（食品科学专业论文）利用原生质体融合技术降解玉米秸杆生产单细胞蛋白的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 导师签名 时间：上6 年f 月7 0 同 时1 8 j i ，二年玛曰 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的内容。 研究生签名： 刊泠 时间：上6 年，月佃同 导师签名： 郴汐 时i 剖： 矿年多月，口同 沈阳农业大学博士学位论文 利用原生质体融合技术降解玉米秸杆生产单细胞蛋白的研究摘要 研究生：刘玲导师：刘长江 秸杆资源是我国丰富的能量资源，也是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同 时它也是地球上数量最大的再生资源。由于秸杆的组分不易分解，其利用率很低。秸杆 中主要成分是木质纤维素，包括木质素、纤维素和半纤维素。它们只有一小部分得到了 利用，绝大多数浪费的同时还造成环境污染。利用微生物生产的纤维素酶将其转化为人 类急需的能源物质，对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实 意义。 本论文采用能够有效降解木质素和纤维素的菌株白腐真菌和康宁木霉作为出发菌 株进行实验，最终有效生产单细胞蛋白。本论文内容主要包括：木质素酶和纤维素酶高 产菌株的产酶条件的研究：康宁木霉和白腐真菌发酵培养基的优化研究；康宁木霉和白 腐真菌混菌发酵条件的优化研究：康宁木霉和白腐真菌原生质体融合条件的研究；融合 子性质性能鉴定；亲本和融合子产酶的分离和纯仡研究：酵母和融合子混菌发酵产单细 胞蛋白的研究。经过大量实验工作，得到了如下结果： 1 ) 利用正交试验确定康宁木霉和白腐真菌混合发酵的最佳培养基组成：秸秆：麸皮为 5 ：1 ，硫酸铵1 4 ，硫酸镁0 0 5 ，磷酸= 氢钾o 0 5 ，硫酸亚铁0 0 1 ，硫酸锰o 0 1 ， 硫酸亚铁o 0 1 ，硫酸锰o 0 1 ，氯化钠o 5 ，p h6 ，5 。培养温度2 8 3 0 ，转数1 8 0 r i 血n ， 接种时间间隔为4 8 h ，混合菌的接种量3 ，装液量4 0 m l ，2 5 0m l 。在此条件下混合菌 的产酶高峰期由5 6 d 缩短为4 5 d ，优化后酶活力的平均值f p a 为2 5 3 u ，c m c a s e 为 3 0 8 u ，分别比优化以前提高了1 0 8u 和1 4 4 u ；p o d c a s e 为7 9 8 u ，比优化前提高了 2 6 9 u 。 单因素实验探讨康宁木霉和自腐真菌的对数生长中期分别是1 0 4 0 h 和5 0 1 h ，在 此生长期内以0 7 的氯化纳为渗透压稳定剂，o 1 二硫苏糖醇为脱壁促进剂，以正交 实验探讨纤维素酶和蜗牛酶的配比分别为2 ：1 和1 ：1 ，酶浓度为2 ，酶解时间3 h ， 酶解温度为3 0 条件下完成两菌株的原生质体制备和再生。 3 ) 从多种真菌抑制剂中试验挑选真菌抑制剂氟康唑作为亲本生长的抗药性标记筛选， 白瘸真菌在浓度为4 0 0 斗m l 的条件下抑制生长。康宁木霉的原生质体在硫酸二乙酯与紫 外复合处理条件下灭活。 4 ) 采用3 5 p e g 6 0 0 0 作为促融合剂，0 1 m m 0 1 lc a c l 2 参与的条件下，2 5 ，2 5 m i n 进 摘要 行融合，获得7 株融合子，其中2 株稳定传代。 5 ) 采用与亲本的菌落特征对比，生长曲线比较，酶活力比较，蛋白全细胞电泳，同工 酶电泳，确定融合子与亲本的遗传相关性和差异性，鉴定融合子的形成。 6 ) 亲本和融合子的发酵粗酶液分别经过硫酸铵盐析，利用s e p h a d e xg 1 0 0 柱两次过柱 分离纯化纤维素酶和木质素酶，融合子富含纤维素酶活和过氧化物酶活，亲本白腐真菌 含有过氧化物酶活，康宁木霉含有滤纸酶活和羧甲基纤维素酶活。以薄层层析和高效液 相色谱对比融合子与亲本发酵产物。 7 ) 对融合子的发酵能力和条件进行了摸索，通过正交试验获得了融合子产酶的最适条 件为硫酸铵氮源，p h 为5 。5 ，l 。o 的麸皮、温度为2 8 ，适当添加c a 2 + o 。0 5 ，m n 2 + o 0 5 ， f e ”o 0 1 ，k + 0 0 5 ，培养4 d 产酶量最高。 8 ) 利用正交实验得到了秸杆在融合子作用下酶解糖化并混合酵母发酵生产单细胞，获 得最适发酵条件为：培养基成分以秸杆粉为降解对象，温度2 8 ，含水量2 0 倍，接种 量5 ，p h 6 5 ，真菌降解秸杆1 d 后接入酵母。在这个条件下粗蛋白的产量为2 8 ，比 发酵前提高1 8 3 5 ；粗纤维的分解率4 7 3 。 