（茶学专业论文）水溶性绿茶多糖的系统分级纯化及其免疫活性与清除羟自由基活性的研究.pdf

摘要多糖因具有多种生物活性越来越引起人们的重视，为了筛选出高免疫活性和高清除羟自由基活性的多糖组分，将炒青绿茶经水提取后，茶汤用0 2i im 孔径的膜过滤，滤液依次经过1 5 0 k d 、2 0 k d 、6 k d 的膜组件进行分级和浓缩。得至l j l 5 0 k d 、2 0 k d 、6 k d 三部分的截留液。同时对茶渣进行碱提处理，以比较水提绿茶多糖与碱提绿茶多糖的各分级组分理化性质及免疫活性等方面的差异。分别将1 5 0 k d 、2 0 k d 、6 k d _ 三部分的截留液和碱提多糖依次经过d e a e 一5 2 纤维素离子交换层析和丙烯葡聚糖凝胶s e p h a c r y ls - 3 0 0 柱层析系统分离、纯化，h p g p c e l s d 鉴定各多糖组分的纯度及分子量分布，并测定了各分级组分对小鼠巨噬细胞系r a w 2 6 4 7 检测免疫活性的影响以及清除羟自由基的活性。结果表明，茶汤中5 0 以上的干物质能够透过2 0 k d 的膜，对于多糖来说，则以2 0 k d 膜截留液中含量最高，其占干物质的比重可达n 3 6 8 6 ，1 5 0 k d 膜和6 k d 膜截留部分中多糖含量分别为2 7 1 3 和2 1 1 6 ，而透过6 k d 膜部分中占干物的含量则仅为1 0 9 ，由此可见，膜分离处理对于茶多糖的分离纯化效果明显。水溶性绿茶多糖经过系统分级后共得到了2 0 多个分级组分；h p g p c - e l s d 鉴定各多糖组分的纯度及分子量分布，结果表明得到7 个均一水提多糖组分和两个碱提多糖组分：用小鼠巨噬细胞系r a w 2 6 4 7 检测免疫活性，发现对小鼠巨噬细胞r a w 2 6 4 7 有显著活性的多糖组分大多集中在2 0 k d 左右，有较强清除羟自由基的多糖组分大多集中在6 k d 左右，部分为2 0 k d 左右的多糖，且大多为不均一多糖，而碱提多糖的免疫活性相对较低。关键词茶多糖，超滤，分级纯化，免疫活性，羟自由基活性a b s t r a c tb e c a u s e so fv a r i o u sk i n d so fb i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，m o r ea t t e c t i o nw a sp a i dt ot h ep o l y s a c c h a r i d e t os c r e e np o l y s a c c h a r i d ec o m p o n e n t sw i t hh i g ha c t i v i t yo fi m m u n i t ya n ds c a v e n g i n gb i o a b i l i t yo fh y d r o x yf r e er a d i c a l ，w a t e r - s o l u b l eg r e e nt e ap o l y s a c c h a r i d e sw e r es e p a r a t e da n dp u r i f i e db yu l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n e sw i t hp o r ed i a m e t e ro f15 0 k d ，2 0 k d ，6 k di nt u r n s t h r e ep a r t so ft r a p p e df l u i d sw i t hm o l e c u l ew e i g h t so f15 0 k d ，2 0 k d ，6 k dw e r eo b t a i n e d m e a n w h i l et h ea l k a l it e ar e s i d u ew a st r e a t e dt oc o m p a r et h ed i f f e r e n c e so ft h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sa n di m m u n ea c t i v i t yb e t w e e nw a t e r - s o l u b l eg r e e nt e ap o l y s a c c h a r i d ea n da l k a l i s o l u b l eg r e e nt e ap o l y s a c c h a r i d e a l lt h et h r e ef r a c t i o n sa n da l k a l i - s o l u b l eg r e e nt e ap o l y s a c c h a r i d ew e r ef u r t h e rs e p a r a t e da n dp u r i f e db yd e a e - e e i l u l o s ei o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dp r o p y l e n eg l u c o s a ng