（食品科学专业论文）豆豉纤溶酶发酵条件的优化及双水相萃取工艺的研究.pdf

摘要 摘要 目前临床治疗血栓性疾病的常用溶栓药物效果都不尽人意，普遍存在着特异性差，副 作用大，作用时间短，溶栓效果差，价格昂贵等缺点。纤浴酶由于其安全性高、特异性强、 作用温和持久、易被人体消化吸收等优点，其作为新一代溶栓产品越来越受到广大学者的 重视。我国对纤溶酶虽然也进行了多方面的研究，然而我国的纤溶酶市场几乎还是空白， 产品仍然依赖国外进口，我国对此类功能性食品的开发势在必行。本论文对如何获得高产 率、高纯度的豆豉纤溶酶作了初步研究。 首先通过单因素试验、p l a c k e n b u n l l a n 实验和响应面分析法，获得了豆豉纤溶酶产 生菌u y d 8 的最佳培养基组成：蔗糖1 8 7 7 1 3g l ，蛋白胨2 0 7 8 9 1g l ，k 2 h p 0 43 7 3 5 1 l ， k h 2 p 0 41g l ，m g s 0 4o 5g ，l ，c a c l 20 2 l ，此条件下发酵，豆豉纤溶酶的酶活为2 8 0 6 4 6 4 i u m l 。 根据发酵条件的单因素试验和正交试验结果，确定了较佳的发酵条件：接种量2 ， 初始p h = 7 ，转速1 8 0 r m i n ，培养温度3 7 ，培养时间7 2 小时。此条件下发酵，豆豉纤 溶酶的酶活达到2 9 9 2 8i u m l 。 在优化传统发酵条件的同时，还对新兴的发酵技术双水相发酵进行了初步探索。； 双水相发酵技术的研究表明：p e g 酒石酸钾钠体系对产酶最为有利。当p e g 6 0 0 0 浓度为 2 4 ，酒石酸钾钠1 0 ，接种量3 ，装液量为8 0 m l 2 5 0 m l ，产酶量相对较大。此时发 酵液的平均酶活达到了1 4 2 1 6i u m l ，相对于初始酶活2 3 5 5i u m l 提高了5 倍。 常规的酶分离技术存在诸多弊端，如：操作间歇长、收率低、成本高等，很难进行扩 大生产，已不适应当前日益发展的生物工程生产生物活性大分子的需要。探讨适合于豆豉 纤溶酶分离纯化的新方法是目前研究的热点。本论文系统研究并比较了大孔吸附树脂、反： 胶束萃取以及双水相萃取这三种方法对豆豉纤溶酶的分离纯化效果，建立并优化了双水相 萃取技术工艺参数，p e g ( 4 0 0 0 ) 浓度1 8 ，无机盐浓度8 ，n a c l 浓度0 4 ，酶液添加量 1 0 。此时，萃取体系下相酶活回收率6 0 2 ，纯化倍数98 ，脱色率达8 2 7 。 关键词：豆豉纤溶酶响应面双水相发酵反胶束萃取双水相萃取大孔吸附树脂 江南大学硕： 学位论文 a b s t r a c t d o c h if i b r i n 0 1 ”i ce n z y m e ( d c f e ) w a sp r o d u c e db y 肋c f ，“j 点pw h i c hw a si s o l a t e df r o ma t r a d i t i o n a lc h i n e s ef e r m e n t e df o o d d o u c h i d c f ec a nd i s s o l v et h r o m b u s ，c o n t r o lt l r o m b o s i s ， i n h i b i tb o d yc m o ra n ds u p p r e s sp i a t e l e ta g g r e g a t i o n d c f eh a sm o r es t r o n g b r i n o l ”i ce 髓c t a j l di ss a f et ou s ec o m p a r e dw i t ht h em o s t u s e dt h r o m b o l ”i cd n i g n o w a d a y s i th a st h e p o t e n t i a lt ob e c o m ean e wt h r o m b o b 厅i cd n i g a 1 t h o u g hi th a sb e e ns t u d i e de x t e n s i v e j yi nc h i n a ， i ti ss t i l ln o ti n d u s t r i a l i z e dd u et oi t sl o wp r o d u c t i v i t ya n dl o wp u r i t y s ot h i ss t u d yi sf