（分析化学专业论文）化学发光及其与毛细管电泳联用技术的应用研究.pdf

摘要 化学发光( c u 是化学反应的反应物或生成物吸收了反应释放的化学能，电 子由基态跃迁至激发态，再由激发态返回基态时所产生的光辐射，它不需要 任何光源，避免了杂散光的干扰，因此具有极高的灵敏度。由于仅使用较为 简单的仪器设备，这一方法得到了迅速发展。目前，化学发光分析成为一个 非常活跃的研究领域，已成功地用于生产过程的控制、遥测技术、环境污染 自动检测网络系统的建立、生物医学及临床化学中各种无机和有机化合物的 分析、药物分析和免疫分析等。其最新发展主要是在原有的发光试剂及体系 的基础上，建立新的发光体系。与其它技术如流动注射( f i a ) 、毛细管电泳( c e ) 、 高效液相色谱饵p l 秭等的联用，拓宽了化学发光的应用范围。 毛细管电泳( c e ) 是以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型 分离分析技术，在2 0 世纪8 0 年代中后期得到迅速发展。毛细管电泳实际包 含电泳、色谱及其交叉内容，被誉为继气相色谱和液相色谱之后分离科学的 第三次重大变革，使分析科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞， 乃至单分子分析成为可能。最富特色的应用研究有蛋白质分离、糖分析、d n a 测序、手性分离、单细胞分析以及用于分子动力学及疾病早期诊断等，此外 金属离子及小分子有机化合物的毛细管电泳分析也备受关注。毛细管电泳中 窄径毛细管的使用，使c e 具有很低的质量检出限和仅需要很少的样品体积等 优点，但同时窄的内径也给检测带来了困难，使其浓度灵敏度很低。最近， 灵敏度的限制已成为毛细管电泳发展的一大障碍，改善检测灵敏度也已成为 毛细管电泳一个十分重要的研究领域。 高灵敏度的化学发光检测手段与高选择性的毛细管电泳结合于一体，成 为一种理想的分离分析方法，两种方法能取长补短，充分发挥各自优势，非 常适合复杂中草药有效成分的分析。可以说，毛细管电泳化学发光法的联用 技术为现代痕量分析带来勃勃生机，开辟了高灵敏分析中草药中多羟基酚类 化合物的新途径。 本论文首先对已建立的发光体系灵敏度的改善和新建立的化学发光体系 进行了深入系统的研究，建立了流动注射化学发光法测定入体体液和动物血 液中的一些成分以及四环素类药物的方法。其次，为了改善化学发光较差的 选择性和毛细管电泳较低的灵敏度，将两种技术联用，运用自组装的改进后 的毛细管电泳化学发光分析仪，用于分析中草药中有效成分多羟基酚类化合 物。由于毛细管很容易再生，毛细管电泳化学发光法成为分析复杂样品的一 种理想方法。 一、流动注射化学发光 1 研究发现，阳离子表面活性剂c t m a b 对鲁米诺铁氰化钾亚铁氰化 钾体系分析尿酸的含量有很强的增敏作用，并且尿酸的形态对发光强度也有 很大的影响。基于此，采用流动注射技术，建立了测定人体体液中尿酸含量 的方法。该方法的线性范围和检出限分别是7 0 x 1 0 9 - 9 0 x 1 0 1 7 m o l l ，2 5 8 x i 0 1 0 m o l l ，与文献报道的其它方法相比，检出限降低约两个数量级。并详细讨论 了c t m a b 对该体系增敏及尿酸的形态对发光强度影响的机理。 2 氯化血红素的光稳定性较差，利用h 2 0 2 - n a 2 c 0 3 - n a o h 介质，首次使 用流动注射- 化学发光技术，对氯化血红素在强自然光、弱自然光及紫外光作 用下分解情况进行了研究，分析了光解反应的动力学规律，结果发现氯化血 红素在不同光作用下的分解反应速度不同，但其光解行为符合一级反应方程。 优化反应条件后，测定了药物和动物血液中氯化血红素的含量，线性范围为 2 2 0 x 1 0 1 0 - 6 8 8 x 1 0 m o l l ，检出限( 3 们为2 2 1 0 d l m o y l 。对1 7 2 x l 旷m o t l 的氯化血红素测定1 0 次的相对标准偏差为2 8 2 。此法直接用于药物及动物 血液中氯化血红素含量的分析，回收率在9 6 - 1 0 8 之间。 3 碱性条件下，罗丹明b 与过氧化氢反应产生微弱化学发光信号，氯化 血红素作为一种过载化物酶，大大增强了其化学发光强度。当加入处于临界 胶束浓度的阴离子表面活性剂s d s 后，其发光强度又增大了4 倍多。同时对 加入s d s 和不加入s d s 的氯化血红素样品在紫外光下的光解行为进行研究， 发现两种情况下，氯化血红素的分解行为均符合一级动力学方程。但是，加 入s d s 后，由于其形成的胶束相的增稳作用，氯化血红素的光解速度降低了 1 8 倍。该方法用于铡定了药片及动物血液中氯化血红素的含量。 4 对于四环素类药物的化学发光分析报道的方法中，有的方法反应比较复 杂，有的方法使用的试剂比较昂贵、不稳定或者有毒性。本研究首次使用间 接发光法，以铜离子为探针，利用四环素类药物与铜离子形成络合物后，减 弱了铜离子对鲁米诺过氧化氢体系的催化作用机理，分析了药物及其人体尿 液中四环素、土霉素和金霉素的含量。方法的线性范围分别是四环素 3 6 1 0 。8 _ 1 0 1 0 一，土霉素1 1 1 0 - 7 一1 o x l 0 一，金霉素1 9 1 0 7 1 o 1 0 一m o l l 。 药物中的赋形剂和尿液中的共存物不干扰测定，方法的回收率为9 5 1 0 5 。 二、毛细管电泳化学发光 1 运用改进后的毛细管电泳化学发光仪，以鲁米诺为电泳电解质的一个 组成部分及以铁氰化钾作为唯一柱后液的新型混合模式进行丹参的主要成分 原儿茶醛和原儿茶酸的毛细管电泳化学发光法研究，结果发现原儿茶醛和原 儿茶酸能增强体系的发光强度，且发光强度与其浓度在一定范围内成正比。 详细研究了影响分离和检测的参数，在最佳条件下，6 分钟内基线分离了原儿 茶醛和原儿茶酸。方法的检出限分别为7 0 x 1 0 _ 8m o l l l 和5 0 x 1 0 一m o l l 。