e l a t i ns e p h a c r y ls 3 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h e i rp u r i t ya n dm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o nw e r ed e t e r m i n e dw i t hh i g hp e r f o r m a n c eg e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( h p g p c ) e q u i p p e dw i t he l s dd e t e c t o r , a n dt h em o u s em a c r o p h a g ec e l ll i n er a w 2 6 4 7i m m u n ed e t e c t i o na n dc l e a r a n c ea c t i v i t yo ft h eh y d r o x y lr a d i c a la c t i v i t yo ft h ec l a s s i f i c a t i o nc o m p o n e n tw e r ed e t e r m i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm o r et h a n5 0p e r c e n to fd r ym a t t e rc o u l dp e r m e a tt h eu l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n ew i t ha o e r t u r eo f2 0 k d ，w h i l et h ec o n t e n to f2 0 k dm e m b r a n et r a p p e df l u i dw a st h eh i g h e s lt h ep r o p o r t i o no fd r ym a t t e rc a nr e a c h3 6 8 6 t h ec o n t e n to fw i t h h o l d i n gp a r to ft h ep o l y s a c c h a r i d eo f1 5 0 k dm e m b r a n ea n d6 k dm e m b r a n ew a s2 7 13 a n d21 16 r e s p e c t i v e l y , w h i l et h e6 k dm e m b r a n eo ft h es t e mi np a r to ft h ec o n t e n to fo n l y1 0 9 t h u s ，u l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n es e p a r a t i o nt e c h n o l o g yc o u l db eu s e dt os e p a r a t ea n dp u r i f yp o l y s a c c h a r i d ea n do t h e rc o m p o u n d si nt e a a f t e rs y s t e m a t i cg r a d a t i o n , m o r et h a n2 0c o m p o n e n t so fw a t e r - s o l u b l eg r e e nt e ap o l y s a c c h a r i d ea l t o g e t h e rw e r eo b t a i n e d t h e i rp u r i t ya n dm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o nw e r ed e t e r m i n e dw i t hh i g hp e r f o r m a n c eg e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ( h p g p c ) e q u i p p e dw i t he l s dd e t e c t o r , a n d7c o m p o n e n t so fh o m o g e n e o u sw a t e r - s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e sa n dt w oc o m p o n e n t so fh o m o g e n e o u sa l k a l i - s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d e sw e r eo b t a i n e d t h ei m m u n o l o g i c a la c t i v i t i e so ft h e s eg r e e nt e ap o l y s a c