清除自由基研究方法汇总.doc

_电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-）、羟基自由基体系（OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。其中 ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。原理部分：1.DPPH法测试机理DPPH（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH溶液中时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。2. 羟基自由基（OH）1）邻二氮菲法70实验原理：邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在 510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲Fe3+后，其 510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则 Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以 A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。2）水杨酸法71实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的OH，生成的 2,3二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在 510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下：Fe2+H2O2Fe3+OH-+OH甲基紫在酸性溶液中呈现紫色9,在 578nm 处有强吸收。反应产生的OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在 578nm 处吸光度值的变化可间接测定出OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。3.超氧阴离子自由基（O2-）邻苯三酚法：超氧自由基难于用一般方法产生和检测,但是在弱碱性条件下, 邻苯三酚能发生自氧化反应,生成 O2-和有色中间产物, 该中间产物在=320 nm处有一特征吸收峰。在初始阶段, 中间产物的量与时间成线性关系。当加入O2-清除剂时, 它能迅速与 O2-反应, 从而阻止中间产物的积累, 致使溶液在 =320 nm处吸收减弱。故可以通过测定 A320 值来评价清除剂对 O2-的清除作用。1. 黄儒强，李娘辉，黄科礼，郑陆威，林盛，林健华.(华南师范大学生命科学学院，广东 广州 510631) 山稔子黄酮类提取物抗自由基作用及体内抗氧化功能的研究J.食品科学，2008,29（9）：588-590.1.3.2动物试验方法选用雄性昆明种小鼠，适应性饲养1周后，随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。低、中、高剂量组小鼠每天灌胃1次，每次 0.5ml。对试验小鼠重新进行分组，分为高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组。各组均常规饲养，自然光照，自由饮水。除对照组外，其他各组进行如下处理：每天给药1次，每次每只灌胃0.5ml。1.3.3动物实验指标测定及统计分析连续试验3周，最后一次给药后，禁食2h，摘取各小鼠眼球取血，离心分离，吸取上层血清，用于SOD、GSH-Px、MDA 的测定。以对照组为对照，对各试验组数据用SPSS11.0作单因素方差分析和均数间多重比较。1.3.4 清除羟自由基7取6支10ml比色管，分别依次加入0.3ml7.5mmol/L硫酸亚铁铵溶液、0.3ml7.5mmol/L邻二氮菲溶液、1mlpH7.47Tris-HCl缓冲溶液，在2、3、4、5、6号比色管中各加入0.2ml7.5mmol/LH2O2，然后在3、4、5、6号比色管中分别加入0.3ml浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.10mg/ml的山稔子黄酮类提取物，用重蒸水定容至刻度，在37的水浴中，反应1h，在450550nm波长范围内扫描，得最大吸收波长，并在此波长下测光密度值，根据下式计算羟自由基的清除率：式中，OD样品、OD未损及OD损，分别为加入提取液的羟自由基体系、不加H2O2及加入H2O2的光密度值。1.3.5 对超氧离子自由基(O2)的抑制率取4支10ml的比色管，各加入2.0ml pH8.34 Tris-HCl缓冲溶液，依次分别加入1.0ml浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.10mg/ml 的山稔子黄酮类提取物，最后都加入1.0ml 0.2mmol/L邻苯三酚，重蒸水定容至刻度。在吸收波长322nm处每隔30s记录一次光密度值,根据邻苯三酚自氧化速率计算抑制率：式中，OD1/t 为邻苯三酚自氧化时反应速率，OD2/t 为加入提取液后邻苯三酚自氧化反应速率。