（环境工程专业论文）bphc酶的纯化、固定化及处理芳香化合物的研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本论文旨在从联苯降解菌d y e l l ag i n s e n g i s o l il a - 4 中纯化一种新型外二醇双加氧酶 b p h c ，进行纯酶特性考察；重组酶b p h c 固定化方法的考察；优化以海藻酸钠为载体固 定重组酶b p h c 的条件。 从菌株l a 4 中纯化一种新型天然酶b p h c ，并进行纯酶特性考察，包括：酶促反应 动力学、p h 值、温度、金属离子及抑制剂对纯酶活性的影响等。研究发现：该酶是f e ( i i ) 依赖型2 ，3 二羟基联苯1 ，2 双加氧酶，分子量约为3 4 + l k d a ；n 端氨基酸测序结果为 s e r - v a l l y s a s n l e u g l y t y r m e t g l y p h e s e r - v a l l y s a s p v a l ；从细胞粗提物到纯酶， 纯化倍数为1 3 8 2 ，酶活性回收率为8 7 6 ；b p h c 可氧化2 ，3 二羟基联苯、3 甲基邻苯 二酚、4 甲基邻苯二酚、邻苯二酚和4 氯邻苯二酚，对应的比酶活分别为：9 5 2 0 、1 4 3 7 、 o 1 5 、3 6 4 和0 5 3 u m g ；b p h c 对2 ，3 二羟基联苯亲和力最大；底物为2 ，3 二羟基联苯 时，该酶最适p h 值为8 o ，最适温度为2 0 0 c ；3 甲基邻苯二酚和4 甲基邻苯二酚做底 物时，该酶最适温度分别为3 0 和2 0 0 c ；一些金属离子和抑制剂( 抗坏血酸、s d s 和过 氧化氢) 能够明显抑制天然酶b p h c 的活性。 以活性炭、强碱性阴离子交换树脂、海藻酸钠、聚乙烯醇和z n o 溶胶凝胶基质为 载体，均可以成功固定重组酶b p h c 。选择苯甲酸和苯胺为底物时，载体固定化效果顺 序为：海藻酸钠 z n o 溶胶凝胶基质 聚乙烯醇。投加活性炭为载体固定化酶可以提 高苯甲酸和苯胺降解率，但主导作用是活性炭对底物的吸附作用。投加强碱性阴离子交 换树脂为载体固定化酶可以提高苯甲酸降解率，但主导作用是树脂对苯甲酸的吸附作 用，而该固定化酶对苯胺降解影响很小。 应用表面响应法优化了以海藻酸钠为载体固定化重组酶b p h c 的条件，考虑了四个 主要影响因素：海藻酸钠浓度、c a c l 2 浓度、加酶体积和固定化时间。研究发现：联苯 降解率与上述四个影响因素不是简单的线性关系，由a n a l y s i s 模块拟合出了方程。模型 显著性较好，拟合值和真实值之间的符合程度较好。通过o p t i m i z a t i o n n u m e r i c a ls o l u t i o n 求最优解，结果为海藻酸钠浓度3 6 8 ，氯化钙浓度3 7 2 ，加酶体积1 0 8 m l ，固定化 时间5 h ，对应的联苯降解率为9 9 2 7 ，而实际测得的联苯降解率为9 9 ，与预测值符 合程度较好。 关键词：d y e l l ag i n s e n g i s o l i ；2 ，3 一二羟基联苯1 ，2 - 双加氧酶；纯酶特性；固定化酶； 表面响应法 b p h c 酶的纯化、固定化及处理芳香化合物的研究 p u r i f i c a t i o na n di m m o b i l i z a t i o no fb p h cf o rb i o d e g r a d a t i o no fa r o m a t i c c o m p o u n d s a b s t r a c t t h ep u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f2 , 3 - d i h y d r o x y b i p h e n y l1 , 2 d i o x y g e n a s e ( b p h c ) 丘o md y e l l ag i n s e n g i s o l il a 4 - i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d so fr e c o m b i n a n tb r p h ca n dt h e i m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n so fs o d i u ma l g i n a t ea sc a r r i e rt ob eo p t i m i z e da r ed e s c r i b e di nt h i s r e p o r t an o v e ld i o x y g e n a s e ( b p h c ) f r o md y e l l ag i n s e n g i s o l il a 一4c o u l db ep u r i f i e da n d c h a r a c t e r i s