（生物医学工程专业论文）用于微流控芯片的落射荧光检测技术研究.pdf

a b s t r a c t m i c r o f l u i d i cc h i pt e c h n i q u eh a ss o m es u c c e s s f u la p p l i c a t i o n si nb i o c h e m i c a l a n a l y s i sa r e as u c ha sd n as e q u e n c i n g ，s e p a r a t i o na n da n a l y s i s f o rp r o t e i na n d m o n o p l a s t ，e t e c o m p a r i n gw i t ht r a d i t i o n a lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) ，i t h a sm a n y p o t e n t i a la d v a n t a g e ss u c ha sh i 曲e f f i c i e n c y ，h i g hs p e e d ，l e s sr e a g e n tc o n s u m e ，k 曲 r e l i a b i l i t ya n ds oo n t h es i g n a ld e t e c t i o nt e c h n i q u eo fm i c r o f l u i d i cc h i p si sa l w a y s t h ee m p h a s i sa n dt h ed i f f i c u l t yf o rt h er e s e a r c h e sa n da p p l i c a t i o n so fm i c r o f l u i d i c c h i p s t h ed i s s e r t a t i o nw o r ki sar e s e a r c ht o p i cf o rs i g n a ld e t e c t i o nt e c h n i q u eo f m i c r o f l u i d i cc h i p s ，a l le p i f l u o r e s c e n c ed e t e c t i n gd e v i c ew a sd e s i g n e da n dm a d eo u t ， t h e nd e t e c t i o n so fr h o d a m i n eba n df l u o r e s c e i nw e r ec o m p l e t e d 、i 吐lt h ed e v i c e t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e v i c eh a sc e r t a i ns e n s i t i v i t y , g o o dl i n e a r i t y a n dr e p e a t a b i l i t y i nt h i sp a p e r , t h er e s e a r c hw o r ki n c l u d e sf o l l o w i n ga s p e c t s ： 1 a c c o r d i n gt ot h er e f e r e n c e sb o t hh e r ea n da b r o a d ，t h ed i f f e r e n tf a c t o r st h a t a f f e c tt h ew h o l ep e r f o r m a n c eo f t h ed e t e c t i o ns y s t e mh a v eb e e na n a l y z e d ，t h es y s t e m w a sc o n s t r u c t e dw i t l la ne p i f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o ns y s t e mw h i l et h el i g h tp a t hw i t h i n h a sas p e c i a ld e s i g nc a l l e d “l i g h tt r a p ” 2 t h e d e t e c t e df l u o r e s c e n td a t aa c q u i s i t i o na n dp r o c e s s i n gs y s t e mh a sb e e n d e s i g n e da n df a b r i c a t e d t h ef l u o r e s c e n c es i g n a li sc o l l e c t e db yt h em i c r o s c o p ! c a l o