2. 陈旭丹,于晓莹,郝晓萌,陆曦,王威.(天津师范大学化学与生命科学学院,天津300074) 三种黄酮类化合物抗自由基的研究J. 食品研究与开发2007,128（6）：20-22.连苯三酚法和DPPH法对其清除活性自由基的能力进行研究。1.2.2 连苯三酚法1.2.2.2 清除超氧自由基的测定步骤分别将金银花和葛根的提取液配制成百分浓度为20 %、30 %、40 %和10 %、20%、30%的待测液。用10mmol/L HCl 溶液配制成1.5 mmol/L 的连苯三酚溶液; Tris- HCl 缓冲溶液为 50 mmol/L, pH 值为 8.2; 各样品浓度为 1 mmol/L。按表 1 加样于具塞比色管中, 迅速摇均后每隔30 s,以10 mmol/L HCl 溶液为参比液,光程 1 cm,用紫外-可见分光光度计于320 nm处测定相应吸光度值, 至 3 min 止。取 3 次试验的平均值计算清除率。清除率计算公式:S=1-(Aj-Ai)/A0100 %S:清除率; Ai:待测液在320 nm的吸光值; Aj:待测液与连苯三酚混合物的吸光值; A0:连苯三酚在320 nm的吸光值。1.2.3 DPPH 法1.2.3.1 原理DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl或1,1-二苯基苦基苯肼)分子结构图,见图。在有机溶剂中是一种稳定的自由基, 其乙醇溶液(显深紫色)在517nm处有最大吸收峰,见图。当与抗自由基活性物质作用时, 其孤对电子被配对, 因而吸收消失或减弱,通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除剂的活性。1.2.3.2 清除自由基的测定步骤分别将金银花、葛根和栗子叶的提取液配制成百分浓度为10 %、20 %、30 %、40 %、50 %的待测液。DPPH用70 %的乙醇配制成6.510-5mol/L的溶液; 按表 2 加样于具塞比色管中, 摇匀反应 30 min 后, 用紫外-可见分光光度计, 光程1cm, 70%乙醇溶液为参比液, 在 517 nm处分别测定吸光度值 A0、 Ai、 Aj。按下列公式计算清除率:S ( %) =1- ( Ai- Aj ) /A0 100 %S:清除率; Aj:待测液在 517 nm的吸光值; Ai: 加入DPPH待测液后的吸光值;A0:DPPH在517nm的吸光值。3.牛骨胶原多肽的制备及其清除自由基活性研究（华南理工大学硕士研究生论文）4.3.2 水解物清除超氧阴离子（O2-）能力的测定本实验采用邻苯三酚自氧化法89测定样品清除超氧阴离子的活性。取浓度为 80g/L的水解样品溶液 0.2mL，加入pH8.2，50mmol/L的Tris-HCl缓冲液4.5mL，蒸馏水 4mL，混匀，置于 27保温 10min，作为试剂A；取 0.3mL 3mmol/L的邻苯三酚溶液，置于 25下保温 10min，作为试剂B；以试剂A与 0.3mL 10mmol/L HCl溶液的混合液作为空白调零后，将试剂A与试剂B迅速混合，在 320nm 处测定 3min内吸光度的变化，回归求出吸光度变化斜率K1。以蒸馏水代替水解样品溶液作为对照样品重复上述过程，得出吸光度变化的斜率为K0；计算清除超氧阴离子的能力：式中：K0空白对照液的吸光度变化斜率K1加入水解液后的吸光度变化斜率4.3.3 水解物清除羟基自由基（OH）能力的测定采用水杨酸法测定水解物清除羟基自由基（OH）能力90。在反应体系中加入 10mL 9mmol/L FeSO4溶液和 10mL 9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，然后加入浓度为 80g/L的水解样品溶液 10mL，最后加入 10mL 8.8mmol/LH2O2启动反应。对照液中以 10mL蒸馏水替换同体积的水解液，37条件下保温 0.5h。以蒸馏水为参比液，在 510nm测定其吸光值。计算清除羟基自由基的能力：式中：A0空白对照液的吸光值Ax加入水解液后的吸光值Ax0水解液的本底吸光值4.3.4 水解物清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH）能力的测定91二苯代苦味酰基自由基（DPPH）法是一种广泛用于筛选抗氧化剂的方法，用该法测定了水解物清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH）的能力。将2mL浓度为80g/L的水解液与2mL 0.1mmol/L的DPPH-乙醇溶液混匀置于试管中,静置30min后，以无水乙醇作为参比测定其吸光度Ax；在对照液中，以2mL无水乙醇代替水解液，静置30min后，以无水乙醇作为参比测定其吸光值A0；取相同浓度的水解液2mL和2mL的无水乙醇混匀，以无水乙醇作为参比测定其本底吸光值Ax0。计算清除二苯代苦味酰基自由基的能力：式中：A0空白对照液的吸光值Ax加入水解液后的吸光值Ax0水解液的本底吸光值4.