（食品科学专业论文）铬革屑中提取的胶原蛋白水解物的化学改性研究.pdf

摘要本文以铬革屑中提取的胶原蛋白水解物为原料，采用戊二醛( g t a ) ，碳化二亚胺( e d a c ) ，叠氮二苯基磷( d p p a ) 进行化学改性，并对影响胶原蛋白水解物乳化性、乳化稳定性和分子量的各种因素进行了研究。胶原蛋白水解物及其改性产物的乳化性( 以e a i 值反映) 和乳化稳定性( 以e s i 值反映) 采用紫外可见分光光度计进行测定，分子量采用s d s p a g e 电泳进行测定。采用戊二醛对胶原蛋白水解物进行改性时，以分子量、乳化性和乳化稳定性作为评价指标，研究了各因素对改性结果的影响。对于乳化性而言，最佳改性条件为：戊二醛用量6 0 0 9 1 0 0 9 、p h 7 0 0 、反应温度6 0 。c 、反应时间2 o h ，在此条件下，胶原蛋白水解物的e a i 为o 9 6 3 7 8 ；对乳化稳定性而言，最佳改性条件为：戊二醛用量6 0 0 9 1 0 0 9 、p h 9 0 0 、反应温度6 0 。c 、反应时间2 0 h ，在此条件下，胶原蛋白水解物的e s i 为1 1 2 4 6 m i n 。采用碳化二亚胺对胶原蛋白水解物进行改性时，对于乳化性和乳化稳定性而言，最佳改性条件均为：碳化二亚胺用量9 0 0 9 1 0 0 9 、p h 7 0 0 、反应温度3 0 * ( 2 、反应时间2 o h ，在此条件下，胶原蛋白水解物的e a i 为o 9 9 6 3 2 ，e s i 为1 2 0 6 9 m i n 。在采用叠氮二苯基磷对胶原蛋白水解物进行改性时，对于乳化性而言，最佳改性条件为：叠氮二苯基磷用量o 5 0 9 1 0 0 9 、反应温度2 5 * ( 2 、反应时间1 2 h ，在此条件下，胶原蛋白水解物的e a i 为o 9 8 8 6 7 ；对乳化稳定性而言，最佳改性条件为：叠氮二苯基磷用量o 5 0 9 1 0 0 9 、反应温度2 5 * ( 2 、反应时间1 6 h ，在此条件下，胶原蛋白水解物的e s i为1 0 8 0 6 m i n 。在所得到的最佳改性反应条件下，对改性前后胶原蛋白水解物的理化性质和功能特性进行分析，结果表明，改性后胶原蛋白水解物的分子量比改性前大，氮溶解指数降低，而分子量较大的胶原蛋白水解物吸油性、乳化性和乳化稳定性较好，分子量较小的胶原蛋白水解物其吸水性和保水性较好。综合评价，三种交联剂的改性效果依次从大到小为：碳化二亚胺 叠氮二苯基磷 戊二醛。关键词胶原蛋白水解物戊二醛碳化二亚胺叠氮二苯基磷化学改性s d s - p a g e 理化性质功能特性a b s t r a c ti nt h i sp a p e r , t h ec o l l a g e nh y d r o l y s a t ep r o d u c e df r o mt h el e a t h e rs h a v i n g ，w a sm o d i f i e d、i t l lg l u t a r a l d e h y d e ( g t a ) ，1 - e t h y l 一3 - ( 3 - d i m e t h y la m i n o p r o p y l ) - e a r b o d i i m i d e ( e d a c ) a n dd i p h e n y l p h o s p h o r y l a z i d e ( d p p a ) ，t h ev a r i o u si n f u e n c ef a c t o r so fe m u l s i f i c a t i o nc a p a c i t y ,e m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t ya n dt h em o l e c u l a rw e i g h t ( m w ) o fh y d r o l y s i sp r o d u c t sv c a ss t u d i e d t h ee m u l s i f i c a t i o nc a p a c i t yr e f l e c t e db yt h ee m u l s i f i c a t i o na b i l i t yi n d e x ( e a i ) a n dt h ee m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t yr e f l e c t e db ye m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t yi n d e x ( e s i ) o fc o l l a g e nh y d r o l y s a t ea n dm o d i f i e dp r o d u c t sw e r em e n s u r a t e db yu v - v _ i s i b l es p e c t r o p h o t o m e t e r , a n dt h em o l e c u l a rw e i g h t ( m w )a n a l y z e db ys o d i u m - d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l - e l e c t r o p h o r e s i s ( s d s p a g e ) c o l l a g e nh y d r o l y s a t ew a sm o d i f i e dw i t hg l u t a r a l d e h y d e t h ev a r i o u si n f u e n c ef a c t o r si nt h ep r o c e s so fm o d i f i c a t i o nw e r es t u d i e db yc o m p a r i s o no ft h ee m u l s i f i c a t i o nc a p a c i t y ,e m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t ya n dt h em o l e c u l a rw e i g h t ( m w ) f o rt h ee m u l s i f i c a t i o nc a p a c i t y , t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm o d i f i c a t i o nw e r e ：g l u t a r a l d e h y d el e v e lb e i n g6 0 0g ，1 0 0 9 ，p hv a l u e7 0 0 ，r e a c t i n gt i m e2 o h ，a n dt e m p e r a t u r e6 0 。c ，u n d e rs u c hc o n d i t i o n s ，e m u l s i f i c a t i o na b i l i t yi n d e x ( e a do fm o d i f i e dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew a so 9 6 3 7 8 ；f o rt h ee m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t y , t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm o d i f i c a t i o nw e r e ：g l u t a r a l d e h y d el e v e lb e i n g6 0 0g 1 0 0 9 ，p hv a l u e9 0 0 ，r e a c t i n gt i m e2 o h ，a n dt e m p e r a t u r e6 0 c ，u n d e rs u c hc o n d i t i o n s ，e m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t yi n d e x ( e s r ) o f m o d i f i e dc o l l a g e n h y d r o l y s a t e w a s1 1 2 4 6 m i n c o l l a g e nh y d r o l y s a t ew a sm o d i f i e dw i t he d a c f o rt h ee m u l s i f i c a t i o nc a p a e i t ya n de m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t y , b o t ho ft h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm o d i f i c a t i o nw e r e ：e d a cl e v e lb e i n g9 0 0g 1 0 0 9 ，p hv a l u e7 0 0 ，r e a c t i n gt i m e2 0 h , a n dt e m p e r a t u r e3 0 * ( 2 ，u n d e rs u c hc o n d i t i o n s ，e m u l s i f i c a t i o na b i l i t yi n d e x ( e a do fm o d i f i e dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew a so 9 9 6 3 2a n de m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t yi n d e x ( e s i ) w a s1 2 0 6 9m i n c o l l a g e nh y d r o l y s a t ew a sm o d i f i e dw i t hg l u t a r a l d e h y d e f o rt h ee m u l s i f i c a t i o nc a p a c i t y ,t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm o d i f i c a t i o nw e r e ：t h ee m u l s i f i c a t i o nc a p a c i t yw a sd p p al e v e lb e i n g0 5 0 1 0 0 9 ，r e a c t i n gt i m e1 2 h , a n dt e m p e r a t u r e2 5 * c ，u n d e rs u c hc o n d i t i o n s ，e m u l s i f i c a t i o na b i l i t yi n d e x ( e a i ) o fm o d i f i e dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew a so 9 8 8 6 7 ；f o rt h ee m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t y ,t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm o d i f i c a t i o nw e r e ：d p p al e v e lb e i n go 5 0 1 0 0 9 ，r e a c t i n gt i m el i1 6 h ，a n dt e m p e r a t u r e2 5 c ，u n d e rs u c hc o n d r i o n s ，e m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t yi n d e x ( e s i ) o fm o d i f i e dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew a s1 0 8 0 6m i n u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n so fm o d i f i c a t i o n , t h ec h a n g e so ft h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sa n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fc o l l a g e nh y d r o l y s a t eb e f o r ea n da f t e rm o d i f i c a t i o n谢t ht h et h r e ec r o s s l i n k i n ga g e n t sw e r ea l s oc o m p a r e d s t u d ys h o w e dt h a t m o l e c u l a rw e i g h to fm o d i f i e dc o l l a g e nw a sh i g h e rt h a nn o m o d i f i e dc o l l a g e n ，a n dn i t r o g e ns o l u t i o ni n d e x ( n s i ) w a sd e c r e a s e d ，a n dt h a tc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew i t hh i g h e rm o l e c u l a rw e i g h th a db e t t e ro i la b s o r p t i o n e m u l s i f i c a t i o nc a p a c i t ya n de m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t y , a n dc o l l a g e nh y d r o l y s a t ew i t hl o w e rm o l e c u l a rw e i g h th a db e t t e rw a t e ra b s o r p t i o na n dw a t e rm a i n t e n c e s y n t h e s i z eo p i n i o n ，t h em o d i f i e de f f e c to ft h et h r e ec r o s s l i n k i n ga g e n t sc o u l db ef o u n d ，w h i c hw a se d a c d p p a g a k e yw o r d s ：c o l l a g e nh y d r o l y s a t ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sg l u t a r a l d e h y d ee d a cd p p as d s - p a g ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o nf u n c t i o n a lp r o p e r t i e s独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。