第五章微生物酶的工业提取.ppt

,第五章微生物酶的工业提取,酶分离纯化的基本原则,1.防止酶变性失效（1）一般在低温下进行（2）控制pH不要过酸、过碱（3）尽量减少泡沫（4）防止重金属、有机溶剂引起酶变性，防止微生物污染和蛋白酶水解。2.选择有效的纯化方式（1）在不破坏待纯化酶的限度内，使用各种“激烈”手段。（2）使用亲和剂进行纯化。3.酶活性测定贯穿纯化过程始终。,微生物酶制剂工业提取的一般步骤胞内酶：分离收集菌体破碎抽提胞外酶：深层培养液或固体培养的抽提液离心或过滤去杂浓缩沉淀分离（盐析、有机溶剂沉淀等）干燥加工不同剂型产品,第一节酶抽提液的制备,一、胞内酶的抽提液二、深层培养液（或抽提液）的过滤三、酶抽提液的去杂,一、胞内酶的抽提液,（一）胞内酶在细胞内分部概况（二）细胞破壁方法（三）破碎检查,（一）胞内酶在细胞内分部概况,1.在细胞壁内，游离在细胞浆里与外围细胞浆里。2.牢固结合在细胞器或细胞膜上。,（二）细胞破壁方法,1.机械法2.物理法3.化学法4.酶解法,1.机械法,通过机械切力的作用使细胞组织破碎的方法。如：高压匀浆器的挤压冲击。,2.物理法,通过物理作用使细胞组织破碎的方法（1）反复冻融法（2）冷热交替法（3）超声波振荡法,3.化学法,（1）丙酮干燥法（2）表面活性剂处理,4.酶解法,（1）自溶法（2）溶菌酶法,（三）破碎检查,1.直接测细胞破碎2.测释放出的蛋白的量3.测酶活力,二、深层培养液（或抽提液）的过滤,（一）添加絮凝剂（二）添加凝固剂（沉淀剂）（三）添加助滤剂（四）提高温度处理,（一）添加絮凝剂,1.为何进行絮凝处理2.絮凝作用原理3.常用絮凝剂,1.为何进行絮凝处理,酶的发酵液是一种胶体溶液，固液分离比较困难，原因是：（1）细菌细胞微小（2）细胞表面带有负电荷（3）-COOH、-NH2、-OH等各种基团形成水化层,2.絮凝作用原理,絮凝剂中和了悬浮粒子表面的电荷，与胶体粒子表面基团之间形成架桥絮凝。,3.常用絮凝剂,（1）无机絮凝剂（2）有机絮凝剂,三、酶抽提液的去杂,（一）阳离子沉降除杂（二）表面活性剂沉淀除杂（三）无机盐凝胶沉淀除杂,四、酶抽提液的浓缩,（一）真空低温蒸发浓缩（二）超过滤浓缩,第二节酶的沉淀方法之一：盐析法,酶（蛋白质）的沉淀：添加某些试剂或者改变某些环境条件，致使酶（蛋白质）离开溶液，形成不溶性颗粒的过程。盐析：蛋白质在高浓度的中性盐溶液中沉淀析出。,一、盐析的基本原理二、盐析剂中性盐的选择三、盐析剂用量的确定四、分部盐析法,一、盐析的基本原理,1.酶蛋白溶液是稳定的亲水胶体2.盐析的基本原理3.盐析过程,二、盐析剂中性盐的选择,盐析常用的中性盐：硫酸铵最常用。原因：（一）溶解度大（二）温度系数小（三）盐析效果好（四）来源容易，价格便宜,三、盐析剂用量的确定,例：以硫酸铵盐析糖化酶,糖化酶的盐析曲线,四、分部盐析法,1.分部盐析法2.盐析曲线3.两种酶的分离,第三节酶的沉淀方法之二：有机溶剂沉淀法,有机溶剂沉淀蛋白质的原因：1.有机溶剂加入酶溶液会使溶液的介电常数降低2.有机溶剂加入酶溶液可能会破坏酶或蛋白质中的某些键，导致疏水基团外露，形成疏水层。,一、有机溶剂的选择二、有机溶剂用量的确定三、温度对有机溶剂沉淀酶的影响(一)温度低沉淀完全(二)温度升高，已沉淀的蛋白质可能复溶(三)温度降低，原先溶解的蛋白沉淀，影响酶纯度(四)有机溶剂与水混合会放出大量的热，使酶液温度升高,四、实例,有机溶剂沉淀法制取食品级-淀粉酶,工艺流程说明：1.发酵液预处理2.压滤3.浓缩4.沉淀5.压滤6.干燥,第四节液体浓缩酶和酶的干燥,一、液体酶制剂的制备二、酶的干燥,一、液体酶制剂的制备,（一）液体酶的制造：发酵液经过滤除杂浓缩后，添加防腐剂和稳定剂成品（二）液体酶的保存1.添加防腐剂2.添加稳定剂,二、酶的干燥,