第七章 亲和层析技术.doc

第2章 亲和层析1 亲和分离技术概论利用生物分子之间的专一性识别性或特定的相互作用的分离技术称为亲和分离技术。在该技术中，亲和分离过程是通过引入亲和配基得以实现的（如图2-1）。所谓亲和配基，是指具有对生物分子专一识别性或特异相互作用的物质。将亲和配基固定在不同的介质上，可得到不同的亲合分离技术，如固定在层析介质上，达到专一性层析分离的技术称为亲和层析技术。将亲和配基接在分离膜上，得到亲和膜分离技术。图2-1：亲和分离过程的示意图生物分子之间的亲和识别包括抗体和抗原、酶和底物、激素和受体等之间的亲合作用，这些亲和作用属于生物专一性识别；此外，某些物质和生物大分子之间还有一些特异性作用，如染料和某些酶（特别是脱氢酶和激酶等），植物凝集素和糖蛋白，金属离子和蛋白质表面的组氨酸等之间的作用，都可以应用于亲和分离过程。根据以上两种亲和作用的不同，可将亲和配基按其来源分为二类：生物特异性配基，如抗体、NAD、AMP等和拟生物亲和配基，如染料、金属离子等。表 2-1常见亲和层析的命名作用原理以及它们的相关应用名称作用原理应用免疫亲和层析抗体和抗原专一性识别抗体或抗原固定化金属亲和层析Zn2+,Ni2+等与蛋白质表面组氨酸的特异性识别含有组氨酸的蛋白质染料亲和层析染料和蛋白质之间的特异性识别激酶、脱氢酶核苷酸亲和层析核苷酸和蛋白质之间的特异性识别激酶、脱氢酶凝集素(Lectin)亲和层析凝集素和糖之间专一性的可逆的结合糖蛋白蛋白质A(Protein A)亲和层析对IgG 类似的抗体的专一性免疫蛋白等在亲和技术中应用的配基必须具备以下的条件：(1)亲和配基和被分离生物大分子之间的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。(2)配基与被分离的生物大分子之间要有足够高的结合常数，能形成稳定的复合物；但同时结合又不能太强，当外界条件适当的改变，且不使待分离的目的大分子变性时，就可将复合分子解离，使目标分子和配基分离，同时亲和配基得以再生。(3)能够进行一定的化学改性，易于固定在层析介质或其他分离介质上。且固定到分离介质上之后，配基的专一性识别或特异性作用不发生明显的变化。目前，亲和分离技术众多，命名方法也很多。一般而言，常根据配基的名称和所使用技术的名称组合来命名，如固定化金属离子亲和膜技术、染料亲和层析等。现将常用的亲和层析技术名称、原理和应用简单的列如表2-1：1.1 亲和配基在亲和分离技术中，亲和配基起着举足轻重的作用。亲和配基的专一性和特异性，决定着分离纯化时所得产品的纯度，亲和配基与目标分子之间作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度，影响它们的使用范围。根据配基亲和作用专一性程度和配基分子量的大小，可以将它们做如下分类： (1)单专一性的小分子配基。如激素、维生素和某些酶抑制、金属离子等小分子，这些亲和配基只和某个或少数几个特定的蛋白作用，无论这些蛋白来源于特定细胞或生物体。单专一性的亲和配基专一性高，结合力较强，比较难于洗脱。(2)基团专一性小分子亲和配基。主要包括酶的辅因子，如NAD和其类似物，惰性染料等。如果被分离的酶需要辅因子，该蛋白就能够和辅因子结合（如果配基是辅因子类似物，原理也一样，只是酶可将其识别为辅因子）。将该辅因子或类似物作为亲和配基，便可将蛋白质结合到亲和配基上，实现分离纯化的过程。表2-2列出了一些基团专一性小分子亲和配基和它们对应能纯化的蛋白质。表 2-2小分子亲和配基和对应所分离的产品配基蛋白5-ATPNAD类脱氢酶2,5-ADPNADP依赖脱氢酶NAD+NAD依赖脱氢酶Cibacron Blue激酶或脱氢酶Procion Red HE-3B脱氢酶或干扰素等其中蓝染料Cibacron Blue是NAD辅因子的类似物，因而可用于提取需要NAD或NADP的蛋白质酶类。(3)专一性的大分子亲和配基。利用生物大分子具有三维识别结构的亲和作用，将其中的一种作为配基，就可以用来分离另外所对应的生物大分子，如凝集素ConA对多糖和糖蛋白有专一性；蛋白A及G对IgG和IgM等免疫蛋白有专一性。组织纤维溶酶原激活剂（t-PA）是一种糖蛋白，具有激活溶酶原，促进血纤维蛋白溶解的作用。