c h a r i d e sw e r ed e t e r m i n e db ys t i m u l a t e dp h a g o c y t o s i sa n dn i t r i co x i d ep r o d u c t i o no nr a w 2 6 4 7m a c r o p h a g ec e l ll i n eo fm i c e r e s u l t ss h o w e dt h a tt e ap o l y s a c c h a r i d e sw i t h2 0 k dm wp o s s e s s e ds i g n i f i c a n ti m m u n o l o g i c a la c t i v i t i e so nn op r o d u c t i o no rp h a g o c y t o s i so fm i c em a c r o p h a g er a w2 6 4 7c e l l s ，t h et e ap o l y s a c c h a r i d e sc o m p o n e n tm o s t l yc o n c e n t r a t ea t6 k dm w , t h ep a r tp o l y s a c c h a r i d e sw i t h2 0 k dm wh a dt h es t r o n gs c a v e n g i n ga b i l i t yo fh y d r o x yf r e er a d i c a l b u tt h ei m m u n i t ya c t i v i t yo fa l k a l i s o l u b l ep o l y s a c c h a r i d ew a sr e l a t i v e l yl o w k e yw o r d ：t e ap o l y s a c c h a r i d e ，u l t r a f i l t r a t i o n ，s e p e r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，i m m u n ea c t i v i t y ，a c t i v i t i e so fh y d r o x y lf r e er a d i c a li i英文缩略表英文缩写s o dt p sa t p sg s h p xm d ad p p ht p ch p g p cd n st n fg l pm 9a s tf b sc o n a英文全称中文名称s u p e r o x i d ed i s m u t a s e超氧化物歧化酶t e ap o l y s a c c h a r i d ea l k a l it e ap o l y s a c c h a r i d e茶多糖碱溶性茶多糖g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e谷胱甘肽过氧化物酶(m a l o n d i a l d e h y d e丙二醛l ，1 d i p h e n y l 2 p i c r y l h y d r a z y l二苯三硝基苯肼t e ap o l y s a c c h a r i d ec o m p l e x茶多糖复合物h i g hp e r f o r m a n c eg e lp e r m e a t i o n高效凝胶渗透色谱2 - h y d r o x y 一3 ，5 - d i n i t r o b e n z o i ca c i d3 , 5 二硝基水杨酸t u m o rn e c r o s i sf a c t o r肿瘤坏死因子g a n o d e r m al u c i d u mp o l y s a c c h a r i d e灵芝多糖单核巨噬细胞a s p a r t a t ea m i n o t r a n s f e r a s e天冬氨酸转氨酶f e t a ib o v i n es e r u mc o n c a n a v a l i na胎牛血清刀豆蛋白a独创性：声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的网志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：寇小乡工时问：撂年多月，日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)论文作者签名：寇- 卜窒工时间：沙岳年占月导师签名3 形日时问：) 雳衫) 年乡月r6 日中国农业科学院硕i j 学位论文第一章绪论1 1国内外研究现状第一章绪论糖类是自然界最多的有机化合物，多糖及耱复合物分布广泛，功能多种多样，它们参与了细胞各种生命活动的调节。多糖因具有多种生物活性已越来越引起人们的重视。近2 0 年来，多糖的分离纯化、组成测定和结构分析有了很大的进展，人们发现多耱是生命活动中起中心作用的分子，是一种无细胞毒的免疫促进剂，有望作为防治肿瘤、心血管疾病、糖尿病的药物。