关键词：康氏木霉，自腐真菌，混菌发酵，原生质体融合 2 沈阳农业大学博士学位论文 s t u d i e so nd e g r a d i n gc o r ns t r a wb yp r o t o p l a s tf u s i o n a n dp r o d u c i n g s i n g l ec e np r o t e i na b s t r a c t c a i l d i d a t e ：l i ul i n gt u t o r ：l i uc h a j l 舀i a i l g s 拄a wi sak i n do fa b u n d a n te n e 唱yr e s o l l r c ei nc h i n a ，a n dt h em o s ta b u n d a mo r g a l l i cr a w m a t e r i a li nm ew o r l d ，a tt t l es 锄et i m e ，i ti st 1 1 eo n l yr e n e w a b l er e s o u r c ew h i c ha v a i l a b l ei n l a r g eq u a l l t i t i e s b e c a u s eo fn o te a s i l yr e s o v l e d ，o n l yaf e ws t r a w sa r eu t i l i z e d ，m o s to f 也锄 a r ew 弱t c da n dp o l l u t ee n v i r 0 啪e n t s oi th a s 伊e a tr e a l i s t i cm e a i l m gf o rh u m 姐b e i n gt o s o l v ee n v i r o n n l e mp o l l u t i o 巩f o o ds h o r t a g e 锄de n e r g yc r i s i s 也a tu s i n gc e l l u l 嬲ep r o d u c c db y m i c r o o r g 砌s mt r a i l s f o 册c e l l m o s et 0e 舱r g y ，c h e m i c a la n df o o d t h i sp 印e ru s e ? 耙幻d 音，徽勋以以酊fa r l dp 向日拧e r o c 础怡c ，”d 掣，d r f 甜ma ss t a r t 删n s o f d e g r a d i n gc e l l u i o s e 蛆d1 i 弘i na 芏1 dp r o d u c i n gs i 醴ec e up r ) t e i n t m s p a p e ri n c l u d e d ：1 ) s t u d yo nc o n d i t i o n sf o re n 巧m ep m d u c t i o n ；2 ) c u l t u r em e d i l l i n o p t i m i z a t i o nf o rp r o d u c i n g c e l l u l a s ea l l dl i g n i n 嬲eb y 乃把向。幽，l 识幻恐啦g 盯8 n dp 而口w 加c 一 邪据c 加”o 印d 盯村胛；3 ) f e m a i l t a t i o nc o n d i t i o n so fn f 拍。如m n 幻h 以fa 1 1 dm 口聘p 加c 胁。膪 c 胁”船印o ，l 枷b ym i x e d c u l c u r e ；4 ) s t l l d yo np r o t o p i a s tf u s i o nb e t 、v e e n 纷f c 向凸如，m 口幻”f 馏打 a n dj 确鲫掘r d 幽日e 犯蛳d 印d 一“m ；5 ) i d e n t i 母t l l e 向n c t i o n so f c r a s i s ；6 ) s t u d yo ns e p 删i o n a i l dp u r i f i c a t i o no f m e 掣n e so f t h ep a r e n t sa i l dc r a s i s ；7 ) s t u d yo nh i 曲s c py i e l d b ym i x f c 蛳e n 协t i o no f c r a s i sa 1 1 d 劂d 洳脚蛔，妇t h em a i nr e s i l 王t sw e r ef o l l o w e d ： 1 ) u s i n g t h eo r n l o g o n a ie x p e r i m e n _ 七sw h i c hg e t t i n gt l l eo p t i m 姗c u l t l l r em e d i u m ：t h er a 把o f s t r a wa n db r a n 聃5 ：1 ；( m 4 ) 2 s 0 41 4 ，m g s 0 4 0 0 5 ，k h 2 p 0 4 0 0 5 ，m n s 0 4 0 0 1 ， f e s 0 40 0 1 a r l dp h6 。