（细胞生物学专业论文）中国林蛙皮肤生物活性肽基因的cdna克隆、序列分析及生物活性的测定.pdf

中国林蛙皮肤生物活性肽基因的e d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 摘要：两栖类皮肤中含有种类繁多、功能复杂的生物活性物质，用来抵御有害环境 因子的侵袭，是极具开发潜力的生物资源宝库。中国拥有丰富的两栖类资源，在将 近3 0 0 个亚种中，其中三分之二是特有种，在生物活性物质开发方面具有极大的潜 力。但是，由于两栖类皮肤生物活性肽在其组织中含量少，分离获得大量的天然产 物又很困难，往往不能满足进一步研究的需要。利用分子生物学技术筛选活性肽就 成为必然选择，丰富了两栖类活性物质资源库，并为进一步研究活性肽表达及分离 纯化奠定基础。 本论文以辽宁省抚顺市新宾县地区的中国林蛙作为试验材料，从中国林蛙皮肤 中得到一系列活性肽基因的e d n a 序列，并利用生物信息学方法初步分析活性肽基 因的序列及结构，进而研究各活性肽的生物活性，为两栖动物活性肽的开发和利用 奠定理论基础。 首先，根据g e n b a n k 中蛙类皮肤生物活性肽信号肽n 端保守序列，设计引物， 采用r t p c r 和y - r a c e 方法，从中国林蛙皮肤总r n a 中克隆出了6 条编码不同 活性肽前体的c d n a 序列，经n c b i 数据库中的b l a s t 软件，进行氨基酸序列同源 性比较之后，分别命名为：p r e p r o t e m p o r i n 1 c e a 、p r e p r o t e m p o r i n 1 c e b 、 p r e p r o t e m p o r i n 一1 c e c 、p r e p r o b r e v i n i n - 1 c e a 、p r e p r o b r e v i n i n - 1 c e b 和p r e p r o e h e n s i n i n - 1 。 序列分析结果表明，6 条编码中国林蛙皮肤生物活性肽前体的e d n a 序列全长 为2 8 9 3 1 5 b p ，编码5 9 6 5 个氨基酸。其前体由3 部分结构域组成：2 2 个氨基酸残 基组成的信号肽、多个酸性氨基酸残基组成的中间序列、高度变异的成熟肽。 p r e p r o t e m p o r i n 1c e a 、p r e p r o t e m p o r i n - 1c e b 和p r e p r o t e m p o r i n 一1c e e 属于t e m p o r i n 一1 家族抗菌肽前体，具有肽链短，c 端酰胺化的特点；p r e p r o b r e v i n i n - 1 c e b 和 p r e p r o b r e v i n i n - 1 c e a 属于b r e v i n i n 1 家族抗菌肽前体，在肽链的c 端含有r a n a 盒 结构，可在2 个半胱氨酸残基间形成二硫键，组成7 肽环；p r e p r o c h e n s i n i n 1 在已 知多种数据库中没有发现序列同源的多肽，被鉴定为新生物活性肽。 ，人工合成t e m p o r i n 1 c e a 、t e m p o r i n - 1 c e b 、b r e v i n i n i c e a 和c h e n s i n i n 一1 四种中 国林蛙皮肤生物活性肽，抗菌和抗癌活性检测结果表明：它们对金黄葡萄球菌等3 种革兰氏阳性细菌的生长具有明显抑制作用，同时抑制乳腺癌m c f 7 细胞和宫颈 癌h e l a 细胞生长。其中，t e m p o r i n 1 c e a 对金黄葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和乳链球 菌抑制作用较强，同时对2 种癌细胞有明显的抑制作用，而且溶血作用弱。有望成 为新型抗生素和抗肿瘤药物。 关键词：中国林蛙，e d n a 克隆，序列分析，抗菌活性，抗癌活性 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 a b s t r a c t ：a m p h i b i a ns k i nc a l ls e c r e t eav a r i e t yo f b i o a c t i v es u b s t a n c e st od e f e n s ea g a i n s ti n v a d i n g f a c t o r s a sw ek n o w , c h i n ai sa b u n d a n ti nr e s o u r c e so fa m p h i b i a n sw h i c hi n c l u d et w o - t h i r d so f e n d e m i co n e si na b o u t3 0 0k i n d so fs u b s p e c i e sa n dt h e ya r eg r e a tp o t e n t i a li nt h ed e v e l o p m e n to f b i o a c t i v es u b s t a n c e s h o w e v e