b j e c tl e n sa n dc o n v e r t e dt oe l e c t r o n i cs i g n a lb yp h o t o d i o d e ，f i n a l l yt h es i g n a li s s a m p l e da n dd e a l tw i t hb yt h ef o l l o w i n gc i r c u i t s ，a n dt h ef u n c t i o n so fd a t a a c q u i s i t i o n ，t r a n s m i s s i o na n dd i s p l a yi nt i m ew e r ec o m p l e t e d 3 t h e e x p e r i m e n t a lv e r i f i c a t i o nw a sa c c o m p l i s h e d t h ew h o l es y s t e mw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e c tt h ef l u o r e s c e n td y e ：r h o d a m i n eba n df l u o r e s c e i n ， w i t lc e r t a i ns e n s i t i v i t ya n d l i n e a r i t y t h e “l i g h tt r a p ”s t r u c t u r eh a sp r o v e de f f e c t i v ei n r e d u c i n gt h eb a c k g r o u n dn o i s et os o m ee x t e n t t h ed i s s e r t a t i o nw o r ka c c o m p l i s h e ds o m e e x p l o r i n g s f u r d e s i g n a n d d e v e l o p m e n to f d e t e c t i n gs y s t e m f o rm i c r o f l u i d i c c h i p s ，t h ee p i - f l u o r e s c e n c e d e t e c t i n gi d e aw a gp r o p o s e d ，o p t i c a l ，e l e c t r o n i ca n ds o f t w a r es y s t e m sw e r ed e s i g n e d a n dd e v e l o p e d t h i sw o r kw a sm e r i t o r i o u sf o rm i c r o f l u i d i cd e t e c t i o nt e c h n o l o g y k e yw o r d s ：m i c r o f l u i d i cc h i p s e p i f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n 、l i h tt r a p d a t a a c q u i s i t i o n ， 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘茎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：杀春签字吼抛年6 月谚日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨盗盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权蠢鎏盘芏可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 券骨 签字日期：沙堪年6 月上厂日 名： 硝私p 、 签字日期：吃f ，年名夕硝 第一章 1 , 1 微流控芯片概述 第一章绪论 随着分析仪器技术的不断发展以及生命科学发展的需要，分析仪器的一个日 益明显的发展趋势就是集成化、微型化和便携化。微机电系统 ( m i c r o e l e c t r o m e e h a r f i c a ls y s t e m s ，m e m s ) 技术的发展为分析仪器的微型化提供 了便利的条件。在这一基础上，1 9 9 0 年m a n z 和w i d m e r 提出了以m e m s 为基 础的微全分析系统( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m s ，或者m a c r ot o t a la n a l y s i s s y s t e m s g t a s ) 1 1 2 1 。 