利 用此方法，分析了丹参片剂和注射液中原儿茶醛和原儿茶酸的含量。对二者 增强鲁米诺铁氰化钾体系发光强度的机理进行了详细讨论。 2 芦丁和绿原酸均为生理学上重要的多羟基酚类化合物，也是烟草中的 重要成分。本工作将毛细管区带电泳分离化学发光检测应用于芦丁与绿原酸 的分析。c l 检测基于芦丁或绿原酸对鲁米诺铁氰化钾发光体系的增敏作用。 仔细研究了分离与检测的各种参数后，将此方法用于香烟丝和药物制剂中芦 丁与绿原酸含量的测定，回收率在9 7 1 0 5 之间。 3 利用s d s 作为有机添加剂，首次报道了应用c e c l 技术分析芦丁、原 儿茶醛、绿原酸、木犀草素和原儿茶酸5 种药物有效成分。实验表明，不加入 s d s 时，5 种分析物不能得到完全分离；s d s 加入后，5 种分析物在1 0 分钟内得 到完全基线分离，且峰形尖锐对称。分析物峰高的r s d 不太于2 6 ，迁移时 间的r s d 不大于0 5 。将建立的方法应用于实际样品的测定，回收率在 9 5 1 0 5 之间。该方法具有分离效果好、检测灵敏度高等特点，为复杂中草药 中有机小分子的分析开辟了新的途径。 4 基于在碱性介质中葡萄糖苷和黄芩苷对鲁米诺一铁氰化钾化学发光体 系的抑制作用，建立了一种毛细管区带电泳分离在线间接化学发光法检测中 药有效成分葡萄糖苷和黄芩苷的方法。电泳缓冲液为8 0m m o l l 硼砂( p h = 8 5 ) ，o 3 0m m o l l 鲁米诺作为其中的组分。化学发光试齐l 由0 1 2 5m m o l 盈 k 3 f e ( c n ) 6 和o 0 5m o l l 的n a o h 组成。葡萄糖苷和黄芩苷在5 分钟内得到基线 分离。方法的检出限分别为6 0f m o l 和2 4f m o l 。该方法用于双黄连口服液中黄 芩瞢的测定，回收率为1 0 3 3 。 5 溶液中单分子检测涉及到化学、生物、医学、材料等多个学科领域， 对其进行研究具有十分重要的意义，目前对有机小分子的分子级检测尚未见 报道。我们研究了小分子有机化合物棉酚的化学发光性能，借助毛细管电泳 技术检测了超稀溶液中超痕量的棉酚分子。 关键词：化学发光、毛细管电泳化学发光、尿酸、氯化血红素、四环素、多 羟基酚 a b s t r a c t c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) i sd e f i n e d a st h ee m i s s i o no f l i g h t f r o ma n e l e c t r o n i c a l l ye x c i t e ds t a t es p e c i e sw h i c hi sp r o d u c e dd u r i n gt h ec o u r s eo fa c h e m i c a lr e a c t i o n ，a n di so b s e r v e dw h e nt h ee l e c t r o n i c a l l ye x c i t e dp r o d u c to r i n t e r m e d i a t ef o r m e dd e c a y st ot h eg r o u n ds t a t ew i t hap h o t o ne m i t t e d t h e r ea r e m a n ym e r i t so nc ls u c h a ss i m p l ec h e a po p t i c a ls y s t e m sr e q u i r i n gn ol i g h ts o u r c e s w h i c ha v o i d i n gt h ee f f e c t so fs t r a yl i g h ta n dt h ei n s t a b i l i t yo fl i g h ts o u r c e ，a n d t h u sp r o v i d i n gl o wb a c k g r o u n dw i t l le x c e l l e n ts e n s i t i v i t y , w i d el i n e a rr a n g e r a p i d i t y , s i m p l i c i t ya n ds oo n b u ti t sw e a k n e s si st h o u g h t t ob ei t sp o o rs e l e c t i v i t y u pt on o w , t h ec la n a l y s i sh a sb e e nw i d e l ya p p l i e di nc l i n i c a l ，b i o l o g i c a la n d e n v i r o n m e n t a lf i e l d sa n di sb e c o m i n go n eo ft h em o s tp o w e r f u lt e c h n i q u e sf o ru s e i na n a l y t i c a lc h e m i s t r y t h ep r e d o m i n a n td e v e l o p m e n to fc la n a l y s i sn o w a d a y si s f o c u s e do nt h ed e v e l o p m e n to fn e wc ls y s t e m ，t h ec o m b i n a t i o nw i t ho t h e r t e c h n i q u e ss u c h a sf l o wi n j e c t i o n ( f i ) ，c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) ，h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n