t i c so ft h eb p h ci n c l u d i n ge n z y m ek i n e t i c s ，e f f e c t so fp h ，t e m p e r a t u r e ，m e t a li o n s a n di n h i b i t o r so ne n z y m ea c t i v i t ya r ei n v e s t i g a t e d 砀er e s u l t ss h o wt h a tt h en a t i v eb p h c e n z y m ew i t ht h em o l e c u l a rw e i g h to fa p p r o x i m a t e l y3 4 士lk d a i san o v e lf e ( i i ) 一d e p e n d e n t 2 3 一d i h y d r o x y b i p h e n y l1 , 2 - d i o x y g e n a s ew i mn - t e r m i n a ls e q u e n c e ：s e r - v a l - l y s a s n - l e u g l y - t y r - m e t - g l y p h e s e r - v a l - l y s - a s p - v a l t h ep u r i f yt i m e sw e r e1 3 8 2 ，a n dt h ea c t i v i t y r e c o v e r yw a s8 7 6 t h ep u r i f i e dn a t i v eb p h c _ l a 一4c o u l do x i d i z et h es u b s t r a t e ss u c ha s 2 , 3 - d i h y d r o x y b i p h e n y l ，3 - m e t h y l c a t e c h o l ，4 - m e t h y l c a t e c h o l ，c a t e c h o la n d4 - c h l o r o c a t e c h o l ， w h o s es p e c i f i ca c t i v i t i e sa r e9 5 2 0 ，1 4 3 7 ，0 1 5 ，3 6 4a n d0 5 3 u m gr e s p e c t i v e l y a m o n gt h e f i v et e s ts u b s t r a t e s2 ，3 - d i h y d r o x y b i p h e n y l 晰t ht h el o w e s tk mh a st h eh i g h e s ta f f i n i t yf o r b p h c _ l a 一4 t h eo p t i m a lp hv a l u eo fb p h c _ l a - 4 i s8 0f o r2 , 3 - d i h y d r o x y b i p h e n y l ，a n dt h e e n z y m er e s p e c t i v e l y i n d i c a t e si t sm a x i m a l a c t i v i t y a t 2 0 ，3 0a n d 2 0 。cf o r 2 ，3 - d i h y d r o x y b i p h e n y l ，3 - m e t h y l c a t e c h o l a n d4 - m e t h y l c a t e c h 0 1 s o m em e t a li o n sa n d i n h i b i t o r s ( a s c o r b i ca c i d ，s d sa n dh 2 0 2 ) a r ea b l et oi n h i b i tt h ea c t i v i t yo fb p h ce n z y m e t h er e c o m b i n a n tb p h cc o u l db es u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e do na c t i v a t e dc a r b o n ，s t r o n g l y b a s i ca n i o ne x c h a n g er e s i n ，s o d i u ma l g i n a t e ，p o l y v i n y la l c o h o l ，a n dz n o s o l g e lm a t r i x t h e h i g h e s ta c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dr e c o m b i n a n tb p h ci su n d e rt h ef o l l o w i