的主要成分为产物l 一抗坏血酸月桂酸酯以及反应物 月桂酸和l 抗坏血酸。考虑到这些反应底物以及产物的极性差异，实验设计了 有机溶剂分离方法、硅胶柱分离法以及制备液相分离方法，分别探讨了三种方法 的可行性、分离纯化的效果和得率。 2 3 。2 有机溶剂萃取法 在有机溶剂分离法巾，参考b r a d o os 等【2 2 】人分离l 一抗坏血酸棕榈酸酯的方 法利用正己烷分离纯化产物l 抗坏血酸月桂酸酯。正己烷的极性很弱，月桂酸 在正己烷中的溶解度最大，酯次之，而l ，抗坏血酸很小。结果显示，1 0 m l 清滤 液蒸干丙酮厉加入不同体积比( 与反应后清滤液的体积之比) 的正己烷，经过一 次萃取后，月_ 树：酸已大部分被去除，虽然随着体积比的提高，月桂酸去除率提高， 纯度提高，但损失率也相应上升。在体积比达到8 ：5 时，纯度达到最高为8 6 5 ， 得率达到8 5 左右。 2 3 3 硅胶柱分离纯化法 在硅胶柱分离法中，详细探讨了各种不同极性溶剂的分离效果。结果显示： 采用分步洗脱工艺，可以良好地分离合成产物体系中的l 抗坏血酸月桂酸酯、 月桂酸和l 抗坏血酸。利用含5 异丙醇的正己烷可以将月桂酸基本洗脱，提高 洗脱液的极性( 即用1 0 含异丙醇的j e 己烷) ，可以将产物l 抗坏血酸j 桂酸酯 沈脱下来，所得产舷纯度为9 0 4 ，得率大约为8 0 。 2 3 4h p l c 分离纯化法 对半制备h p i ，c 分离反应物体系的研究结果显示，采用流动考i | 为甲醇：水 - - - - 7 5 ：2 5 ( v ：v ) 条件。卜，月桂酸在c 1 8 柱始终被保留。图2 2 为制备的液棚图， 图中保留时间为2 5 m i n 的、乎头峰为l 。抗坏痂酸月桂酸酯峰，由于流速比理论值 江南大学硕士学位论文 低，因此保留时间滞后。将收集到的液体旋转蒸发后得到高纯度的固体产品，检 测得到纯度为9 5 5 的l 一抗坏血酸月桂酸酯，得率超过9 0 。 图2 - 2l 一抗坏血酸月桂酸酯制备的液相图 f i g 2 2p r e p a r a t i v el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yo fl - a s c o r b y ll a u r a t e 2 3 5 三种纯化方法的比较 在三种分离纯化方法中，有机溶剂萃取法虽然操作简单，得率可达到8 5 ， 但产品纯度不高，然而有机溶剂和未反应的月桂酸可以回收利用，所以有进行大 规模生产的可能性；硅胶柱法虽然纯度达到了9 0 以上，但耗时、产量低，而且 得率不高；h p l c 法纯度和得率都很高，但仪器和试剂的耗费较高，样品的前处 理要求比较高，比较适用得到高纯度的少量样品。 2 3 6l 一抗坏血酸月桂酸酯的h p l c 分析 在c 1 8 反相柱中，极性越强的物质出峰越早。由于本反应体系比较简单， 反虑液混合物中只有反应物l 抗坏血酸与月桂酸以及产物l 抗坏皿酸月桂酯。 图2 3 为l 抗坏血酸与月桂酸反应后反应产物的h p l c 图谱( 检测器为蒸发光散 射榆测器) ，由于随着反应过程，1 7 4 6 m i n 和1 5 。8 2 2