（食品科学专业论文）红酵母色素的提取、分离及其抗氧化功能的研究.pdf

摘要 类胡萝b 素是全球生念系统中的一大类色素，其在人类生活、保健、医疗 上的重要性逐渐为人们所认识，以卢胡萝h 素为代表，作为食品添加剂起色素 和营养强化剂的作用，另外，其出色的抗氧化功能也被研究所证实。 红酵母是形态结构较简单的一种真菌，可产生酵母红素、卢胡萝p 素、番 茄红素、虾青素等多种类胡萝b 素。利用红酵母生产类胡萝h 素具有许多其他 工业微生物不可比拟的优点。 本文以粘红酵母发酵液的菌体为原料，研究了红酵母中色素的提取工艺， 比较了浸提法与超声波提取和微波提取的效果，最终确定有机溶剂浸提为本实 验的最佳方法，通过提取单因素实验和f 交实验得到有机溶剂浸提法的最佳条 件为：提取溶剂为丙酮，提取温度为3 5 。c ，提取时问为6 0 r n i n ，提取料液比为 l ：3 0 ( m v ) ，提取级数为2 级。 红酵母产生的色素属于类胡萝h 素，本文分别研究了光照、温度、有机酸、 氧化剂和还原剂对其稳定性的影响，实验结果说明红酵母色素对温度的稳定性 较差，在4 0 以上时，会随时间的变化而变化；对光特别是室外闩光很不稳定， 对紫外光和室内散刺光也不稳定，在避光状态下色素几乎没有变化；对酸的稳 定性较差；氧化剂( 过氧化氢) 能氧化红酵母色素，在2 4 h 内使红酵母色素的 吸光度从08 降到0 2 ；而还原剂( b h t 和v c ) 对红酵母色素有一定的保护作 用。 为了研究红酵母色素的抗氧化性，本文分别采用还原k 。f e ( c n ) 6 法测定其 还原力、以氧化c t 脱氧核糖法测定其清除羟自由基的能力，最后测定了其抵抗 卵磷脂和亚油酸脂质体氧化的能力。其实验结果表明红酵母色素具有较强的还 原力，且随着浓度的增加而增加：红酵母色素对羟自由基有很强的清除能力， 在相同实验条件下其清除自由基的能力与标准抗氧化剂a 一生育酚相当：红酵 母色素的对卵磷脂脂质体氧化有一定的抵抗能力；红酵母色素有较强的抗亚油 酸脂质过氧化能力，在粗物质浓度为3 3 3 3 m g m l 的时候相当于对照n 一生育酚 的抗氧化能力。 最后本文采用薄层层析法( t l c ) 和高效液相色谱法( h p l c ) 对色素进行 了分离和初步鉴定，结果显示红酵母色素至少含有4 种组分，其中一种色素可 能是$ 一胡萝p 素。 关键词：红酵母，色素，抗氧化 a b s t r a c t t h ec a r o t e n o i d si sam a i nk i n do fp i g m e n t si nw o r l de c o s y s t e m ，i th a sb e e n k n o w na sa ni m p o r t a n t p i g m e n t sw h i c hc a nb eb e n e f i t e df o rp e o p l e sl i f e ，h e a l t ha n d m e d i c a lt r e a t m e n t s t h ep c a r o t e n o i di sa t y p i c a lc a r o t e n o i d s w h i c hh a sb e e nu s e d a s p i g m e n t a n dn u t r i t i o n s t r e n g t h e n e r i nf o o di n a d d i t i o n ，i t h a se x c e l l e n t a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw h i c hh a db e e nt e s t i f i e db ym a n y e x p e r i m e n t s t h er h o d o t o r u t a r u t i n i si sak i n do f e p i p h y t ei ns i m p l ec o n f i g u r a t i o n ，i tc a n p r o d u c em a n ys p e c i a l c a r o t e n o i d sw h i c hi sl i k e t o r u l a r h o d i n ，卢- c a r o t e n o i d ， l y c o p e n e ，a s t a x a n t h i n e ta li ti s s u p e r i o rt o o t h e ri n d u s t r i a lm i c r o b et o p r o d u c e c a r o t e n o i d sb yr h o d o t o r u l a r g l u t i n i s t h er h o d o t o r u t a r g l u t i n i st h a l l iw a su s e dt or e s e a r c ht e c h n i c so fe x t r a c t i o ni n t h i sp a p e r i nt h ee x