i o c u s e do n t h e s et w oa r e a s e f r e c t so fc u l t u r em e d i aa n df 色n 1 1 e n t a t i o nc o n d i t i o no nd c f ep r o d u c t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d f o ru 丫d 8 ，o r g a n i cn i t r o g e ni sp r e f 色r r e dt od c f ep r o d u c t i o n ，a n db a s e do nt h e p l a c k e n b u n n a na j l d r e s p o n s i v e s u r f a c em e t h o d o l o g y ，a no p t i m u mc u l t u r em e d i aw a s d e v e l o p e dw i t ht h ef o l l o w i n gc o m p o s i t i o n ( l ) ：s u c r o s e18 7 7 1 3 ，p e p t o n e2 0 7 8 9 1 ，k 2 h p 0 4 3 7 3 5 1 ，k h 2 p 0 4l ，m g s 0 4o 5 ，c a c l 2 0 2 ，p h = 7 m e a n w h i l e ，f e n n e n t a t i o nf o r7 2h r sa t3 7 i n as h a k e ro f18 0 r m i nw i t ha2 i n o c u l u mv o l u m ec a nm a x i m i z et h ee n z y m a t i ca c t i v i t yt o 2 9 9 2 8i u m la c c o r d i n gt ot h er e s u l to fl ( 9 ) 3 4o n h o g o n a le x p e r i m e n t t h ea q u e o u st w op h a s ef b r n l e n t a t i o nt e c h n o l o g yw a si n t r o d u c e dt o o p t i m i z ed c f e p r o d u c t i o n w i t h i nt h e6k i n d so fa q u e o u st w op h a s es y s t e m s ，p e g p o t a s s i u ms o d i u mt a n r a t e w i t hac o n c e n t r a t i o no f2 4 ，lo r e s p e c t i v e l y ，i st h eb e s tf o rd c f ep r o d u c t i o n ，a n dw i t ha n i n o c u l u mv o l u m e3 ，l4 21 6i u m lo fe n z y m a t i ca c t i v i t yc o u l db eo b t a i n e d n e wt e c h n 0 1 0 9 i e si n c l u d er e v e r s e dm i c e l l e s ，m a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i na n da q u e o u s t w op h a s ee x t r a c t i o nw e r ec o m p a r e dt op u r i f yd c f ef r o mt h ef e n n e n t a t i o nm e d i a ，a n dt h e a q u e o u st w op h a s ee x t r a c t i o nw a sc h o s e na st h ep r e f e 盯e dm e t h o db a s e do nt h ep u “行c a t i o n f a c t or c o s t ，f e a s i b i l i t ye t c a l s ot h et e c h n i q u e so fs u c hm e t h o dw e r es r u d i e d t h er e s u l t sa r ea s f o l l o w s ：p e g ( 4 0 0 0 ) 18 ，n a 2 s 0 48 ，n a c lo 4 ，f e n n e n t a t i o nc u l t u r el o a dl0 u n d e rs u c h c o n d i t i o n st h ee n z y m a t i cr e c 。