白腐菌降解木质纤维素过程中清除自由基物质产生研究（华中科技大学硕士学位论文）2.2.5 羟自由基清除率测定（1）邻二氮菲法70实验原理：邻二氮菲可与 Fe2+形成络合物，此络合物在 510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过 Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲Fe3+后，其 510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则 Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以 A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。操作步骤：10mL 反应体系中，依次加入 5mmol/L 的邻二氮菲 1.5mL，PH7.4 0.5mol/L 的磷酸缓冲液 3mL，7.5mmol/L 的 FeSO41.0mL，立即混匀。再加入待测样品 3mL，0.1% H2O21.0mL，用蒸馏水定容至 10mL。混匀后，于 37水浴 1 小时，然后在 510nm 波长下测其吸光值。计算方法：自由基清除率 E（AsA0）/（A1A0），其中 As 为加了待测样品和 H2O2所测得的吸光值，A1为没有加样品和 H2O2所测得的吸光值，A0为没有加样品、加了 H2O2所测得的吸光值。（2）水杨酸法71实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的，生成的 2,3二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在 510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。操作步骤：10mL 刻度具塞试管中，依次加入 10mmol/L 水杨酸 0.5mL，0.4mol/LpH7.4 的磷酸缓冲液 3mL，3.8mmol/L Fe(II)的 EDTA 溶液 0.5mL，待测样品 1mL，加入 4mmol/L 的 H2O21mL 启动反应，于 25水浴 90min。加入 6mol/L HCL 结束反应，再加入 0.5g NaCL，滴加去离子水至 6mL 刻度处，混匀。加入冷的乙醚 4mL，充分混匀，静置后移取上层乙醚 3mL 于 10mL 刻度离心管中，将离心管置于 40恒温水浴中，将乙醚蒸发至干。加入 10三氯乙酸 0.15mL，10钨酸钠 0.25mL，0.5NaNO2（每天配置）0.25mL，放置 5min 后，加入 1mol/L KOH 0.25ml，滴加去离子水至 4ml 处，混匀，于 510nm 处测定其吸光度 A。计算方法：自由基清除率 E（A0As）/A0，其中 A0为没有加待测样品时（以蒸馏水代替）所测得的吸光值，As 为加了待测样品时所测得的吸光值。5.黑沙蒿和凤尾茶中二氢黄酮类化合物及其抗自由基活性研究（河南大学研究生硕士学位论文）3.2 二氢黄酮类化合物对 DPPH的清除作用本节采用分光光度法测定了五种二氢黄酮类化合物对 DPPH的清除作用。3.2.1.2 仪器与试剂7550 紫外-可见分光光度计（上海分析仪器厂），酸度计（上海大中分析仪器厂）；DPPH（德国默克公司）；无水乙醇（ethanol）为分析纯；试液及样品的配制：1.DPPH 储备液：称取 0.0085gDPPH（分子量为 394.32），用无水乙醇定容于 10mL容量瓶中，所得溶液浓度为 2.15510-3mol/L，将其盛于棕色容量瓶中，并用铝箔包裹，置于冰箱中 4C 下保存，可保存 3-5 天，用时稀释 25 倍至所需浓度8.62010-5mol/L。所有测定均重复三次，求其平均值。2.样品的配制：分别称取每种样品 0.0050g，用无水乙醇溶解后定容于 50mL 容量瓶中，浓度为 0.1000g/L，用时稀释至不同浓度。3.2.1.3 实验方法样品捕捉自由基能力以 IC50来比较。IC50的定义为：使自由基数目减少 50%时所需样品的浓度。在此指可使 DPPH 溶液在波长 517nm 下吸收值下降 50%的样品浓度，浓度以 g/L 表示。测定方法依据 Mensor L.L.11等报道的方法稍加改进。分别将各样品配制成一系列浓度的溶液，然后在 2.0mL 样品溶液中加入8.62010-5mol/L 的 DPPH 溶液 2.0mL 于 10.0mL 比色管中，摇匀反应 30min 后，用紫外-可见分光光度计于 517nm 处进行测定，以 2.0mL 无水乙醇与 2.0mL 样品液作参比，测吸光度值 A，同时测定 DPPH 空白溶液吸光度值 A0（以乙醇溶液为参比）。清除率计算公式：S(%)(A0-A)/A0100%以清除率 S 对各种样品的浓度进行回归处理，得工作曲线 S(%)=ax+b( R2=0.995-0.998)，式中 x 是各样品的终浓度，计算出 IC50的数值。3.3 二氢黄酮类化合物对OH 的清除作用本节采用分光光度法及甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系测定了上述天然二氢黄酮类化合物对OH 的清除作用。