p e r i m e n t ，t h r e em e a n so f e x t r a c t i o n ，u l t r a s o n i c ，m i c r o w a v ea n d s o a k i n gw e r ec o m p a r e di ne x t r a c t i n ge f f e c t ，f i n a l l y , s o a k i n gw i t ho r g a n i cs o l v e n t s w a sd e t e r m i n e dt ob et h eo p t i m a lm e t h o d ，w h i c hd e s c r i b e da sf o l l o w s ：t h eo p t i m a l o r g a n i cs o l v e n t sw a sa c e t o n e ，t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s3 5 。c ，t h eo p t i m a lt i m e w a s6 0 r a i n ，t h eo p t i m a lm a t e r i a l l i q u i dw a s1 ：3 0 ( m v ) a n dt h e o p t i m a le x t r a c t i n g g r a d ew a ss e c o n dg r a d e t h e p i g m e n t sp r o d u c e db yr h o d o t o r u l a rg l u t i n i sb e l o n g e dt oc a r o t e n o i d s t h e s t a b i l i t yo ft h ep i g m e n t si nd i f f e r e n ti l l u m i n a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，a c i d ，o x i d a t i v ea n d r e d u c t i v es i t u a t i o nw a ss t u d i e di nt h i sp a p e r t h er e s u l ts h o w e dt h a ta l lt h e s ef a c t o r s b u tt h er e d u c e rc a ni n f l u e n c et h es t a b i l i t yi nd i f f e r e n td e g r e e ，h o w e v e rt h ea d d i n go f r e d u c e rw i l li m p r o v ei t i no r d e rt o s t u d yt h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so ft h ep i g m e n t so fr h o d o t o r u l a r g l u t i n i s ，t h er e d u c i n gp o w e r , t h es c a v e n g i n ga b i l i t yo nh y d r o x y lr a d i c a la n dt h e i n h i b i t i o n a b i l i t y o no x i d a t i o no fl i p o s o m es y s t e mw e r et e s t e d t h e e x p e r i m e n t s i n d i c a t e dt h a tt h ep i g m e n t sh a ds t r o n gc a p a c i t yo f s c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a la n d h a dc o m m o n l yr e d u c i n gp o w e ra n dt h ei n h i b i t i o na b i l i t yo r lo x i d a t i o no fl i p o s o m e s y s t e m a tl a s t ，t h ep i g m e n t sa n di t sc o m p o s i t i o nw e r es e p a r a t e da n di d e n t i f i e db yt l c a n dh p l c ，m o r et h a nf o u rc o m p o n e n t sw e r es e p a r a t e da n do n eo ft h e mc o u l db eb c a r o t e n o j d k e y w o r d s ：r h o d o t o r u l a r g l u t i n i s ，p i g m e n t ，a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s 天津科技人学硕十学位论文 1 前言 1 1 红酵母色素 1 1 1 红酵母的概况 酵母菌是以芽植为主、形态结构比较简单的一类真菌。