该蛋白质可以用纤维蛋白作为亲和配基进行分离。表 2-3给出了几种常见的亲和配基和对应的分离产品。表 2-3大分子亲和配基和所对应分离的产品英文名称中文名称应用Heparin肝素如抗凝血酶Lectin凝集素（如伴刀豆素A，大豆凝集素，麦胚凝集素等）如糖蛋白等Protein A.G蛋白质A. G如IgG和IgM (4)免疫亲和配基。利用抗体和抗原之间的专一作用性进行的亲和分离技术，又称免疫吸附(Immunosorbent)，在免疫吸附中使用的亲和配基称为免役亲和配基。该配基即可以是抗原，也可以是抗体。现代杂交瘤技术已经有可能大规模生产单克隆抗体，这为免疫亲和配基的生产和免疫亲和吸附的应用创造了前提条件。相对于其他的亲和配基而言，免疫亲和配基专一性高，纯化效率高，只需一步操作就可以得到很高纯度的产品。但是，它的价格相对较高，配基与目的产品可能会产生不可逆性吸附，在保证目的产品不变性的前提下，难以解吸。一般而言，免疫亲和配基多为蛋白质，因此配基本身也容易被蛋白酶降解。（5）基因专一性的大分子亲和配基。利用大分子之间或基因亲和识别性实现分离。一般而言，基因亲和层析可以用来分离纯化多聚核苷酸和能够与多聚核苷酸结合的蛋白质，如限制性核酸内切酶，聚合酶，以及转录因子等。随着分子生物学和重组DNA技术的飞速发展,纯化DNA结合蛋白的方法引起了人们越来越大的兴趣。一些基于固定化DNA吸附剂的亲和分离技术，尤其是亲和层析方法得到了广泛应用。表2-4给出了常用亲和层析分离方法的比较。表 2-4不同亲和层析分离方法的比较参数生物专一性（AC）拟生物专一性配基亲和层析金属离子亲和层析（IMAC）染料亲和层析（DLAC）HLAC专一性很高较高中等较高，取决于吸附条件配基交联技术很多环氧化物直接吸附或对氧化物解吸难易中等容易化学交联容易容易吸附容量低高高中等再生及稳定性较差，易变性高高高成本高较低最低较低亲和配基的选择一直是一个难题，目前主要靠试验确定。为减少实验工作量，人们已开始采用组合化学和生物技术选择配基;（1）组合化学肽库选择亲和配基：小肽亲和配基具有性质稳定、合成简单、价格低及生物相容性好等特点，但这类配基也存在着亲和力弱或选择性低的缺点。因此，如何寻找小肽配基以及如何提高小肽配基的亲和力和选择性的问题引起了人们的关注与重视。组合肽库包括噬菌体展示肽库和合成肽库，这两类肽库均可用于小肽配基的筛选与优化。为能更简捷地筛选到针对目的小肽的高结合力的小肽配基，出现了从基于反义肽的组合化学肽库中筛选亲和配基的新的研究思路。具体过程如下：首先运用反义肽简并性的概念，设计并合成出对目的肽具有一定亲和力的反义肽，以其为出发点，进行位置扫描组合合成，每个位置上仅需合成含20个以内肽的小库。再通过对这种小肽库进行亲和筛选，以确定每个位置上的最佳残基。将各位置上的最佳残基装配起来，便可得到具有优选序列的肽。此方法简单、方便而且有效，不仅可用于生物产品的分离纯化，还可用于研究肽-肽和肽-蛋白质的相互作用1。（2）噬菌体展示技术筛选亲和配基：利用噬菌体展示技术，从肽库中筛选出与目标蛋白相互作用的多肽配基。它与其它筛选方法比较有以下优点：快速、高效、低费用、低风险、高成功率。一般包括以下几个步骤:构建肽库、确立吸附与洗脱条件、筛选及测定。将纯化的目标蛋白(可以通过分析手段制备，或购买)固定在固相载体上，用吸附条件的缓冲液平衡，然后加入噬菌体文库，能与目标蛋白结合的噬菌体被捕获在固相载体上，未结合的噬菌体被洗去，用洗脱的缓冲液将结合的噬菌体洗脱下来，洗脱下来的噬菌体通过新鲜大肠杆菌扩增。结合的噬菌体也可以洗脱下来，只将新鲜的宿主菌加到固相载体上，让结合的噬菌体去感染这些细菌，从而被扩增。扩增后的噬菌体再投入二轮筛选，经过23轮筛选后，最后洗脱噬菌体，挑单克隆繁殖后，确定其核苷酸序列及相应的氨基酸序列，该氨基酸序列为筛选的目标蛋白的亲和配基。（3）SELEX技术筛选亲和配基：这是一种新的组合化学技术，它是应用大量的随机寡核苷酸库结合PCR体外扩增技术，以指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过几轮或十几轮筛选过程，获得高亲和力、高特异性的核酸配基。