d s oo nw h i l et h eu s e so f e s t a b l i s h e dc lr e a c t i o ns y s t e m ss t i l la t t r a c tm u c hi n t e r e s t c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i se m e r g e di nt h ee a r l y 19 8 0 sa sah i g h l ye f f i c i e n t m e a u so fs e p a r a t i o n ，w h i c hi sp e r f o r m e di nc a p i l l a r yt u b ea n dd r i v e nb ye l e c t r i c f i e l d i tb r i n g sa p r o f o u n dr e v o l u t i o nf o l l o w i n gt h es e p a r a t i o n so fg ca n dh p l c a n dd e v e l o p st h ea n a l y s i st e c h n o l o g yf r o mal e v e lo fm i c r o l i t r et on a n o l i t r e a n d c e - c lh a sm a d ei tp o s s i b l et oa n a l y z eas i n g l ec e l la n ds i n g l em o l e c u l e t h em o s t i n t e r e s t i n ga c h i e v e m e n t sf o c u so nt h es e p a r a t i o no fp r o t e i n ，s a e c h a r i d e ，c h i r a l c o m p o u n d sa n dt h ed n as e q u e n c i n g ，a sw e i la ss i n g l ec e l la n ds i n g l em o l e c u l e d e t e c t i o n y e tc eh a sp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nm a n yr e s e a r c ha r e a s ，s u c ha s m o l e c u l a rk i n e t i c sa n de a r l yd i s e a s e sd i a g n o s i s m u c ha t t e n t i o nh a sb e e ng i v e nt o t h ea n a l y s i so fm e t a li o n sa n ds m a l lo r g a n i cs p e c i e ss i n c e19 9 0 s n l er e l a t i v e l y s h o r ts e p a r a t i o nt i m e s ，s i m p l ei n s t r u m e n t a t i o na n dl o wo p e r a t i o n a lc o s t sm a k ec e a na t t r a c t i v ea l t e r n a t i v e n e v e r t h e l e s s ，t h es m a l lv o l u m e sm a n i p u l a t e di nc a p i l l a r y d i m e n s i o n sp o s ear e a lc h a l l e n g ef o rd e t e c t o r si na c h i e v i n gs e n s i t i v i t y t h e p r o b l e mh a sc r e a t e dad e m a n df o ran e wf o 珊o fd e t e c t i o n w h i c hw o u l db e r e l a t i v e l ys i m p l e ，w i d e l ya p p l i c a b l e ，g o o ds e n s i t i v e ，a n dp r o v i d i n gq u a n t i t a t i o n c o m b i n i n gc ew i t l lc li san e wa p p r o a c hw i t ht h eh i g hs e n s i t i v i t ya n dh i g h s e l e c t i v i t yf o ra n a l y z i n gt h e s m a l lo r g a n i cm o l e c u l e si nc o m p l e xc h i n e s eh e r b a l m e d i c i n e sa n dh a sb e c o m et h em o s tp o w e r f u lt e c h n i q u ei na n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h et h e s i s ，t h es e n s i t i v i t ya n dt h es e l e c t i v i t yo fo l dc ls y s t e mw a si m p r o v e d a n dt h en e wc ls y s t e mw a sd i s c o v e r e d ，a n dt h ec o r r e s p o n d i n gc o m p o u n d sw e r e d e t e r m i n e dw i t hf l o wi n j e c t i o nc lm e t h o d a l s o ，d u et oc l ss i m p l eo p t i c a l s y s t e ma n dl o wb a c k g r o u n dn a t u r e ，c lh a sb e c o m ea ni d e a ld e t e c t i o nm e t h o df o r c e c e - c lt e c h n i q u eh a sr e c e i v e ds i g n i f i c a n ta t t e n t i o no v e rt h ep a s ts e v e r a ly e a r s i nt h i sw o r k ，t h en e wa p p r o a c h e sf o rd e t e c t i o no fs o m ep o l y p h e n o l si nc h i n e s e h e r b sw e r ee x p l o i t e d b e c a u s et h ec a p i l l a r yc a l lb ee a s i l yr e g e n e r a t e d ，c ei si d e a l f o ra n a l y z i n g d i r t y ”s a m p l e s t h er e s e a r c hr e s u l t so b t a i n e di nt h et h e s i sa r el i s t e d a sf o l l o w s ： 1 i n v e s t i g a t i o nn e w c l s y s t e ma n di m p r o v e m e n to l ds e n s i t i v i t yo f c l s y s t e mc o m b i n e dw i t hf l o wi n j e c t i o nt e c h n i q u e f l o wi n j e c t i o na n a l y s i s ( f i a ) i sn o ww e l le s t a b l i s h e da sap o w e r f u ls a m p l e h a n d l i n gm e t h o df o ra n a l y s i si nl a b o r a t o r y , w h i c hi sc o m p a t i b l ew i t haw i d er a n g e o fd e t e c t i o ns y s t e m s i ni t sm o s tb a s i cf o r m ，i ti sac o n v e n i e n tm e a n so fd e l i v e r i n g s a m p l e st od e t e c t o ri nac o n t r o l l e da n dr e p r o d u c i b l em a n n e r t h ec o m b i n a t i o no f f i aw i t hc ld e t e c t i o ni sb e c o m i n gi n c r e a s i n g l yi m p o r t a n ti nv a r i o u sf i e l d s b e c a u s eo fh i g hs e n s i t i v i t y , w i d el i n e a rd y n a m i cr a n g e ，r e p r o d u c i b i l i t y , s i m p l i c i t y a n dr a p i d i t y 1 1 c t m a be n h a n c e dc ld e t e r m i n a t i o uo fu r i ca c i du s i n gl u m i n o l k 3 f e ( c n ) 6 一k 4 f e ( c n ) 6s y s t e m ac lm e t h o du s i n gf 1w a sd e y e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fu r i ca c i db a s e d o nt h ee n h a n c e m e n tc li n t e n s i t yo fl u m i n o l k 3 f e ( c n ) 6 k 4 f e ( c n ) 6i nt h e p r e s e n c eo fc t m a ba n dt h eu r i ca c i ds p e c i e s 。