图1 1 是微分析系统的分类示意图，从中我们可以清楚地看出微流控分析技 图1 - 1 微分析系统及微流控芯片的分类 术在微化学分析中的地位。微流控分析系统的目的是通过化学分析设备的微型化 与集成化，最大限度地把分析实验室的功能整合到便携的仪器的分析设备中，甚 至集成到方寸大小的芯片上。由于这种特征，本领域一个更广泛的通俗名称叫做 “芯片实验室”( l a b o l l a - c h i p ，l o c ) ，它的实质是采用微加工方法( 现多采用光 蚀刻和腐蚀技术) 在硅、玻璃或其他材料平板上制作出微米级别的结构( 多数为 通道网络，通道宽2 0 1 0 0 i _ t m ，深1 0 3 0 岬) ，采取适当方法使试样和试剂在这 些微结构或通道中作受控流动及混合、并完成试样分析。 微阵列芯片目前的应用领域主要是d n a 分析，所以也称为d n a 或者基因 第一章 芯片。这类芯片目前在国外已经实现了深度产业化，技术发展已经较为成熟了， 而微流控芯片则主要是在分析化学领域发展起来的，因此具有更广泛的适用性及 应用前景。由于种种原因，微流控芯片的研究和应用还处在比较初级的阶段，国 内外都远未达到可以大规模产业化的程度。 1 1 1 微流控芯片的特点 分析系统通过在微米级别通道与结构中实现微型化，不仅带来了分析设备尺 寸上的变化，而且在分析性能上也带来了众多的优点，但是相应的，微型化也带 来了一系列对器件的特殊要求和加工上的困难。 微流控分析芯片的优势： ( 1 ) 微流控分析芯片效率高：许多微流控芯片可以在数秒至数十秒时间内 自动完成测定、分离或其他更复杂的操作。分析和分离速度常高于相对应的宏观 分析方法一至二个数量级。其高分析或处理速度既来源于微米级通道中的高导热 和传质速率 r杉7 刀 t 1 图2 8 用于固定滤片组的部分 第二章 镜。在4 5 度斜面上铣出一个浅槽用于放置二向色镜。上端的模块和下端的模块 结构相似，在上端也有一个用于放置滤片的凹槽，不同之处在于后端加工出的通 孑l 后连接了一个用于降低杂散光干扰的“l i g h tt r a p , ( 光阱) 。该部分结构如图2 - 9 所示。 光阱的结构比较简单，就是一个封闭的暗室。其作用就是可以进一步减弱进 入检测器的杂散光。如图2 9 所示，由于二向色镜对激发光的反射不可能达到 1 0 0 ，所以必然会有一部分透过二向色镜，这一部分光射到二向色镜后的管壁 上时，必然会有一部分杂散光反射到检测器中，这一部分光会对检测造成干扰。 图2 - 9光阱原理示意图 在加了“光阱”之后，一部分的激发光在透过二向色镜之后，反射方向改为向下， 再采用对光吸收比较好的物质放在下部对光线进行吸收。这样可以达到进一步减 少杂散光的目的。 具体实现部分如图2 1 0 所示。 撼个光具座用一个铁架台固定，铁架台可以上下移动，便于调节聚光物镜的 位置，以便使得被测物处在物镜的焦面上，这样既可以获得最大的激发光强，又 可以在探测器处收集到最多的荧光。 第二章 一4 脐 一 严 杵一南 1 li 艇 址 刁l 髟旒 笙 图2 l o 光阱的具体实现部分 2 2 - 第三章 第三章电路系统硬件设计 电路系统硬件设计包括信号采集放大部分以及和计算机的接口部分。整体 系统硬件框图如图3 1 所示。 3 1 微弱信号检测【2 4 1 图3 - 1 系统硬件框图 由于本系统中是要对激发产生的微弱荧光进行检测，也就是要处理微弱信号 检测的问题。微弱信号的检测，都是基于研究噪声的规律( 如噪声幅度、频率、 相位等) ，和分析信号特点( 如信号频谱、相干性等) 的基础上的。然后利用电 子学、信息论和其他物理、数学方法，来对被噪声覆盖的弱信息，进行提取、测 量。 提高信号检测灵敏度或降低检测下限的基本方法有两种：一是从传感器或放 大器入手，或降低它们的固有噪声水平，或研制新的低噪声传感器；二是分析测 量中的噪声规律和信号规律，通过各种手段从噪声中提取信号。微弱信号检测， 大部分是利用后一途径。必须注意：从噪声中提取信息，首先需在尽量降低噪声 的基础上进行。 应用于微弱信号检测的技术多种多样，例如有频域的窄带化与相干检测技 术、时域信号的平均处理、并行检测、计算机的数字处理等许多方面。要根据实 际情况以及需要，采用种或多种提高微弱信号检测效果的技术。在本系统中， 主要是通过对电路的优化设计以及采用低噪声的优质器件来达到提高信噪比以 第三章 及检测灵敏度的目的。 3 2 光电接收系统 光学检测系统最关键的部分之一是光电检测部件，常用的光学检测器件有 光敏电阻、光电池、各种半导体光电二极管、光电晶体管、光电场效应管、光电 倍增管以及一些特殊结构的结型器件等等。其中灵敏度最高的是光电倍增管，但 是相应的，其缺点也很多：体积庞大、量子效率低下、反向偏压高、仅能够工作 在u v 和可见光谱范围内，抗外部磁场能力较差等等，所以在实际应用中往往受 到很大限制。而体积比较小的光电探测器件，如光敏电阻、光电池等，前者具有 前历效应，以及温度特性比较复杂，带宽较窄等许多缺点；而后者产生的光生电 动势和照度成对数关系，处理起来比较复杂。