r , t h ei s o l a t i o no fn a t u r a lb i o a c t i v ep r o d u c t sf r o ma m p h i b i a ns k i ni ss o d i f f i c u l tt h a tc a nn o tm e e tt h ef u r t h e rr e s e a r c h s o ，t op r o d u c eb i o a c t i v ep e p t i d e su s i n gm o l e c u l a r b i o l o g y h a sb e c o m ea ni n e v i t a b l ec h o i c e t h ec l o n i n go fg e n e se n c o d i n gb i o a c t i v ep e p t i d e si sh e l p f u l t ot h ee x p r e s s i o no f b i o a c t i v ep e p f i d eg e n e s c h i n e s eb r o w nf r o g sw e r eo b t a i n e df r o mx i nb i n ，l i a o n i n gp r o v i n c e t h ec d n a se n c o d i n g b i o a c t i v ep e p t i d ep r e c u r s o r sw e r ec l o n e df r o mt h es k i no fc h i n e s eb r o w nf r o g s ，r a n ac h e n s i n e n s i s t h en u c l e o t i d ea n da m i n oa c i ds e q u e n c e sa n ds e c o n d a r ys t r u c t u r eo fb i o a c t i v ep e p t i d ep r e c u r s o r s w e r ea n a l y s e du s i n gb i o i n f o r m a f i c sm e t h o d s t h e nt h eb i o l o g i c a la c t i v i t yo fb i o a c t i v ep e p t i d e sw e r e d e t e r m i n a t e d f i r s t l y , t h eg e n es p e c i f i cp r i m e r w a ss y n t h s i z e d a c c o r d i n g t ot h ek n o w n c o n s e r v a t i v ea m n i oa c i ds e q u e n c e se n c o d i n gt h es i g n a lp e p t i d eo fb i o a c t i v ep e p t i d e p r e c u r s o rf r o mf l o g ss k i ni nt h eg e n b a n k s i xc d n a se n c o d i n gb i o a c t i v ep e p t i d ep r e c u r s o r s w e r ec l o n e df r o mt h es k i no fc h i n e s eb r o w nf r o g ，r a n ac h e n s i n e n s i sb yr t - p c ra n d3 - r a c e p r o c e d u r e a f t e rc o m p a r e dw i 也o t h e ra m p h i b i a ns k i np e p t i d e si nt h en c b id a t a b a s e t h es i xb i o a c t i v e p e p t i d e p r e c u r s o r s f r o mr a n a c h e n s i n e n s i sw e r e i d e n t i f i e d 嬲p r e p r o t e m p o r i n - 1 c e a , p r e p r o t e m p o r i n - 1 c e b ，p r e p r o t e m p o r i n 一1 c e c ，p r e p r o b r e v i n i n - 1 c e a , p r e p r o b r e v i n i n - 1 c e b a n d p r e p r o c h e n s i n i n 1 ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 er e s u l t so fs h o w e dt h a tt h es i xo fe d n ae n c o d i n gp e p t i d ep r e c u r s o r sc o n s i s t e do