从二十世纪9 0 年代初开始，研究主要集中在粗茶多糖的药理作用方面，研究表明茶多糖( t p s ) 具有降血糖、防治糖尿病，还具有降血脂、抗动脉粥样硬化、增加冠状动脉血流量、增强免疫功能、降血压、抗凝血、抗血栓、防治心血管疾病等作用。目前对茶多糖的化学结构、作用机理及构效关系的研究还不深入，有待进一步研究。我国和日本民间均有用粗老茶治疗糖病的传统( 刘强，1 9 9 0 ；安徽农业大学主编。1 9 8 0 ) ：茶叶愈租老治糖尿病的效果愈好( 蔡鸿恩，1 9 8 0 ) ，常饮茶的人高血压、冠心病的患病率较低。近年来有关茶多糖及其药理作用的研究报道逐渐增多，1 9 8 7 年，日本学者清水岑夫研究发现茶叶治疗糖尿病的主要药理成分是茶多糖( 清水岑夫，1 9 8 7 ：汪东风等。1 9 9 5 ) 。目前市场上中低档茶严重滞销，在茶叶加工过程中也有大量的枝叶和灰末等副产品未被利用，若从其中提取茶多搪作为保健食品的功能因子，则可变废为宝，为中低档茶的综合利用开辟一条新途径。1 1 1 茶多糖的提取分离茶叶中具有生物活性茶多糖的提取，一般根据其溶解性及相对分子质量大小，选择合适的提取、分离方法。1 1 1 1 影响茶叶多糖提取率的因素影响茶叶多糖提取率的因素很多，原料的产地、品种、制茶工艺、茶叶的老嫩不同，茶多糖的含量也就不同，因此原料的选择对茶多糖的提取率影响很大( 傅搏强等，2 0 0 1 ；严俊等1 9 9 3 ；汪东风等1 9 8 8 ；1 9 9 5 ：安徽农学院，1 9 8 8 ；清水岑夫，1 9 9 0 ) ；原料的预处理过程中，将茶叶粉碎，可增大与溶媒的接触面积，会提高茶多糖浸出率。加入纤维素酶改善细胞壁的通透性以提高茶多糖的提取率( 谭淑宜等。1 9 9 9 ) 。提取之前，用乙醇浸泡粉碎的茶叶，可以除去茶叶细胞外的脂质层，提高水茶多糖浸出率( 王丁刚等，1 9 9 1 ；黄桂宽等，1 9 9 5 ；肖慧等，1 9 9 3 ) ：浸提的温度不同，茶多糖的浸出率不同，汪东风等( 1 9 9 6 ) 研究证实，茶多塘在热水中溶解性较好，热水浸提得率高于冷水浸提，但是茶多糖热稳定性较差，6 0 以上降解加快。李布青等( 1 9 9 6 ) 研究表明，茶多糖可能为一酸性糖蛋白，故为防止其变性失活，他采用冷水反复浸泡浸提。一般浸出量与浸提时间成正比，但扩散达平衡后，时间即不起作用。增加浸提次数。即增加浓度差能大大提高浸出率，一般2 3 次即可。溶媒不同，则提取成分不同，茶叶复合多糖的得率也就不同。中国农业科学院硕f 二学位论文第一章绪论中国农科院茶叶研究所( 1 9 9 5 ) 的研究表明，总糖含量，酸性乙醇提取法( 4 7 7 ) 水提法( 4 3 1 ) 热碱法( 3 2 8 ) ，前两者相筹4 6 。溶媒的体积越火，提取越彻底，但会增加浓缩的i ：作量、试剂用量和成本，一般吲液比为l ：2 0 l ：3 0 。沉淀刑的选用及其用量不同，不仅茶叶复合多糖的得率不同，而且组成成分也不同。李布青等( 1 9 9 6 ) 证实茶多糖为酸性多糖，利用溴化十人烷基三甲基铵( c t a b ) 可与酸性多糖蜩离产形成不溶性络合物，他们将提取液先用c t a b 二次沉淀，2 0 n a c l溶解后，离心，上清液再2 倍体积的丙酮沉淀，所得茶多糖中总糖含量5 1 2 ，降血糖效果最佳，而仅用3 倍体积9 5 乙醇沉淀所得茶多糖中总糖含量为2 1 1 ，血糖降低值偏低。1 1 1 2 粗茶多糖的提取分离工艺流程从茶叶中提取茶多糖主要可分为单独提取法和综合提取法，而膜法分离技术是一种新型分离提取手段，迄今为止活性多糖的提纯运用已较为成熟，但关于茶叶方面的报导却较少。由于膜法提纯本身是纯物理性的分离，在压力驱动下常温进行，特别适合于像茶叶活性多糖之类对热敏感的物质，分离过程中不发生相的变化，被分离物质不会有热学性、化学性或生物性的变化，能较好地保持茶多糖生理活性，同时不带入化学物质，操作简便、能耗低、无废水污染。将超滤膜用于多糖这种生物活性物质的分离，由于具有不损害活性、分离效率高、可连续生产等优点，因此近年来越来越受到茶业界人士的关注，成为茶多糖研究的热点。若提取茶多糖只是用于丸片、胶囊的原料，则提取的茶叶复合多糖可不必除蛋白、脱色，仅用粗制品即可( 黄桂宽等，1 9 9 5 ；王丁刚，1 9 9 1 ；陈建国，2 0 0 0 ；刘冬等，2 0 0 4 ；赵和涛，1 9 9 2 ；周志等，2 0 0 1 ；姜爱莉等，1 9 9 8 ：y a m a g u c h i ，e ta 1 1 9 9 6 ：s u n ，e ta 1 1 9 9 9 ：l i a n g ，e ta 1 2 0 0 1 ；h o n n a v a ll y ，e ta 1 1 9 9 9 ；h r o m dd k o v d ，e ta 1 2 0 0 2 ：陈海霞等，2 0 0 1 ；代佳等，2 0 0 0 ) 。单独提取法：大致可归纳为下面三类。( 1 ) 原料一水浸提( 2 3 次) 一沉淀过滤一取滤液浓缩一乙醇沉淀一过滤、回收乙醇一粗多糖一精制、干燥一茶多糖。( 2 ) 原料一乙醇浸泡回流( 3 次) 一取滤渣一沸水提取( 3 次) 一过滤一提取液浓缩、脱脂、脱蛋白、脱色等一乙醇沉淀( 2 次) 一取沉淀精制、干燥一茶多糖。( 3 ) 原料一水浸提一超滤一取滤液一乙醇沉淀一千燥一茶多糖。综合提取法：具简化、试剂省、效益高等优点，大致也可分下面两类。