对于任意一种蛋白质，都可以利用SELEX技术寻找到一个可与之相匹配的寡核苷酸配基。这种寡核苷酸配基能分辨同源蛋白质或几乎完全一样的小分子量复合物，亲和力和特异性往往高于其它任何类型的配基。但是作为大规模生产是不适宜的，它的稳定性较差，可用作分析性制备2。 1.2 亲和洗脱 亲和洗脱（Affinity elution）是和亲和吸附（Affinity adsorption）对应的，即利用在洗脱液中加入和吸附目的蛋白有专一性作用或者和亲和配基有专一作用的物质，而只将目标分子解吸下来。亲和洗脱可用于亲和层析，也可以用于普通的层析如离子交换、共价色谱等的解吸。亲和洗脱一般采用和目标分子具有识别性的小分子或类似物。 在核苷酸亲和色谱中，用可和蛋白质有专一性识别的辅酶如NAD、AMP等，解吸蛋白质，实现亲和洗脱。如采用5 mM AMP 可从8-氨己基-cAMP-agarose 解吸下鱼精蛋白激酶。在共价色谱中，用含有巯基的二硫苏糖醇（DTT）等物质的解吸液进行洗脱，可洗下结合的含有硫醇基的蛋白质。在伴刀豆素A（Con A）亲和层析中采用和亲和配基有专一性作用的甲基甘露糖苷或甲基葡萄糖苷进行梯度洗脱，可以将吸附在介质上的糖蛋白等物质洗脱。 一般而言，亲和洗脱过程中加入的洗脱物质，价格都比较昂贵。在实际的生产应用中，要综合考虑目标产品的价值和生产成本，尽可能的采用常规洗脱方法，降低产品的生产成本。2 亲和层析分离技术亲和层析是利用偶联亲和基团的层析吸附介质为固定相，亲和吸附目标分子，使目标分子得到分离纯化的层析方法。在目前众多的亲和分离技术中，亲合层析分离技术是应用最多，分离效率最好的技术。2.1亲和层析的理论亲和色谱因其分离过程简单、纯化倍数高、选择性强，在蛋白质的分离纯化领域占据着越来越重要的位置。研究亲和色谱的理论模型，可以准确的预测柱容量的利用率、目标组分的损失以及分离过程的操作时间，为亲和色谱系统的设计、优化、控制和放大提供十分重要的依据。本文现以凝胶过滤理论和酶与固定配基之间的相互作用为基础，做如下讨论。当蛋白质（酶）在非凝胶相和凝胶相之间达到如下平衡： （式2-1）E为凝胶外的游离蛋白（酶），E1为凝胶小珠内的游离蛋白（酶），LM为配基，ELM为蛋白配基形成的复合物 分配系数： （式2-2）解离常数： （式2-3）对正常的凝胶过滤色谱而言 （式2-4）其中，Vi为凝胶内部所含溶剂的体积，V0是凝胶颗粒之间的溶剂体积，VE为蛋白质的洗脱体积。亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产生的额外亲和作用1。 （式2-5）而 （式2-6）因为 （式2-7） （式2-8）将（3）（4）（5）（7）和（8）合并，则得到 （式2-9）由于蛋白质与配基的相互作用而增加的洗脱体积与结合配基浓度（LM）成正比，而与蛋白和配基作用的解离常数Klm成反比，如果介质未被配代，LM=0，则VE=V0,这时凝胶过滤起主要作用。假设VEV0，则可得到：（式2-10）实际上，VE/VE很难测定，但在洗脱液中，加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定配基的表边的亲和力降低。其数值可以测得。这一过程可以表示如下：（式2-11）EI和E1I1分别是填料外部和内部的蛋白-抑制剂复合物。如此，可得到类似的方程：（式2-12） （式2-13）在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定配基对蛋白的阻滞作用降低，其程度取决于可溶性配基和固定配基的相对浓度和解离常数。2.2亲和介质的制备亲和层析介质是将亲和配基通过化学键接在层析介质上而得到的。常用层析介质并不能直接和亲和配基化学结合，一般先要进行活化或功能化，即要引入反应基团。活化后的层析介质能够通过反应基团和亲和配基反应，从而制备出亲和层析介质。因而亲和层析的制备至少应包括以下几步：(1)介质和配基选择(2)介质的活化或功能化(3)活化的介质和亲和配基的偶联，偶联后未发生偶联反应的反应基团必须封闭或钝化。(4)洗涤除去未反应的配基和其他反应物。2.2.1介质的选择介质是亲和配基附着的基础，起着支撑和骨架作用。