5 ，t e m p c 栩t i l r e2 8 - 3 0 ，a e r 日匝o n4 0 m l ，2 5 0m l ，r p m18 0 r m i n t h ei n o c u l a t i o ni n t e r v i a lw 踮4 8h o i l r sa i l dt h e 锄o u n tw a s3 am a ) ( i m 哪e n z y m e 枷v 姆w a so b t a i n e do i lt h i so p t i m u mc o n d 试o n ，i n c l u d i n gf p a2 5 3 u ，c m c a s e3 0 8 u ， p o d7 9 8 u 、：v i t l li n c r c a s i n gr e s p e c t i v e l y1 0 8u ，1 4 4 ua n d2 6 9u 2 ) u s i n gs i n g kf 如b 叫e x p 髓i i n 嘛，t h el o g a r i t h i n i cme _ t a j 幽a s eo fg r o w i ho f 开 c h d 幽r m a 勋 f ，猡fa n d ， 册e r d 幽口e 胞c 奶坫。印d r f 堋a r el o 一4 0 ha n d5 0 - l o o h ，u s i n go m l o g o n a l e x p 商m e n tw h i c hg e t t 沁g 也ef h c t o r so f a 矗e c t 也ef o 珊a t i o nr a t ea n dr e g e n e r 撕o nr a t e p r o t 叩l a 或s 舶mr 勋撑垤订趿dp 如那口印d r f 删w e r ei s o l a t e d b yu s i n gc e l l u l o s ea 1 1 d s n a i l u s ea t 2 ：1 翘d1 ：l ，也e o 两m u m n d i t i o n f o r 脚l a s tp r e p a r “傩i se i l z y m a 矗c d i g e 蚰o na t3 0 f o r3 hb yu s i n go 7 m o 儿n a c la s 趾o s m o t i cs t a b i l i z e ra i l do 1 d 订 a sr e a g e n to f p r o m o t i n gc e l lw a i ld e 铲a d a t i o n 3 摘要 3 ) c h o o s i n gs o m ek i n d so f a n t i 她a ld m g sa sm es c r e e n i n gm 删n g ，p 哪鹎p o r f 姗w a s k i l l e dw i 也“c d 九n z d 拓a ta4 0 0 咖l c o n c e n t r a t i o n m i x i n gd i e t h y ls u l f l a t ea 1 1 du i t r a v i o l e td e s t r o ym ep r o t o p l a s to fz 幻竹f ，喈f t 4 ) u s i n g3 5 p e g 6 0 0 0 a sr e a p e mt om d u c et l l ef i l s i o na t2 5 i nw a t e rb a la n dg e m n g7 i n d i v i d u a lp l a n t sc m s e so n l e c t i n gc u l t i l r em e d i 啪a n d2i n d i v i d u a lp l a n t ss t e a d yc r a s e s 5 ) c o m p a r e dw i mt h e 哪e a r a n c eo f c o l o n y s ，m i c r o s o s m i cc o n f i g u r a t i o n s ，a i l t a g o l l i s t i c e x p e r i m e m ，凡l l c e l ls o l u b i l i 锣p r o t e i ne l e c 订o p h o r e s i sa n di s o e n z y m ee l e c t r o p h o r e s i s ， p a r e n t sa 1 1 dc r a s i sc e r t a i nt h er e l a t i v i 母e a c ho t l l e r 6 ) t h ec e l l u l o s ea n dl i g n i n a s eo f p 盯e n t sa n d c r a s i sw e r ep 嘶f i e db y( n h 4 ) 2 s 0 4 p r e c i p i - t a t i o na n d 押i c es 印h a d e xg 一1 0 0c o h 盯n ng e l 6 l t m t i o n s 1 1 1 e r ea r cc m c a s ea 1 1 dl i g i l i n a s e i nc r a s i sf b m e n t a t i o nl i q u i d ，l i g n