( 1 ) 原料一沸水浸提( 2 次) 一离心、除渣一提取液氯仿萃取一r 有机层一回收氯仿、精制、干燥一咖啡碱弋r 有机层一回收、精制、干燥一茶多酚咏层一乙酸乙酯萃取一l 水层一乙醇醇析一离心、取滤渣、精制、干燥一茶多糖2中囝农业科学院硕l 学位论文第一章绪论1( 2 ) 原料一乙醇浸提一滤渣酸性乙醇提取一滤液丙酮分离一同收、精制、干燥一茶多糖j，有机层同收、精制、干燥一咖啡碱l 滤液浓缩氯仿萃取一_ r 有机回收、精制、干燥一茶多酚l 水层乙酸乙酯萃取一一l 水层浓缩、干燥一水溶性复合物膜法分离：7 i 透析多糖水提取液预过滤超滤l 超滤2l 一反渗透浓缩( 低压人孔) ( 高压小孔)干燥超滤是一种膜分离技术，可有效地将茶多糖、蛋白质等大分子物质从提取液中分离出来( 刘军海，2 0 0 7 ) ，实现了茶多糖与茶多酚、咖啡碱的全面分离，而且整个过程不引入有毒的有机溶剂，设备操作简便，极具工业应用前景( 何江川等，2 0 0 5 ：尹军峰等，2 0 0 6 ) 。1 1 2 茶多糖的纯化1 1 2 1 茶多糖的初步纯化脱蛋白实际操作中，大多用s e v a g 法除茶多糖中的蛋白质( 黄桂宽等，1 9 9 5 ；肖慧等，1 9 9 3 ) ，该方法条件温和，可避免多糖的降解。缺点是一次只能除去少量蛋白质，一般4 - 5 次方能除尽；多糖常因多次除蛋白而损失。三氟三氯乙烷法效率较高，但因其易挥发，不宜大量应用( 李布青，1 9 9 6 ) 。脱色茶叶复合多糖脱色主要是用5 的h 2 0 2 氧化脱色( 李布青，i 9 9 6 ) 。1 1 2 2 荼多糖的进一步纯化通过提取分离等方法得到的茶叶多糖中可能还有与其分子质量相差不大的水溶性物质，或者存在未除净的色素、脂类、低聚糖等杂质，为了得到茶叶多糖的均一性组分，进一步分析茶叶复合多糖的组成、相对分子量、化学结构和药理，必须对其进行进一步分离纯化。超滤法不同的超滤膜具有允许不同分子量和形状的物质通过的性质，多糖溶液通过各种已知的超滤膜就能达到分离。纤维素阴离子交换剂柱层析此法适合于分离各种酸性、中性多糖和粘多糖。许新德等( 许新德等，2 0 0 0 ) 将粗老绿茶过d e a e 纤维素柱，得一中性多糖及3 个酸性多糖。任健等( 2 0 0 3 ) 将脱蛋白后的茶多糖用d e a e - 纤维素柱层析，用蒸馏水平衡后，用o 1 - - - 0 5 m o l l 的氯化钠梯度洗脱，得三种茶多糖。凝胶柱层析凝胶柱层析是根据多糖分子的大小和形状不同进行分离。茶多糖分离时多选用3中目农业科学院硕f 一学位论文第章绪论s e p h a d e xg - 5 0 以分离相对分子量在l 万以下的各组分，然后选用s e p h a d e xg 1 5 0 2 0 0 以达到进一步纯化的目的。周鹏等( 2 0 0 1 ) 用脱蚩白、醇沉后的粗多糖经s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶柱层析纯化，0 i m o f l n a c i 洗脱。获得两个茶多糖组分。，1 3 茶多糖的纯度鉴定及相对分子质量测定由于多糖类复合物等生物大分子的理化性质、生物活性与其相对分子质量有很大关系，因此，在多糖类复合物的研究及其产品质量控制中，相对分子质量是一个重要指标( v a r k i ，e ta 1 2 0 0 2 ：陈惠黎，1 9 9 7 ) 。要测定多糖类复合物的相对分子质量，首先要求鉴定其纯度，但是茶叶多糖是高分子化合物，其纯品实质上是一定相对分子质量范围的相对均一组分，它的纯度只代表相似链长的平均分布。目前，国内外多糖类复合物纯度的鉴定方法主要有：比旋度法，超离心法，电泳法和凝胶色谱法( 张惟杰，1 9 9 9 ；方积年，1 9 8 4 ) ，高效液相凝胶渗透色谱法( h p g p c ) ，具有快速、高分辨和重现性好的优点，因此最为常用。目前测定多糖相对分子质量的方法主要有：聚丙烯酰胺凝胶电泳法( 张惟杰，1 9 9 9 ) 、光散射法( c h e n ，e ta 1 2 0 0 4 ) 、粘度法( 张惟杰，1 9 9 9 ) 、凝胶过滤法( 方积年，1 9 8 4 ) 、渗透压法( 虞志光，1 9 8 4 ) 、蒸汽压法( 虞志光，1 9 8 4 ) 、端基法( s m i t h ，e ta 1 1 9 8 1 ) 、超过滤法( 刘饲良，1 9 8 2 ) 、高效液相凝胶渗透色谱法( 汪东风等，2 0 0 0 ) 等。高效凝胶渗透色谱法测定多糖类复合物的相对分子质量具有快速、高分辨和重现性好的优点，在国内外已撂到广泛应用。在茶叶多糖相对分子质量的测定中，周鹏等( 2 0 0 4 ) 采用高效液相色谱电喷雾质谱法( h p l c - e s i m s ) 测定了从江西分宜粗老绿茶中分离纯化出的茶叶多糖的相对分子质逞为5 1 5 0 0 ；陈海霞等( 2 0 0 1 ；2 0 0 5 ) 利用高效凝胶渗透色谱法测定富硒茶中提取出的茶叶多糖的重均相对分子质量( m w ) 为l1 7 0 0 0 ；汪东风等( 1 9 9 6 ) 采用凝胶过滤法( s e p h a d e xg 2 0 0 ) 测定从粗老茶中提取出的茶叶多糖的相对分子质量为1 0 7 0 0 ，两用高效凝胶渗透色谱法测得则为1 1 0 0 0 。1 1 4 茶叶多糖的含量测定准确测定茶多糖质量分数对选择原料和评价提取、纯化工艺非常重要。