n go r d e r ：s o d i u m a l g i n a t e a sc a r r i e r z n os o l - g e lm a t r i xa sc a r d e r p o l y v i n y la l c o h o l 豁c a r d e r t h e d e g r a d a t i o nr a t e so fb e n z o i ca c i da n da n i l i n ec o u l db eg r e a t l yi m p r o v e db ya d d i n g i m m o b i l i z e db p h co fa c t i v a t e dc a r b o n 嬲c a r r i e r ，b u ta c t i v a t e dc a r b o na d s o r p t i o ni sm a i n f u n c t i o nf o rt h ei m p r o v e m e n to fd e g r a d a t i o nr a t e t h ed e g r a d a t i o nr a t eo fb e n z o i ca c i dc o u l d b eg r e a t l yi m p r o v e db ya d d i n gb p h ci m m o b i l i z e dw i t l ls t r o n g l yb a s i ca n i o ne x c h a n g er e s i n 。 b u tr e s i na d s o r p t i o ni sm a i nf u n c t i o nf o rt h ei m p r o v e m e n to fd e g r a d a t i o nr a t e t h i s i m m o b i l i z e db p h ch a sl i n l ee f f e c to na n i l i n ed e g r a d a t i o nr a t e t h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n so fr e c o m b i n a n tb p h cw i t hs o d i u ma l g i n a t ea sc a r r i e ra r e o p t i m i z e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yi nf o u rm a i ni n f l u e n c ef a c t o r s ：t h ec o n c e n t r a t i o n i i 大连理工大学硕士学位论文 o fs o d i u ma l g i n a t e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fc a c l 2 ，t h ea m o u n to fe n z y m ea n di m m o b i l i z a t i o n t i m e r e s u l t ss h o wt h a tt h e r ei sn o ts i m p l el i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ed e g r a d a t i o nr a t eo f b i p h e n y la n dt h ef o u rm a i ni n f l u e n c ef a c t o r s e q u a t i o ni sf i t t e db ya n a l y s i sm o d u l e ，a n dt h e m o d e li ss i g n i f i c a n tw i t ha c c e p t a b l ee r r o r s f i t t i n gv a l u e so ft h em o d e la c c o r dw i t ha c t u a l v a l u e s t h eo p t i m a ls o l u t i o ni so b t a i n e db yo p t i m i z a t i o nn u m e r i c a ls o l u t i o n ：s o d i u ma l g i n a t e 3 6 8 ，c a c l 23 7 2 ，t h ea m o u n to fe n z y m e1 0 8 m la n di m m o b i l i z a t i o nt i m e5 h t h ef i t t i n g d e g r a d a t i o nr a t eo fb i p h e n y li s9 9 2 7 ，w h i c ha c c o r d sw i t ht h ea