红酵母属 ( r h o d o t o r u l ah a r r i s o n ) 属于半知菌亚门，尚未发现其有性阶段，若发现其有性 阶段则被归入担子菌亚门红色冬泡酵母属( r h o d o s p o r i u mb a n n o ) ”。目前，红酵 母属真菌的分类是根据它们的形态和生理生化特征进行的，这种分类方法有一 定的合理性，因为形态结构和生理生化特征一致的个体，可能遗传背景一致， 但同时存在一些问题。不同学者由于所选用的分类指标的种类和数量不同，使 红酵母属内种的划分出现不一致。l o d d e r 等( 1 9 7 0 ) 将红酵母属真菌归为9 个种4 个变种，k r e g e r - v a nr 等( 1 9 8 4 ) 简化了红酵母属的分类指标把红酵母属真菌 合并为8 个种，这8 个种通过6 项特征性生理生化指标( n o + ，m e ，m a ，m z ， r a ，e r ) 相互区分，其中，把果蝇红酵f f ( r h p i l i m a n a e & b u r k e ) 合并入深红酵母 r 砌r u b r al o d d ) 。 红酵母可产生类胡萝h 素：圆酵母素( t o r u l e n e ) 和红酵母红素 ( t o r u l a r h o d i n ) ，此外还积累少量的口一胡萝h 素。其中酵母红素为可与蛋白质 结合的类胡萝i - 素，其结构与口一胡萝h 素极其相似。口一胡萝b 索作为一种天 然色素其营养、药用、保健等作用被广泛应用于饮料、食品、化妆品及饮料添 加剂。近年来，口胡萝h 素的需求急增，一直处于供不应求的状态。目前口一 胡萝l - 素的生产以合成法为主，但合成法生产的食用色素因毒性问题，使其在 食品工业中的应用受到限制。食用天然色素的生产将为今后的发展趋势。用生 物方法制取芦一胡萝h 素的方法有两种，一种是用培养盐藻来提取罗一胡萝p 素， 另一种是用微生物发酵法生产。其中，采用三孢布拉氏霉菌生产，菌体生长迅 速，生物量高，但发酵过程复杂，成本高，产业化困难；采用红酵母发酵生产 胡萝h 素，虽然其色素含量较三孢布拉氏霉菌低得多，但其成本低，易于产业 化，且菌体可综合利用。因此具有较大的应用价值和开发前景。所以以红酵母 为菌种，通过细胞培养、细胞破碎及色素提取等过程，获取天然胡萝h 素制品， 是一项很有发展前景的微生物技术。 1 1 2 红酵母的研究开发近况 酵母具有作为色素生物来源的一些必要特征：快速异养代谢，培养时间短， 能够在发酵罐中实现高密度培养，以及色素提取后菌体单细胞蛋白可作为饵料、 饲料添加剂，因此酵母产类胡萝卜素成为目前研究的热点。 目前发现产类胡萝h 素的酵母只有两个属：普法夫酵母属( p h a f f i a ) 和红 前言 酵母属( r h o d o t o r u l a ) ，前者以产虾青素为主( p h a f f ，1 9 7 6 ) ；后者产卢胡萝h 素、酵母红素等多种类胡萝h 素。产虾青素的普法夫酵母伊h a f f i ar h o d o z y m a ) 的干制品已在国外市场大量销售，作为饲料添加剂，年销售额在1 亿美元以上 2 1 。早已有报道深红酵母( r h o d o t o r u l ar u b r a ) 可以发酵生产酵母红素和b 胡萝h 素，但该产品目前仍未得以推广，主要原因在于：与杜氏藻相比，红酵母色素 普遍含量较低，提取方法及发酵条件尚待改进，从而使天然产品的成本远高于 合成色素。类胡萝h 素是一类有广泛应用价值的天然色素，细菌、霉菌和酵母 菌形成类胡萝b 素都有报道，但其中酵母菌生产类胡萝h 素有许多其他工业微 生物无法比拟的优点，它不但发酵周期短、产量高，而且菌体含有丰富的蛋白 质、氨基酸和维生素等，色素提取后，其菌体下脚料还可作为饵料、饲料加以 综合利用。因此，许多国家都在竞相开发研究。 许多研究者利用遗传育种及基因工程的手段来获得高产类胡萝h 素的工程 菌，国外，较早开展诱变育种的是产虾青素的红法夫酵母( p h a m ar h o d o z y m a ) ， 在这方面取得了很大的进展。1 9 7 0 年p h a f f i a 等人在美国阿拉斯加的高山及日 本的北海道地区发现这一菌株时，其类胡萝h 素产量仅3 0 0 4 0 0 p g g 干细胞 孙。 通过利用e m s ，n t ga n t i m y c i n 等进行诱变产量分别达到了6 3 0 9 9 g 干细胞、 1 0 5 0 彬g 干细胞、9 6 0 g g 千细胞【4 j 。另外有报道，该酵母通过诱变处理后，封 锁了d 一胡萝h 素氧化为虾青素的途径，从而成为过量累积d 胡萝h 素的菌株【5 】。 现在，利用诱变红酵母获得高产b 一胡萝b 素的菌株也取得了进展忙】。另外，通 过改变发酵条件及添加发酵助剂来提高类胡萝h 素的产量，国内外学者在这一 方面进行了研究并且取得了定进展。