h l a s ei np c 向，) 馏d 点即厂m 珊f e l n e n t a t i o nl i q u i da n dc m c a s ea i l df i l 把rp a p e re n z y m e 协z 勋玎f 愕f jf e m e n t a t i o nl i q l l i d t l ef b m e n t a t i o np r o d u c t so f c r a s i sa n di t sp a r e n t sw e r ec o m p a r c do nh p l c 姐dt l c 7 ) s t u d y o nf e m e n t a t i o nc o n d i t i o no fc r a s i sa n dt l l eo p t i i n u me i i z y m ec o n d i t i o nu s i n go r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，m eo p t i m 啪e i l z y m ec o n d i t i o n ：n i 订a g c nr e s o u r c ei s ( n h 4 ) 2 s 0 4 ， p h 5 5 ，b r a i l1 ，2 8 ，4 d a y sf e m e n 诅t i o n ，c a 2 + o 0 5 ，m n 2 + o 0 5 ，f e2 + 0 0 1 ， k + o 0 5 w e r ea d d e da p p r o p r i a t e l y 8 ) t h eo p t i m 啪s a c c f i c a t i o nc o n d i t i o na n dh 诎s c p ) r i e l dc o n d i t i o no f c o ms t r a wp o w - d e rw a so b t a i n e db yt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，a sf o l l o w 沁g s ：c o ms 仃a wp o w d e rd i g e s - t i o na t2 8 ，2 0t i m e sw a t e r ，i n o c u l a t i o nv o l 咖e5 ，i n i t i a lp h5 o a f t e ro n e - d a y f b m e n t a t i o n ，“孵西d 口驴印泐凰w a si n o c u l a t e d a tl a s t ，t 1 1 ep r o t e i nc o n t e mw a s2 8 ，t h e c e l l l l l o s ed e g r a d i n gr a t i ow 4 7 3 u i l d e rt h eo 曲m i z e dc o n d i t i o n k e 州o r d s ：删c d 砌伽肋柚增憾朋删e 融4 魄曲棚唧d 砌卅，m i xf e 咖皿扭t i o n ，p r o t o p l a s t f h s i o n 4 沈阳农业大学博士学位论文 前言 世界秸秆的年产量为2 0 亿吨3 0 亿吨，我国年产各类农作物秸秆达5 7 亿吨，其数 量相当于北方草原打草量的5 0 多倍，占全世界秸秆总产量的2 0 3 0 。农作物秸秆是 农业生产的副产品，也是一项重要的生物资源。但是，要充分、有效地利用这类资源却 相当困难，这是由于秸秆产量随季节变化，而且量大、低值、体积大、不便运输，大多 数动物都不能消化其木质纤维素，自然降解过程又极其缓慢，导致大部分秸秆以堆积、 荒烧等形式直接侵入环境，造成极大的环境污染和浪费。因此，科学合理地利用农作物 秸秆已引起全社会的普遍关注( 粱新红，常景玲，2 0 0 3 ) 。目前农作物秸秆的主要利用 渠道有：( 1 ) 秸秆还田，包括直接还田和堆沤还田；( 2 ) 秸秆养畜，退耕还田；( 3 ) 利用秸秆生产能源，包括气化，发展沼气，直接燃烧等：( 4 ) 工业原料和建筑材料： f 5 ) 秸秆养菌。 研究表明，利用微生物可转化秸秆，因为微生物有广泛的适应性，能利用和分解多 种畜禽不能利用的复杂有机化合物，合成含有丰富蛋白质、脂肪的菌体细胞，这些分解 产物和菌体可用于饲料，还可用于其它许多领域。微生物在秸秆转化中有用途多、营养 价值高、周期短、可再生等优点，越来越受到国内外科学研究者重视。 目前关于微生物降解秸杆的研究主要集中在利用不同菌株产生的降解酶混合发酵 降解秸杆为还原糖方面。考虑秸杆组分复杂、单菌株无法有效降解的问题，采用多菌种 混合发酵比较彻底降解秸杆。另外，随生物技术在农业科技中的应用，原生质体融合技 术日益发展起来。原生质体技术开始于二十世纪8 0 年代，总的来说是一种新的生物技 术手段( nb a l a s u m i i n a 埘，2 0 0 3 ：m r i a i i ic ，1 9 9 6 ) 。它是将两亲本的整个基因组强迫 性混杂在一起，为异源d n a 片段交叉互换创造一个优良的环境( 髓c h m d ，2 0 0 1 ) 。