c t u a lv a l u e ( 9 9 ) k e yw o r d s ：d y e l l ag i n s e n g i s o l i ；2 , 3 - d i h y d r o x y b i p h e n y l1 , 2 d i o x y g e n a s e ；c h a r a c t e r i z a t i o n o fp u r i f i e de n z y m e ；i m m o b i l i z e de n z y m e ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目： 作者签名： 却 乙t 酌的呢心、固定亿久义礁考裔亿会确鹪矾凳 弓桥 b p h c 酶的纯化、吲定化及处理芳香化合物的研究 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目：型兰堕鱼丝：鱼垒垄型竺垩墨竺坌塑鱼翌至 作者签名： 童塑! 日期：塑年j 三月二二日 导师签名 ：臼挈亟车l 日期：旦年j 三一月三l 日 大连理工大学硕士学位论文 引言 十九世纪以来，工业化的加剧使得芳香化合物在空气、土壤和水体等环境中的含量 急剧上升。芳香化合物是指含有芳环结构的化合物，由苯系物( b t e x ) 、多环芳烃( p a n s ) 及其衍生物组成，在自然界中广泛存在，仅次于葡萄糖残基，苯环是自然界中分布最广 的化学单元。芳香化合物具有：结构稳定、毒性大和水溶性低等特点，同时又具有致癌、 致突变和生殖发育毒性，部分该类化合物已被列为优先控制污染物”。由于其应用价值 高，在石油化工、农药生产和印染化工等工农业中大量使用人工合成的芳香化合物，使 其不可避免地泄漏到环境中，造成严重的环境污染，对人类健康构成极大威胁。目前由 芳香化合物引起的环境问题已经引起了世界各国学者的极大关注。 处理芳香化合物常规方法主要有：物理法、化学法和生物法。物理法和化学法主要 包括：吸附法、膜技术、混凝法、电解法和高级氧化技术等等，但由于投资大、占地广 又需要特殊设备等缺点，人们将视线更多转向了价格低廉的生物处理方法。其中应用微 生物降解环境中的污染物具有投资少、占地小和环境友好等特点，成为治理环境污染最 有前途的方法之一。采用微生物降解或催化转化高毒性芳香化合物，具有安全、高效和 经济等优点，该降解技术的核心问题是高效降解菌株的获得，近年来大量文献报道了人 们分离得到多种能够以芳香化合物为碳源，氮源和能源生长的微生物。为加快微生物对 芳香化合物的降解速率，随之而来提出了一项新型处理技术生物强化技术，即：通 过向体系中投加高效菌制剂或高效酶制剂来提高其处理污染物的能力，其中酶制剂可以 从野生菌或基因工程菌中通过破碎和纯化等一系列步骤得到，也可直接购买商品化的酶 制剂。 本文选取苯甲酸、苯胺和联苯这三种典型的芳香化合物为降解底物。从联苯降解菌 d y e l l ag i n s e n g i s o l il a 4 中纯化一种新型外二醇双加氧酶b p h c ，探索具有良好固定化效 果的重组酶b p h c 的固定方法，并对效果最好的固定化方法( 以海藻酸钠为载体包埋法 固定重组酶b p h c ) 进行条件优化。通过本文研究，不仅为该固定化酶的工业化应用提 供了必要的理论依据，还为一些芳香化合物降解机理的探究提供了一定的参考价值。 b p h c 酶的纯化、固定化及处理芳香化合物的研究 1文献综述 1 1 芳香化合物的来源、毒性和污染现状 芳香化合物由苯系物( b t e x ) 、多环芳烃( p a h s ) 及其衍生物组成，在自然界中广 泛存在，仅次于葡萄糖残基，苯环是自然界中分布最广的化学单元。 芳香化合物是一类重要环境污染物，由于石油化工、农药生产、印染化工等工农业 中大量使用人工合成的芳香化合物，使其不可避免地泄漏到环境中，造成严重的环境污 染，该类环境问题屡见不鲜【l 】。 1 1 1 芳香化合物的来源和毒性 常见的芳香化合物主要包括：b t e x ( 苯b e n z e n e 、甲苯t o l u e n e 、乙苯e t h y l b e n z e n e 和二甲苯x y l e n e s ) 等单环芳烃类物质、硝基芳香族化合物、氯代芳香族化合物、多环芳 香烃类化合物( p a h s ) 等等。 b t e x 主要存在于原油和石油产品中，作为工业原料广泛应用于农药、塑料和纤维 合成等行业【2 】。b t e x 化合物在生产、储存和运输过程中，容易释放到环境内，造成环 境污染并对生态系统和人体健康构成危害，例如：由于储油罐的泄漏和石油工业废物的 排放，使得地下水遭受单环芳香化合物的污染【3 】。b t e x 通过其代谢产物对生物体产生 危害作用，例如产生氧化自由基，与d n a 形成d n a 加合物，破坏造血系统和免疫系 统等1 4 。苯是世界卫生组织公布的具有致癌、致畸和致突变作用的有害污染物；甲苯和 乙苯具有致突变和致畸作用，对泌尿系统及骨骼发育也有损害；二甲苯则具有致畸作用， 影响肌肉和骨骼的发育，其毒性作用主要表现血小板和白细胞减少【5 j 。 