v e r ya tt h eb o t t o mp h a s er e a c h e s6 0 2 ，p u “n c a t i o nf h c t o r9 8 ， d e c o l or i z “o nr a t i oj s8 27 k e yw o r d s ：d c f e ；r s m ；a q l l e o u st w o p h a s es y s t e m s ；e x t r a c t i v ef e r m e n t a i i o n ；a t pe x t r a c t j o n ：r e v e r s e d m i c e l l e s ：m a c r o p o r o l l sa d s o r p t i v er e s i n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：煎垫整日期：枷年月谬日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 。 签名：堑l 鱼坠导师签名：毯垒 日期：脚年6 月冯日 第一章绪论 第一章绪论 血栓栓塞性疾病是一类严重危害人类健康和生命的常见病与多发病。据统计，全世界 血栓栓塞性病人约1 5 0 0 万人，心脑血管血栓病己跃居人类死因的第一位川。目前在临床 上较常用的治疗方法主要有两种【2 。j ：外科手术，这是去除血栓最迅速直接的方法，开 始于2 0 世纪3 0 年代的法国，5 0 年代流行于美国，此种方法要求条件复杂，费用昂贵， 目前已经较少使用。溶栓疗法，即服用或注射溶栓剂使血管开通，这是目前使用的主要 方法。但是临床上使用的溶栓剂均在不同程度上存在一定的缺陷：或毒性较强、副作用大； 或在体内半衰期短，药效难以发挥或来源紧缺、价格昂贵1 4 9 】。 因此研究人员应用现代分子生物学技术，不断对溶栓剂进行改进，开发出在特异性、 半衰期及溶栓效率方面都有较大提高的新型溶栓剂，如突变体【l0 1 、嵌合体及导向溶栓剂 三大类。它们均能够高度选择性溶栓，作用时间长，但仍具有抗原性过敏反应。除了致力 于新型溶栓剂的开发以外，研究人员也在寻找天然的较具优势和发展前途的溶栓物质，并 分别发现了动物、植物、昆虫、微生物来源的溶栓性功能组分，更为喜人的是研究人员在 某些传统食品中同样发现了溶栓性功能组分并成功将其产业化。自2 0 世纪8 0 年代以来， 日本的须见洋行教授筛选了2 3 0 多种食品，发现纳豆激酶【1 1 】( 日本的传统大豆发酵食品) _ 可以溶解体外人工血栓，随之从不同国家的传统食品中相继发现了纤溶酶，如韩国传统食 品c h u n gk o o k - j a n 2 1 和d e o n j a n 3 1 中的纤溶酶c k 和s u b t i l i s i nd j 一4 ，从我国豆豉中 分离到的豆豉纤溶酶以及从台湾大豆发酵食品【l5 】中发现的纤溶酶原。这些纤溶酶活性较 高，有明显的溶解血栓和抑制血栓形成的作用，具有抑制机体凝血、抗血小板聚集的功能 以及增强纤溶的功能。此外它还具有安全性好、价格便宜、方便生产等优点，因此将纤溶 酶开发成为新的溶栓药物具有非常好的发展前景。 1 1 纤溶酶的研究进展 1 1 1 纤溶酶的来源 纤溶酶有动物、植物、昆虫、微生物四大来源。其中动物来源的纤溶酶有蚯蚓纤溶酶 陋2 6 1 、蛇毒纤溶酶1 2 7 _ 3 0 1 和吸血蝙蝠d s p a ( d e s m o d u ss a l i v a r yp a ) | 3 l 】。植物来源的有蒲黄溶 纤酶 3 2 】。昆虫来源的有甲虫c a t h a r s i u sm o l o s s u s 3 3 】、螳螂f 3 4 j 。 微生物是纤溶酶的重要来源，包括细菌陋3 叭、真菌f 4 0 4 “、放线菌和藻类【4 6 。”。