目前国内外快速测定多糖含量主要有蒽酮一硫酸法和苯酚一硫酸法，均以葡萄糖为标准。罗一鸣等( 1 9 ) 采用苯酚一硫酸法测定1 3 种从湖南、广西、云南等不同茶厂获得的茶叶中多糖质量分数在2 7 5 - - 一4 2 2 之间。傅博强等( 2 0 0 1 ) 认为由于茶叶多糖为杂多糖，而不同的单糖与葸酮一硫酸试剂显色情况不同，不同单糖标准曲线的斜率不周，因而仅采用葡萄糖做标准的测定结果，会存在一定的误差，结果比实际含量偏低，从而提出以校正因子修正测定茶叶多糖质量分数。由于苯酚一硫酸法受颜色的影响较大，而茶叶多糖在提取和初步纯化过程中伴有大量的茶色素生成，因此多采用蒽酮一硫酸法。聂少平等( 2 0 0 5 ) 采用高效液相凝胶渗透色谱法测定了江西分宜、婺源、上犹等地的绿茶和红茶中该多糖组分的含量，发现其质量分数在0 6 1 - - - 1 2 7 之间。4中国农业；善学院硕f j 学位论文第一审绪论i1 1 5 茶叶多糖的理化性质及组成茶叶多糖中除了有单糖外，还结合有糖醛酸，缀合有蛋白质、无机元素等配体。m o r im 等( 日本专利：jp6 33 0 80 0 1 ) 得到的具有降血糖效果的茶叶复合多糖的组成为l 邛口拉伯糖、d 核糖、d 葡萄糖，摩尔比为5 1 ：4 7 ：1 7 ，平均相对分子质量为4 0 0 0 0 。t a k e oc 等( 1 9 9 2 ) 报道，从绿茶中提取的具有降糖作用的多糖为半乳葡聚塘。汪东风等( 2 0 0 1 ) 对经s e p h a d e x g 2 2 0 0 柱纯化的茶多糖的多糖部分进行了分析，证明其是由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，其单糖摩尔比为5 5 2 ：2 2 1 ：6 0 8 ：4 4 2 0 ：4 1 9 9 ，相对分子质量为1 0 7 0 0 0 ，除此之外，还发现有鼠李糖存在。周鹏等( 2 0 0 4 ) 研究江西婺源绿茶发现其单糖组成是鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。聂少平等( 2 0 0 8 ) 用g c 。m s 分析了绿茶多糖蛋自的组成，证明其是由核塘、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成的杂多糖，其单糖摩尔比为：1 7 l ：5 8 8 ：1 3 7 0 ：1 9 9 ：1 0 0 ：1 8 4 ：3 3 7 5 。陈海霞等( 2 0 0 8 ) 得到三个糖蛋白。t p c 1 是由l 邛可拉伯糖，d 核糖，d 木糖，d 葡萄糖，d 半乳糖和d 甘露糖组成：t p c 2 是由阿拉伯糖，核糖，葡萄糖，甘露糖组成；t p c 3没有甘露糖检出。这三个糖蛋白中蛋白的含量分别为2 8 ，3 8 ，4 0 ；分子餐分别为2 6 8 x 1 0 4 ，1 1 8 1 0 4 。4 。2 1 0 4 。1 1 6 茶叶多糖的生物活性1 1 6 1 降血糖作用蔡鸿恩( 1 9 7 9 ) 用租老茶治糖尿病，临床观察其有效率达7 0 。周杰等( 1 9 9 7 ) 也报道茶叶多糖有明显降低血糖的作用。江和源等( 2 0 0 4 ) 以小鼠为实验动物，针对茶叶多糖的急性毒理，对正常小鼠和四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖值的影响进行研究，发现茶叶多糖的半数致死剂量为4 1 9 9 k g ，能抑制小鼠口服淀粉和葡萄糖后1 5 h 内血糖的升高，能抑制四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的升高，能改善小鼠的糖耐量，具有降血糖功能。倪德江等( 2 0 0 4 ) 湖北福鼎大白茶、福建水仙以及云南大叶种鲜叶，分别制成绿茶、乌龙茶和红茶研究发现在所设定的低、中、高剂量下，各种茶叶多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠都有显著的降血糖效果，其中在低、中等剂量下，乌龙茶、红茶多糖的降低血糖作用明显优于绿茶多糖，但在高剂量下差异不明显；不同产地、品种和茶类的茶叶多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠降血糖效果均不相同，其中以湖北产茶叶多糖降血糖效果最好，其次是福建茶叶，再次是云南茶叶。由此可见不同产地、品种、加工工艺对茶叶多糖降血糖效果都有显著性影响。1 ，1 6 2增强机体免疫功能作用多糖的构效关系是指多糖一级结构和高级结构与其生物活性的关系，是当前糖化学和糖生物学共同关注的焦点问题。多糖构效关系的研究可为活性多糖的筛选提供理论指导。多糖的药用研究始于1 9 4 3 年，6 0 多年来，人们从动物、植物、微生物中提取分离了大量的多糖和多糖类物质用作治疗和辅助治疗的药物- o 作为生命活动中起核心作用的基本物质，多糖具5中图农业科学院硕f j 学f 、7 ：论文第一一章绪论有能控制细胞分裂和分化，调节细胞的生长与衰老等复杂的功能；同时，作为一种免疫调1 了剂，多糖能起到刺激机体的各种免疫活性细胞的成熟、分化和繁殖，增加巨噬细胞1 卜特异性细胞毒，诱导细胞白介素1 、细胞自介素2 、肿瘤坏死因子、干扰素等细胞冈子的产生和细胞冈子受体的表达，促进抗体的形成，活性补体系统的经典途径及变更途径等作用( 陈惠黎，1 9 9 7 ：吴寿金等，2 0 0 2 ) 。