而光电二极管在受到光照时，会产 生一个与照度成正比的小电流，是很好的光电传感器，可广泛应用于精密光度计、 高速光纤接收器等领域，此外光电二极管具有体积小，成本低，故障率低等许多 优点，而且随着技术的不断发展，光电二极管的灵敏度也不断提高，目前灵敏度 较高的光电二极管如i n t e r n a t i o n a ll i g h t 公司的s h d 0 3 3 通过在内部集成高性能的 前置放大器，能够达到1 0 1 3 w m m 2 数量级的灵敏度，仅比该公司生产的p m 2 7 1 d 光电倍增管的1 0 d 4 w r a m 2 的灵敏度低了一个数量级。还有一种特殊的雪崩光电 二极管( a v a l a n c h ep h o t o d i o d e ，a p d ) 利用“雪崩”倍增效应，也可以达到很高的 灵敏度，具有量子效率高、功耗低、工作频谱范围大、体积小、工作电压较低等 优点，但是同时也有增益低、噪声大，外围控制电路及热电制冷电路较复杂等缺 点。正是由于光电二极管相比较之下具有许多优点，我们在检测装置中采用光电 二极管作为传感器来接收荧光信号。 3 2 1 光电二极管放大电路设计 光电二极管可以以两种模式工作2 5 1 ，一是零偏置工作( 光伏模式，如图3 - 2 图3 - 2 光电二极管的零偏工作模式 堡三翌 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 所示) ，一是反偏要工作( 光导模式，如图3 3 所示) 。在光伏模式时，光电二极管可 图3 - 3 光电二极管的反偏工作模式 非常精确地线性工作；而在光导模式时，光电二极管可实现较高的切换速度，但 要牺牲线性。在反偏置条件下，即使无光照，仍有一个很小的电流，叫做暗电流 ( 无照电流) 。在零偏置时则基本没有暗电流，这时二极管噪声主要是分路电阻产 生的热噪声。在反偏置时，由于导电产生的散粒噪声成为附加的噪声源。在设 计光电二极管过程中，通常是针对光伏或光导两种模式之一进行最优化设计的， 而不是两种模式的使用都是最优化。由于是对微弱信号进行检测，所以必须把电 路中的各种噪声考虑进去。 在实际应用中，由于种种原因，往往并不直接采用简单的电流一电压转换 电路，而是采用其他形式的变形。 第一种变形电路如图3 - 4 所示。电路在运放的同相输入端串联电阻r 2 来消 除运放的偏置电流造成的偏压误差( 包括由温度引入的偏置电流的影响) ，通常 r 2 = r l 。 c l 了 图3 - 4 变形电路一 这种电路的缺点是r 2 会引入热噪声，通常可用c 2 与之并联以减少噪声频带。 第三章 此外，r 2 由于偏置电流还会引入压降，使p i n 产生暗电流。当选用偏置电流为 p a 级的运放时，实际应用中可忽略偏置电流的影响，故没必要引入电阻r o 。 第二种变形电路如图3 5 所示。电路用t 型电阻网络来代替反馈电阻，这种 电路的优点是可以用小阻值的电阻组成的t 裂网络，来代替大阻值的反馈电阻。 在图3 5 中，反馈电阻r t = r ，+ r ，+ r r ：r 3 ( 通常r ：r ， 1 ) ，以减小电 阻的寄生电容的影响，提高信号的频带宽度。 这种电路的输出为 驴，焉+ ( 1 ，+ 等) 岭v 卺r l + ( 半+ 抄： 吐( r l + r 2 + r ，r 2 r 3 ) 十e 撕+ 型学+ 静 吐r 一“+ i r t + 静 由此可见，此种融路的缺点在乎：运放的偏移电压、电压噪声以及电阻r 1 产生酌热嗓声郄眈非t 型阿络放大了l + r 2 i r 3 倍。 匿3 - ：5 交形电路三 爨体在戍建孛袋燧哪秘变形电路，是壤据疑体= 募孽要决定憋。出予农零系绫中， 我销擐关浚熟是捡装遐戆灵敏发以及糖噪魄，所鑫聚瘸零编羧大工俸方式。 由于率装置输入电流比较小，要蠢效地剃熙运教的特性，反馈电龌r f 鬟要 设漫褥较大，这里残 】采鬟2 0 m q 鹣彀隧。翔爨3 - 6 所示，光敏二掇罄黥结惫蜜 附加程运算放大器的反相输入端和地之间。此时戚考滤印劁扳上寄生电容的影 第三章 响，我们把这些电容归结为c l n 。c n 的存在将会引起运放工作的不稳定，严重 时将使电路产生振荡。为了消振，把电容c f 并联到r f 上，其容量的选择应满足 公式： r g c r f c f 式中r g 为从放大器反相输入端看出去的信号源内阻。对反相放大电路来说， 信号源内阻和输入电阻的总和为r b ，这时c 州等于反相输入端与地之间的电容容 量。然而，实际上r g 和c 甜并不是已知的值，调试时可以用试探法来改变c f 的 容量，直到使输出脉冲不产生上冲和振荡。c f 过大虽不会出现振荡，但将使波形 的上升沿变坏，因此我们在临界点附近反复调整，直至选择一个最佳的c f 容量。 i 。ii 图3 - 6 输入电容的补偿方法 在本装置中，由于光电二极管的并联电阻较大，当采用比较小的并联电容 时，输出端很容易就产生了震荡。经过反复实验，我们采用了l n f 的电容，这样 虽然导致了响应时间变长，但是由于被测信号的频率较低，因此没有太大影响。 电路中的光电二极管是最为关键的器件，它的性能直接决定了检测装置的 最小检测限，灵敏度，线性度等特性。光电二极管的选择是根据具体需要来决定 的，在荧光检测系统中，因为要检测的两种荧光试剂发出荧光的波长分别在 5 2 0 r i m 和5 8 4 n m ，所以需要采用在这两个波段上都能达到比较高灵敏度的光电二 极管。 