论文作者签名：垫坌i 垒日期：塞竺! ：兰：! 艺关于论文使用授权的说明本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：巫盆苍：日期：垒! ! 羔：望导师签名：鞘鹾甥监日期：丝铬革屑中提取的胶原蛋白水解物的化学改性研究第一章前言1 1 本课题研究的目的和意义在制革工业中，伴随着湿蓝皮的削匀、修边等过程，将产生大量的含铬固体废弃物，包括铬革屑。据统计，仅有3 0 5 0 的原材料转化为最终的皮革产品。在印度，每年约产生1 5 万吨的各类制革固体废弃物犯l 。在美国，每年产生0 1 0 万吨含铬废弃物。据统计，世界范围内每年产生约6 0 万吨的含铬废弃物，其中胶原蛋白约占8 0 ( 以固体含量计) ”“。我国是制革大国，年投产1 7 亿张皮，将有1 4 0 万吨废弃物产生l 引。干铬革屑含有3 6 的铬氧化物和9 0 0 o 的胶原蛋白。在如何充分利用这一丰富资源，减轻环境污染方面，国内外对此作了大量的研究工作。二十多年以前的研究报道或专利多是利用这些“废弃物”制造再生革、无纺布、人造革基底材料和混纺纤维等睁i 。广泛深入的研究工作始于2 0 世纪9 0 年代，主要成果是采用不同方法提取胶原蛋白，进而用作动物饲料、花肥、凝胶、添加剂、胶片、工业明胶等附加值比较低的产品l ”8 i 。近1 0 年来，美国农业部东部地区农业研究中心对含铬废弃物的回收利用进行了大量的研究工作，研究开发的二步法提胶”。1 ”，其产物主要用作工业明胶、饲料添加剂、花肥、微胶囊、染料、乳化剂和防火剂【| 1 , 1 2 10 据报道，由二步法提取的胶原蛋白经离子交换树脂处理后，可用做化妆品、粘合剂、印刷或摄影等【l 1 。由含铬废弃物制取的胶原蛋白未能广泛利用，且目前多用于低附加值产品领域的主要原因是：铬与胶原的分离不彻底。所得产物中的铬含量过高，一般碱法提胶所得胶原蛋白中的铬( c r 3 + ) 含量在1 5 3 0 m g k g 以上。明胶是一种富含天然胶原蛋白的物质，我国规定，作为食品添加剂的明胶，铬( c p ) 含量一 5 9 1 是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、且可以重复的方法。其原理是主要根据蛋白质的分子量对其进行分离，s d s ( 十二烷基硫酸钠)与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。s d s 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以忽略。2 3 2 6 1 储液的配制3 0 分离胶贮液：称取3 0 9a c r 及o 8gb i s 溶于蒸馏水，定容至1 0 0 m l ，过滤后置棕色瓶中，4 贮存；1 0 浓缩胶贮液：称取1 0 9a c r 及o 5gb i s ，溶于蒸馏水中，定容至1 0 0 m l ，过滤后棕色瓶中4 。c 保存；分离胶缓冲液( 3 0 m o l lp h 8 9t r i s h c l 缓冲液) ：称取3 6 3gt r i s ，加少量蒸馏水使其溶解，再加4 8m l1 m o l l h c l ，调节p h 至8 9 ，最后加蒸馏水定容至1 0 0 m l ，4 。c 保存；浓缩胶缓冲液( o 5 m o l l p h 6 7t r i s h c l 缓冲液) ：称取3 6 3g t r i s ，加少量蒸馏水使其溶解，再加l m o f l h c l1 6m l ，调节p h 至6 7 ，最后加蒸馏水定容至1 0 0 m l ，4 c 保存；1 0 ( w v ) s d s 溶液：称取5 9 s d s ，加蒸馏水至5 0 m l ，微热使其溶解，4 。c 保存；1 t e m e d f “v 1 ：取1 m l t e m e d ，加蒸馏水至1 0 0 m l ，棕色瓶中4 。c 保存；1 0 a p ( w v ) 过硫酸铵：称l g a p ，加蒸馏水至1 0 m l ( 最好临用前配制) ；样品溶解液( 按照表2 1 配制) ：内含2 s d s ，5 巯基乙醇，1 0 甘油，o 0 2 溴酚铬革屑中提取的胶原蛋白水解物的化学改性研究兰，o 0 1 m o l lp h 8 0t r i s h c i 缓冲液：电极缓冲液：称取6 , 0gt r i s ，2 8 8 9 甘氨酸，加入1 0 m l1 0 s d s ，加蒸馏水使其溶解后定容至1 0 0 0 m l ；表2 - 1 样品溶解液的配制1 0 s d s巯基乙醇溴酚兰甘油0 0 5 m o l l1 y i s h c l加蒸馏水后总体积2 m l0 ，5 m l2 m l】m l2 m l1 0 m l1 琼脂糖溶液：称取1 0g 琼脂糖，加电极缓冲液1 0 0 m l ，加热使其溶解，4 保存备用。考马斯亮兰g - 2 5 0 染色液：将2g 考马斯亮兰g 2 5 0 溶解于1 l 蒸馏水中，加入1 l 1 m o l l 硫酸，搅拌3 h 后过滤，再加入2 2 0 m l1 0 m o l l 氢氧化钠和3 1 0 m l1 0 0 三氯乙酸，混匀备用。