通常而言，亲和色谱的介质应具备下面四个条件 ：(1)具有多孔网络结构；(2)非特异吸附小且化学性质呈惰性，表面电荷尽可能低；(3)理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸附条件的变化而发生变化；(4)基质必须能够活化或功能化。在亲和色谱发展的早期，多采用天然材料的多糖类球形软胶，随着技术的发展和分离要求的提高，一些可以在高流速下使用的半硬或硬质的细颗粒球形填料也在亲和色谱中得到应用，常见的亲和色谱介质有如下几种：（1）多糖类：主要由纤维素（cellulose）、葡聚糖（dextrin）和琼脂糖（agarose）等制备而成的基质。纤维素基质比较软，容易压缩，但价格低廉，目前已在大规模的亲和层析中应用。 交联葡聚糖（又称Sephadex）本身孔径较小，经过活化功能后，会进一步降低其多孔性，使其亲和活化效率降低。琼脂糖(agarose)是亲和层析的理想介质之一，具有优良的多孔性，而且经过交联后，可大大改善其物理化学稳定性和机械性能。 （2）聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶也是一种常用的亲和层析介质。它是由丙烯酰胺与双功能交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺在一定条件下共聚产生的凝胶。通过调节单体浓度和交联剂的比例，可得到不同孔径的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的非特异性吸附较强，一般应在较高离子强度（0.02M以上）下操作，以消除非特异的离子交换吸附。其优点是功能基团多。聚丙烯酰胺和琼脂糖共聚物Ultrogel凝胶（LKB产品）非特异性吸附少，容易改性。（3）无机基质亲和层析可以使用的无机基质主要有可控制孔径多孔玻璃（CPG）、陶瓷和硅胶等。无机基质有其本身的优点，它具有优良的机械性能，不受洗脱液、压力、流速、PH和离子强度的影响，可获得快速、高效的分离；而且可抗微生物腐蚀，容易进行消毒。但是也有缺点，如表面对某些蛋白质有非特异性吸附作用，而且难于功能化等。亲和层析中所使用的可控孔径多孔玻璃是粒径较大的玻璃珠（4080目或80120目），因为对于亲和层析而言，孔径的选择是一个关键，它决定了功能化基团的数量和亲和介质的吸附容量。如孔径为2500A的玻璃珠，其吸附容量显著小于孔径为1750和750A的玻璃珠。为利用无机基质的优点（如机械强度高），而避免其缺点（如不易于功能化），目前很多基质采用涂层，即将容易功能化的介质如多糖包裹在多孔无机基质上，从而易于接上多种亲和配基。 专一性、容量及稳定性是衡量所选介质好坏的三个标准。在用于分析时，专一性比容量及稳定性重要，而应用制备时，吸附剂的稳定性是最主要的指标，同时还要考虑成本因素。对于不同的介质而言，这些要求不可能同时满足。所以在介质的选取时，应该根据具体的分离要求选择合适的介质。2.2.2介质的活化和偶联用于活化惰性层析介质的化学反应主要由介质和本身的性质和稳定性决定。对于制备亲和介质而言，亲和配基和层析介质的化学反应过程应相对比较温和，尽可能保持配基和介质原来的性质，以便保持目标产物和亲和介质之间特异性或专一性的作用。现将几种常用的活化方法比较，如表2-5：表2-5 各种活化方法比较活化剂试剂毒性活化时间(h)偶联时间(h)偶联pH稳定性非特异性吸附戊二醛中等1-86-166.5-8.5好溴化氰高0.2-0.42-4,8-10PH7双环氧化物中等5-1814-48, 8.5-12不稳定二乙烯基砜高0.5-2.0快8-10高PH不稳定羰基二咪唑中等0.2-0.46天左右8-9.5PH10稳定高碘酸盐无毒14-20127.5-9.0好三嗪高0.5-2.04-167.5-9.0好重氮化物中等0.5-1.06-8中等芳香物肼高1-33-167-9较好(1)多糖基质 以下几种方法为常用的多糖基质活化和偶联方法。 溴化氰法(CNBr) 溴化氰法是活化多糖基质的介质中最为常用的方法，由Axen和Porath等人1967年提出，其反应时间短，只需要几分钟至几十分钟。但是溴化氰是剧毒药品，活化操作必须在通风橱中进行。反应机理示意图如图2-2所示。