f2 8 9 - 315b p a n dc o u l d b et r a n s l a t e di n t o5 9 - 6 5a m i n oa c i d t h e s ep r e p r o p e p t i d e sc o n t a i nt h r e es t r u c t u r a ld o m a i n s ： ap u t a t i v e2 2 - m e rn - t e r m i n a ls i g n a lp e p t i d e ，a l la c i d i cp e p t i d ea n dah y p e r v a r i a b l eb i o a c t i v em a t u r e p e p t i d e p r e p r o t e m p o r i n 一1 c e a , p r e p r o t e m p o r i n - 1 c e ba n dp r e p r o t e m p o r i n 一1 c e cb e l o n g e dt ot h e m e m b e r so ft e m p o r i n - 1f a m i l y , w h i c hu s u a l l ya r es h o r t , h y d r o p h o b i c ，a n dc - t e r m i n a l l ya - a m i d a t e d a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s p r e p r o b r e v i n i n - 1c e aa n dp r e p r o b r e v i n i n - ic e bw e r ei d e n t i f i e da sb r e v i n i n - 1 f a m i l yo fa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sc o n t a i nt h es t r u c t u r eo f r a n ab o x ”，i nw h i c had i s u l f i d eb o n d b e t w e e nt w oc y s t i n er e s i d u e sa tt h ec - t e r m i n a lo fp e p t i d er e s u l t e di nc y c l i ch e p t a p e p t i d e t h e n u c l e o t i d ea c i ds e q u e n c ea n dt h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo f p r e p r o c h e n s i n i n - 1w e r en o tf o u n d t 0b ei d e n t i t yw i 也a n yk n o w na m p h i b i a ns k i nd e f e n s i v ep e p t i d e s ，s o ，p r e p r o c h e n s i n i n - lw a s i d e n t i f i e d 舔an o v e lp e p t i d ep r e c u r s o r f o u ro fb i o a c t i v ep e p t i d e s ：t e m p o r i n - 1 c e a 、t e m p o r i n - 1 c e b 、b r e v i n i n - 1 c e aa n dc h e n s i n i n - 1 w e r es y n t h e s i z e dt oi n v e s t i g a t et h e i ra n t i m i c r o b i a l ，a n t i c a n c e ra n dh a e m o l y s i sa c t i v i t i e s t h er e s u l t s s h o w e dt h a ta l lo ft h es y n t h e s i z e db i o a c t i v ep e p t i d e si n h i b i t e dt h eg r o w t ho ft h eg r a m - p o s i t i v e b a c t e r i u m , a n de x h i b i t e dt h ea n t i e a n e e ra c t i v i t ya g a i n s tt h eg r o w t ho fm c f - 7c e l l sa n dh e l a c e l l s a m o n g o ft h e m , t e m p o r i n - 1c e as h o w e d s t r o n gi n h i b i t o r y e f f e c t i nd e f e n s e a g a i n s t s t a p h y l o c o c c u sa w e u