我们选用的是滨松( h a r n a m a t s u ) 公司生产的s 1 2 2 6 5 b k ，该型号光电二极 管的响应波长范围从3 2 0 h m 到1 0 0 0 n m ，峰值波长响应灵敏度为0 3 6 a w ，最大 暗电流在5 x 1 0 一n a ，分路6 电阻为2 0 g 欧姆，上升时间是o 5 9 s 。其具体的波长 响应灵敏度图如图3 7 所示。可以看到，在5 0 0 6 0 0 n m 之间，灵敏度在 0 2 6 0 。3 2 之间。其他在此波段内可供选择的光电二极管还有$ 6 4 2 9 0 1 ，$ 7 5 0 1 等等，但是 第三章 这些光电二极管之所以可以检测不同波段的光实质上是采用t - - - - 个具有不同灵 敏度波段的的光电敏感模块集合在一起所达到的效果，而且在我们所需的波段 5 2 0 h m 和5 8 0 r t m 附近并不能达到比s 1 2 2 6 5 b k 更高的灵敏度，所以我们最终采 用了8 1 2 2 6 5 b k 型号。光电检测电路存在着各种外部扰动和内部噪声。外部扰 ， “i l 卜 i s 槿2 6 b l卜一毛名 厂、 + j 划l 邈i 浮x 镏参奴 ，音|卜卜 图3 7 光电二板管的光谱特性曲线 动包括光源的随机波动和附加的光调制，光路传输介质的湍流以及背景越伏，杂 激光的入射以及检测电鼹受到的电磁干扰等。前颇我们设计了滤光片组来实现这 一功能，消除邀赡挠动源。光电梭测器件、输入电路和前置放大器等的器件固有 噪声是光信号检测接受的另一主要扰动源。这些内部噪声是随机起伏的，覆盏在 很宽的频谱范围内，它们和有赠信号同时存在，相互混淆，限翻了检测系统分辨 率的提高。因此猩光电检测电路中要进行综合噪声估算以确保可靠健侧所需的信 臻跑。 光电检测电路的设计要求从三方面考虑：一是要求镕噪比高；二是要求被测 信号无频率失真；三楚鬟求信号传输功率最大。对于徽弱光信号蓊置敲夫器，由 于信号小，输入信噪比低，所以应采用低噪声放大器。对于光电检测电路来说， 簸关键耱懿分各予第一缀放大部分，裣溺系统懿灵敏度， 瑟大程液主取决于第一 级放大部分。 3 2 2 光电二极管噪声分析【2 7 】 光电二极管的等效电路如图3 - 8 所示。光电二极管灵敏度的标准规定方法之 第三章 一是对来自严格定义的光源给定的光强确定它的短路电流i s c 。在! o o f c ( 眠- 烛光) 照度( 相当于阴天的光强) 对于小面积( 小于l m m 2 ) - 铡g 的短路电流通常是数皮 安( p a ) 到数百微安( p a ) 。 短路电流在6 - 9 个数量级的光强范围呈理想线性变化， 因此常被用作绝对光强的测量。光电二极管两端的开路电压随光强呈对数变 柏t 光、 、 理想二极 图3 - 8 光电二极管等效电路图 化，但因为其温度系数很大，所以二极管电压较少用于光强的精密测量。 硅光电二极管的噪声主要是散粒噪声和热噪声。散粒噪声是由p n 结中随机 电流所产生的，即由p n 结载流子的随机变化引起的噪声，它同频率无关，属于 “白噪声”。当硅光电二极管使用负偏压，而硅光电二极管反向漏电严重的情况下， 可造成较大的散粒噪声。散粒噪声的电流均方值由公式3 1 给出 i ：= 2 e i 。f ( 3 1 ) 由于本装置是在零偏置下工作的，产生的散粒噪声相对较小，所以不考虑 光电二极管散粒噪声的影响。 热噪声是自由电子在电阻中随机运动产生的，其值如公式( 3 2 ) 所示： 耻半 俘z ， 式中r d 是光电二极管的并联电阻，a f 是噪声带宽。 除了光e g - - 极管的噪声，还要考虑电路中电阻产生的热噪声。 生的热噪声如公式( 3 - 3 ) 所示： e m = 鲁厩 反馈电阻产 ( 3 3 ) 式中，r f 是反馈电阻阻值，是光电二极管的并联电阻阻值。可见，只要 光电二极管的并联电阻较大，可以降低反馈电阻产生的热噪声。 运放的噪声电压和噪声电流对噪声的影响可以折合为运放输入噪声电流源 和运放输入噪声电压源的作用，它们对于组合电路输出的影响如公式( 3 - 4 ) 以 第三章 及( 3 - 5 ) 所示 e 。1 = 等r f c f ( 3 4 ) e n2 景厄坨f 由此可见要减小噪声要采用低噪声电压和低噪声电流的运放，同时要选用高并联 电阻的光电二极管。 由于运算放大器存在失调电压和失调电流，其值随着温度漂移，经过计算， 失调电压会对输出造成比较大的影响，因此，采用运放的调整端以及变阻器尽量 调整失调电压加以补偿。而失调电流和失调电压的温漂引起的误差如公式( 3 6 ) ， ( 3 7 ) 所示： e o 毋= t c uo f a i r ft rd ( 3 6 ) e o 垃= t c i 。a i r f ( 3 - 7 ) 式( 3 6 ) 中t c u 。为失调电压的温漂系数，t 为温度变化范围。式( 3 7 ) 中，t c i o s 为运算放大器的输入失调电流的温漂系数。 根据系统误差传递和合成理论，未定系统误差既有系统误差可知的一面，又 有不可预测随机的一面。