化石燃料的不完全燃烧和硝化反应都会生成硝基芳香化合物，其应用广泛，是合成 炸药、杀虫剂、除草剂、染料和医药等的化学原料，过去人类对其无节制的使用导致了 严峻的环境污染问题。硝基芳香化合物具有稳定性、持久性和毒性【6 】，对环境危害较大， 在哺乳动物体内容易被转化为致癌性更强的亚硝基和羟氨基化合物。通常，大多数此类 化合物通过空气被人体吸入，到达皮下，进入腹膜腔及肌肉，从而引起毒害作用1 7 j 。s a x 等【8 j 将所有硝基芳香化合物都定为3 级( 其中3 级表示危害性毒性最大的级别) 。目前， 如何降低该类化合物对人类和生态环境的危害，已成为国内外关注的焦点。 氯代芳香化合物是指芳香烃及其衍生物中一个或几个氢原子被氯原子取代之后的 产物，主要包括：氯苯、氯酚、氯代苯甲酸、氯萘和多氯联苯( p c b s ) 等几大类，是一类 污染面广、结构稳定、毒性大、水溶性低且不易降解的化合物1 9 1 ，这些物质大多具有致 癌、致畸、致突变的“三致”效应。氯代苯类化合物广泛存在于染料、制药、油漆和农药 大连理工大学硕士学位论文 中，对人体的肝脏和肾脏具有损害作用，还可抑制神经中枢。这类化合物中的多氯联苯 ( p o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ，p c b s ) 是12 种持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i c p o l l u t a n t s ，p o p s ) 之一，自然界本来没有p c b s ，从s c h m i d t 和s c h u l t sl8 8 1 年首次成功 合成开始，到1 9 8 4 年已能人工合成2 0 9 种这类化合物【】o 】。p c b s 曾广泛应用于热介质、 特殊润滑油、可塑剂、涂料、防尘剂、油墨添加剂、杀虫剂及复写纸等的制造和用于电 容器、变压器等电力设备中作为绝缘油，在工业生产和使用过程中通过意外泄漏、废物 处置等过程进入到环境中，对生态系统产生持久的不利影响，严重威胁人类健康，世界上 绝大多数国家已停止生产和使用多氯联苯【l ，斯德哥尔摩公约中也已经禁止对其的 使用。p c b s 通过皮肤、呼吸道、消化道等进入机体，可导致机体内分泌紊乱、生殖及 免疫机能失调、神经行为和发育紊乱，甚至能够引起癌症等疾病的发生【l 厶1 5 j 。 环境中p a h s 主要来源于化石燃料的燃烧，此外化石燃料和矿物形成的地球化学反 应、森林植被燃烧以及一些细菌参与的生化反应等也会向环境中释放p a h s 。p a h s 在土 壤和大气飘尘中能够持久稳定地存在，极易在环境中累计，对人类健康和生态环境具有 很大危害性，美国环保局早在2 0 世纪8 0 年代初就已经把1 6 种未带分支的p a h s 确定 为环境中的优先污染物【l6 1 。绝大多数p a h s 及其中间代谢产物在生物体内具有细胞毒性、 遗传毒性、免疫毒性、致癌、致畸和致突变等作用1 1 7 j 。 1 1 2 芳香化合物的污染现状 ( 1 ) 国外污染状况 b t e x 化合物具有较高的光化学反应活性【1 8 1 ，进入大气在太阳辐射作用下可提供烃 类过氧自由基形成有害的光化学烟雾【1 9 】。它是大气中0 3 和气溶胶粒子的前体物，是引起 大气二次污染的重要原因【2 0 1 。有文献报道，p a r r r a 等【2 1 】发现机动车尾气的排放、木材燃 烧和垃圾填埋等因素都会增加西班牙北部乡村大气环境中笨的含量。b t e x 化合物不仅 对大气环境造成了严重污染，还由于地下油罐和输油管线腐蚀渗漏等原因污染土壤和地 下水源【2 2 1 。美国环保部门研究发现，约有2 5 以上的地下储油罐出现不同程度的泄漏， 且泄漏隐患日趋增加，将会有更多的土壤和地下饮用水水源受到污染，对人类健康构成 严重的威胁【2 j 。 硝基芳香化合物种类繁多，是重要的化工原料，广泛应用于农药、染料、炸药和医 药等领域。在生产、军事活动、储油箱渗漏和损耗以及转运等过程硝基芳香化合物被释 放到环境中，使得世界上很多区域受到了这类化合物的污染，特别是t n t 等爆炸物造成 的污染尤其显著f 2 3 l 。据1 9 8 8 年美国环保署报道，全世界每年排入环境中的苯胺类和硝基 苯类化合物约为1 0 ，0 0 0 t 和3 0 ，0 0 0 t 1 2 4 1 。据2 0 0 1 年的文献报道，全世界每年排入环境中的苯 胺和硝基苯类化合物约为3 0 ，0 0 0 t 和1 0 ，0 0 0 t 【2 5 1 。随着化工工业的发展，对这类化学品的需 b p h c 酶的纯化、固定化及处理芳香化合物的研究 求呈显著上升趋势，势必会有一部分进入到环境中，基于硝基芳香化合物的高毒性，开 展对这类污染物的治理势在必行。 世界范围内，氯代芳香化合物污染区域广泛，美国环保署在1 9 7 7 年公布的1 2 9 种优 先污染物中，氯代芳香化合物就占了2 5 种【26 。据报道，在污染比较严重地区、化工厂排 污渠及其附近水体中都已发现了大量六氯苯，例如l o u i s a l l a 在监测井中采得的油水混合 物中发现六氯苯，其浓度竟高达9 ，5 0 0 ，0 0 0 , g l ，而油井附近水域中六氯苯也达到 2 8 9 9 l 【2 。