s ，b a c i l l u sc e r e u s ，s t r e p t o c o c c u sl a c t i sa n dt h et w ok i n d so fc a n c e rc e l l s ， m o r e o v e r , i th a sw e a k e rh e m o l y s i st h a no t h e r s i ti se x p e c t e dt ob e c o m et h en e wa n t i b i o t i c sa n d a n t i c a n c e rd r u g s k e y w o r d s ：r a n ac h e n s i n e n s 翘e d n ac l o n i n g ，s e q u e n c ea n a l y s i s ，a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y , a n t i c a n c e ra c t i v i t y 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以 标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究 成果对本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文储签名霞【孔墓日飙岬。厶r 9 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学， 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 一躲虞风髦 5 2 指导教师签名：r 日期： 砂。7 步，p | 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的e d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 上j 一 刖吾 两栖类皮肤分泌物是两栖类动物生物活性分子的一个主要来源【l 2 j 。其中，两栖 类皮肤中的生物活性多肽的表达量要远比哺乳动物各种组织类似物的含量多。而两 栖类皮肤是一种极易获得的资源，更适合并有利于这些多肽的发现和功能研究等。 另外，在不同种两栖类的皮肤中所含有的生物活性分子的种类也是不同的【3 】，因此， 多肽分子呈现出分子和功能多样性。 国外学者对两栖类皮肤分泌物的研究已达4 0 年之久，共涉及5 0 0 多个种类。 迄今为止，多种两栖类皮肤生物活性肽的氨基酸序列已被测定，并对其结构和功能 进行了详细的研究，其中以抗菌肽居多。与之相比，我国在分子水平上对两栖类皮 肤分泌物的研究较少。其中，赖仞等对我国6 种常见的两栖类动物：红瘰疣螈( t y l o t o t r i t o nv e r r u c o s l l 哼) 、华西蟾蜍( b u f oa n d r e w s i ) 、大蹼铃蟾( b o m b i n am a x i m a ) 、黑斑 蛙( r a n an i g r o m a c u l a t a ) 、沼蛙( r a n ag u e n t h e r i ) 和泽蛙( r a n al i m n o c h a r i s ) 皮肤中的生 物活性物质进行了系统研究，获得了1 0 多种生物活性肽和蛋白质，克隆了多个基 因，对活性物质进行的活性研究表明，我国两栖类动物皮肤分泌液中含有大量的结 构新、生物活性复杂多样的活性分子。 中国林蛙( r a n ac h e n s i n e n s i s ) 是集药用、食补、美容功能于一体的珍稀两栖类动 物，主要分布于我国东北三省，是我国优势药用价值动物资源之一。中国林蛙以其 特有的药用、营养价值日益被人们所重视，除林蛙油( 雌蛙输卵管) 被用做成高级 营养补品、具有较高经济价值外，其它组织器官尚有待开发利用。多年来，人们从 多方面对中国林蛙进行了研究，并取得了一定的成果。但是，在分子水平上对中国 林蛙皮分泌物的研究尚不多见，本试验立足于我国丰富的林蛙资源，进行了中国林 蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定的研究，如果能 从中国林蛙皮肤中获得具有重要价值的生物活性物质，必将拓宽中国林蛙的开发、 利用新途径，具有重要的现实意义，同时唤起人们对两栖类皮肤生物活性肽，尤其 是我国特色物种的特殊分子多样性的关注，及重视它们在生物学、生物医学基础研 究和天然药物开发中的意义。 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的e d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 1 1 生物活性肽简介 第一章综述 生物活性肽( b i o l o g i c a u ya c t i v ep e p t i d e s ) 指一类有益于生物机体的生命活动或 者具有一定生理作用的肽的总称，包括由2 0 种编码氨基酸构成的二肽和线性、环形 结构的多肽。在生物体中存在多种活性肽，并参与重要的生命活动，而且具有不同 的空间结构和生理功能，生理功能有：抑菌、抗癌、抗病毒、激素作用、免疫调节 等等。