3.3.1.1 仪器与试剂7550 紫外-可见分光光度计（上海分析仪器厂），酸度计（上海大中分析仪器厂）；甲基紫、硫脲及硫酸亚铁均为分析纯；三羟甲基氨基甲烷（MTris=121.14，中国惠兴生化试剂有限公司）；H2O2（30%）、无水乙醇、浓盐酸均为分析纯；所有溶液均用二次蒸馏水配制；溶液的配制3.3.1.2 实验方法在一系列10mL比色管中依次加入 1.0mL 甲基紫溶液（2.010-4mol/L）、1.0mLFe2+溶液（1.010-3mol/L）、1.0mLH2O2（0.12%）溶液，用 Tris-HCl 缓冲溶液调节 pH4.5 后用水稀释到 10mL，摇匀放置 30min，然后用分光光度计在 578nm处测定吸光度 A0，甲基紫和 Tris-HCl 缓冲溶液做空白溶液测定吸光度值为 A，两者均以水为参比。测定样品时在上述体系中预先加入 1.0 mL 样品溶液，同上测定吸光度值 As，同体积样品溶液、Tris-HCl 和水溶液作参比，则清除率计算公式为：S(%)=(As-A0)/(A-A0)100%以清除率 S 对各样品的浓度进行回归处理，得工作曲线 S(%)=ax+b，式中 x 是各样品的终浓度，计算出各样品的 IC50数值。3.4 二氢黄酮类化合物对O2-的清除作用本节采用分光光度法（邻苯三酚自氧化产生O2-）测定了上述二氢黄酮类化合物对O2-的清除作用，以期挖掘植物中的药用成分，找出高效的自由基清除剂，为中草药开发利用提供理论依据。3.4.1.1 仪器与试剂7550 紫外-可见分光光度计（上海分析仪器厂），酸度计（上海大中分析仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京使用光明医疗仪器厂）；邻苯三酚、浓盐酸均为分析纯；三羟甲基氨基甲烷（分析纯，中国惠兴生化试剂有限公司）；所有溶液均用双蒸水配制；溶液的配制：3.4.1.2 实验方法3.4.1.2.1 O2-的生成及清除率的测定参考文献15-16及 Marklund17法，向 pH8.20，5.7mL50mmol/LTris-HCl 缓冲液中加入 0.2mL 样品，于 25C 保温 10min，然后加入 25C 预热6mmol/L 邻苯三酚 0.1mL，总体积 6.0mL，迅速摇匀后用紫外-可见分光光度计测定反应 1min 时320nm 处的吸光度(As)，同时用等浓度样品溶液作参比以扣除样品本身颜色的干扰；另取试剂同上，将样品用等体积水代替(即 Tris-HCl+水+邻苯三酚)，同时以Tris-HCl 做空白参比，测定反应 1min 时吸光度值(A0)，则清除率为：S(%)=(A0-As)/ A0100%3.4.1.2.2 O2-的生成及抑制率的测定反应体系同上，用动态方法测定O2-生成的反应初速率 V0(A/min)，反应启动后每隔 30s 测一相应 A320，至 5.0min 止，将所得吸光度值与时间 t(min)进行回归分析，其斜率为 Vs(A/min)，则抑制率为：I(%)=(V0-Vs)/V0100%6.郭元亨，马李一，郑华，张弘，甘瑾，李坤(中国林业科学研究院资源昆虫研究所，国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室)，胭脂红酸清除自由基的作用，2010,31（17）：73-76.1.3.1 胭脂红酸与抗坏血酸清除DPPH自由基活性的测定配制质量浓度为39.40g/mL的DPPH自由基乙醇溶液；配制适当质量浓度的胭脂红酸水溶液和抗坏血酸水溶液。按下式计算胭脂红酸或抗坏血酸的自由基清除率21。胭脂红酸对自由基清除率 /%=(1ACAi /ACA0)100抗坏血酸对自由基清除率/%=(1AVCi /AVC0)100式中：ACA0为DPPH 自由基乙醇溶液和纯水混合液的吸光度与胭脂红酸溶液和乙醇混合液的吸光度之和；ACAi为DPPH自由基乙醇溶液与胭脂红酸溶液混合液的吸光度。AVC0为DPPH 自由基乙醇溶液与纯水混合液的吸光度；AVCi为DPPH 自由基乙醇溶液与抗坏血酸溶液混合液的吸光度。以上混合液均为等体积比混合，波长517nm处测吸光度，每个样品重复3次实验，取平均值。1.3.3 胭脂红酸与抗坏血酸清除O2的活性测定配制质量浓度为126g/mL的连苯三酚水溶液，并滴加12滴0.1mol/L的盐酸；配制适当质量浓度的胭脂红酸溶液和抗坏血酸溶液；配制pH8.2 左右的Tris-HCl缓冲液。按下式计算胭脂红酸和抗坏血酸的自由基清除率22。胭脂红酸对自由基清除率/%=(1FCAi/F0)100抗坏血酸对自由基清除率/%=(1FVCi/F0)100式中：F0=A0i / t；FCAi=ACAi/ t；FVCi=AVCi/ t；t 表示时间。A0i 为Tris-HCl 缓冲液2mL、纯水与连苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度；ACAi为Tris-HCl缓冲液2mL、胭脂红酸溶液与连苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度；AVCi为Tris-HCl缓冲液2mL、抗坏血酸水溶液与连苯三酚溶液各1mL的混合液吸光度。10min内每隔0.5min在波长318nm 处测吸光度，每个样品重复3 次实验，取平均值。李颖畅, 孟宪军, 修英涛, 冯颖. 化学发光法测定蓝莓花色苷对氧自由基的清除作用，食品研究与开发，2008,29（3）：72-75.1.2.2 超氧阴离子( O2-)的产生及清除5,7用化学发光法测定产品对碱性连苯三酚体系(非酶体系)产生的 O2-的清除作用。在反应池中加入 5 mmol /