一 般包括原生质体制各、培养、融合、再生，原生质体转化等等。通过原生质体融合是在 工业微生物育种当中，原生质体融合技术是重要手段之一( 李殊等，2 0 0 1 ) ，是在细胞 水平上操作的遗传工程，与传统诱导杂交育种相比，它具有重组频率高、重组范围更广， 遗传物质传递比较完成，融合不受接台型影响同时可以进行多个亲本菌株融合的特点， 是微生物基因重组的有效方法，也是改良工业微生物菌株的遗传本质的一种行之有效的 手段。采用原生质体技术融合不同菌株，比较混合发酵，可以将混合发酵的菌株通过生 物技术方式进行遗传物质的融合，从而简化发酵流程，节约成本，培育高产、优质、抗 物技术方式进行遗传物质的融合，从而简化发酵流程，节约成本，培育高产、优质、抗 前言 逆性强的良种。 降解秸杆组分的真菌将秸杆降解为可以利用的还原糖，该还原糖更是微生物生长利 用的良好碳源，对于细菌、酵母、霉菌及藻类植物等微生物生长十分有利。微藻细胞、 酵母等蛋白质极为丰富，还含有丰富维生素和矿物质，因此利用真菌发酵产物生产高酶 活单细胞蛋白成为开辟新的蛋白资源，提高现有资源利用率最有发展前途的途径。利用 真菌在产生较高活性纤维素酶的同时亦能与酵母菌等微生物很好配伍，产生大量菌体 蛋白，使纤维素酶的产生、纤维物的降解、酵母菌的增殖在同一基质中进行( s h o u t a l ( a s h 妇a ，e ta l ，1 9 9 8 ) 。发酵所得产品既可以作为一种复合酶制剂添加于饲料中，用 于提高饲料的消化吸收率，降低饲料消耗。也可以作为一种蛋白资源部分代替食品中部 分成分，综合利用。 本论文的研究以有效降解玉米秸杆为目的，采用真菌混合发酵方式降解秸杆为还 原糖。首先筛选出高效降解秸杆的木质素和纤维素混合发酵菌株；在此基础之上，将混 合的两种菌株通过原生质体融合技术结合为一株兼具亲本遗传特性的融合菌，鉴定融合 菌的属性和性能，保持融合子的稳定性，从而采用融合子发酵使降解秸杆率大幅度提高： 之后将降解菌株与高产单细胞的酵母菌株混合发酵，大幅度提高单细胞蛋白的产量，为 有效利用玉米秸杆提供一种良好途径。 6 沈阳农业大学博士学位论文 文献综述 近几十年来，国内外一直在寻找利用物理、化学和生物处理手段降解农作物秸秆的 最佳途径，常见有物理方法和化学方法，物理方法又叫机械法，如用机器将秸秆切碎磨 粉；化学方法，如用碱处理，使不易溶解的木质素变成较易溶，或加硫酸铵、尿素等， 发酵后制成氨化饲料，或者加酶( 如淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等) 直接催 化水解反应，使秸秆大分子有机物降解( 李彩霞等，2 0 0 0 ) 。以上方法虽然应用时间较早， 但有许多缺点，秸秆的营养价值不高，主要还是大分子有机化合物，只适合于牛、羊等 反刍动物消化，却不易于给鸡、猪等单胃动物饲喂，并且处理时间均较长；另外，使用 酶的成本高，效果受动物的生长期和体内环境( 如p h 值、温度) 影响，又不能再生。 存在于秸秆中的非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解，主要是因纤维素的结晶 度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘所致。木质素与半纤维素以共 价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使酶不易与纤维素分子 接触，而木质素的非水溶性、化学结构的复杂性，导致了秸秆的难降解性。要彻底降解 纤维素，必须首先解决木质素的降解问题。因此，秸秆利用的研究从过去的降解纤维素 的研究转向了木质素的降解研究。研究表明，利用微生物可转化秸秆，因为微生物有广 泛的适应性，能利用和分解多种畜禽不能利用的复杂有机化合物，合成含有丰富蛋白质、 脂肪的菌体细胞，这些分解产物和菌体可用于饲料，还可用于其它许多领域。微生物在 秸秆转化中有用途多、营养价值高、周期短、可再生等优点，越来越受到国内外科学研 究者重视( 李海红，2 0 0 3 ) 。 1 、秸杆组分和降解菌种的介绍 作物秸秆的主要成分是粗纤维，粗纤维是所有不溶于一定浓度的稀酸、稀碱、乙醇 ( 醚) 的有机物的总称。它包括纤维素、半纤维素、多缩戊糖及镶嵌物质( 木质素、角质) 等。植物秸秆的蛋白质含量很低( 0 。2 - 5 ) ，纤维含量高( 3 0 4 5 ) ，适口性差，单冒动 物很难利用。最常见的玉米秸杆从组分上可见：纤维素占3 2 9 ，半纤维素占3 2 5 ，木 质素4 6 ，粗蛋白2 0 3 。 纤维素属木质化天然纤维，其结晶度和聚合度都很高，是细胞壁的主要组成部分， 也是自然界中最大的有机物质( 关铜，2 0 0 3 ) 。纤维素分子是由葡萄糖苷通过b 1 ，4 葡萄糖苷键连接起来的链状聚合体( 淀粉则是以廿1 ，4 葡萄糖苷键联接的) ，其分子 7 奎堕堡堕 量、聚合度根据种类及测定方法的不同有较大差别。植物秸秆纤维素结构复杂，基本上 是由原纤维构成的微纤维束集合而成的。原纤维是由1 5 - 4 0 根有结晶部分和非结晶部分 构成的纤维分子长链。