图2-2溴化氰活化偶联法以琼脂糖的活化偶联过程为例，说明溴化氰法活化偶联过程，具体如下：在装有20ml水，2M NaHCO3烧杯中加入20克充分洗涤的湿琼脂糖，放在冰(-15)浴中45分钟。用磁力搅拌器，徐徐搅拌悬浮物，加入溴化氰（用量为100mg/g湿胶），在45下活化10分钟。因为溴化氰不溶于水，所以最好先将溴化氰溶于乙晴中，并于20下贮存。活化一结束，立即将凝胶转移到玻璃布什漏斗中，迅速过滤，在漏斗下的烧瓶中装有固体硫酸亚铁，过滤下来滤液中所含的溴化氰能和固体硫酸亚铁迅速反应，生成无毒的亚铁氰化物。用1L冷的蒸馏水及1L偶联用的缓冲液依次洗涤凝胶，得到的活化胶。偶联，将要偶联的配基溶解在0.1M NaHCO3（PH8.3），0.5M NaCl或其它缓冲液（如硼酸、磷酸盐，但离子强度须降低到8-10mM），亲和配基的加入量取决于需要的配基密度，低分子亲和配基浓度为1-10m mol/ml，蛋白质亲和配基浓度5-10mg/ml。加入配基后，在室温下(22-25)搅拌2小时或在4下过夜。偶联完成后，残留的活化基团可用氨基葡萄糖、乙醇胺中和。三嗪法 均二氯三嗪或三氯三嗪（氰尿酰氯）可活化多羟基的介质。单氯三嗪基多糖复合物，在PH7-9及0-20条件下，可和含有伯胺之类亲和配基偶联，生成亲和层析介质。过程如图2-3所示其中R为亲和配基图2-3三嗪法活化偶联原理图具体操作过程如下： 活化：100ml凝胶用无离子水洗涤后，在室温下搅拌3045分钟。加入二氯三嗪溶液（0.51.0g二氯三嗪溶于1520ml丙酮，并用冰水稀释1倍，此操作需在通风柜中，因为二氯三嗪有毒）。二氯三嗪溶液加入5分钟后，再加入2M NaHCO3溶液，继续搅拌5分钟，混合液过滤并用0.1M磷酸缓冲液（pH6）及含有50丙酮洗涤，得到活化凝胶。偶联：经洗涤的凝胶用0.5M硼酸缓冲液（pH8.7）或其它无氨基缓冲液（pH在7.5-9.0之间）悬浮，加入配基，配基的加入量为：小分子配基0.5-1mg/ml凝胶，大分子配基5-10mg/ml凝胶，在4或在室温下，搅拌反应412h，用相同的缓冲液洗涤，除去过量的配基。用乙醇胺封闭未偶联的活化基团。高碘酸盐法偏高碘酸钠(NaIO4)可将多糖基质上相邻的连二醇基氧化成为醛基，而且偏高碘酸钠可溶于含水溶液中，反应后易于用水洗去残留的偏高碘酸钠，其反应式如下（图2-4）：其中R为亲和配基图2-4偏高碘酸盐活化反应示意图高碘酸盐法适用于琼脂糖、纤维素和交联葡聚糖介质的活化，是一种简单、快速的活化方法，其中纤维素偶联取代程度高，而对孔隙率较高的Sephadex凝胶(G-100,G-200)，经高碘法处理后易于碎裂，因此不应采用。高碘酸法结合的配基没有溴化氰法高，但其操作简单、安全。配基密度一般可达0.05-1.0 mmol/ml凝胶。环氧化物法 环氧化物法包括单环氧化物活化法和双环氧化物活化法。这两种活化方法有采用不同的试剂，如单环氧化物活化法常用氯代环氧丙烷做活化剂，双环氧化物活化法常用二羟基正丁烷双缩水甘油醚做活化剂。在引入含有羟基或硫酸基的小分子亲和配基时环氧化物法非常有效。该方法最早是由Porath等人发展的，其反应过程可用图2-5表示：其中R为亲和配基图 2-5环氧化物活化偶联反应示意图以Sepharose 6B活化为例,具体过程如下：将7ml洗涤后的Sepharose 6B悬浮于5ml含10mg NaBH4的NaOH溶液（1M）中，再加入1ml 1,4-丁二醇二缩水甘油醚，在室温25下缓慢搅拌反应5h，过滤，用蒸馏水充分洗涤活化后的凝胶。活化凝胶可在二甲基亚砜或丙酮中保存30天，偶联效率不变。每克干胶约含20mol环氧化物。偶联：活化胶悬浮在等体积的PH为913的缓冲液（碳酸盐、磷酸盐）中，加入一定量的亲和配基，配基的加入量为：小分子配基0.5-1mmol/ml胶，大分子配基5-10mg/ml胶，在2045下搅拌1548h，便可完成偶联。残留的环氧化基团可用乙醇胺或硫基乙醇封闭。 在碱性条件下，双环氧化物中的两个环氧基团和凝胶中OH反应，从而产生交联反应，提高了胶的刚度，降低了胶的孔度。 (1.5)苯醌法 苯醌法是一种简单、高效的偶联方法，可在较宽的pH范围内应用的方法。