t h el i n e a rr a n g ew a s7 0 1 0 1 0 - 9 o x l o 7 m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i t ( 3 a ) o f2 5 8 1 0 - 1 0 m o v l ，w h i c hw a sa b o u t t w oo r d e r so fm a g n i t u d el o w e rt h a nt h a tr e p o r t e di nl i t e r a t u r e s t h ep r o p o s e d m e t h o dw a su s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fu r i ca c i di nr e a ls a m p l e s a n dt h e p o s s i b l em e c h a n i s mi sp r o p o s e d 1 2 i n v e s t i g a t i o no ft h ep h o t o d e e o m p o s i t i o no fh e m i na n dt r a c ea m o u n t d e t e r m i n a t i o no fh e m i nw i t hf i - c lm e t h o d u s i n gh 2 0 2 - n a 2 c 0 3 一n a o hs y s t e m ，t h es t u d y o nt h e p h o t o d e c o m p o s i t i o n b e h a v i o ro fh e m i nu n d e ru l t r a v i o l e tl i g h ta n ds o l a rl i g h tw e r ec a r r i e do u ta n dt h e d e t e r m i n a t i o no fh e m i nw a sd e v e l o p e dc o u p l e dw i t h s i m p l ef l o wi n j e c t i o n t e c h n i q u e t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e d e c o m p o s i t i o nr e a c t i o no fh e r o i ni n d i f f e r e n tl i g h ti r r a d i a t i o n sc o r r e s p o n d e dw i t haf i r s t o r d e rr e a c t i o n a n dt h e nt h e d e t e r m i n a t i o no fh e m i nw a sc o m p l e t e db yt h ec le m i s s i o nf r o mt h er e a c t i o no f h e r o i nw i t hh 2 0 2i n a q u e o u sc a r b o n a t e t h el i n e a rr a n g ew a s2 2 0 x 1 0 。1 0t o 6 8 8 1 0 7m o l la n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s2 2 1 0 1 1m o l lf 3 0 ) t h er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w a s2 8 2 f o rt e ni n d e p e n d e n td e t e c t i o n so f1 7 2 x 1 0 “ m o l lh e r o i n t h ep r o p o s e dm e t h o dw a ss u c c e s s f u l l ya p p l i e df o rt h ea n a l y s i so f h e r o i ni np h a r m a c e u t i c a lf o r m u l a t i o n sa n da n i m a lb l o o dw i t har e c o v e r yo f 9 6 1 0 8 ap o s s i b l ec lm e c h a n i s mo f t h ep r e s e n ts y s t e mw a sd i s c u s s e d ，a n df r e e r a d i c a l sw e r es u g g e s t e dt ob ei n v o l v e di nt h i sr e a c t i o n 1 3 。p h o t o l y t i ek i n e t i c ss t u d ya n dd e t e r m i n a t i o no fh e m i nb yf i - c l af i - c lm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e da n da p p l i e dt ot h es t u d yo ft h ep h o t o l y t i c k i n e t i c so f h e r o i na n dt h ed e t e r m i n a t i o no f h e m i n t h ep r o p o s e dm e t h o dw a sb a s e d o nt h el u m i n e s c e n tp r o p e r t i e so fh 2 0 2 一r h b - n a o hs y s t e ma n dt h ea d d i t i o no fs d s a sp h o t o s t a b i l i t y s t a b i l i z e ra n de m i s s i o n s e n s i t i z e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e d e c o m p o s i t i o nr e a c t i o no fh e r o i ni n 也ep r e s e n c ea n da b s e n c eo fs d su n d e r u l t r a v i o l e tl i g h tc o r r e s p o n d e