纤维素的结晶部分是由纤维素分子进行非常整齐规则地折叠排列 而成的。在结晶部分里，葡萄糖分子的羟基或在分子内部或与分子外部的氢离子相结合， 没有游离的羟基存在，所以纤维素分子具有牢固的结晶构造，酶分子及水分子难以侵入 到内部，因此，纤维素的结晶部分比非结晶部分难分解得多。除此之外，在微纤维之间 还有牢固的氢键连接，从而导致纤维素基本上不可溶，对于各种酶的作用也有极大的抵 抗力。 半纤维素是许多不同的单糖聚合体的异源混合体，包括葡萄糖、木糖、甘露糖、阿 拉伯糖与半乳糖等，各单糖聚合体之间分别以共价键、氢键、酯键或醚键相连接，因而 呈现稳定的花絮状在植物细胞壁中。半纤维素位于许多纤维素之间，好象是一种填充在 纤维素框架中的填充料。此外，随着农作物秸秆的成熟，植物体内的半纤维素逐渐增长， 从而进一步增强了植物的坚实性，但半纤维素与纤维素不同，它很容易水解，有些半纤 维素的组成成分，如阿拉伯糖、半乳聚糖在冷水中的溶解度就相当大。半纤维素溶于碱 溶液中，也能被稀酸在1 0 0 以下很好地水解，但是由于半纤维素是和纤维素交杂在一 起，所以，只有当纤维素也被水解时，才可能全部水解。 降解纤维素和半纤维素的有效菌种很多，包括细菌、放线菌和真菌，最广泛使用的 是木霉属( 乃砌。沈，脚口) 、曲霉属( 彳妒卿f 淞) 、青霉属( ，锄f c 删聊，) 和支顶孢霉 属( 一h 用。拧f 姗) ，其中真菌木霉属是迄今所知形成和分泌纤维素酶系成分最全面、活 力最高的一个属。它们在发酵过程中产生纤维素酶，使一部分纤维素转化为葡萄糖，从 而破坏植物细胞壁释放内容物，消除秸杆中非淀粉多糖的抗营养因子，降低肠道内容物 粘度，使动物充分吸收利用饲料中的蛋白质、淀粉、纤维素和脂肪等。另外，产生的葡 萄糖是良好的碳源，可继续发酵产生多种有益菌种，使木质纤维素得到充分的利用。 木质素( l i 印i n ) 是植物界中仅次于纤维素的最丰富和最重要的有机高聚物( a n d r z e i ， 1 9 9 9 ) ，是第二再生有机资源( c r a w f o r drl ，e ta 1 ) ，其基本结构单元是苯基丙烷，靠 多种共键连接形成一种不溶性的、异质的、无光学活性的、无规则的、如晶体的、高度 分支的三维空间结构的高分子聚合物。它与纤维素和半纤维素一起构成细胞壁的主要成 分，其中8 0 存在于植物的细胞壁中，2 0 分布于细胞间隙中，成为细胞联合的粘连剂。 木质素的惰性对于植物来说是极具价值的结构组成，但却是所有自然产物中转化率最低 沈阳农业大学博士学位论文 的物质。由于木质素分子间链键多为c c 键，非常稳定。其连接单元不易水解，所以 木质素降解过程是一系列酶催化和非酶催化的非特异性氧化还原过程。完整的木质素组 织中，木质素以一种物理屏障存在，包围纤维素，成为外围茎质，保护纤维素免遭微生 物及酶的攻击，成为许多工业化过程中有效利用纤维素的一个障碍。在木质植物组织中， 木质素的降解必须先于纤维素的降解。 在自然界中，能攻击、降解木质素的微生物主要是真菌。根据真菌降解木质素时引 起的木材性状变化分为白腐真菌、褐腐真菌和软腐真菌( 黄丹莲，曾光明，2 0 0 4 ) 。其 中，白腐真菌对木质素降解具有最强的特异性，并成为顽固性有机污染物降解中最具应 用前景的一类真菌( g o l dmh ，1 9 9 3 ) 。在严酷的环境中，白腐真菌属于真菌门担子菌纲， 包括桦多孔菌、云芝黑褐色刺草菌、漏斗状侧耳、粉状侧孢霉等2 0 0 多个品系。它利用 菌丝、木质素降解及自由基反应作为“利器”攻击和降解木质素，以获得自身的生存及 繁殖，并由此决定了它们在木质素及其他难降懈有机物转化中的核心地位。 2 、单细胞蛋白的利用和营养性评价 单细胞蛋白( s i n g l ec e l l p r o t e i n ) 亦称微生物蛋白，缩写为s c p ，是指细菌、真菌和某 些低等藻类生物，在其生长过程中利用各种基质在适宜条件下，培养单细胞或丝状微生 物的个体，获得菌体蛋白。这里微生物一词并不是生物分类学意义上的名词，而是自然 界一切微小低等生物的总称，主要涉及细菌、酵母、霉菌及藻类植物中的微藻( 冯忠义， 2 0 叭) 。 微生物细胞中蛋白质极为丰富，还含有丰富维生素和矿物质。随着全球人口迅速增 加及生活水平提高，人类可能将面临着蛋白质严重缺乏；而单细胞蛋白既可供饲料用， 也可供食用。微生物种类多、数量大、分布广、繁殖快，作为蛋白质新资源具有很大开 发潜力。据测定，一般单细胞蛋白蛋白质含量为4 0 一8 0 ，其中酵母类4 5 5 5 ，霉菌 类3 0 5 0 ，细菌高达6 9 - 8 0 ，藻类6 0 7 0 。面对蛋白质缺乏日益严重，传统的借 助于农耕土地和饲养畜禽来解决人类对蛋白质需求已越来越不可能得到满足，为此研究 开发和应用推广微生物生产单细胞蛋白成为一条重要的途径，日益受到普遍关注。应 用微生物生产单细胞蛋白意义主要有：( 1 ) 可以变废为宝。利用廉价农副产品、下脚料甚 至是工业废物进行生产。( 2 ) 可提供稳定的蛋白质来源。微生物蛋白可进行连续工业化生 产，不受土地、气候等自然条件限制，菌体按指数速度迅猛增长。( 3 ) 蛋白质含量高( 4 0 ) ， 营养丰富，富含畜禽生长发育所必需的氨基酸；在作饲科配方时，一是其蛋白含量高， 9 文献练述 占用空间小，便于其它原料的进人；二是优化了氨基酸模式。