而且多糖是通过宿主中介起作用，所以多糖药物没有细胞毒性，不影响正常细胞。目前，多糖药物的研究集中在它们的结构和免疫调节活性的关系、分子水平的作用机制和如何通过化学修饰增强其生物活性上( o o i ，e ta l ，2 0 0 0 ) 。目前，国内外对茶多糖药物的研究集中在他们的结构和免疫调节活性的关系、分子水平的作用机制和如何通过化学修饰增强其生物活性。已经有较多关于免疫促进活性和抗肿瘤与结构的关系的研究报道。在生物体的免疫系统中，巨噬细胞( m 伞) 由于其活跃的生物学功能，尤其是在免疫应答和集体防御机制中的重要作用，而一直受到重视。m 母能表达数十种受体，产生数十种酶，并能分泌数百种生物活性产物，是体内功能最为活跃的细胞之一。m t p 具有吞噬功能，能主动吞噬和清除颗粒型外来抗原或直接杀伤病原微生物；还能通过其产生的肿瘤坏死因子( 1 n f o ) 及n o 等分子杀伤靶细胞，同时产生多种生物活性物质发挥其免疫调节作用；m r 0 的抗原提呈作用也是m 9作为一种免疫辅佐细胞的重要功能之一( 陈慰峰，2 0 0 1 ) 。张庆等( 2 0 0 1 ) 研究了大枣中型多糖( j d p - n ) 对小鼠腹腔m p 分泌t n f 及其m r n a 表达水平的影响。结果显示，j d p - n 能诱导m r 0 分泌t n f ，达峰时间为6 h ，与脂多糖( l p s ) 相比，时效关系相仿；j d p - n 能促进m g t n f am r n a 的表达，提示j d p - n 诱导m q 分泌t n f 的机制之一是提高m r n a 的表达水平。李明春等( 2 0 0 0 ) 报道，灵芝多糖( g l b 7 ) 能剂量依赖性地引起小鼠腹腔m 叩中c a m p 浓度的升高，从而引起蛋白激酶a 的活化，激活m q 。这可能是其影响m r 0 活性，增强免疫功能的机制之一，为了进一步探讨g l b 7 的免疫增强作用机制尤其是对免疫细胞信号转导过程的影响，李明春等( 1 9 9 9 ) 采用竞争性蛋白结合分析法则定培养的小鼠腹腔m q 中c a m p 含量，研究了灵芝多糖g l b 7 对m 叩内c a m p 含量的影响。结果显示，g l b 7 能剂量依赖性地引起小鼠腹腔m q 中c a m p 浓度快速升高，1 0 m i n 达到峰值，之后缓慢下降，直3 0 m i n 是基本恢复至原来水平。一般可以认为e g m p 可通过激活e g p k 、活化a d p 核糖环化酶等途径发挥其调控细胞功能的作用。因此认为g l b 7 对m 叩内c a m p 含量的影响可能是其增强m 9 功能、发挥免疫调节作用的机制之一。h e r a m e s h 等( 2 0 0 2 ) 研究了葫芦巴半乳糖配甘露聚糖对大鼠腹腔m 9 的吞噬活性及人淋巴细胞h b 4 c 5 增殖和免疫球蛋白m 分泌活化作用。多糖碱提取部分b在1 0 1 x g m l 浓度下对大鼠腹腔m q 表现出4 0 的活化作用。对于h b 4 c 5 淋巴细胞，碱提取的多糖b 能提高其活化百分率，对免疫球蛋白m 分泌分泌的影响在2 5 1 t g m l 浓度下表现为2 4 o 的抑制作用。有研究表明，内毒素脂多糖和许多细胞因子如i f n 吖、i l 一2 、i l 4 g m - c s f 等物质均能活化m r 0 ，并通过l - a i e 途径产生n o ，起到杀伤肿瘤和病原体的作用( l i ，e ta l ，19 9 5 ) 。这类影响因子m qi n o s 的基因表达或影响i n o s 的活性，并同时消耗细胞内的g s h ，这可能是l t n的免疫调节机制之一。i s m a e ld b 等( 2 0 0 0 ) 从真菌细胞壁中发现的壳聚糖能以剂量、时间依赖方式通过增强花生四烯酸的活动激活m 9 。方伟等( 2 0 0 8 ) 从六安炒青水提物中分离纯化得到t p s i i ，对其纯度和和分子量进行检测，6中围农业科学院硕1 ：学位论文第一帝绪论通过测定小鼠血清超氧化物歧化酶( s o d ) 活性、大冬氨酸转氨酶( a s t ) 活性、丙- 二醛( m d a )含量及肝脏指数，研究其对四氯化碳( c c l 4 ) 引起的急性肝损伤的保护作用。结果表明t p s l i 相对分子量约为1 0 1 1 0 5 ，总糖含量为8 5 3 0 ，蛋白含量为2 8 0 ，并对c c l 4 引起的小鼠急性肝损伤有明显的保护作用。陈海霞等( 2 0 0 8 ) 得到的三个糖蛋白中，用脱氧核糖法，光硝基监四氮唑检测和脂质过氧化抑制法用于测试的茶多糖复合物的体外抗氧化活性。结果表明t p c 一3 的抗氧化活性最高，在诱导去氧核糖的氧化反应中i c 5 0 为1 8 2 p g m l ，光硝基蓝四氮唑光还原反应的检测中i c 5 0 为9 3 烬j m l ，均低于t p c 1 和的t p c - 2 。多糖分子量大小和与多糖结合的蛋白质含量，能显著改善多糖的生物活性。这些都说明多糖的结构以及分子量的大小和生物活性之间的关系非常密切。