其原理如下（图2-6）：活化反应如下： 偶联反应如下：其中R为含有氨基的亲和配基图2-6：苯醌活化偶联反应示意图以琼脂糖为例，说明其具体操作过程： 100ml琼脂糖用无离子水洗涤后，转入0.1M磷酸缓冲液(pH8.0,含20乙醇)中，缓冲液体积为30-50ml，在搅拌下加入含有0.5-1.0g 苯醌的乙醇溶液，搅拌1-2h，过滤凝胶，并用20%乙醇及1M NaCl水溶液洗去未反应的物质。偶联：在0.1M NaHCO3(pH8.0)缓冲液中进行，配基用量为：小分子配基0.5-1.0m mol/ml凝胶，大分子配基5-10mg/ml凝胶，在4下偶联过夜，分别用NaHCO3缓冲液(pH8.0)和0.1M NaAc缓冲液(pH4.0)洗涤。其他活化剂 对多糖基质还有其他活化剂，如对甲苯磺酰氯2和三氯甲基磺酰氯。这种方法非常适合于含有氨基酸及硫醇基团的亲和配基。反应如下（图2-7）：其中R含有氨基的配基图2-7对甲苯磺酰氯活化偶联反应示意图 这个活化过程是在有机溶剂中进行的，因而只对在有机溶剂中溶胀的介质适用，结合于agarose基质，说明其活化过程：10ml凝胶依次用34倍体积的水、不同比例的丙酮水混合溶液洗涤，丙酮和水混合溶液的比例依次改变为30：70、60：40、80：20，每一种混合溶液洗涤35次，每次用量70ml，最后用纯丙酮洗涤。将凝胶悬浮在5ml 无水丙酮中，加入2倍对苯甲基磺酰氯，在搅拌的条件下，加入0.05-0.2ml 吡啶作为催化剂（总加入时间为1分钟），加完后继续搅拌1015分钟，用10倍体积的丙酮洗2次，然后依次用丙酮、不同比例的丙酮：1mM HCl溶液（70：30；50：80；20：80）依次洗涤，最后用3被体积水洗涤，即可得到活化后的凝胶。将活化后的凝胶滤干，用4的硼砂缓冲液淋洗，直到凝胶的pH与缓冲液一致，再在磁力搅拌下加入适量的配基，反应12h后，加入Tris HCl缓冲液或者巯基乙醇封闭未反应的活化基团。反应结束后用10倍体积的硼酸缓冲液淋洗，再用1mM HCl溶液淋洗。 (2)聚丙烯酰胺基质 聚丙烯酰胺基质的化学活化和功能化有二种方法：一种为直接在聚丙烯酰胺凝胶上活化；另一种为丙烯酰胺和具有丙烯或乙烯单体功能基团的交联剂共聚。戊二醛法戊二醛容易和含有氨基的聚丙烯酰胺基质反应，同时也利用戊二醛将含有氨基的亲和配基引入聚丙烯酰胺，反应原理如图2-8具体合成过程如下： 将20ml Biogel P-300用34倍体积蒸馏水洗涤，再用34倍体积0.5M 磷酸缓冲液（pH7.6）缓冲液洗涤。在37下搅拌，同时加入100 ml 2.5%（v/v）的戊二醛,保温1618小时，便可达到活化目的。活化后的凝胶用1520倍体积的蒸馏水或0.1M KPO4缓冲液（pH7.7）洗涤，然后转入10ml 0.5M KPO4缓冲液（PH6.9-8.5）的烧杯中。缓冲液已溶有510mg胶蛋白（配基），在4下与蛋白质混合保温18小时，便可达到偶联目的.。 图2-8：戊二醛活化偶联反应示意图肼法 肼法特别适用于含有酰胺基基质的活化，活化后可交联含有醛基（-CHO）和NH3的配基。原理反应如图2-9：具体操作如下：10g纤维素或球状纤维素悬浮在1 L 0.5 M 偏高碘酸溶液中，在室温下搅拌2小时，加入30 ml （0.54 mol）乙二醇，悬浮液继续搅拌1小时。氧化后的凝胶用10份200 ml水洗涤，洗涤后的胶用水配成悬浮浆（胶和水的用量比为1：1 （w/v），加入SDH（succinic dihyrazine，琥珀酰二肼）（27 mmol溶在29 ml水中），用浓HCl调整pH到5。反应1小时后，用固体NaCO3调节pH到9.0。加入1g NaBH4 (21 mmol)，搅拌混合，过夜。所得到的凝胶先用5份400ml水溶液洗涤，再用200 ml 0.1M醋酸洗涤，最后将凝胶保留在水中（胶和水的用量比为1：1 （w/v）。用将1份浓HCl和浓H3PO4混合物(HCl: H3PO4=90:10(V/V)与10份体积的冷SDH混合，再将活化过的凝胶悬浮于其中。向该悬浮液中加入1份1M NaNO2，在冰浴中搅拌12分钟，再加入1份约12M NaOH，使PH在6左右。将中和后的悬浮液直接加到10份体积含有一定配基的0.2M碳酸氢钠(pH9.5)溶液中，在4下搅拌2小时，用缓冲液洗涤。