对于未定系统误差要求其确切值和变化规律是不可能 的，只需估计出它的极限变化误差的范围就可以了。所以，未定系统误差多以极 限误差的形式给出误差的最大变化范围。其传递方法主要有绝对和法、方和根法， 未定系统误差传递规律，常用方和根法。方和根法也称为几何法。当进行传递的 未定系统误差分项项数较多时，各分项误差之间的低偿性就有所加强，此时采用 绝对和法所得的结果偏大过于保守，则可采用方和根法对未定系统误差进行传 递。如果各分项误差的极限误差大小已知，并且各分项系统误差的量纲与最后结 果量纲采用的量纲相同，则有： e = e ；+ e ：+ e ；+ + e ：= ( e ；) i ( 3 8 ) 在本系统中，各个噪声并不相关，所以可以采用公式( 3 - 8 ) 计算各个噪声对输 出的综合影响为： 巨。= 瓶忑再i 万瓦i 再可两 ( 3 ，9 ) 根据公式( 3 9 ) ，计算得到输出的总噪声 e 。= 打而耳再i 孺而面再而万丽= 7 4 8 ( m v ) ( 3 1 0 ) 这个输出的总噪声是理论计算值，它决定了系统的信噪比。信噪比在实际应用中 第三章 体现了探测的精度，信噪比越大，检测精度就越高。 3 3 接口部分设计 分。 单片机的外围接口部分包括与计算机的接口部分和与计算机串口的接口部 3 3 1m a x l 9 1 接口设计 a d 的选择参数有：采样率、工作电压、功耗、精度等。本系统对于检测数 据的采样率为1 0 h z ，考虑到要采用较高的分辨率，采用1 2 位的模数转换器 m ：a x l 9 1 。 m a x l 9 1 2 8 堤单片c m o s 、1 2 位a d 转换器，它既可以输入单极性信号， 也可以输入双极性信号，并且具有内部采样、保持电路，既可以利用内部时钟工 作，又可以利用外部时钟工作。m a x l 9 1 的数据转换时间为7 5 灿s ，其中获取数 据时间为2 “s ，它的最高采样速率达到了1 0 0 k p s 。m a x l 9 1 与微处理器之间可以 采用串行或者并行接口传输数据，串行接口与s p i ，q s p i 和m i c r o w i r e 串行接口 标准兼容。由于m a x l 9 1 具有功耗低、速度快和精度高的特点非常适合用于微 弱信号的实时采集。输出方式通过2 2 脚p a r 设置。当p a r = 1 时，选用并行输 出模式；为0 时，选用串行输出模式。 在系统中，我们采用并行方式输出。a d 转换器的工作由c s 、r d 、h b e n 匹 m 酬w 图3 - 9m a x l 9 1 时序数据输出格式图 第三苹 三个输入端控制，当h b e n 为低电平时，在c s 和r d 的下降沿，t h 进入保持方 式并且转换开始，b u s y ；i f ：转换开始后变为低电平，在第1 3 个输入脉冲的下降沿 时刻，b u s 坡高，转换结果被送入三态输出缓冲器。在串行方式下，p a r 选择 低电平。c s 的下降沿时刻转换开始。硼进入保持方式，随着转换的进行，数据 被连续输出。并行方式下，数据采集和输出又可以分为s l o w _ m e m o r y 和r o m 方式两种。这两种方式的主要区别就在于前者可以在一次转换过程中读取全部数 据而无需再启动一次新的转换。在本系统中采用的是s l o w - m e m o r y 模式。 在数据采集和转换中，当采用s l o w - m e m o r y 方式时，转换通过读指令启 动，当h b e n 、c s 、p a d 为低时，转换开始。r d 的下降沿时刻，输入模拟量被采 集。转换期间b u s y 为低电平，以前的转换结果保持在输出端直到新的转换结束， 此时b u s y 为高电平。在d 7 d o 上输出新的8 l s b s 结果，然后，使h b e n 置高， 执行第二次操作，数据输出端d 7 d o 输出4 位m s b s ，此时d 4 - d 7 为低电平。 在读出高4 位时，不能进行新的转换，因为此时h b e n 为高电平，如进行新的 转换，必须在第二次读操作以后使h b e n 置低。s l o w l m e m o r y 的时序数据的 输出格式如图3 - 9 所示。数据输出格式如表3 1 所示。 表3 - 1m a x l 9 1 数据输出格式表 管脚名称d 7 巾l o u t d 6 s c l k o u td 5 1 s s 珊 d 4d 3 ，d 2 dd 1 ，d o ， d 1 1l od 9d 8 h b e n = o ： f i a r = 1 ： d 7 d 6d 5d 4d 3d 2d 1d o c s = r d ；o f i b e n = l ： p a r ；l ：oo 0 0d 1 1d 1 0d 9d 8 c s = r d = 0 图3 1 0 是系统中m a x l 9 1 和a t 8 9 c 5 2 以并行输出模式接口的硬件连接图， m a x l 9 1 的8 位数据总线d o d 7 ( 其中d 0 - d 8 与d 8 一d 1 1 分时复用) 分别与 a t 8 9 c 5 2 的p 0 0 p 0 7 口相连，单片机从p 0e l 读取转换结果。