2 , 3 2 6 2 制胶采用不连续凝胶系统。由于水解后胶原蛋白分子量变亿较大，分子量较小，因此考虑采用浓度较大的凝胶，分离胶为1 2 ，浓缩胶为4 。配胶时各种贮液的配比如表2 2所示。采用垂直板式电泳槽，先灌注分离胶，聚合后灌注浓缩胶( 前者一般需要3 0 m i n ，后者也需3 0 m i n ，并有3 0 m i n 的老化时间) 。2 3 2 6 3 进样用e p p e n d o r f 微量进样枪加标准蛋白和待测蛋白于样品槽中。2 3 2 6 4 电泳表2 - 2 不连续s d s p a g e 胶的配制试剂名祢1 2 分离胶3 浓缩胶分离胶贮液8 0 0 m l分离胶缓冲液2 5 0 m l浓缩胶贮液3 0 0 m l浓缩胶缓冲液1 2 5 m l1 0 s d s0 2 0 m l0 1 0 m l1 t e m e d2 0 0 m l1 0 0 m l蒸馏水7 2 0 m l4 6 0 m l混匀后真空干燥器中抽气1 0 m i n1 0 a p0 1 0 m l0 0 5 m l1 9河南t 业大学硕士学位论文先在1 0 m a 左右的电流下电泳，直到样品进入分离胶后，电流可升至2 0 m a 左右，当溴酚兰指示带接近胶底l c m 时，停止电泳。2 3 2 6 5 染色一般染色5 - ，| 6 h 。2 3 2 6 6 脱色采用蒸馏水脱色，般1 h 就可看到清析的条带。2 3 3 胶原蛋白功能特性的测定2 3 3 1 吸水性的测定准确称耿1 0 9 ( 准确至0 0 0 0 2 9 ) 胶原蛋白样品，均匀平铺于预先恒重的培养皿中，称其质量为r f l l ，然后置于恒温恒湿( 温度3 0 。c ，相对湿度6 0 ) 的生化培养箱中，每隔6 h 测定一次培养皿的质量，至到培养皿的质量不再增加为至，称其质量为m 2 ，则样品的吸水性为：吸水船) 2 纛蠢1 0 0 2 3 3 2 保水性的测定准确称取1 0 9 ( 准确至o 0 0 0 2 9 ) 的胶原蛋白样品溶于一定量的蒸馏水中，定容至1 0 0 m l ，然后量取i m l 样液将平铺在预先恒重的培养皿中，称其质量为i t i l ，然后置于恒温恒湿( 温度3 0 。c ，相对湿度6 0 ) 的生化培养箱中，每隔1 0 r a i n 测定一次培养皿的质量，计算水分残存率。2 3 3 3 吸油性的测定旧准确量取2 m l 油，放入5 m l 刻度离心管中，再称取0 3 9 样品加入离心管中，用细棒搅拌1 m i n ，静止3 0 r a i n 后，在1 0 0 r r a i n 的速度下离心2 5 m i n ，汜下游离油的体积，则样品的吸油性为：姗陛( m l g ) = 号警2 3 - 3 4 乳化性及其稳定性的测定删胶原蛋白的乳化性及其乳化稳定性用乳化能力指数e a i 和乳化稳定指数e s i 表示，具体操作如下：用称取1 5 9 样品溶解于5 0 m l 蒸馏水中，调节p h 值至7 ，加入1 0 m l花生调和油，在匀质机中以1 3 0 0 0 r m i n 的速度匀质2 m i n ，用微量注射器迅速从底部抽取乳状液5 0 川l ，与2 5 m l0 i s d s 溶液混合，然后在分光光度计上5 0 0 n m 处测其吸光2 0铬革屑中提取的胶原蛋白水解物的化学改性研究度，1 0m i n 后再重新测定，刚丌始的吸光度即表示为e a i ，乳化稳定指数e s i 的计算如下：e s i ( m i n l ：e a i f式中，a e 为最初的吸光值与1 0m i n 后的吸光值之差；t 为测量两次吸光度之间的时间间隔，本实验中t 为1 0 m i n ；2 3 3 5 氮溶解指数( n s i ) i 叫氮溶解指数( n s i ) 是指在控制浸出条件下，溶解在水中的氮占总氨的百分率，它是一种反映蛋白质水溶性大小的物理量，是蛋白质的重要功能特性之一。称取一定量样品置于4 0 0 m l 烧杯中，量取2 0 0 m l 3 06 c 的水，用搅拌棒使样品充分分散；把烧杯浸入3 06 c 水浴中，以1 2 0 r m i n 的转速机械搅动混合物1 2 0 m i n ，转移到2 5 0 m l容量瓶中，并稀释至刻度；静置数分钟取上清液4 0 m l 至容积为5 0 m l 刻度离心管中，离心分离( 1 5 0 0 r m i n ) 1 0 m i n ，取上清液，收集于1 0 0 m l 烧杯中：吸移2 5 m l 清液，按照标准操作进行蛋白质含量测定。以下式计算：黼胁型篙等坐式中b 为反滴定空白的碱液体积( m l ) ：s 为反滴定样品的碱液体积( m l ) ；n 为碱的浓度( m o l l ) 。2 3 4 胶原蛋白的改性方法称取1 5 9 胶原蛋白粉溶于5 0 m l 水中，室温下静景0 5 h 使其充分溶解，在定温度的水浴中静置3 0 m i n 后，用h c i 溶液调p h 值到所需值，加入一定量的改性剂，在同样温度下搅拌反应一段时间，最后过滤，减压浓缩、真空干燥。把提取出的样品放入内有硅胶的干燥器中，备用。河南工业大学硕士学位沧文第三章结果与讨论3 1 实验用胶原蛋白粉末的理化指标3 1 1 铬标准曲线的绘制重铬酸钾标准曲线的绘制见图3 - 1 。