SDH的制备：64g，2mol 的肼(99%)加入装有100ml无水乙醇的烧杯中，在室温下搅拌，逐滴加入35g琥珀酸二乙酯（0.2 mol），在34小时内加完，升温到4550，反应液变澄清。在室温下过夜，过滤收集结晶析出的SDH，用1L冷冻的无水乙醇洗涤，干燥，可得到265g SDH。图2-9：肼法活化偶联反应示意图 (3)多孔玻璃与硅胶 要使有机功能基团接到无机材料如硅胶或多孔玻璃上，必须用硅烷化试剂进行偶联反应。硅烷化试剂一端为有机功能活化基团，另一端为硅烷氧基。常见的硅烷如环氧基丙氧基三甲氧基硅烷。环氧基丙氧基硅烷化试剂将环氧基团引入无机材料上，以便进一步引入其它功能基团。反应原理如图2-10所示;图2-10：硅烷化试剂进行活化偶联反应原理图具体操作过程如下：10g硅胶Li Chrosphersi 1000，依次用20HNO3水溶液、0.5M NaCl、H2O、丙酮及乙醚洗涤后，放入一个500ml三颈瓶中，在150下真空干燥4h, 冷却烧瓶，加入150ml 甲苯，2.5 ml-环氧丙氧基三甲氧基硅烷（glycidoxypropyl-trimethoxy silane ，Dow Corning Z6040）及0.05 ml 三甲胺（trimethylamine），开始回流反应。反应中不断加入N2以确保无水条件。16小时后，将形成的环氧硅烷用布什漏斗过滤，用甲苯（toluene）、丙酮及乙醚依次洗涤，最后在真空下干燥，含有环氧基团量50mol/ g。偶联：偶联步骤和其它环氧化物基团偶联相同(PH Ni2+ Zn2+Co2+ Fe2+。蛋白质在金属离子的吸附强度排列顺序为：Cu2+ Ni2+ Zn2+Co2+ Fe2+用Cu2+和 Ni2+作为亲和配基时，蛋白质吸附的非特异性较为严重，目标蛋白质和杂质蛋白质均有吸附，这对目标蛋白质的纯化不利。Zn2+和Co2+应用较多。Fe2+也经常用于金属离子亲和层析，但其稳定性比Zn2+和Co2+较差。金属离子和蛋白质或氨基酸的亲和作用主要有以下机理;(1) 静电作用: Cu2IDA-琼脂糖带负电荷，可以和蛋白质表面的氨基酸残基带正电荷的集团作用。(2) 配位键结合：蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基与Fe2，Cu2+,Zn2+等金属离子形成配位键结合。(3) 金属离子与蛋白质表面含巯基基团如半胱氨酸作用形成共价键。(4) 键：如果蛋白质侧链含有苯环，苯环上的大键具有供电性，容易受到带正电的亲电分子攻击，形成络合物。2322亲和层析介质的合成 固定化金属亲和离子介质的合成主要是要在介质中引入能够和金属离子产生螯和作用的基团，以实现金属离子的固定化。以在Sephadex上偶联氨基二醋酸为例说明亲和介质的合成过程，如图2-12所示。将2g氨基二醋酸钠溶解在50 mlNa2CO3和NaHCO3的缓冲溶液中，碳酸盐的总量为2M，pH8-12.5。再将10 g经环氧氯丙烷活化的Sephadex G-25转移进装有75ml 含有Na2CO3和NaHCO3（2M）缓冲溶液的烧瓶中，该体系中含有3g的氨基二醋酸钠。调至合适的pH值后，转移到6065水浴中，在搅拌的条件下反应24h，反应后所得到的IDA-Sephadex G-25分别用水（2 L）、10醋酸（0.5 L）和水（2 L）洗涤。图2-12：固定化金属离子亲和层析介质的合成示意图2323固定化金属离子亲和层析的吸附和解吸条件 无论是自己和合成的固定化金属离子亲和层析介质，还是商业化的亲和层析介质，在选择了金属离子后，首先都要把金属离子固定在介质上。一般采用50 mmol/L的金属盐溶液通过填有亲和层析介质的层析柱，饱和层析介质，直到流出液中含有的金属离子浓度和上样盐溶液相同为止。用3-5倍柱体积平衡缓冲液洗去未螯合的金属离子，便可进行亲和层析的操作了。在吸附时，为减少非特异性吸附，平衡缓冲液中应加入0.5 M 1.0 M NaCl，吸附的pH选择为5.0-9.0较为合适。吸附蛋白质的解吸可采用以下几种方法：改变pH：将pH降低到3.0-4.0进行洗脱。改变pH是一种简单的方法，但不一定对所有蛋白质有效。竟争性洗脱：采用一些和金属离子有作用的物质如咪唑、甘氨酸、组氨酸等。