刘月英、陈晓强等人通过添加桔子皮和 盐酸硫胺素并以蔗糖为碳源，经发酵优化使他们所筛选的一株红酵母类胡萝h 素产量达到1 1 5 5 m g l 【7j 。王怡平、汪朝晖发现稀土元素对红酵母类胡萝h 素的 合成有促进作用【8 】。r a v i n d e 利用泥炭水解液发酵红酵母也获得了成功【9 。 在获得经基因工程改造的高产工程菌方面日本走在了前列，n o r i h k o m i s a m a 领导的科研小组通过将从欧氏杆菌( e r w i n i a ) 分离到的c r t e ，c r t b ，c r t i 基 因转入假丝酵母c a n d i d a “盯船中，并通过截断( d i s r u p t i o n ) e r g 9 基因的方法使 类胡萝h 素合成支路另一端合成麦角圃醇( e r g o s t e r 0 1 ) 的s q u a l e n e 合成酶大大削 弱，从而获得了高产番茄红素的工程菌，其产量可达7 8 m g g 干重【l 。据n o r i h k o m i s a m a 在其论文 1o 中披露，他们用这种方法己获得了产b - 胡萝h 素的工程菌。 此外，路福平】、徐虹【1 2 1 等作了利用红酵母转化反式肉桂酸生成l 苯丙氨 酸的研究。 1 1 3 类胡萝h 素的介绍 随着类胡萝h 素在人类生活、保健、医疗上的重要性逐渐为人们所认识， 以及天然类胡萝h 素制品的需求量的增加，开发利用天然类胡萝h 素资源己成 天津科技大学硕士学位论文 为一个引人瞩目的发展趋势。目前，天然类胡萝b 素主要有三大来源：( 1 ) 一 些富含类胡萝h 素的植物，如胡萝b 、木瓜、南瓜等；( 2 ) 富含类胡萝h 素的 微生物( 微藻) 资源：( 3 ) 废弃的富含类胡萝b 素的动物资源，主要是虾、蟹 的甲壳【1 3 j 【1 4 】。目前，市场需求较多且开发效果较好的天然胡萝h 素产品主要有 一胡萝b 素、虾青素、番茄红素、叶黄素l l 。 目前市场上出售的口胡萝b 素产品有化学合成品和天然色素两类。其中 化学合成品占主导地位。化工合成的鼻一胡萝b 素相对纯度高，生产成本低，但 它的缺点是：( 1 ) 某些胡萝b 素合成技术复杂，在合成的产品中，少量的成分有 毒【1 5 】：( 2 ) 化学合成品被人体吸收的比例也较少【1 6 】；( 3 ) 化学合成品也影响食品及 所饲动物的口味1 16 】；( 4 ) 胡萝b 素的合成品，与维生索a 、c 一样，用量过大 ( 大于1 2 0 m e g d ) 有一定副作用。而天然夕一胡萝b 素与化学合成的卢胡萝b 素 有顺反异构体上的差异，使得天然卢。胡萝b 素在进入人体后可以转变为维生素 a ，不会有因过量摄食而造成维生素a 累积中毒现象。因此与化学合成的产品 相比，天然口一胡萝b 素拥有更高的附加值。同时，天然卢一胡萝h 素也更迎合 当今绿色、环保的潮流。 随着毒理学和分析技术的不断发展，合成法生产食用色素的毒性问题越来 越受到人们的关注，国外许多国家相继制定了一系列限制合成色素使用的法规， 有的国家( 如挪威) 甚至禁止使用任何合成色素。我国对合成色素的生产及使用 也非常关注，并于1 9 9 1 年做出合成食用色素的定点生产及婴j l 4 - e 孚l 品不得使用 合成食用色素的规定。因此，大力开发天然食用色素的生产将成为今后的发展 趋势。 1 1 3 1 类胡萝b 素的结构和分类 胡萝b 素是由几个异戊二烯单位构成、含有多个双键的化合物，呈黄、橘 红等色。它们是自然界分布广泛和十分重要的色素之一，存在于整个植物界所 有进行光合作用的植物组织和一些微生物的细胞中，并通过食物链转化，在动 物的不同组织贮存【i ”。类胡萝h 素一般可分为两类：胡萝h 素和叶黄素。前者 以芦胡萝b 素为代表，仅含碳、氢两种元素，后者则是两者的含氧衍生物，如 虾青素。另一种分类系统是将类胡萝h 素分为链状、单环和双环衍生物，它们 的母体代表化合物分别为：y 胡萝b 素、番茄红素、卢一胡萝b 素【1 8 】，结构式 如图1 1 ： r 一胡箩h 素 前言 f h 3 声胡萝h 素 番茄红素 幽1 1 类胡萝h 素的结构 类胡萝b 素因其卓著的功能及其良好类的应用前景，f 引起众多研究者的 关注。 1 _ 1 3 2 类胡萝b 素成为研究热点的原因 类胡萝h 素作为全球生态系统中的一大类色素，它们不仅赋予各种生物美 丽的色彩，作为光合作用的辅助色素，类胡萝h 素参与执行光能传递和物质转 化、抗光敏化作用、淬灭自由基等重要的生理生态功能，而且还能保护生物体 免受不利环境因素的伤害。例如由于臭氧层的空洞扩大，紫外线辐射的增大而 造成对动、植物有害的影响和人类皮肤癌的增加，类胡萝h 素对此也能起保护 作用。这对于维护生态系统的正常运转意义重大 ”】。 类胡萝b 素分子中重要的共同结构是有一条9 个双键的异戊二烯链，在其 两端各有一个p 紫萝酮【l ，此p 一紫萝酮可能以异构型、取代型和开环型的形式 存在，从而使得自然界中存在结构多样的类胡萝h 素。自然界中存在着6 0 0 多 种类胡萝b 素，其中有5 0 余种能被人体利用，并具有维生素a 原的活性【2 。 其中以b 胡萝b 素最为典型，其作为前维生素a 的活性也最强，它被认为是人 体获得必需的维生素a 的重要来源。 维生素a 缺乏症是世界卫生组织确认的世界四大营养缺乏症之一。