有研究报道表明，全球p c b s 产量大约有3 0 已经进入环境中，其中土壤受污 染最为严重 2 8 , 2 9 1 ，世界各大洲的土壤和沉积物中都已经发现p c b s 的存在，甚至在极地也 检测出了p c b s 3 0 , 3 1 j 。 据报道，每年经由炼油厂和石化厂的废弃物从而进入到生态环境中的石油产品和原 油全世界有数百万吨，并且多环芳烃排入环境中的量也逐年增加【3 2 1 。通过对科威特一采 油厂附近湖中沉积物的调查，s a e e d 等【3 3 】发现在2 1 个月内p a h s 的总浓度从5 7 6 m g k g 增加 到7 1 3 m g k g ，其中苯并芘从0 7 m g k g 增加到1 2 9 m g k g 。据2 0 0 3 年的报道，c e c i l e 等【3 4 】 对法国东部的一个飞机场和高速公路旁的草坪和土壤进行了取样分析，发现位于高速公 路旁的青草中p a h s 含量为位于机场附近的四倍，草中高分子量和四环以上的p a h s 约占 总p a h s 的8 6 。 ( 2 ) 国内污染状况 我国b t e x 的污染主要体现在大气、土壤和地下水等方面。有文献报道，通过对5 0 种痕量有机污染物5 年的监测结果分析，表明了北京大气挥发性有机物( v o c s ) 中b t e x 的含量最高 3 5 j 。在对沈阳东部石油污水灌溉土壤中污染物残留与生态毒理研究中，宋玉 芳等 3 6 j 发现所有土壤均有矿物油的残留，含量为6 6 2 2 1 3 9 1 1 4 m g k g ，使得该地土壤受 到b t e x 的污染。 硝基芳香化合物的污染主要体现在江河、地下水和土壤等方面。例如：据文献报道， 2 0 0 3 年锦卅l 市太和区大许村井水受到了硝基苯的污染，污染近半年后水源进入枯水期， 井水中硝基苯含量最高值仍达0 0 3 l m g l ”1 ；2 0 0 5 年中石油吉林石化公司双苯厂爆炸事 故发生，致使松花江受到了硝基苯的污染，松花江哈尔滨段的硝基苯浓度最高峰值超标 3 3 倍【3 8 1 ，并在界河黑龙江中检测到了硝基苯【3 9 1 。 我国氯代芳香化合物的污染主要体现在土壤中，此外水体悬浮物和水底沉积物中也 能检测到其存在。2 0 0 3 年袁旭音等【4 0 】研究了太湖沉积物中的有机氯农药残留情况，结 果发现六氯苯的平均残留值达2 1 5 8 n g g ( 干重) 。由于居民私自回收、拆卸含p c b s 的变 压器，使得长江三角洲某地区成为我国典型的p c b s 污染区，其农田土壤中1 6 种p c b s 总量变化范围为0 0 1 4 8 4 5 n g g ，平均值为3 5 5 2 n g g ，远高于世界其它地区1 4 ”2 1 。 大连理工大学硕士学位论文 国内p a h s 污染主要体现在土壤、大气和江河沉积物等方面。2 0 0 2 年张天彬等 4 3 j 对东莞市各地土壤进行了研究，发现1 6 种p a h s 平均含量为4 1 3j t g k g ，含量较高的几 种组分分别是菲、荧葸、苯并嗍荧蒽和芘。2 0 0 5 年俞飞等m 】发现南京焦化厂厂区土壤 中p a h s 含量高达1 7 6 3 8 1 i _ t g k g 。2 0 0 5 年许姗姗等根据国内p a h s 的主要来源、相关排 放因子和相关排放活动的统计资料，估算得出1 9 9 9 年1 6 种p a h s 的全国排放总量约为 9 7 9 9 t 1 4 5 1 。 1 2 芳香化合物的微生物降解研究进展 处理芳香化合物的常规方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法和化学法主要 包括：吸附法、膜技术、混凝法、电解法和高级氧化技术等等，但由于投资大、占地广 又需要特殊设备等缺点，人们将视线更多转向了价格低廉的生物处理方法。其中应用微 生物降解环境中的污染物具有投资少、占地小和环境友好等特点，成为治理环境污染最 有前途的方法之一。 1 2 1降解芳香化合物的微生物资源 表1 1 芳香化合物的降解微生物 t a b l e l 1 m i c r o o r g a n i s m sf o ra r o m a t i cc o m p o u n d sb i o d e g r a d a t i o n 污染物微生物参考文献 p s e u d o m o n a sp u t i d a b t e x 盔糍筠嬲嚣篇t ， 1 4 6 r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u s r h o d o c o c c u ss p s t r a i nd k 17 【4 7 1 b t e 。x n 2 瑟嬲：霉i l u p o 嘶r e s 冀e l l s 【4 8 】 ，s p l 删硎d 胛口sc 。 