型米髻051 0152 00 53 0铬的禽量( m g t a lj图3 - 1 重铬酸钾标准曲线3 1 2 胶原蛋白粉末的理化分析结果胶原蛋白粉末的理化分析结果见表3 - i 。表3 - l 胶原蛋白粉末的理化分析3 2 戊二醛的改性戊二醛为目前应用最广泛的一种同型双功能变联剂，其两个醛基可分别与两个相同或不同分子的伯氨基形成s c h i f f 碱，将两个分子以五碳桥连接起来。戊二醛不仅与胶原蛋白分子中的赖氨酸或赖氢酸残基的e 氨基反应，还会与胶原蛋白分子中的羧基、酰胺基以及其它基团发生反应。在低浓度下，戊二醛与胶原蛋白分子将形成分子内交联，而在高浓度情况下，戊二醛本身还可能发生自聚。3 2 1 分子量、乳化性和乳化稳定性单因素试验改性胶原蛋白水解物的乳化性与乳化稳定性受颗粒大小、溶液p h 值、温度、蛋白改性胶原蛋白水解物的乳化性与乳化稳定性受颗粒大小、溶液p h 值、温度、蛋白2 2端鬻僦黜勰铬革屑中提取的胶原蛋白水解物的化学改性研究分子量等影响。本文选择了四个主要因素( 戊二醛用量、p h 值、反应时间、温度) 作单因素实验，研究其对改性前后胶原水解物分子量、乳化性和乳化稳定性的影响。3 2 1 1 戊二醛用量的影响戊二醛用量指戊二醛质量与胶原蛋白水解物质量之比( g 1 0 0 9 ) 。在p h 值8 0 0 ，反应温度7 0 0 。c ，反应时间1 5 h 的条件下，戊二醛用量对胶原蛋白水解物乳化性、乳化稳定性和分子量的影响见图3 2 a 、3 2 b 和3 2 c 。1 0 0 0 00 9 0 0 008 0 0 00 7 0 0 0= 0 6 0 0 005 0 0 00 4 0 0 00 ，3 0 0 00 2 0 0 09 0 0 08 0 0 07 0 0 0i6 0 0 0昌5 0 0 04 0 0 03 0 0 02 0 0 04 0 060 08 0 01 0 0 01 20 04 0 06 0 08 0 01 0 0 01 2 ，0 0a( g 1 0 0 9 )b ( g t 0 )图3 - 2 交联反应中戊二醛用量对胶原蛋白水解物乳化性( a ) 、乳化稳定性( b ) 和分子量( c ) 的影响c 中a 到e 依次为戊二醛用量3 0 0 、6 , 0 0 、9 0 0 、1 2 0 0 、1 5 0 0 9 1 0 0 9 时改性产物分子量分布，f 为分子量标准( 从上至下依次为9 7 4 0 0 、6 6 2 0 0 、4 3 0 0 0 、3 1 0 0 0 、2 0 1 0 0 和1 4 4 0 0 ，下同)从图中可见，随着戊二醛用量的增加，乳化性、乳化稳定性和分子量均先增大后减小，当戊二醛用量为8 0 0 9 1 0 0 9 时三者的值都达到最大，而用量达到1 0 0 0 9 1 0 0 9 以上时，三者的值都已降到很低。这可能是由于戊二醛用量为8 0 0 9 1 0 0 9 时，胶原蛋白与戊二醛间的交联反应已基本完全，如果戊二醛用量高于8 0 0 9 1 0 0 9 ，过量的戊二醛将发生自聚，自聚产物在胶原蛋白表面生长，将阻止交联试剂渗入到胶原蛋白内部；此外，胶原蛋白的表面是胶原蛋白分子间交联的重要场所，从而大为降低胶原蛋白交联的效率，分子量的改变也小。自聚产物的形成还会阻止胶原蛋白结合油的能力，减少交联产物中胶原蛋白的相对含量，导致吸光度降低，从而使交联产物的乳化性和乳化稳定性降低。河南工业大学硕士学位论文3 2 1 2p h 值的影响在反应温度7 0 0 。c ，反应时间1 5 h ，戊二醛用量8 0 0 9 1 0 0 9 的条件下，p h 值对胶原蛋白水解物乳化性、乳化稳定性和分子量的影响见图3 3 a 、3 3 b 和3 3 c 。6 0 07 0 08 0 09 0 01 0 0 0a( o h 值)abcdef60 07 0 080 0g0 0l o 0 0b( p h 值)图3 - 3 交联反应中p h 值对胶原蛋白水解物乳化性( a ) 、乳化稳定性( b ) 和分子量( c ) 的影响c 中的a 到e 依次为p h 6 0 0 、7 0 0 、8 0 0 、9 0 0 、1 0 0 0 时改性产物分子量分布，f 为标准蛋白从图3 3 可知，随着p h 值的增大，乳化性、乳化稳定性和分子量都先增大后减小，在p h 8 0 0 时达到最大。由此可见在p h 8 0 0 时，胶原蛋白水解物与戊二醛的交联反应最好。在p h 6 0 0 时，胶原蛋白的吸光度在o 3 5 0 0 以下，比改性前的吸光度( o 3 9 4 0 ) 还小，这可能是因为在此p h 值下，胶原蛋白与戊二醛几乎不反应；另外，不参与反应的戊二醛发生分子间自身缩合，形成羟醛缩合物，这些羟醛缩合物可能与水结合，从而与胶原蛋白形成竞争关系，导致胶原蛋白油水结合能力降低，因而吸光度比改性前还小。3 2 1 3 反应时间的影响在p h 8 0 0 ，反应温度7 0 0 。c ，戊二醛用量8 0 0 9 1 0 0 9 的条件下，反应时间对胶原蛋白水解物乳化性、乳化稳定性和分子量的影响见图3 4 a 、3 4 b 和3 4 c 。从图3 - 4 可知，随着反应时间的延长，乳化性和乳化稳定性及分子量仍是先增大后减小，乳化性和乳化稳定性在反应时间为1 5 h 时最好，此时分子量也最大。