据统计， 每年有7 0 多个国家的3 0 0 0 多万儿童因缺乏维生素a 而造成致命性疾病( 2 “。b 胡萝h 素作为维生素a 的前体，用于治疗由于缺乏维生素a 引起的各种疾病， 如上皮细胞角质化、皮肤干燥，表皮组织改变而受到的病菌侵袭，胃肠粘膜表 皮受损引起的腹泻。泪腺分泌障碍引起的干眼病、夜盲症等。b 胡萝h 素被摄 人体内，可分解为两个分子的维生素a 吸收利用。b 一胡萝h 素能较多贮存在肝 脏内，不会引起过量维生素a 产生的毒害，而被称为无毒维生素a 。 类胡萝、素形成维生素a 的反应是由具前维生素a 活性的类胡萝h 素和在 肠道b 。胡萝h 素，15 ，1 5 - 双加氧酶的作用下完成的吲。具前维生素a 活性的类 天津刹挝人学坝l 学位论文 胡萝h 素可以通过两种途径转化成v a ，即偏心裂解( e c c e n t r i cc l e a v a g e ) 和中心 裂解( c e n t r a lc l e a v a g e ) ”3 2 4 】。目前已有有力的证据证明在人体中这两种裂解机制 都存在 2 5 。2 们。 科学家们对类胡萝h 素在体内的生理活性与防治疾病的机理进行了深人的 研究探讨，一致认为类胡萝h 素尤其是b 胡萝h 素和番茄红素是极好的抗氧化 剂，在人体内起到清除氧自由基的作用【2 ”。生物体中存在大量的脂质过氧化和 自由基反应，从而导致细胞功能的下降，机体的衰老以及疾病的发生。因此， 类胡萝h 素可以清除自由基以及淬灭单线态氧的活性受到了普遍的关注。 在光敏反应中，三线态的光敏分子( 3 s e a ) 往往通过两种途径衰变回基态口”： 其一是与生物分子发生光化学反应，产生能起始自由基反应或损害细胞的自由 基物质，从而使自己回到基态；其二是直接与氧分子反应，由于分子氧具有三 线态的基态，通过反应使自己回到基态，而产生极其活跃的单线态氧( 1 0 2 ) 。类 胡萝h 素就可在三线态光敏分子( 3 s e n ) - 与生物分子或氧分子反应之前使它淬灭。 但在某些情况下，类胡萝 素并不能使所有的三线态光敏分子都失活，从而会 导致自由基物质和单线态氧的形成。在这种情况下，类胡萝h 素惊人的清除自 由基和淬灭0 2 的能力还会将自由基物质和单线态氧钝化，使它们回到基态。 m a s c i o 等指出类胡萝h 素的抗氧化性是由其有效共扼双键数决定的，因此在天 然类胡萝h 素中，番茄红素由于萁结构特性而表现出最强的淬灭单线态氧活性 2 9 1 。 目前已经有很多关于服用类胡萝h 素对免疫活性变化的影响的报道3 0 - 引】。 在8 0 年代初s e i f l e r 和他的工作组就己发表了增补类胡萝h 素可以增强免疫活 性的报道“。b e n d i c h 在1 9 9 1 年又指出：类胡萝h 素能增加免疫系统中b 细胞 的活力，从而消灭外源入侵的病源菌；类胡萝h 素能提高淋巴辅助t 细胞( c d 。 细胞) 的活力，能协助b 细胞产生抗体，并提高其它免疫组分的活性：类胡萝h 素能增加自然杀伤细胞( n k ) 的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞1 3 3 】。 关于d 一胡萝h 素能增加免疫功能的报道已有很多 3 4 - 3 5 1 ，目前还了解除了1 3 胡萝 h 素外番茄红索以及斑蟊黄素等其它类胡萝h 素也具有增强机体免疫功能的作 用。 大量的流行病学研究一致表明经常的摄入富含类胡萝h 素的果蔬可以在很 大程度上降低多种癌症的发病率，包括如肺癌、口腔癌、胃癌和食道癌等。流 行病学认为癌症的低发病率与血清中离水平的类胡萝h 素也存在密切的关系。 从1 9 7 5 年到1 9 9 2 年的4 6 项有关膳食中或血清中类胡萝l - 素水平与肺癌发病率 之间的关系的研究中，有4 1 项研究发现摄入类胡萝h 素水平高的或血清中类胡 萝h 素水平高的的受试者，其肺癌的发病率显著较低。从众多的研究看来，番 茄红素预防前列腺癌、肺癌和胃癌发生的证据最充分，对其它类胡萝h 素的流 行病学研究发现，叶黄素的血清水平和肺癌的发生有反向的关系，a 胡萝h 素 前言 的血清水平和宫颈癌有反向关系p “。 在类胡萝h 素增强细胞间隙连接通讯的功能上以b 一胡萝b 素研究的最多。 目前，有关b 一胡萝p 素抗癌机理有以下几种；转化为类视黄醇而起作用、抗氧 化机制、提高机体免疫力等。但在2 0 世纪8 0 年代末9 0 年代初，p u n g ，b e r t r a m 等首次提出并证明有关p 一胡萝h 素与转化为类视黄醇及抗氧化机制无关的抗癌 作用机制，即b 胡萝h 素能增强细胞间隙连接通讯，抑制细胞的恶性转化 3 3 8 。 研究表明d 胡萝b 素是细胞间通讯的诱导剂，它能增强转化的癌起始细胞与健 康细胞之间的交流作用，而且目6 口研究人员通过荧光染料示踪技术已获得b 胡 萝b 素增强转化细胞和未转化细胞问的g j i c 功能的直接证据，但对于其具体 的调节机理尚不清楚。 k n e k l 等研究发现血清中d 一胡萝h 素和a 生育酚浓度低的人群中患白内障 的可能性显著高于血清中d ，胡萝b 素和一生育酚浓度高的人群【3 9 】。在另一项试 验中，研究者发现在5 万多名受试者中v 一摄入水平高的人群与摄入水平低的 人群比较，其自内障发病率低了3 9 。