( 4 ) 单细胞蛋白在畜禽体内 经水解后，转化为多种氨基，吸收率达9 0 左右。单细胞蛋白含维生素，特别是b 族维 生素，其中硫胺素、核黄素、泛酸、胆碱、尼克酸的含量超过于粉。此外，单细胞蛋白 还含有较为丰富的微量元素，包括磷、铁、锰、锌、铜、硒等，尤以无机磷较多，有利 于有机物在动物体内代谢。( 5 ) 单细胞蛋白含有丰富的生理活性物质，单细胞蛋白不但适 用于饲料行业，还可用于人类食品、制药、饮料和发酵工业。目前，我国抗菌素行业正 在广泛采用单细胞蛋白作为培养基成分。( 6 ) 单细胞蛋白含有一定量的活性细胞和生理活 性物质，在动物体内起到净化肠道的作用。在饲料中添加单细胞蛋白不仅能防止畜禽拉 稀，而且能提高畜禽免疫力并使肉质鲜美。另外，单细胞蛋白带有一种特殊香味，可刺 激、增进畜禽食欲，提高畜禽的采食量。 对s c p 的营养性评价，除化学分析数据外，最终取决于生物测定，生物测定的方法 有生长法和氮平衡法两种( 黄群等，2 0 0 3 ) 。生长法是测定蛋白质效率比( p e r ) ，氮平 衡法是测定蛋白质生物价( b v ) ，p e r 和b v 值越高说明蛋白质质量越好。s c p 另个重要 指标是核糖核酸( 鼢淞) 含量，通常细菌和酵母中r n a 含量都较高，而一般真菌和螺旋藻 中含量则较低。人们如果摄入过多r n a ，就会导致尿酸含量高于安全标准，有可能引起 痛风和肾结石等病症，因此，降低菌体r n a 含量成为必不可少工艺环节。此外，有些菌 体蛋白制品虽是安全又富有营养，但因其气味、口味、色泽和质地问题，也难以被接受 为食品蛋白。例如，螺旋藻具有不讨人喜爱的腥味及深绿色。 s c p 蛋白特别是由农副产物原料生产的酵母菌和假丝酵母及最近美国用乙醇为原料 生产的s c p 可用作人类食品，酵母蛋白具有粘性和凝胶性、起泡性、水合性、成纤性和 组织成型性等功能特性，因此，除可作为食品直接食用外，还可广泛应用于食品加工中。 在食品加工中它的主要作用有： ( 1 ) 改变食品物理性能酵母蛋白本身具备上述一系列功能特性，因此，当酵母蛋白 用作食品生产中加工助剂时，食品物理性能也就相应受到影响，例如，将食用酵母以 l 3 比例加入肉类制品中可提高肉与水、脂肪结合性能；将活性干酵母加入面饼中可 提高其延伸性能；利用流动性可改善饮料或汤汁口感质地；利用其凝胶性可帮助形成凝 胶，为水、风味及其它成分提供载体；利用其良好水合性，用于肉制品及焙烤食品制作 时，可保持食品中水分在加热过程中不被丧失并保持食品良好口感和风味；利用其组织 成型性可开发人造肉等新食品。 沈阳农业大学博士学位论文 ( 2 ) 作营养摄入剂酵母蛋白的蛋白质含量高，又具备人体必需8 种必需氨基酸及丰富 维生素和多种矿物质，可用于补充多种食品( 如面条、通心粉等) 所需全部或部分维生 素和矿物质。每千克产品这些物质极限量是：如v b l8 一l o m g ，烟酸5 4 i n g - 6 8 m g ，v d 5 0 0 一 2 0 0 0u s p c ( 美国药典) 单位，铁2 6 m g 3 m g ，钙1 0 0 0 m g - 1 2 5 0 m g 。微藻可提供丰富的硒、 铬、铁、铜等微量元素。 ( 3 ) 提高谷类产品蛋白质生物价众所周知，谷类产品第一限制性氨基酸是赖氨酸， 补充富含赖氨酸的酵母蛋白可提高植物蛋白生物价和营养价值。用量一般为面包重量 2 ，黑面包中假丝酵母用量可达5 ，其它谷类食品、罐装婴儿食品和老人食品中，通 常食用酵母用量为2 。 ( 4 ) 作食品添加剂酵母蛋白经破碎并提取而制得酵母浓缩蛋白，比未经处理的s c p 全细胞具有显著鲜味，已被广泛用作汤汁、肉汤等食品增鲜剂；其发泡性优于蛋清，酵 母质壁分离物已被用作焙烤食品增香剂。 ( 5 ) 作食品发酵剂新鲜酵母和活性干酵母可作为发酵剂，用于面包和馒头的加工。 焙烤酵母就属于这类蛋白制品，在美国已获得批准作为人类食品配料。 ( 6 ) 微藻在食品加工中应用微藻蛋白质含量高见质量优，例如螺旋藻蛋白质含量达 7 0 1 0 0 9 ，比牛肉高5 2 ，比鸡肉高4 2 ，比小麦高6 0 ，并且其氨基酸组成非常完善， 蛋白质消化率亦很高，因此藻类是人类最有希望的蛋白质资源，具有广阔开发前景，被 誉为“世界食品资源”。此外，微藻含有丰富色素，生产简便、投资少，而当前许多国 家为了人们的健康，正在全面禁止在食品饮料中添加化学合成色素，希望用天然植物色 素代替化学合成色素，这为微藻开发提供又一条重要途径。m i y a g a z ak a z u z it a l ( 船h i 等 提取藻蓝蛋白作为食品和化妆品色素添加剂。 3 、混合发酵 白腐真菌能分解所有的植物聚合物，降解木质素，对底物适应广，降解能力强，多 种真菌作用在一起相互影响小，目前被科学人员应用在降解纤维素的菌种里混合发酵。 混合发酵主要是采用多种真菌共同作用，利用它们不同的降解酶系将秸杆中的各种成分 降解。在混合发酵中，主要考虑各个菌种之间的相互拮抗作用和竞争作用，这些作用可 能导致各种降解酶产量和降解力的降低。