随着反应时间的进一步延长，乳化性和乳化稳定性都降低，这可能是因为当胶原蛋白与戊二醛的交童啪啪眦伽|i(u州旦i幽00000o00著；湖啪枷|i铬革屑中提取的胶原蛋白水解物的化学改性研究联反应已经完成后，再延长反应时间，由于胶原蛋白水解物的水解反应占主导地位，反而导致交联产物的分子量减小( 这一点可以从图3 4 c 中看出) ，从而导致胶原蛋白水解物油水结合能力的下降。10 0 0 00 0 0 0 00 8 0 0 0。0 7 0 0 0。06 0 0 00 5 0 0 00 4 0 0 003 0 0 00 51 01 52 02 5a( h )abcdefc0 51 _ ol52 02 5b( h )图3 4 交联反应中反应时间对胶原蛋白水解物乳化性( a ) 、乳化稳定陛( b ) 和分子量( c ) 的影晌c 中的a 到e 依次为反应时间为0 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 h 时改性产物分子量分布，f 为标准蛋白3 2 1 4 反应温度的影响在p h 8 0 0 ，反应时间1 5 h ，戊二醛用量8 o o 1 0 0 9 的条件下，反应温度对胶原蛋白水解物的分子量，乳化性和乳化稳定性的影响见图3 5 a 、3 5 b 和3 5 c 。从图3 5 可知，随着反应温度的升高，乳化性、乳化稳定性和分子量都是先增大后减小，在6 0 0 。c 时，胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性最好，分子量也最高。由此可知胶原蛋白与戊二醛反应的最佳温度范围在6 0 0 。c 左右。当反应温度在6 0 0 * c 以上时，由于反应较为剧烈，对胶原蛋白的影响较大，因此其乳化性和乳化稳定性都显著降低。由图3 5 c 也可以看出，在温度高于7 0 0 。c 时，胶原蛋白的分子量已经降得很低。0o00o00ooo00o0oooo0o00o0o9876543(u州目一一叫河南工业大学硕士学位论文i0 0 0 009 0 0 00 8 0 0 00 ，7 0 0 0h盏06 0 0 005 0 0 004 0 0 00 3 0 0 00 2 0 0 04 0 0s o 06 007 0 08 0 0a( )1 1 0 001 0 0 0 09 0 0 0 8 0 0 0占7 0 00器6 0 0 05 0 0 04 0 0 03 0 0 0abcdef4 0 05 0 ，06 0 07 008 0 0b( )图3 5 交联反应中反应温度对胶原蛋白水解物乳化性( a ) 、乳化稳定性( b ) 和分子量( c ) 的影响c 中的a 到e 依次为反应温度为4 0 0 、5 0 ，0 、6 0 0 、7 0 0 、8 0 0 c 时改性产物分子量分布，f 为标准蛋白3 2 2 胶原蛋白水解物的乳化性和乳化稳定性的正交试验根据以上单因素试验结果，确定a ：戊二醛用量、b ：反应p h 值、c ：反应温度、d ：反应时间为影响胶原蛋白水解物分子量、乳化性和乳化稳定性的主要因素，各因素水平见表3 - 2 ，同时考虑a b 、b x c 可能的交互作用，采用七因素三水平的正交表l 1 8 ( 3 7 ) 进行正交试验，结果见表3 3 。表3 - 2 正交试验因素水平表由表3 - 3 可知，各因素对胶原蛋白水解物乳化性的影响主次顺序为：a b c d a x b b c 。直接看的最佳组合是a l b l c 2 d 2 ，即戊二醛用量6 0 9 i 0 0 9 、p h 7 0 、反应温度6 0 0 c 、反应时间1 5 h ，在此条件下胶原蛋白水解物的乳化性为o ，9 4 1 0 ；算一算最佳组合为a 1 b l c 2 d 3 。各因素对胶原蛋白水解物乳化稳定性的影响主次顺序为：a b c d a x b b x c 。直接看的最佳组合是a l b l c 2 d 2 ，与乳化性的最佳条件相同，在此条件下胶原蛋白水解物的乳化稳定性为9 9 5 2 r a i n ；算一算最佳组合为a i b 3 c 2 d 2 。粥铬革屑中提取的胶原蛋白水解物的化学改性研究表3 3 胶原蛋白水解物改性的正交结果l 1 8 ( 3 )测定指标试验号aba 。bb 。ccd空白1 五f i 五面111111110 7 8 3 67 9 2 ，621222222o 8 3 2 48 2 88313333330 7 3 2 47 9 5 84211223307 5 3 86 7 9 5522233110 3 8 5 65 7 2 56233l1220 4 5 9 78 4 0 273121323o 4 2 3 25 6 2 18323213l0 3 5 8 55 5 3 7933132120 5 1 0 97 9 151 01l332210 9 4 1 09 9 5 21 1l2113320 6 8 2 77 7 591 21322l130 7 0 1 59 1 3 41 321231320 7 0 2 66 4 1 21 422312130 6 9 1 37 8 2 61 523123210 3 8 7 67 6 7 71 63132312o 3 3 5 95 0 8 11 132131230 3 9 8 45 4 2 41 8332l2310 3 2 3 26 1 8 6乳10 7 7 90 7 5 7o 5 9 605 4 10 5 6 70 4 6 8n 5 6 0最佳组合茬0 5 6 3n 5 5 8o 5 6 1n 5 6 20 6 7 50 5 7 40 5 8 7a 1 b l