本电路中，采用 内部时钟模式，在c l k 和d g n d 引脚之间并联一个1 2 0 p f 的电容来设置选用内 部时钟。 第三章 图3 - 1 0 m a x l 9 1 与单片机的硬件连接图 在v r e f 和a g n d 之间并联一个4 7 心和o 1 庐的无极性电容，将在内部产生 一个4 0 9 6 v 的内部参考电压。 单片机内的u a r t ( 通用异步接收发送) 和计算机串口之间的通讯f 2 吼3 0 1 ， 由于r s 2 3 2 标准定义的逻辑电平( e i a 电平) 与t t l 电路的电平不匹配： r s - 2 3 2 中驱动器输出电压相对于信号地线在- 5 v 1 5 v 之间为逻辑l 电平，输 出电压相对于信号地线在+ 5 v + 1 5 v 之间为逻辑0 电平；而在接收端逻辑1 电 平为- 3 v 一1 5 v ，逻辑0 电平为+ 3 v + 1 5 v ，即允许发送端到接收端有2 v 的电 压降。这样的r s 2 3 2 电平和嗣匝逻辑电路产生的电平是不样的，所以需要专 门的电平转换器电路来进行订l 电平和r s 2 3 2 电平间的转换。m a x 2 0 2 e 使用 单一的+ 5 v 电源供电，正常工作时仅需要外接四个0 1 l a f 的电容，而且m a x 2 0 2 e 具有额外保护装置防止静电，提高了它工作时的可靠性。 第四章 第四章系统软件设计 系统软件设计包括单片机内的软件设计和上位机计算机的数据采集和显示 部分。 4 1 单片机软件设计 4 1 1 单片机程序的总体设计 在进行程序设计之前，首先要分析系统的总体结构。单片机程序主要分为两 部分：a f d 采集程序以及与计算机的通讯接口程序。 采集到的荧光信号经过放大、滤波后，进行a d 变换。采样率为1 0 h z ，采 样间隔由定时器控制，采集程序作为定时器中断服务程序。因为采样率比较低， 所以检测信号的存储不采用外部的r a m ，直接利用单片机内部的r a m 块作为 临时数据存储。因为数据量不大，所以一次存储发送十个字节的数据。在采集过 程中，m a x l 9 1 的地址为7 f f f h ，在数据转换过程中，利用p 1 ，1 控制m a x l 9 1 的h b e n 端，没有利用bu s y 日l 脚来查询转换是否结束，而是利用软件延时的 方式，等待转换结束。 数据采集与转换程序如下： s 黼l e ：s e t bp 1 1 n o p n o p c l rp 1 1 n o p n o p m o vd p t r ，# 7 f f f h m o v xa ， d p t r m o v r 0 ，# 0 3 h d j n z r 0 ，$ l c a l lr e a d d 觚a r e t 第四章 r e a d d a t a ：m o vd p t r # 7 f f f h m o v x a ， d p t r m o v3 1 h ，a s e t bp 1 1 m o v xa ， d p t r m o v3 2 h a r e t 与计算机的通讯接口硬件是采用r s 2 3 2 串口，在本系统中，由于传输的数 据流量较小，所以采用最为简单的三线连接方式1 3 ”，也就是单片机通过r x d 、 t x d 和g n d 三线与计算机相连，波特率设置为1 2 0 0 ，他的主要功能是完成定 时数据采集以及数据发送工作，其中定时采样的中断频率由定时器的常数自动装 载8 位计数器方式产生。 由于发送的数据量不大，波特率可以设置得比较低，这样可以降低误码率， 图4 - 1 单片机程序流程图 从而无需太复杂的通讯协议，直接采用一个选定的常数作为握手信号，如果单片 第四章 机接收到的数据等于此常数，则说明握手成功，开始工作；否则重新接收握手数 据。图4 1 为程序流程框图。 4 2 p c 枫程序设计 p c 机在整个系统中擞要起与单片机实时通讯，控制单片机以及数据采集， 实时鼹示等功能。为了较为方便的实现这然功能，我们采用b o r l a n d 公司开发的 可视化软件开发工具。d e l p h i 3 2 】被称为第四代编程开发工具，它具肖简单、高效、 瑷憝强大等优点。帮v c 鞠魄，它更麓单、鬟予掌握，瑟在功怒上酝不逊色；襄 v b 稳比，d e l p h i 委| j 功黢爨强大、更实矮，霹戳说d e t 两i 溺露其餐了v c 鹣强大 功能和v b 的简单易学的特点，而且它还具脊各种丰富的控件，使用起来更为简 单。 4 2 1d e l p h i 孛m s c o m m 控件 p c 机中的程序的主辩的功能实质上就熄通过r s 2 3 2 串口，与单片机进行异 步通讯：向单片机传输控制信号、对单片机采集到的信号进行记澈、保存和实时 显示。在d o s 系统中d o si n t 2 1 h 的0 3 h 和0 4 h 号功能调用为辫步串行通信的 接受秘发送功钱，藤b i o s1 n t l 4 h 畜4 缝功调瘸为串牙运馈鞭务，正因为如 j l ：凌d o s 中采用寒存器纛接读写、b i o s 镶潮、遥信中蕻程彦等方法可臻魄较容 易实现串口通信。