在竟争性洗脱中，咪唑和甘氨酸比较温和，一般浓度在50-100 mmol/L便可达到解吸目的。在解吸时可以采用梯度洗脱，以提高分辨率。 解吸后需要对层析柱进行再生，再生一般采用EDTA。EDTA不但可以解吸蛋白质，而且将可以将所有结合在层析介质上的金属离子也一起接洗脱下来。EDTA浓度一般采用50-100 mmol/L。完全解吸后，需要重新平衡层析柱，然后再将金属离子固定到柱子上。2324 固定化金属离子亲和层析的应用表 固定化金属离子亲和层析的应用 分离蛋白亲和层析介质分离效果参考文献猪血中Cu,Zn-SOD壳聚糖金属离子收率67%纯化倍数6.1王雪峰等5淡菜中分离纯化纤维素酶Streamline Cu2+膨胀床直接分离收率82，纯化倍数19.4谭天伟等6重组人甲状腺激素蛋白（PTHrP）采用6个组氨酸亲和尾技术一步纯度大于90鈄理强等7 固定化金属离子亲层析在重组蛋白质的分离纯化中已成为一种标准方法，利用基因设计来协助蛋白质纯化的另外一个例子是亲和尾。在目的基因的片段上融合一段编码某些特定氨基酸的DNA片段，修饰目的蛋白，让它带有可以预测的性质，这样就能简化纯化过程。在脲抑胃素(urogastrone)的C末端融合几个精氨酸残基就是早期的例子之一，这种方法使得蛋白质的碱性非常强，能够牢牢地结合在阳离子交换介质上。由于介质所能结合的蛋白量是细胞中总蛋白量的10，在洗脱后，目的蛋白得到的纯化程度就很高了。聚精氨酸的片段可以用羧肽酶A切除。将切除了亲和尾的蛋白质重新通过同样基质的阳离子交换色谱，目的蛋白的洗脱位置发生了很大的变化，但并不与杂质的洗脱位置重合。其他一些亲和融合系统见表6。表6 用亲和尾纯化蛋白质的实例8亲和尾配基基质键合条件洗脱条件少量的精氨酸S-SepharosePH4-8NaCl梯度少量的组氨酸亚氨基双乙酸酯Sepharose(Ni+)PH7-8盐酸胍乙啶咪唑缓冲溶液或递减PH梯度盐酸胍FlagTM 抗原肽Anti-Flag 抗体-Sepharose0.15M NaCl, 1mM CaCl2, PH7.810mM EDTA,PH7.4牛乳糖TPEG-Sepharose1.6M NaCl, PH71.0M硼酸钠氯霉素乙酰基转移酶fP-氨基氯霉素-Sepharose0.3M NaCl PH7.85mM氯霉素蛋白质AIgG-SepharosePH7.60.5M乙酸谷胱甘肽-S-转移酶谷胱甘肽- SepharosePH7.3谷胱甘肽用亲和融合的方法来纯化蛋白质存在的主要问题就是如何成功的移走亲和尾和所使用的试剂。用基因工程的方法在亲和片段和重组目的蛋白的连接处引入高度专一性的蛋白酶酶切位点或在酸性条件下不稳定的键，能够部分的解决这一问题。一些使用酶切位点的方法如表7所示。需要强酸环境才能切除亲和尾的方法只对在该环境下能保持稳定的蛋白质适用。由于采用酶切方法所需的环境比较温和，所以它更受人们的偏爱。常用的一些蛋白酶有凝血酶、肠激酶和Xa因子。所有这些酶都是在37下作用，但由于专一性不够或者存在污染物，蛋白酶可能切割目的蛋白内部的某些位点。此外，在后续的色谱分离步骤中，还要除掉切下来的亲和尾和蛋白酶。表7 切除亲和尾的方法连接序列切割方法条件-Asn+Gly-a羧胺PH9,45-Asp+Pro-b酸10醋酸，55-Met+Xxx-c溴化氰70蚁酸，20-Xxx+(Arg)nd羧肽酶BPH8，37-Xxx+(His)ne羧肽酶APH8，37-Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg+Xxx-f凝血酶PH7-8，37-Ile-Glu-Gly-Arg+Xxx-gXa因子PH7-8，37-Asp-Asp-Asp-Lys+Xxx-h肠激酶PH8，37-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln+Gly-pro-iPreCission蛋白酶PH7，5注：处表示被切割的键，Xxx表示任意氨基酸2.3.3染料亲和层析染料亲和层析是1968年英国科学家Haeckel和德国科学家Kopperschlager分别偶然发现的。他们发现蓝染料和磷酸化激酶有专一性作用，并成功地应用于纯化酵母中磷酸激酶。之后许多研究者