dw i t l laf i r s t o r d e rr e a c t i o n h o w e v e r ，t h ep r e s e n c eo f s d si nt h es y s t e md e c r e a s e dt h ep h o t o l y t i cr a t eo fh e r o i n1 8t i m e st h a nt h a to fi n t h ea b s e n c eo fs d s a n dt h e nt h eh e m i nw a sd e t e r m i n e di nr e a ls a m p l e s a p o s s i b l ec lm e c h a n i s mo ft h ep r e s e n ts y s t e mw a sd i s c u s s e d ，a n df r e er a d i c a l s w e r es u g g e s t e dt ob ei n v o l v e di nt h i sr e a c t i o n 1 4 d e t e r m i n a t i o no ft e t r a c y c l i n e ，e h l o r t e t r a c y e l i n ea n do x y t e t r a c y c l i n eb y f l o w - i n j e c t i o nw i t hi n h i b i t o r yc ld e t e c t i o nu s i n gc o p p e r ( i i ) a sap r o b ei o n t h i sw o r kr e p o r t e da ni n d i r e c tf im e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h e t e t r a e y c l i n e s ( t c s ) d r u g st e t r a c y c l i n e ( t c ) ，c h l o r t e t r a c y c l i n e ( c t c ) a n d o x y t e t r a c y c l i n e ( o t c ) u s i n gc u ( i i ) a sap r o b ei o n t h ec lr e a c t i o nw a si n d u c e d o n l i n ea n di n j e c t i o no ft h es a m p l ep r o d u c e dn e g a t i v ep e a k sa sar e s u l to ft h e c u ( i i ) c o m p l e x a t i o nb yt h ea n a l y t e s ，c a u s i n gt h ed e c r e a s e dc li n t e n s i t yo ft h e c u ( i i ) - c a t a l y s e dr e a c t i o nb e t w e e nl u m i n o la n dh 2 0 2 t h eh e i g h t so ft h ep e a k s w e r e p r o p o r t i o n a l t ot h e d r u g c o n c e n t r a t i o n s t h el i n e a r r a n g e w a s 3 6 x 1 0 - 8 _ 1 0 1 0 一，1 1x 1 0 - 7 _ 1 0 x 1 0 a n d1 9 x 1 0 - 71 0 x 1 0 m o l lf o rt c ，c t c a n do t c ，r e s p e c t i v e l y t h em e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no ft c si n p h a r m a c e u t i c a lf o r m u l a t i o n sa n dh u m a nu r i n e w i t hr e c o v e r i e si nt h er a n g e 9 5 - 1 0 5 as i m p l ed e t e c t i o nm e c h a n i s mw a sp r o p o s e d 2 s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v eo n - l i n ec ld e t e c t i o ni nc ef o r t h e p o l y p h e n o l si nc h i n e s eh e r b s 2 1 o n - l i n ec ld e t e r m i n a t i o np r o t o c a t e c h u i ea l d e h y d ea n dp r o t o e a t e e h u i c a c i di np h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n sb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c ew i t ho n l i n ed i r e c tc ld e t e c t i o nw a sf i r s tu s e di nd e t e c t i n gp r o t o c a t e c h u i c a l d e h y d e ( p a h ) a n dp r o t o c a t e c h u i ca c i d ( p a ) i nt h e i rp h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n s i tw a sf o u n dt h a tt h ew e a kc lp r o d u c e df r o mt h er e a c t i o no f l u m i n o l w i t h f e r r i c y a n i d ei na na l k a l i n es o l u t i o nw a ss t r o n g l yi n c r e a s e db yp a ha n dp aw h i c h w a ss e p a r a t e db yc e p a r a m e t e r sa f f e c t i n gs e p a r a t i o np r o c e s sa n dc ld e t e c t i o n h a v eb e e ne x a m i n e di nd e t a i l u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h eb a s e l i n e s e p a r a t i o no fp a ha n dp aw a so b t a i n e dw i t h i n6m i n t h er s df o rt h ea n a l y s i so f p a ha n dp aw a sl e s st h a n1 1 f o rt h em i g r a t i o nt i m ea n d1 6 f o rt h ep e a k h e i g h t t h ed e t e c t i o nl i m i t so fp a ha n dp aw e r e7 0 x l o 。8m o l la n d5 o x l o 8 m o t l ，r e s p e c t i v e l y t h ep r o p o s e dm e t h o dh a sb e e ns a t i s f a c t o r i l ya p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no fp a ha n dp ai ns a l v i am i l t i o r r h i z ap h a r m a c e u t i c a lp r e p a r a t i o n s t h ec lr e a c t i o nm e c h a n i s mw a sd i s c u s s e d 2 2 o n - l i n ee n h a n c e dc ld e t e c t i o no fr u t i na n dc h l o r o g e n i ca c i db yc a p i l l a r y z o n ee l e c t r o p h o r e s i s ac ew i t he n h a n c e dc lm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h es i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no fr u t i na n dc h l o r o g e n i ca c i d t h ee l e c t r o p h o r e t i cb u f f e r ( p h8 5 1 c o n t a i n i n g8 0m m o l lb o r a t ea n d0 2 8m m o y ll u m i n o lw a su s e di ns e p a r a t i n gt h e a n a l y t e sa n dt h ep o s t c o l u m nc lr e a g e n tw a s0 1 2 5m o l lk 3 f e ( c n ) 6i n0 0 5 m o l ln a 0 h t h ee f f e c t so fo t h e rf a c t o r ss u c ha st h ea c i d i t yo fr u n n i n gb u f f e r t h e a p p l i e d v o l t a g ea n dt h ei n j e c t i o nt i m ew e r ei n v e s t i g a t e d t of i n dt h eo p t i m u m c o n d i t i o n s t h eb a s e l i n es e p a r a t i o nw a sc o m p l e t e dw i t h i n5m i n t h ed e t e c t i o n l i m i t s ( 3 0 ) o fr u t i na n dc h l o r o g e n i ca c i dw e r eo 3 3g m o l l ( 5 0 6f m 0 1 ) a n d0 1 5 g m o l l ( 1 2 6f r n 0 1 ) ，r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw a s2o r d e r so f m a g n i t u d el o w e rt h a nt h a t o fc e - i n h i b i t e dc lm e t h o d t h em e t h o dw a sa p p l i e dt ot h ea n a l y s i so fr u t i na n d c h l o r o g e n i ca c i di nc i g