目前，在眼组织发现了两种类胡萝h 素： 叶黄素和玉米黄素，它们可以淬灭单线态氧，可能因此降低了氧化对品状体蛋 白的胁迫，而d 胡萝h 素可以整体性的降低系统的氧化胁迫，从而间接的降低 了白内障的发生。 与衰老相关联的色斑退化可以导致健康者全盲，这已是引起西方社会中6 5 岁以上的老年人失明的主要原因。色斑退化的发生率与维生素a 前体类胡萝h 素如d 胡萝b 素的摄取之间存在显著的负相关【4 。有研究报道在类胡萝h 素摄 入水平中等或高的人群中其色斑退化现象显著降低，分别降低了5 0 和7 0 ， 并指出与其它5 种摄入的类胡萝b 素比较，以b 胡萝b 素最有效。 1 1 3 3 类胡萝h 素的生物合成 通过大量的研究，人们已基本上搞清楚了类胡萝h 素生物合成的主要途径。 它是一类自乙酰c o a 开始的次生代谢产物，其形成过程为：3 个乙酰c o a 分子 通过失去羧基而缩合成3 一甲基3 ，5 二甲基戊酸( m v a ) ，在酶的作用下磷酸化形 成焦磷酸酯并经脱羧后形成异戊二烯焦磷酸( i p p ) ，异戊二烯焦磷酸在异构酶作 用下异构为二甲基丙烯基二磷酸( d m p ) ，d m p 与i p p 通过缩合产生二甲基辛烯 二甲基辛烯焦磷酸( g p p ) 、f p p ( 法尼基二磷酸) 、二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸 ( g g p p ) 。2 个g g p p 在八氢番茄红素合成酶( p s y ) 作用下头对头进行二聚作用 形成第1 个无色的类胡萝b 素八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续的脱氢反 应，共扼双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的 作用下分别生成d 胡萝b 素、d 胡萝b 素，在0 【、p 一胡萝h 素的c 4 位置引入酮 基和c 3 位置引入羟基以及在d 一环上引入c ( 5 ，6 ) - 环氧基后，则形成结构更为 复杂的叶黄素等【4 0 “j 。其过程详见图1 2 ： 天津科技大学硕士学位论文 乙酰c o a 0 3 3 - 甲基3 ，5 - 二甲基戊酸( m v a ) 0 异戊二烯焦磷酸( i p p ) 二甲基丙烯基二磷酸( d m p ) 甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸( o o e v ) i 八氢番茄红素 l 丫 六氨番茄红素 酬萝h 素 上 链孢红素 0 番茄红素 v 胡萝h 素6 一胡萝h 索 j上 海胆酮一胡萝b 素。一胡萝h 素 上上0 角黄素0 - 隐黄质叫黄质 上0 虾青素玉米黄索 0 十 环氧玉米黄素辣椒红素 卜辣椒玉红素 新黄质 国1 - 2 类胡萝p 素的生物合成 1 2 活性氧与天然抗氧化剂 ”燃0 g 1 前言 氧气是一切需氧生物包括人类生活必不可少的，在生物体中，氧是生物氧 化过程中的重要电子受体。基态的氧分子为自旋三重态，具有顺磁性，含有两 个未成对电子。按照自由基的定义，任何包含一个未成对电子的原子或原子团 均可称为自由基，基态氧也可看作自由基。当基态氧接受电子后会生成一系列 含氧而且具有高度化学活性的自由基，例如超氧阴离子自由基( 0 2 ) ，羟自 由基( o h ) 等，可称为活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 。【4 3 4 4 j 除了这 些活性氧，活性氧还包括单线态氧( 1 0 2 ) ，过氧化氢( h 2 0 2 ) ，次氯酸( h c i o ) 以及脂质过氧化的中间产物等。 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 简称r o s ) 被公认为是癌症、慢性病和 老化的诱因，同时人们也发现多种天然食品对上述病症有预防作用。天然食品 的这种功效主要是由于其中含有清除r o s 的有效活性成分。事实上，已有大量 生物活性物质如植物中的黄酮、茶叶中的茶多酚都己被证实具有清除自由基的 作用。关于富含番茄红素的番茄和富含a 生育酚的大豆这两类食品的对人类健 康有益的文章也屡见报道，番茄红素己被证明是非常有效的单线态氧淬灭剂， 同时也对氮氧自由基( n o ) 、磺酰基( r s 0 2 ) 等自由基有清除作用；而a 生育酚对脂类过氧化的抑制作用也得到了公认。 1 2 1 自由基与活性氧 自由基是游离存在的带有不成对电子的分子、原子或离子，其化学性质非 常活泼、不稳定、寿命很短、自由基反应最大特点是它往往以链锁反应的形式 进行。在生物体内不断产生自由基，但同时也不断被机体内的自由基清除系统 所清除掉，在生理条件下自由基的生成与清除处于平衡状态，自由基浓度是极 低的，不会造成损伤机体，而且还可显示出许多生理作用。而在病理情况下， 环境物理因素或外源性化学物质直接或间接诱导产生的自由基过多，得不到及 时清除，或者机体内源性自由基的产生和清除失去了正常平衡，常常会造成自 由基对机体的损伤，导致衰老和发生多种疾病。 