4 p s e u d o m o n a sp u t i d af i 硝基苯 n p 崆c o 加m 册a m 傩o n 芦a s p 警s p 篙芫罗刀 【4 9 】 j s ，o ) p s e u d o m o n a sp u t i d a2 n p 8 s u l p h a t e r e d u c i n gb a c t e r i u m t n t c l o s t r i d i u mb i f e r m e n t a n s 5 0 1 p s e u d o m o n a ss p j l rl l d e s u l f o v i b r i os p 六氯苯d e h a l o c o c c o i d e ss p s t r a i nc b d b 51 】 p c b sr h o d o c o c c u ss p r 0 4 【5 2 1 s t e n o t r p h o m o n a sm a l t o p h i l i as t r a i nv u n10 0 0 3 5 3 1 赞茛 m y c o b a c t e r i u ms p “4 m y c o b a t e r i u r as p 【5 4 】 堡垒2 望2 2 竺! p ： b p h c 酶的纯化、固定化及处理芳香化合物的研究 微生物降解技术的核心问题是高效降解菌株的获得。近年来，大量文献报道了人们 分离得到多种能够以芳香化合物为碳源，氮源和能源生长的微生物。表1 1 列出了能够 降解几种典型芳香化合物的常见微生物资源。 1 2 2 微生物降解芳香化合物的途径 由于芳香化合物种类繁多，自然界中降解芳香化合物的微生物种属多种多样，并且 每种微生物降解污染物的机理有所不同，因此本文旨在阐明针对典型芳香化合物的微生 物具有代表性的降解途径及其降解规律。 1 2 2 1 微生物降解b t e x 的途径 ( 1 ) 好氧代谢 在好氧条件下，b t e x 转化为取代邻苯二酚，从而被微生物降解【5 5 】，如图1 1 所示。 有研究报道，苯降解生成儿茶酚【5 6 】；甲苯和乙苯通过不同的途径分别生成3 甲基邻苯二 酚和3 乙基邻苯二酚【57 1 。将从受汽油污染的地下含水层中分离出的微生物进行混合培 养，研究表明它们能降解所有的b t e x ，生成c 0 2 【5 8 】。好氧代谢中的某些酶，如：邻苯 二酚2 ，3 双加氧酶，可用于b t x 生物修复的检测【5 9 1 。 0 i 一眨 j e i i s 6 夕严扮 i o 图1 1好氧微生物对b t e x 的代谢途径 f i g 1 1p m h w a yf o rc a t a b o l i s mo fb t e xb ya e r o b i cm i c r o o r g a n i s m s ( 2 ) 厌氧代谢 与好氧代谢能耗高、需要昂贵的维护费用相比，厌氧代谢优势明显。由于向地下水 注入0 2 较困难，所以人们在进行地下水中污染物的修复中通常采用厌氧代谢。 c o a t e s - 等1 6 0 1 对厌氧条件下混合种群降解苯进行了研究。c h a k r a b o r t y 等 6 1 1 证实了甲 苯、乙苯和二甲苯异构体存在中间代谢物苯甲酰辅酶a ，它是芳香化合物厌氧代谢 羔摧 大连理t 大学硕士学位论文 最常见的中间产物，苯甲酰辅酶a 进一步还原为乙酰辅酶a ，最终生成c 0 2 ，如图1 2 所 示。在厌氧条件下，对位二甲苯的代谢途径还没有文献给出完整叙述。在进行被燃料污 染的地下含水层研究中，对厌氧降解甲苯和二甲苯进行监测，发现了苯甲基琥珀酸和甲 基苄基琥珀酸异构体等具有指示作用的中间体砸2 1 。 o 竺6 一 图1 2 厌氧微生物对b t e x 的代谢途径 f i g 1 2p a t h w a yf o rc a t a b o l i s mo fb t e xb ya n a e r o b i cm i c r o o r g a n i s m s 1 2 2 2 微生物降解硝基芳香化合物的途径 根据分子中硝基的数目不同，硝基芳香化合物可分为单硝基化合物，二硝基化合物 及多硝基化合物；根据母环结构可将其分为单环，多环及稠环硝基化合物；根据母环原 子组成可将其分为碳环和杂环硝基化合物【6 3 】。通常，硝基芳香化合物的降解可通过环上 硝基的变化和环自身能否断裂来判断。降解途径可分为氧化途径和还原途径，其中氧化 途径包括：( a ) 单加氧酶催化反应，( b ) 双加氧酶催化反应；还原途径包括：( a ) 芳环加 氢反应，( b ) 芳环的部分还原反应。在厌氧条件下，硝基芳香化合物首先降解为氨基芳 香化合物，从而有利于完全矿化。 ( 1 ) 细菌代谢硝基芳香化合物 氧化途径 i 单加氧酶催化反应 好氧条件中，在单加氧酶的作用下，底物分子加一个氧原子，从而使单硝基酚发生 脱硝基的反应。s i m p s o n 和e v a n s 硎证明假单胞菌属存在单加氧酶，能够将4 硝基酚转 化为对苯二酚，同时产生亚硝酸盐。s p a i n 和g i b s o n t 6 5 】利用部分纯化的莫拉菌属单加氧 酶( 黄素蛋白) 揭示了4 硝基酚的降解途径，如图1 3 所示，该菌属通过消耗还原型辅 酶i i 降解4 硝基酚，同时产生亚硝酸盐和对苯二酚。