但是谯w i n d o w s 中由于w m d o w s 采用消息驱动和设备统一管 理，以及利用消息对队列进行程序控制，所以在d o s 下的方法都无法采用。利 用d e l p h i ，在w i n d o w s 中为实现串口通信，w i n d o w s 的s d k 提供了完备的a p i 函数秘戮中叛方式驱动的邋倍驱动程序，使编稷变德较为容易。w i n d o w s 提供懿 稼漆遴绩a p i 嚣数缀多，懑鬻要实现串目邋臻，3 2 僮模式下，一艘采矮鞋下三 种方法； ( 1 ) 以文件方式打开串口。 遮种方法是用w i n 3 2a p i 函数来实现，臌用c r e a t f i l e ( ) 来打开串口，利用 r e a d f i l e ( ) 和w 癜e f i l o ( ) 对串口进行读麓搽依，完成数据传竣过程，最后关 溺窜鞠。 ( 2 ) 使用现有静a c t i v e x 控件实现 串口的a c t i v e x 种兴比较多，使用简单、可靠性高。现在般广泛使用的有 m s c o m m 控件、s p c o m m 控件、c o m m p o r t d r v 控件、s e r i a l p o r t 控件等。这些控 件一般都极大地简化了对底层的设置，提供了许多强大的功能，可以船快应用程 第西章 序的歼发过程。其中m s c o m m 控件是微软公间制作的，它可以作为一个o c x 控件黻 d e l p h i 中，使用比较方便。 ( 3 ) 直接嵌入汇编漩 遮耱方法不能套w i n d o w sn t 搡露系统下袋焉，峦于w i n d o w s 9 8 瓣y o 臼嚣 完全保护，可以在w i n d o w s 9 8 下使用这穆操佟方式。哥g 用d e l p h i 汇编嵌入功能， 可以赢接对串口进行操作。 猩上述的各种方法中，只有两种方法可以在w i n d o w s n t 下使用，就是利用 a p i 函数或者是直接使用现有的控件。这两种方法各有利弊。使用a p i 函数功能 强大，瘦薄广泛，更逶会予绫写袋麓复杂豹低鼷逶售蛰专义；恧搜麓番耪获嵇夔嚣 赢在予使霸简单，著曼基肖丰富的与串口福美的属链与事佟。奁本系统孛，采罱 的趣微软公司的m i c r o s o f tc o m m u n i c a t i o n sc o n t r o l ( 简称m s c o m m 控件) 是微 软的v i s u a lb a s i c 中提供的一个串口控件，馒用简单、性能良好。m s c o m m 控件 在v i s u a lc * 、v i s u a lb a s i c 、d e l p h i 等开发环境中均可使用。 m s c o m m 控俘中掇供了嚣耱处理l 羲镲阕瑟豹方法：一怒搴释驱动( e v e n t - d r i v e n ) 方法，怒套询注。 带件驱动通信是处理串行端口交互作用的一种非常有效的方法。在许多情况 下，程事件发生时需要得到通知，例如，在串口接收缓冲区中有字符时，可以利 用m s c o m m 控件的o n c o m m 事件捕获并处联这魑通信事件。在编程过程中，就 可以程o n c o m m 事传楚疆涵数中掇入叁己熬处理代码。这秘方法黪优点是程痒 确蔽及辩，可靠毪褰。 焱询方式实际上属乎事件驱动，但在有数情况下，这种方式驻得更为便捷。 在程序的每个关键功能之后，可以通过检查c o m m e v e n t 属性的值来查询事件和 错误，只要c o m m e v e n t 属性的值有了变化，就表明一个通信事件媾一个错误发 生。 m s c o m m 整辞辫4 】窍镶多重要戆壤瞧，瞧善宠瑟矮熟悉凡令属毽： c o m m p o r t 设置并返回邋倍端口信号；s e t t i n g s 以字符串的形式设灏并返回数据传 输速率、奇偶校验、数据饿、停止位；p o r t o p e n 设置并返回通信端口的状态，也 可以打开和关闭端口；i n p u t 从接收缓冲区返网和删除字符；o u t p u t 向缓冲区写 个字符串。下面分别描述m s c o m m 控体的激霾要和常用的属性。 ( 1 ) c o m m p o 娃震瞧 这一属性用于设置并返回连接的串行端口号，w i n d o w s 将会利用该串口和外 界通讯。在设计程序时，n n e w v a l u e 可以设置成从l 1 6 的任何数( 默认值为1 ) ， 但是如果用p o r t o p e n 打开一个并不存在的端口时，m s c o m m 控件会产生错误6 8 。 ( 2 ) s e t t i n g s 属性 第四章 该属性以字符串形式设置并返回串口的波特率、奇偶校验、数据位、停止位 参数，共四个参数。如默认值为“9 6 0 0 ，n ，8 ，1 ”，这表示波特率为9 6 0 0 b i t s ， 无奇偶校验，8 位数据位，1 位停止位。当端口打开时，如果该属性设置非法， 则m s c o m m 控件产生3 8 0 ( 非法属性值) 。 ( 3 ) h a n d s h a