获得生物活性肽的途径如下：其它生物体内具有的各种天然生物活性肽。 利用液相、固相或酶法化学合成的生物活性肽。利用基因克隆技术合成的生物 活性肽。2 0 世纪8 0 年代末及9 0 年代初出现的基因组合和化学组合肽库，给肽类药 物及制药工业带来了革命性的进展【4 】。目前，国外对生物活性肽已经进行了大量的 基础和应用研究，并将多种生物活性肽推向市场，获得了巨大的经济效益。我国对 生物活性肽的研究主要集中在对多肽天然组分的分离纯化方面，对基因组合和化学 组合肽库的构建、筛选及应用尚处于起步阶段1 5 】。随着分子生物学和生物信息学等 技术的飞速发展，将会有越来越多的生物活性肽被发现，从而被证明具有更好的稳 定性和更高的生物活性，这将是非常重要和丰富的新药来源，已成为近年来生物化 学和生物药物研究的新热点，具有巨大的新药开发潜力【6 】。 1 2 两栖类皮肤活性肽的研究进展 由于两栖动物皮肤裸露、湿润，有利于微生物的侵袭，因而为了抵御病原微生 物的侵袭，在长期自然进化过程中便形成了三套防御机制：物理屏障，粘液腺分 泌大量糖蛋白和蛋白聚糖形成“多肽网”【j 7 1 ，包裹于皮肤外表面从而构成一道天然 屏障，阻碍病原菌的侵入；获得性免疫系统，两栖动物皮肤中含有抗体i g g t s ； 先天免疫系统【9 1 0 1 ，主要由大量的抗菌肽构成。 两栖类的皮肤及其分泌物中含有丰富的具有杀菌作用的生物活性肽类物质。在 无尾两栖动物皮肤中，人们早已发现其含有大量的活性物质。早在1 9 7 0 年，c s o r d a s 等在研究欧洲铃蟾皮肤分泌物时发现了第一个具有溶血作用的蛙皮抗菌肽 b o m b i r t i n i 明；而1 9 8 7 年，z a s l o f f 从非洲爪蟾皮肤分泌物中获得了蛙皮抗菌肽 m a g a m i n s 家族，人们才开始重视对此类肽的研刭j 。目前，人们已经从如下8 个 属的无尾两栖动物( 约4 0 多种) 皮肤中提取出了抗菌肽，并测定了其基因序列： 铃蟾属( b o m b i n a ) 、肛褶蛙属( k a s s i n a ) 、雨滨蛙属( l i t o r i a ) 、叶泡蛙属 ( m y l l o m e d u s a ) 、多指节蟾属( p s e u d i s ) 、蛙属( r a n a ) 、耳腺蟾属( u p e r o l e i a ) 和 爪蟾属( x e n o p u s ) 。其中包括了中国的五个种：大蹼铃蟾( b m a x i m a ) 、东方铃蟾( b 2 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 o r i e n t a l i s ) 、黑斑蛙( r n i g r o m a c u l a t a ) 、粗皮蛙( r r u g o s a ) 和中国林蛙( r c h e n s i e n s i s ) 。虽然抗菌肽种类繁多、长度千差万别，但几乎所有的抗菌肽都有两个 共同的特征：阳离子型和两亲性结构。 在对两栖类生物活性肽进行结构和功能的研究之后，一部分肽已被用作止痛 剂，并广泛用于治疗从烧伤到心脏病等疾病，其中一些抗菌肽已进入临床应用，和 抗肿瘤、抗病毒活性方面的研究。由此可见，两栖动物是一种天然的药物资源库。 1 2 1 两栖类皮肤活性肽的分类 1 2 1 1 抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s 。a b p ) 两栖动物皮肤抗菌肽是其先天防御系统中的重要组成成分，由基因编码，核糖 体合成，l o 5 0 个氨基酸残基组成，分子表面带有正电荷，大都可形成两亲的c t 一螺旋 结构。不同种属两栖动物的抗菌肽在分子量、氨基酸组成、带电性、疏水性、空间 结构和抗菌谱等方面均各自不同。两栖动物皮肤抗菌肽大多都是碱性多肽，具有独 特的作用机理，可以在不损伤正常细胞的前提下对细菌、真菌、病毒和癌细胞有抑 杀作用【1 2 - 1 4 1 近年来成为国际上动物学、生理学、药理学研究的热点【1 5 1 刀。 两栖类皮肤抗菌肽的分子结构具有多样性的特点，在不同种类的两栖动物皮肤 中含有不同种类的抗菌肽。从结构上可以将其分为两大类：一类为线性仅一螺旋多肽， 它们不含有二硫键，如来源于非洲爪蟾的m a g a i n i n ( g i g k f l h s a k k f g k a f v g e i m n s ) ，仅螺旋是其二级结构的主要成分【l8 】；另一类是环性多肽，分子内含有二硫键， 如来源于r a n a j a p o n i c a 的j a p o n i c i n ( f f p i g v f c k i f k t c ) ”】，其分子中含有由一对半 胱氨酸，可组成二硫键。来源于b o m b i n a 属的抗菌肽b o m b i n i n h 含有d 型氨基酸： 其中5 0 左右c 一端酞胺化；部分两栖类抗菌肽含有两个半胱氨酸残基，形成含有一 个二硫键的肽分子。几乎所有的两栖类抗菌肽分子中都含有较多的亮氨酸和异亮氨 酸残基，因此决定了其具有疏水性的特点；同时也含有部分精氨酸和赖氨酸残基， 因而又具有阳离子性。绝大多数抗菌肽分子在水溶液中呈现无规则卷曲构象，不容 易形成二级结构，但在与微生物细胞膜表面所带的负电荷相互作用时，可诱导抗菌 肽形成两亲的a 一螺旋结构【2 。 