c 2 d 2 ( 看一看)三i i io 3 9 2o 5 1 9o 5 3 7o 6 1 2n 4 9 ln 6 3 2n 6 1 7a l b l c 2 d 】( 算一算)“r03 8 70 2 0 8o 0 9 50 0 7 10 1 8 40 1 2 4o 0 4 7乳i8 5 0 36 9 6 57 2 , 4 97 2 8 77 1 3 97 2 6 87 1 6 7化稳定6 7 5 96 8 9 47 0 8 57 8 2 7i i i5 9 6 17 8 7 97 4 597 2 3 16 6 3 77 5 6 16 7 7 57 3 0 9最佳组合a 1 b l c 2 d 2 ( 看一看)7 1 2 一a 1 阻c 2 d 2 ( 算一算)*r2 5 421 1 1 95 6 52 0 11 1 9 17 8 61 8 3一。_。一一3 2 3 胶原蛋白水解物改性前后分子量与功能性的比较用所得到的算一算最佳条件对胶原蛋白水解产物进行戊二醛改性，改性前后分子量及几种功能特性的比较见图3 - 6 和表3 4 。从图3 - 6 中可以看到，改性前后胶原蛋白分子质量范围都较宽，但改性前样品的分子河南工业大学硕士学位论文质量主要集中在2 0 1 0 0 d a l 左右，改性后产物的分子量总体上提高了，且主要在2 0 1 0 0 d a l以上。不过，改性产物分子量的分布更广，这可能与有机反应的特点有关：有机反应是一个可逆反应，当交联反应达到其平衡点后，仍有部分低分子量成分存在。由表3 - 4 可知，改性后胶原蛋白乳化性和乳化稳定性都比改性前好，这可能是因为改性前胶原蛋白分子质量相对较小，亲水基团暴露较多，憎水基团较少，结合浊能力低，因此乳化性和乳化稳定性不好，改性后由于胶原蛋白与戊二醛发生交联，分子质量增大，暴露出较多的亲油基团，亲油亲水能力增强。因此，胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性与分子质量关系很大，在本试验的分子质量范围内，胶原蛋白的乳化性和乳化稳定性，基本上随分子质量的增大而增加。这可以从表3 4 中体现出来。图3 - 6 改性前后胶原蛋白的s d s p a g e 电泳图a 、b 代表改性前胶原蛋白的分子量分布，c 、d 代表改性后胶原蛋白的分子量分布( 平行实验) ，e 为标准蛋白改性后，胶原蛋白水解物的氮溶解指数比改性前降低。这是因为蛋白质的水溶性取决于其分子中可电离基团和亲水基团的多少，胶原蛋白的交联造成肽键的形成，肽键的形成主要引起以下变化：1 极性基团如氨基，羧基数目的减少，使蛋白质疏水性提高，电荷密度减小，从而引起产品亲水性的减小；2 多肽链分子量的增加；3 分子构象可能引起变化。由于小分子量的胶原蛋白水解物交联为大分子量的胶原蛋白水解物后，大量亲水基团( 一c 0 0 h 、_ n h 2 、o h ) 被封闭，因而胶原蛋白水解物的氮溶解指数降低。吸水性是指蛋白质产品吸附或摄取水分的能力，一般用每克产品吸附水分的克数表示。在表3 - 4 中，改性前胶原蛋的吸水性比改性后好。吸油性是表征蛋白质产品吸附油脂能力的物理量，一般用每克蛋白质产品吸附油的毫升数来表示，其大小决定于蛋白质产品的种类、来源、颗粒大小、温度、加工方法、所使用的油脂、离心速度与时间等，并与蛋白的分子质量大小密切相关。在表3 4 中，胶原蛋白的吸油性也随分子质量的增大而逐渐增加。氮溶解指数( n s i ) 是指在控制浸出条件下，溶解在水中的氮占总氮的百分率，它是一种反映蛋白质水溶性大小的物理量，是蛋白质的重要功能特性之一。改性后胶原蛋白水解物的氮溶解指数降低( 见表3 4 ) 。铬革屑中提取的胶原蚩白水解物的化学改性研究3 3 碳化二亚胺的改性碳化二亚胺( 结构见图3 - 7 ) 是一种化学性质极为活泼的交联剂，它可以介导蛋白质的羧基与氨基结合形成酰氨键，并使产物中羧基和氨基的数量减少。因此，利用碳化二亚胺对胶原蛋白水解物改性，可不引入外源性物质，且能提供有效交联。通常，碳化二亚胺先与羧基( 需处于质子化状态) 反应生成不稳定的中间产物o 异酰脲，此中间产物在没有亲核试剂的存在下，通过环状电子取代重排形成稳定的n 一酰脲，此时没有交联反应发生；而在有伯胺( 可来自于蛋白质分子) 作为亲核试剂时，o 一异酰脲将被亲核试剂进攻，在胺和酸之间形成酰氨键，从而产生交联。反应机理如图3 8 所示。h c ii +。h 3 。h r n 2 。2 卜c h 2 c h 2 c h 2 - - ；q c h 3c h 3图3 7 碳化二亚胺的化学结构旷此h 一竽奄、n v r i矿n 群n “薹卜r ，k 州避+ 凡一r ，o 、n i r 2 t y 一氨加含物脲副产物h3 3 1 分子量、乳化性和乳化稳定性单因素试验改性胶原蛋白水解物的乳化性与乳化稳定性受颗粒大小、溶液p h 值、温度、蛋白分子量等影响。本文选择了四个主要因素( 碳化二亚胺用量、p h 值、反应时间、温度) 作单因素实验，研究其对改性前后胶原水解物分子量、乳化性和乳化稳定性的影响。3 3 1 1 碳化二亚胺用量的影响碳化二亚胺用量是指碳化二亚胺质量与胶原蛋白水解物质量之比( g 1 0 0 9 ) 。在p h值7 o o ，反应温度2 5 0 c ，反应时间2 o h 的条件下，碳化二亚胺用量对胶原蛋白水解物乳化性、乳化稳定性和分子量的影响见图3 9 a 、3 9 b 和3