在人体内常见的自由基有：超氧阴离子自由基0 2 一、羟自由基o h ；氢 过氧自由基h o oj 脂过氧自由基r 0 0 等。0 2 在体内可被超氧化物歧化酶歧 化为h 2 0 2 与0 2 ，h 2 0 2 又可被过氧化氢酶，过氧化物酶分解为h 2 0 与0 2 而无 害化。所以s o d 是清除活性氧的重要的酶，s o d 活性的低下也会造成活性氧 的过剩，引起不平衡，损伤机体。 1 2 2 自由基对生物大分子的损伤 1 2 2 1 自由基引起脂质过氧化形成过氧化脂质( l p o ) 或称脂质过氧化物，致使 细胞膜( 包括细胞器膜) 的脂质变性，膜损伤失去弹性老化，甚至破坏，细胞死 天津科技大学颁士学位论文 1 - 2 2 2 自由基损伤d n a ，引起d n a 氧化或交联，产生一些缺陷如糖苷键断裂， 无碱基位点，或碱基一核苷酸变化，都可能造成d n a 分子出现缺陷，导致遗 传信息的错误，这可能是引起衰老，肿瘤的一个重要原因。 1 2 2 3 自由基引起蛋白质发生交联、变性、致使许多酶蛋白活性下降或失活； 胶原蛋白的变性会引起皮肤起皱、骨骼变脆、晶状体透明度降低( 白内障) 等， 也是引起衰老的原因。 自由基对生物大分子核酸，蛋白质的损伤相对膜脂质过氧化损伤，往往是 导致衰老和引发多种疾病的最基本的病理生理变化，成为多种疾病发生过程中 一个关键性的环节，所以引起生物、医学界的高度重视，近十余年自由基生物 学与医学的研究发展很快，在世界范围内成为生物医学研究的一个热点。 1 3 h p l c 在类胡萝l - 素检测中的应用 由于类胡萝b 素结构的多样性，至今己有7 0 0 多种类胡萝b 素已被确认， 而每种类胡萝p 素都有不同的顺反异构体，从而使得它们的功能发生改变，因 此，现在对类胡萝b 素的生物学功能和作用机理尚未完全了解。为了能在类胡 萝b 素营养学研究中获得可靠和有价值的结论，测定食物中类胡萝b 素组成， 获得可靠的资料变得非常必要。基于此出发点，类胡萝h 素分析方法的研究也 成为类胡萝p 素研究上一个热点。由于类胡萝b 素理化性质及生物学性质的复 杂性致使发展一套简单、快速的检测方法成为一个难题。随着分离技术和硬件 的改进，高效液相色谱技术也得到进一步的发展，h p l c 在食物类胡萝i - 素检 测中应用也越来越广泛。 1 3 1 类胡萝h 素的提取和样品前处理 类胡萝b 素的共扼双键给类胡萝h 素的提取带来很大困难。类胡萝p 素的 双键结构使得它们具有高度的不稳定性：对光、氧、热和活性界面特别敏感； 酸性或碱性条件下对某些类胡萝h 素也会有影响。以上任何一个因素都能引起 类胡萝p 素的降解、结构的转变和其它一些物化反应，导致样品中类胡萝h 素 组分的改变。因此，在提取类胡萝h 索时必须有一些预防措施，以防止或尽可 能减少降解。比如，在提取过程中应加入一些抗氧化剂：实验应在暗光灯下进 行：尽可能避免阳光的直接照射；在浓缩样品液时须用旋转蒸发器或用氮气吹 干；样品液须在充氮后存放在2 0 。c 的黑暗环境中。采用加入抗氧化剂是在提取 和样品处理过程中防止类胡萝b 素氧化的最常用的方法。常用的抗氧化剂有乙 氧基喹琳、焦性没食子酸、抗坏血酸及b h t ，其中以b h t 用的最多【4 。一般 是在提取剂中加入0 0 1 或0 1 的b h t 。 1 3 2 色谱法在类胡萝b 素分析中的应用 前高 由于现代h p l c 方法重复性好，自动化程度高，因此，经典的丌放性柱色 谱分析方法已被取代，换之而来的是更加小型化，更加精确，更加自动化，操 作更方便的新一代h p l c 。现代的h p l c 中，有一些部件有专门的软件来控制 其参数，也有自动处理色谱图以及数据处理的软件，使得h p l c 应用更加方便。 随着色谱技术的发展，用于检测类胡萝h 素的h p l c 的分光光度检测器也 得到了相应的发展。新一代的检测器具有高度的灵敏度及精确度，而且可以对 任何特定波长的吸收光谱进行检测( 1 9 0 8 0 0 n m ) ，二极管阵列检测器( d a d ) 就是 近几年发展起来的检测器。它不需停留便可获得1 9 0 8 0 0 r i m 范围的吸收光谱图： 可以提供时间、波长、吸收值的彩色三维图谱；可以从9 个角度观察色谱峰， 鉴别重叠峰和确认每个峰的纯度，获得真实的结果；可以提供6 个通道的色谱 峰面积的计算和定量，而且可以从贮存器中查寻各波长的数据，不需反复进行 大量工作【4 6 j 。d a d 的这些特性使其成为非常适于类胡萝h 素的检测，现在，越 来越多的文献报道了d a d 在类胡萝h 素分析中的应用。在类胡萝h 素的分析 中，d a d 的波长检测范围的设定依赖于实验的目的。o l i v e r 等人最近在类胡萝 h 素分析中用了3 5 0 5 5 0 n m 的检测范围 2 8 ，而用d a d 系统分析样品时，为了 能同时检测视黄醇、生育酚和类胡萝h 素，用了2 5 0 5 5 0 n m 波长范围。 目前，常用于类胡萝h 素分析的h p l c 方法主要有两类：f 1 ) 正相 h p l c ( n p c ) ，采用以硅胶为固定相的f 相色谱法有利于其顺反对映体的分离， 但却不利于0 1 及d 一位置异构体的分离，而且作为分离柱填料的硅胶还能促进类 胡萝h 素的降解。