为了使各种菌种能在混合发酵的环境里最大限 度的发挥作用，混合发酵的发酵条件非常重要，我们要综合考虑各种菌种需要的碳源、 氮源、温度、p h 、生长因子、微量元素等，同时还要考虑发酵条件，如通气量、压力、 壅塑堡整 容量接种量等。目前，降解纤维素的菌株的混合发酵已经研究相当完善，这些菌株多为 曲霉和青霉的混合发酵。但对于系统降解秸杆的各种组分的菌种混合发酵研究不够深 入。 考虑到秸杆的化学组分，需要先降解细胞壁的木质素，打破纤维的高度结晶网状结 构，然后采用降解纤维素的酶类来作用降解主要的秸杆成分。利用降解木质素的白腐真 菌和降解纤维的菌种混合发酵更加有利于秸杆的彻底降解。 4 、原生质体融合的意义 比较现代基因重组技术原生质体融合具有特殊的意义( c h a u d h r y a s ，1 9 9 8 ： a 1 e c b ，1 9 9 9 ：o k a d ay 1 9 5 8 ) ( 1 ) 原生质体融合是一种更为广泛、更为随机的基因重组方式，受到的限制很少。 ( 2 ) 原生质体融合方式，可以打破微生物的种属界限，实现远源菌种间的基因重组。 ( 3 ) 原生质体融合可使遗传物质传递更为完整，可获得更多基因重组的机会，有利于 提高育种速度。 ( 4 ) 借助聚合剂，可同时将几个亲本的原生质体随机融合在一起，从而获得综合几个 亲本性状的重组体，加速育种进程。 ( 5 ) 原生质体融合可以和其他育种方法相结合，把从其他方法得到的优良行状通过原 生质体融合再重组到一个单株中，提高菌株产量的潜力机率较大。 ( 6 ) 原生质体可以大大提高遗传重组的频率。 ( 7 ) 在生产菌种的选育中，可以应用具有较高产量性状的菌株作为融合的出发菌株， 以期待达到理想的育种目的。 ( 8 ) 可以应用灭活的原生质体进行融合，从而提高筛选效率。 ( 9 ) 原生质体技术有助于建立工业微生物的转化体系，开辟新的育种途径。 ( 1 0 ) 对微生物制备原生质体后直接再生育种，原生质体转导育种、原生质体的固定化 等原生质体技术，在微生物的育种与工业生产中近年来已广泛展开。 ( “) 在理论上，微生物的原生质体融合可用在研究噬菌体与寄主细菌间的关系。 ( 1 2 ) 在细胞学研究方面，通过原生质体融合有助于研究核质关系及细胞遗传问题。 ( 1 3 ) 原生质体融合在研究高等生物的发育学方面，对于研究体细胞的遗传、变异、发 育、细胞分裂、分化的调控与表达机理等问题也提供了一定的条件。( d e a l l ee ，1 9 9 9 ； o i n o n e na m ，1 9 9 7 ；m 趴c z i n g e rl ，1 9 9 7 ) 1 2 沈阳农业大学博士学位论文 ( 1 4 ) 在肿瘤学方面，原生质体融合为研究肿瘤细胞的行为与病因及肿瘤免疫等创造了 条件。 ( 1 5 ) 在免疫学方面，通过细胞融合与单克隆抗体的研究，人与动物的多种疾病的诊治 包括癌症，将获得新的可行途径。 ( 1 6 ) 原生质体融合可以对遗传缺陷病的基因进行互补与治疗。 ( 1 7 ) 微生物原生质体融合，可用于遗传分析等理论研究。 总之，原生质体融合在理论研究和实践应用上都是多方面的，意义是重大的。 5 、原生质体融合的方法使用 原生质体融合技术的具体方法( 张爱文，吴正楷，2 0 0 0 ；p e 舵y t m ，c r 删b r d d l ， 1 9 8 4 ) 大致有如下几个方面： ( 1 ) 原生质体融合中亲本的选择标记原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记， 从而有利于挑选融合子，在融合中，可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光 染色、形态差异和自然生态标记等方法。 营养缺陷型标记营养缺陷型标记是一种传统有效而直接的方法。它是通过诱变 筛选进行的，菌丝、分生孢子、担孢子及原生质体都可用作诱变材料。选择的诱变材料 与使用的诱变剂相适应容易获得较高的突变率，使用能直接改变结构的化学诱变剂，一 般选择孢予为诱变材料，若选用碱基类似物的诱变剂，宜选择已萌发的单核菌丝或经孵 育的孢予进行诱变处理而对于已萌发的孢子、菌丝和原生质体用紫外线进行诱变较好。 现已从糙皮侧耳，桃红平菇、毛木耳、光木耳等获得了不同的营养缺陷型。营养缺陷型 标记虽较费时费力，且会使亲本的优良性状丧失或降低，但它仍是育种研究工作中重要 一部分，只要诱变和选择方法适当，是可选择出具有正突变的营养缺陷型的。 抗药性标记微生物抗药性是其菌种的特性，是由遗传物质决定的，不同的微生 物对某一种药物的抗性存在差异，1 9 8 4 年布拉德斯( b m d s ) 和佩贝迪( p e b e r d y ) 首先利用这 种方法在融合中选择出了融合子。这种不通过诱变而得到的抗药性标记是选择标记的一 个较好途径。且这种抗药性在遗传上也十分稳定，若无自然抗药性标记，则可以通过各 种诱变手段而获得抗药性。用双亲抗药性差异选择融合子时，要掌握好药物的浓度，浓 度过高会使融合频率降低，过低会使亲本生长，而影响融合予的检出。 灭活原生质在融合中灭活一个亲株的原生质体与另一亲株的原生质体融合，被 灭活的亲株可不加任何遗传标记，只需对活菌株进行标记，这样大大减少融合前亲株进 文献综述 行遗传标记的工作量，潘迎捷等人己对香菇属中的不同种进行灭活获得