1 2 1 2 抗癌 l k ( a n t i c a n c e rp e p t i d e s ) 目前来看，人们对蛙类皮肤抗癌肽的研究报道并不多。其中，大蹼铃蟾皮肤肽 是从大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，相对分子量为2 6 7 4 1 2 ，具 有显著的抑制细菌、真菌和肿瘤细胞的作用，可用于制备抗细菌感染和抗肿瘤药物。 s o b a l l e 等研究发现抗菌肽m a g a i n i n 也具有出一定的抗癌活性【2 1 1 。另外，从l a u r e a 3 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 和l r a n i f o 朋西两种蛙的皮肤中提取得到的a u r e i n 家族具有广谱抗癌活性田】，它对 人体大约9 0 的癌细胞都有中等程度的抑制作用，同时也具有一定的抗菌活性。研 究发现：大多数a u r e i n 家族成员也具有两亲性的a 螺旋结构，其抗癌机理类似于 抗菌机理。从树蛙l c i t r o p a 皮肤分泌物中也提取到一种具有抗菌活性的抗癌肽。 a u r e i n 家族一级结构的测定结果显示，它们含有1 3 到1 7 个氨基酸残基，氨基 酸序列具有很大相似性，多数成员存在两亲的g t 螺旋结构，但是其家族多肽之间抗 癌活性差异不显著。r o a e k 等【2 2 】将抗癌肽a u r e i n1 2 和3 2 分别作用于人体红细 胞和癌细胞，发现当浓度达到1 0 0 l 上g m l 时，已能够杀死癌细胞，但没有明显的溶 血现象。只有当a u r e i n1 2 和3 2 的浓度达到l m g m l 时，才会产生溶血作用。另 外，c i t r o p i n l 1 和a u r e i n 家族的一级结构也有着一定的相似性。c i t r o p i n l 1 及其人 工合成类似物都是1 6 个氨基酸残基，而且它们之间存在差异的氨基酸残基数目很 少，并且都显示了广谱抗癌活性，细胞半致死量为1 0 西到1 0 巧m o l l 之间。其中 c i t r o p i n l 1 合成类似物3 的细胞半致死量仅为1 0 币m o l l ，抗癌效力明显比其它多肽 提高很多，然而两者之间却只有一个氨基酸残基的差异。这说明改变抗癌肽的某些 结构就会对其抗癌活性产生相当大的影响，为今后合成更多具有高效抗癌活性的多 肽奠定了很好的基础。 1 2 1 3 免疫调节肽( i m m u n o r e g u l a t o r yp e p t i d e s ) 广义的免疫调节肽是指具有免疫调节活性的所有肽类分子，狭义的免疫调节肽 则指具有免疫调节活性的分子量相对较小的小肽或寡肽。免疫调节肽的种类很多， 包括动物或人的一些肽类激素和肽类免疫调节分子、从微生物体内和植物组织器官 中提取的一些生物活性肽以及通过化学法合成或基因克隆得到的一些小肽或寡肽 等。目前，获取免疫调节肽的途径有4 种：利用物理化学方法从生物体的组织器 官中直接提取；通过适宜的蛋白酶酶解食物中的蛋白；根据一些已知的免疫调 节肽结构序列进行化学合成；应用基因克隆技术表达已知的免疫调节肽。 在蛙类皮肤中，免疫调节肽是一种新生物活性肽。它是从北部豹蛙皮肤提取物 中分离得到的具有免疫调节作用的一种多肽，比蜂毒肽一活性组胺释放肽的效力要 高两成。并且在粒细胞生成原始粒子细胞和肥大细胞中都发挥着相应的生物活性 【2 3 1 。由北部豹蛙皮肤中分离出的免疫调节肽为十八肽，一级结构为： l v r g d w t k s p k p c f 、哏，其中c y s 5 和c y s l 5 形成二硫键，在所有已知数据库中 没有发现与之序列高度同源的多肽，被命名为亮氨酸一精氨酸多肽( p l r ) 。 p l r 是迄今为止发现的最有效的一种多肽，它是天然存在的、非细胞裂解性组 胺释放多肽，不需要中性粒细胞有丝分裂的诱导，就能够抑制骨髓干细胞中粒细胞、 巨噬细胞克隆的早期形成。近年来有报道称，p l r 可以通过高度特异的结合在卵巢 4 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 和乳腺细胞，来体现其抗增殖作用 2 4 】。因此，它的高效生物活性和非溶血性、抑制 细胞生成原始粒子的作用、抗增殖作用以及对结合位点的高亲和作用，值得人们进 一步对它进行研究，使之成为一种更高效的化学治疗物质。 目前，又有研究发现了无指盘臭蛙免疫调节肽、基因和变异体及其在制药中的 应用。无指盘臭蛙免疫调节肽是一种环状多肽，分子量为1 7 9 1 1 2 d a ，等电点是9 8 4 ， 它的序列全长为：t s r c y i g t r k w c s ，第4 位和第1 4 位的半胱氨酸形成分子内 二硫键。编码的基因包含3 0 7 个核苷酸，其中编码成熟部分的为第1 4 1 1 8 6 位核苷 酸。无指盘臭蛙免疫调节肽原始序列中第4 个氨基酸发生替代所产生的变异体、人 工合成的无指盘臭蛙免疫调节肽及其变异体具有强烈的免疫调节活性和抑制肿瘤 活性，应用于制备免疫调节、肿瘤治疗和化疗药物。 