研究表明，虽然降解过程中能够 检测到的中间产物是对苯二酚，但是对苯二酚的生成要经过单加氧酶催化反应中的一种 不稳定的中间体l ，4 苯醌i 删。 上述反应中生成的对苯二酚作为开环底物，在环断裂双加氧酶的作用下，进一步开 环降解，途经为：对苯二酚转化为r 羟基粘糠酸半醛，然后进一步氧化为酰化乙酸，后 b p h c 酶的纯化、固定化及处理芳香化合物的研究 者被进一步还原为p 酮己二酸6 7 1 。相关报道证明，节杆菌和诺卡氏菌属、洋葱假单胞菌、 鞘氨醇单胞菌和恶臭假单胞菌对4 硝基酚的降解遵循相类似的途径6 ”0 1 。 图1 3 单加氧酶催化降解4 硝基酚 f i g 1 3b i o d e g r a d a t i o no f4 - n i t r o p h e n o lb ym o n o o x y g e n a s e i i 双加氧酶催化反应 双加氧酶通常在底物中引入两个羟基，将芳环的硝基还原为亚硝酸盐，如图1 4 所 示。真养产碱杆菌对2 , 6 二硝基甲苯的转化符合这一降解机制【7 l 】。h a i g l e r 等人7 2 ，7 3 1 在对 假单胞菌和丛毛单胞菌的研究中报道了相似的结论。 6 n 0 2 一 c 。2 + h 2 。十卜c c o 。o o h h + _ c c h o 。o h 图1 4 双加氧酶催化降解硝基苯 f i g 1 4 b i o d e g r a d a t i o no f n i t r o b e n z e n eb yd i o x y g e n a s e 还原途径 i 芳环加氢反应 好氧降解菌对芳环的直接还原产物主要包括：氢离子迈森海梅尔络合物、二氢离 子、t n t 及几种质子化的二氢离子t n t 的异构体【7 4 1 。有研究表明，通过加氢阴离子导 致氢离子迈森海梅尔络合物的形成，能够部分还原二硝基和三硝基芳环化合物【75 。由 于多硝基芳香化合物自身缺乏电子，好氧条件下氧化酶攻击反应不容易进行，而亲电子 伽人y眦 一 。入y。 芋 p ) 伽审伽 大连理t 大学硕士学位论文 反应容易发生。因此，在三硝基甲苯和苦味酸这样的多硝基芳香化合物的降解中也能检 测到氢离子迈森海梅尔络合物f 7 6 1 。图1 5 为三硝基芳香化合物还原形成氢离子迈森海梅 尔络合物的过程。 图1 5 三硝基芳香化合物代谢途径 f i g 1 5 m e t a b o l i s m so ft r i n i t r oa r o m a t i cc o m p o u n d s i i 芳环的部分还原 好氧条件下，微生物对硝基芳香化合物的还原还涉及硝基的部分还原反应。此过程 中，硝基转化为相应的羟胺，如4 硝基苯甲酸、2 硝基苯甲酸等化合物的生物代谢通常 通过将硝基部分还原为氨基衍生物的降解途径【7 7 1 。图1 6 为4 硝基苯甲酸的代谢途径。 n 婴审 过，0i 图1 64 硝基苯甲酸的代谢途径 f i g 1 6p a t h w a yf o rc a t a b o l i s mo f4 - n i t r o b c n z o a t c ( 2 ) 真菌代谢硝基芳香化合物 自然界中存在大量能够去除有机污染物的真菌，其中较为常见的白腐菌包括：黄孢 厚毛平革菌( p h a n e r o c h e t ec h r y s o s p o r i u m ) 、彩绒草盖菌( c o r i d u s v e r s i c o l o r ) 、变色栓菌 ( t h a m e t e sv e r s i c o l o r ) 、射脉菌( p h l e b i ar a d i a t e ) 、风尾菇( p l e u r o t u sp u l m o n o n a n u s ) 和朱 红密孔菌( p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s ) 等等。自1 9 8 5 年，b u m p u s 等【7 7 】在( ( s c i e n c e ) ) 发表了自腐菌降解芳香族环境污染物的报道以来，该方面的研究一直是微生物学、环境 生物化学和环境毒理学等学科交叉渗透的热点领域之一【7 9 8 0 】。v a na k e n 和h o f r i c h t e r 等 人【8 l 】利用p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 成功地去除了三硝基甲苯，利用p h l e b i ar a d i a t a 啊7 b p h c 酶的纯化、固定化及处理芳香化合物的研究 成功地去除了三硝基甲苯、4 羟氨基2 ，6 二硝基甲苯( 4 一o h a 2 ，6 d n t ) 和4 氨基2 ，6 二 硝基甲苯( 4 a 2 ，6 d n t ) 。王庆生等【8 2 1 采用经过采集、培养、驯化后的优势白腐菌在废 水温度为2 5 0 c 、p h 值为7 的条件下处理硝基苯类化工废水，c o d