( 2 ) 反相h p l c ( r p c ) ，反相h p l c 是目前应用得最多的和最有 效的方法，它选用非极性的键合相为固定相，最常用的是c 】8 。c r a f t 4 ”，王强 【4 8 j 等人报道利用该系统成功地分离了多种类胡萝h 素。 1 3 2 1h p l c 在类胡萝 素检测中的应用 g r a n a d o 等用s p h e r i 5 r p 1 8 ( p h e r i 5 o d s ) 色谱柱，以乙腈二氯甲烷一甲醇 f 7 0 ：2 0 ：1 0 v ，v ) 作为流动相在1 8 m l m i n 的流速下，分析了西班牙一些蔬菜中f 包 括新鲜的和烹饪过的) 的类胡萝h 素的组成为了能分离出叶黄素和玉米黄质，可 采用乙睛甲醇( 8 5 ：1 5 ，v v ) 作为流动相。该研究中用海胆酮和棕榈酸视黄酯作为 内标物，用可调节多波长检测器在4 5 0 r i m 和3 2 5 n m 下分别检测类胡萝h 素和棕 榈酸视黄酯。他们研究报道了样品中一些非前维生素a 活性的类胡萝h 素( 叶黄 二醇、玉米黄质、番茄红素) 和具前维生素a 活性的类胡萝h 素( p 一隐黄质、y 胡萝h 素、a 胡萝h 素、b 胡萝h 素) ，但是在他们所用的样品中没有检测到 b a p o 8 _ c a r o t e n a l 和角黄素的存在【4 州。k o n i n g s 等用5 p m v y d a c2 0 1t p 不锈钢柱 ( 2 5 0 4 6 m m ) ，甲醇四氢呋喃( 9 5 ：5 ，v v ) 作为流动相，做了胡萝h 、菠菜、番茄 和相橘中类胡萝h 素的分析。这些方法中流动相流速为l m l m i n ，以 e t h y l b a p o 8 c a r o t e n o a t e 作为内标物，在4 5 0 n m 下检测了叶黄二醇、玉米黄质、 胡萝h 素、d 一胡萝h 素、番茄红素口。 天津科技大学硕一 ：学位论文 1 9 9 8 年b e n a m o z 和f i s h i e r 研究报道了有关果蔬中类胡萝h 素组成的更多 的资料，在此研究中，他们用内标法进行了类胡萝h 素的定量，用2 - a p o 8 c a r o t e n a l 或海胆酮作内标物，以5 9 m v y d a c2 0 1t p 5 4 c 18 作为色谱柱在3 0 f ， 以甲醇乙腈( 9 ：1v v ) 为流动相，对果蔬的类胡萝h 素进行了分离和定量，而且 还报道了一些类胡萝h 素异构体的组成情况，尤其是9 一正一b 一胡萝h 素 5 】1 。 反相液相色谱是目前用得较为广泛的一种类胡萝h 素的分析方法，而且效 果也较好。r o u s e f f 等将双离子反相h p l c 运用到了橄榄类胡萝n 素和叶绿素的 分析中口“。实验以5 n ns p h e r i s o r bo d s 2 为色谱柱，以2 m l m i n 的流速非线性 洗脱进行分离( 洗脱液a ：水溶液p 一甲醇，l ：1 ：8 ，v v v ，洗脱液b ：丙酮甲醇， 1 ：1 ，v v ) ，其中溶液p 为o 0 5 m o l l t e t r a b u t y l a m m o n i u ma c e t a t e 和1 m o l l 乙酸铵。 用此方法他们在3 0 m i n 内分离出了1 8 种色素，包括一些类胡萝h 素和叶绿素。 另外，c h e n 和c h e n ”副也报道了同时检测类胡萝h 素和叶绿素的方法，在此方 法中以5 儿mu i t r e m e xc 1 8 为色谱柱，以乙睛一甲醇氯仿己烷( 7 5 ：1 2 5 ：75 ：75 ， v v v v ) 为流动相在1m l m i n 的流速下，以2 - a p o 8 c a r o t e n a l 为内标物，用内标 定量法同时测定了类胡萝h 素和叶绿素。 k h a c h i k ，s c o t t 等人研究了类胡萝h 素h p l c 分析出现的多个峰和杂质峰的 干扰现象，并提出了导致这些现象产生的原因所在。他们提出这些问题的产生 与否取决于类胡萝h 素在洗脱液中的溶解度；检测液的性质；类胡萝h 素之间 及类胡萝h 素与金属界面之间的相互作用的强弱f 54 1 。尤其是番茄红素，番茄红 素在不锈钢柱中显得非常不稳定，因此，回收率往往很低，常低于6 0 m “】， 但是在番茄红素贮备液中加入一些抗氧化剂，如b h t 或者标样用氮气吹干后贮 备，则可以提高番茄红素的回收率【5 ”。为了尽可能达到1 0 0 的回收率，在流 动相中加入一定量的抗氧化剂来防止类胡萝h 素的降解是近年来的一项革新技 术：1 9 9 2 年，h a n d e t m a n 等在流动相中加入0 0 1 的乙酸铵口”，而1 9 9 4 年e p l e r 等同时加入了乙酸铵和t e a 来防止类胡萝b 素的降解，结果使类胡萝h 素回收 率达到了9 4 1 5 6 j ，在1 9 9 5 年，h a r t 和s c o t t 的研究中，他们除了在流动相中 加入乙酸铵和t e a 外，还加了0 1 b h t l 5 7 1 o s c o t t 等还研究了相同的色谱柱 ( v y d a ct p 2 0 15 4 ) ，不同的填充材料对