1 2 1 4 神经调节尼k ( n e u r o a c t i v ep e p t i d e s ) 神经调节肽是一种能够刺激平滑肌收缩的多肽，其组成有神经调节肽b 、c 、k 、 l 、n 和u 。其中，神经调节肽u ( n m u ) 的研究报道较少，主要原因是缺乏对其 受体的认识。n m u 的结构高度保守，广泛分布于动物组织中，对动物健康生长起着 重要作用【2 5 1 。n m u 的免疫反应性贯穿了中枢和末梢神经系统，并且在垂体腺、胃 肠束和神经子叶中都具有最高浓度f 2 6 】。其主要的结构信息一般存在于鼠、蛙、豚鼠、 兔等多肽家族的成员中。n m u 多肽是子宫平滑肌体外收缩的有效刺激物，而且可 以在系统管理下使鼠的血压升耐2 7 2 引。 研究发现，从澳洲树蛙( l i t o h ac a e r u l e a ) 皮肤分泌物中分离得到神经调节肽 n m u 的一种新的类似物，一级结构为：s d e e v q b p g g v i s n g y f l f r p r n ，它与 n m u 存在着高度的相似性。此类似物被称为蛙n m u 2 3 。n m u 家族新成员的发现 表明，虽然这种分子的生物活性对某些组织具有特异性，但它却具有重要的生理功 能。另外，7 0 年代初从铃蟾的皮肤中也分离得到一种神经调节肽，被命名为铃蟾肽 的十四肽。铃蟾肽( b o m b e s i n ，b o m ) 又称蛙皮素，它广泛存在于神经系统中，如 下丘脑、大脑皮质、中脑等，并对体温、代谢、昼夜节律、动物摄食行为及学习、 记忆具有广泛的调节作用 2 9 , 3 0 】。此外，由于在多种肿瘤细胞中分布着较高浓度的铃 蟾肽及其受体，因此，它在肿瘤发生和抗肿瘤研究方面引起了广泛的关注。 一直以来，神经调节肽的作用方式是人们感兴趣的问题之一。有资料表明：作 为一种神经递质，b o m 可以参与突触传递过程，用k c l 溶液处理突触体，并且有 c a 2 + 存在时，b o m 及其相关肽类的释放就会明显增加。同时，也有学者研究发现 b o m 的去极化作用并不受低钙高镁溶液的影响，它发挥生理作用，主要是通过直 接与突触后膜上的受体相作用。b o m 能够刺激胆碱收缩素( c c k ) 的释放，进而 影响胃肠道的运动等等，从而说明b o m 可以担当一种神经调节因子来发挥各种生 5 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 理作用。据有关报道，b o m 可能直接作用于突触后膜上相应的受体，也可能易化 中间神经元或刺激了其它物质的释放而发挥其易化作用3 1 1 。另外，利用受体阻断剂 的研究结果显示：b o m 可以通过非肾上腺素能非胆碱能途径来发挥作用，不同于 b o m 在中枢及其外周其他组织内的作用方式。 1 2 1 5 蛋白酶抑制剂活性肽( p r o t e i ne n z y m ei n h i b i t o rp e p t i d e s ) 蛋白酶抑制剂是指一类天然存在或人工合成的小分子多肽或蛋白质，包括从大 豆中提取的e d i p r o a 和b b i ( b o w e n - - b i r k i n h i b i t o r s ) 以及从动物组织中提取的拟肽 酶( a p r o t i n i n ) 等，它是含有能抑制某些蛋白水解酶的胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋 白酶等1 3 种蛋白酶的活性物质总称。从广义上讲，蛋白酶抑制剂是指与蛋白酶分 子活性中心上的一些基团结合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白 变性的物质。天然的蛋白质抑制剂( p i ) 由于分子量较小，而普遍存在于生物体内。 它能够结合于蛋白质酶的活性中心部位和变构部位，从而抑制酶的催化活性或阻止 酶原转化为有活性的酶。 目前，蛋白酶抑制剂的种类十分丰富，根据它所抑制的蛋白酶的种类，可将其 分为4 大类：丝氨酸蛋白酶类、巯基蛋白酶类、羧基蛋白酶类和金属蛋白酶类。其 中丝氨酸蛋白酶抑制剂各方面研究比较深入。 丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动物、植物、微生物体中，是一类单链蛋白质。 在动物体中，它是维持稳定的体内环境的重要因素，体内平衡失调及任何影响丝氨 酸蛋白酶抑制剂活性的因素都会造成严重的病理性疾病。丝氨酸蛋白酶抑制剂具有 两个最基本的功能，即防止不必要的蛋白水解和调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。因 此，作为一种调控物质，其在机体的各种生理活动中都显示出重要的作用。目前， 已分离得到多种天然的丝氨酸蛋白酶抑制剂，根据其序列、拓扑结构与功能的相似 性大约将其分为2 0 个家族，其生物活性如何更好地使人类受益，这已成为国际研究 的热点。 研究表明，已从两栖类动物皮肤分泌物中分离得到了几种丝氨酸蛋白酶抑制 剂，如来自欧洲铃蟾( b o m b i n ab o m b i n a ) 的b s t i 3 2 1 和大蹼铃蟾( b m a x 蔬n a ) 的 b m t i 3 3 1 。两者的基因序列都是由6 0 个氨基酸组成，根据它们独特的一级结构和特 异性的空间结构，已被鉴定为一个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。