汪东风等( 1 9 9 4 ) 研究发现对小鼠皮下注射茶叶多糖，然后腹腔注射羊红细胞免疫，6 d 后静脉取血，结果表明，茶叶多糖质量浓度在3 0 1 0 0 m g m l 范围内具有以血清凝集素为指标的体液免疫增强作用，其中以质量浓度3 0 m g m l 效果最佳，与对照相比差异达p 0 0 0 1 水平：同时发现茶叶多糖还具有促迸单核巨噬细胞系统吞噬功能、增强机体自我保护能力；也发现用不同方法制备的茶叶多糖对佐剂性关节炎( a a ) 大鼠引起的脾淋巴细胞转化低下和白细胞介素- 2 分泌过低均有恢复作用，而对白细胞介素1 分泌过高则有抑制作用。对正常小鼠机体免疫有增强作用。江秀丽等( 1 9 9 8 ) 研究几种不同途径提取的茶叶多糖对佐剂性关节炎大鼠免疫指标的影响发现，几种茶叶多糖都有提高佐剂性关节炎大鼠过低的脾淋巴细胞增殖反应和i l - 2 的趋势，其中p 2 途径提取的茶叶多糖对脾淋巴细胞增殖反应和i l 2 具有明显的促进作用( p o 0 5 ) ；而对佐剂性关节炎火鼠腹腔巨噬细胞产生过高的i l 1 ，几种不同途径提取的茶叶多糖均有降低趋势，以p 2 茶叶多糖的作用最显著( p 0 0 5 ) 。杨敏等( 1 9 9 7 ) 研究粗老茶中茶叶多糖对小鼠免疫的影响时发现，茶叶多糖质量浓度在3 0 1 0 0 9 ，l 范围内具有以血清碳粒廓清、凝集素为指标免疫增强作用；d t h 为检测t 淋巴细胞功能的有效方法，不同茶叶多糖质量浓度的( 1 5 1 0 0 9 l ) 均有显著性差异，证明茶叶多糖能够提高机体的细胞免疫功能。杨光等( 2 0 0 4 ) 分别用羊红细胞和卵清蛋白为抗原给小鼠注射后，灌服茶叶多糖并设对照组，检测相应抗体生成水平和血清中i l - 2 ，i f n y 生成水平时发现给药组s r b c 抗体生成水平和卵清抗体生成水平，i l 2 ，i f n y 激发水平均显著高于对照组( p 82理1 5oo10 ，50_ o 5管号t u b e4 0图3 - 4t p s l 5 0 k d - 峰1 组分的s e p h a e r y ls - 3 0 0 枉层祈纯化图f i g 3 - 4e l u t i o np r o f i l e so f p e a klo f t p s l 5 0 k db ys e p h a e r y ls - 3 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h yn s 1 5 0 k d 峰l 再经过s e p h a c r y l $ - 3 0 0 凝胶柱层析分级纯化。由图3 - 4 可知，t p s l 5 0 k d 峰l经过s e p h a c r y ls 3 0 0 凝胶柱层析分级纯化，得到了3 种不同分子量的多糖，其中以第二个峰为主，其他两个峰的峰相对较小。第二个峰的峰形比较对称，这3 个组分也基本分开，s e p h a c r y ls 3 0 0凝胶柱层析的分离效果较好。合并收集主峰位洗脱液，在流水中透析2 4 小时，经冷冻干燥得两个组分，根据洗脱液洗脱过程的管位标记，这两个组分分别对应于峰l 和峰2 ，按照出峰先后命名为1 r f s 1 5 0 k d 峰1 1 ，t p s l 5 0 k d 峰1 2 。o三日口。趔qo：1一八八一：。i iwl o 0 嘉4 2 0 v 三o 3 06 04 05 0y6 07管号t u b e一图3 - 5t p s l 5 0 k d 峰2 组分的s e p h a c r y ls 3 0 0 柱层析纯化图f i g 3 - 5e l u t i o np r o f i l e so f p e a k2o f t p s l 5 0 k db ys e p h a e r y ls - 3 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y2 353525l50513210o啪仉毗m叭n吣吨中图农业科学院硕十学位论文第二章膜过滤绿茶多糖及碱提栩多耱的系统分级纯化 乏纯度签定li i i由图3 5 可知，t p s l 5 0 k d 峰2 经过s e p h a c r y ls 一3 0 0 凝胶柱层析分级纯化。得剑r3 种不同分子量的多糖，其中以第_ 二个峰为主，其他两个峰的峰相对较小。第二个峰的峰形比较对称，这3 个组分也基本分开，s e p h a c r y ls 3 0 0 凝胶柱层析的分离效果较好。合并收集主峰f ；7 = 洗脱液，在流水中透析2 4 小时，经冷冻干燥得两个组分，根据洗脱液洗脱过程的管位标记，这两个组分分别对应于峰l 和峰2 ，按照出峰先后命名为t p s l 5 0 k d 峰2 i ，t p s l 5 0 k d - 峰2 - 2 。当=8j 四oo21 5 1 o 55管号t u b e图3 - 6t p s1 5 0 1 d ) 峰3 组分的s e p h a e r y ls 3 0 0 拄层析纯化图f i g 。3 - 6e l u t i o np r o f i l e so f p e a k3o f t p s l 5 0 k db ys e p l m c - r y ! s - 3 0 0c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y由图3 币可知，t p s l 5 0 k d 一峰3 经过s e p h a e r y ls 3 0 0 凝胶柱层析分级纯化，得到了两种不同分子量的多糖，其中以第二个峰为