张英霞等在研究 大蹼铃蟾皮肤匀浆物时，发现了大蹼铃蟾白蛋白，它是首次发现的具有胰蛋白酶抑 制活性的白蛋白，它可以很好的耐受温度、ph 值及二硫苏糖醇( d t t ) ，只有在苛 刻的反应条件下，其胰蛋白酶抑制的活力才会有所降低。大蹼铃蟾皮肤白蛋白在大 蹼铃蟾的皮肤上分布广泛，推测其稳定的胰蛋白酶抑制活性对大蹼铃蟾防御天敌捕 食的过程具有重要作用。 6 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 另外，从螯虾蛙( r a n aa r e o l a t a ) 的皮肤分泌物中也分离得到一种具有胰蛋白酶抑 制剂活性的新的多肽0 4 。它的基因序列由6 1 个氨基酸残基组成，一级结构为： l m c r m h q t y s a c k g h c p p t c q f r k g p p l c s k k c v g a c i c k a p y i a r s k t d n r c v l p e d c 。它含有一条由l o 个半胱氨酸组成的主链，排列方式与从线虫( a s c a r i ss u u m ) 中分离到的同样由1 0 个半胱氨酸组成的胰蛋白酶抑制剂凝血酶抑制剂主链的排列 方式十分相似。据推测：螯虾蛙皮肤分泌物中的胰蛋白酶抑制剂活性肽可能是通过 与阳离子型的两亲性洳螺旋多肽协同作用，从而使蛙类能够抵御病原微生物的侵 袭。还有一种是从番茄蛙( d y s c o p h u sg u i n e t i ) 的皮肤分泌物中分离到k u n i t z 家族的胰 蛋白酶抑制剂，它同时具有抑制大肠杆菌( ec o l i ) 生长的活性【3 引。 目前，天然的蛋白质抑制剂( p i ) 的抗虫机理仍然不是很清楚。在解释蛋白酶 抑制剂对昆虫的抗营养效应时，p i 是与昆虫肠道内的蛋白酶相结合，同时抑制其活 力，使昆虫的消化功能受到影响，从而导致昆虫的不正常发育甚至死亡。不过，这 类蛋白酶抑制剂的作用机理远非如此简单。另有试验表明，昆虫在摄食胰蛋白酶抑 制剂之后，胰蛋白酶的活性并没有下降，而是呈现了升高的趋势。p i 的进一步抗虫 机理可能与昆虫肠道内蛋白酶的合成、分泌和调控机制相关，有待进一步研究。 1 2 2 两栖动物皮肤活性肽的特征及其作用机制 两栖类皮肤活性肽最主要的特点是：不管在种类还是数量上，它在其皮肤中的 分布都是非常丰富的，是哺乳类动物无法匹敌的。因此，两栖类皮肤被誉为生物活 性肽的巨大存储库，而且存在于两栖类皮肤中的大多数活性肽都能在哺乳动物的神 经内分泌细胞和肽能神经元中找到其对应物。另外，在不同种类的两栖类皮肤中储 存着不同的生理、药理性活性多肽，但抗菌肽在每种两栖类皮肤中几乎都有分布。 两栖类皮肤抗菌肽的结构决定了它的抗菌机理。多数抗菌肽如果发生氨基酸残 基的替换后有利于两亲性a 一螺旋结构的形成，其抗菌活性通常都会相应的有所提高 【3 6 1 。螺旋结构的稳定性对抗菌肽的抗菌活性同样是非常重要的，a 一螺旋结构越稳 定其抗菌活性就越强【3 。7 1 。由于大多数抗菌肽都是碱性多肽，因此它们很容易与微生 物酸性的脂质双分子层相结合，然后依靠a 螺旋结构的特点形成跨膜的离子通道， 介导一系列的生物效应。尽管两栖类抗菌肽的作用机理已经研究得比较深入，但其 真正的作用机理尚无定论。目前普遍认为，其可能的抗茵机理是：带正电荷的抗菌 肽与带负电荷的微生物细胞膜相互作用，然后进一步插入到细胞膜内，改变膜结构， 导致细胞内物质外漏，最终引起微生物死亡。 o r e n 等【3 8 】总结出了两种作用机理：栅桶模型( b a r r e l s t a v e m o d e l ) ：多肽分子在 膜上形成通道，导致病原微生物氧化磷酸化解偶联而死亡；毯式模型( c a r p e t l i k e m o d e l ) ：多肽分子聚集在膜外面，与膜脂作用，改变其曲率，逐步包裹膜，使之成 7 中国林蛙皮肤生物活性肽基因的c d n a 克隆、序列分析及生物活性的测定 碎片脱离，最后导致膜崩解。究竟两种模型中哪种正确，还是二者兼而有之，目前 还不完全清楚。但是，不管哪种机理，正电荷对于两栖类抗菌肽的抗菌作用都是非 常重要的，例如，t e m p o r i n 1 家族的t e m p o r i n 1j “几p l v g n l u o l l c o n h 2 ) 与 此家族中的其它抗菌肽分子相比，主要就是第1 1 位的赖氨酸残基被天冬氨酸残基所 取代而成为阴离子肽，试验结果几乎无抗菌活性1 1 9 】。 抗菌肽对哺乳动物的正常细胞一般无损伤【3 9 , 4 0 ，但是大多数两栖类抗菌肽在高 浓度下对哺乳动物红细胞具有溶血作用，少数两栖类抗菌肽甚至在低浓度下就表现 出此作用。因而，它对哺乳动物正常细胞也有一定毒性。溶血作用与疏水残基含量 有关，肽分子中疏水残基含量越高则往往溶血作用也变吲1 8 】。至于两栖类抗菌肽是 否存在其他的分子类型及作用机理还有待进一步研究。 1 2 3 两栖类皮肤活性肽的功能 两栖类皮肤中的活性物质种类繁多、功能复杂。已经证实，越来越多的具有抗 菌活性的多肽已经从两栖类皮肤分泌液中获得。抗菌肽是两栖类动物免疫系统中的 重要组成部分，其功能呈现多样性。除了具有抗茵活性外，两栖类抗菌肽还具有抗 病毒、肿瘤、寄生虫，促进伤口愈合等活性。 1 2