传统 发酵食品中的纤溶酶同样来源于微生物，其种类主要是杆菌属，包括b 印c k l l 4 、 b 点ps t r a i n d j 一4 、b # pk a 3 8 、bj z l 扫，sl m r - n k l 、b 日竹如n g z l 岜向c j 已胛sd c 一4 、bs z ，6 ，讲5h l 一9 8 6 和b j “6 ，f ，打b k 1 7 ，详见；表1 1 。 江南大学硕士学位论文 表1 i 产溶栓物质的微生物 t a b l el - lm j c m o r g a n i s m sp m d 眦i n g 肋r i n o i y t i cc h e m i c a b 1 1 2 分离纯化 纤溶酶提取纯化方法主要包括硫酸铵分段盐析、离子交换、凝胶过滤或亲合层析。付 利等采用过滤、离心、盐析对纳豆激酶的粗酶液提取后，用s e p h a d e xg 1 0 0 柱层析对其 分离，收集的峰馏分浓缩，再用s e p h a d e xg 。2 0 0 柱层析进一步分离纯化，最终得到的单一 吸收峰经冷冻干燥，制成纳豆激酶干粉。日本专利公开了采用硫酸铵沉淀发酵液中的杂蛋 白后，直接上丁基琼脂糖凝胶柱，收集的活性部分用g 一2 5 脱盐后再上s e p h a c r y ls 2 0 0 分子 筛柱，得到收率为5 0 的纳豆激酶纯品。而美国专利公开了2 种纳豆激酶分离纯化工艺： 在发酵液中加入等量无水乙醇，弃沉淀，在上清液中再加入一定量乙醇使其质量分数达 到7 5 ，离心、收集沉淀，然后将沉淀溶解于磷酸缓冲液中，再上丁基琼脂糖凝胶疏水层 析柱，收集洗脱出的活性部分；将该部分液体脱盐、浓缩后过阴离子交换柱( m o n o 一0 ) ，洗 脱液再上烷基琼脂糖凝胶柱，得到收率为2 2o 的纯纳豆激酶：以上述从丁基琼脂糖凝 胶洗脱出的活性部分为原料，上阳离子交换树脂柱( s s e p h a r o s ef a s tf l o w ) ，洗脱出的活性 部分再上s e p h a c r y is 2 0 0 分子筛柱，收集到收率为1 8 1 的纳豆激酶纯品。上述2 种工艺分 离出的纳豆激酶的纯度能达到要求，但工艺复杂，且收率相当低。f u i i t a 等 7 】用生理盐水从 纳豆的发酵液中提取纳豆激酶粗酶，硫酸铵沉淀杂蛋白，离心除去杂质，上清液经疏水色 谱柱( b l i t y lt o y o p e a r l ) 吸附、阳离子交换柱( c m t o y o p e a r l ) 和分子筛层析( s e p h a d e xg 5 0 ) 分 第一章绪论 离后得到电泳纯的纳豆激酶。杨志兴等【5 0 j 对b 口c i ，“s 勋6 f f 曲h w 1 2 分泌的溶栓酶进行了分 离纯化，先用生理盐水从固态发酵产物中提取溶栓酶，再用乙醇对离心后的上清液进行分 级沉淀，经s e p h a d e xg 一1 0 0 和s e p h a c r y ls 2 0 0 两次分子筛层析后得到电泳纯的纳豆激酶。阎 家麒等【5 l 】以发酵大豆( 豆豉) 为原料，先用硫酸铵盐析，采用s e p h a d e xg 一1 0 0 和s e p h a d e x g 2 0 0 色谱分离纯化出一种活性强的纤溶酶，其酶活为3 i o u m l 。p e n g 等f s 2 1 从大豆发酵食 品中，经离心，加入3 0 6 0 硫酸铵饱和溶液沉淀后得上清液，先用c m s e p h a r o s ef f 和 d e a e s e p h a r o s ef f 柱层析，经苯基琼脂糖凝胶6 一f f 疏水性柱收集到其活性组分，再用 s e p h a d e xg 5 0 凝胶过滤，得到了酶活为1 3 0 u m l 的纳豆激酶。李炳锦【5 3 用b u t y lt 0 y o p e a r l 柱层析对纳豆粗提物中的纳豆激酶进行了分离纯化，纯化倍数为5 0 倍，活性回收率为 7 5 5 7 。郝淑凤1 5 4 j 通过s e r i n es e p h a r o s e2 b 和s e p h a c r y ls 一2 0 0 色谱柱对纳豆激酶进行分离纯 化，得到了电泳纯的酶。然而这些常规的分离技术存在诸多弊端，如：操作间歇长、收率 低、成本高等，很难进行扩大生产，己不适应当前日益发展的生物工程生产生物活性大分 子的需要。因此，探讨适合于纤溶酶分离纯化的新方法已成为研究的热点。 1 1 3 性质研究 由于来源不同，纤溶酶的酶学性质也各有差异。据报道，纤溶酶的分子量有2 0 k d 、 2 7 k d 、2 8 k d 、3 0 k d 、3 1 k d 、3 6 k d p l ”56 j 等多种，且酶的最适反应温度、最适反应d h 、 等电点、p h 稳定性也都有很大差异( 表1 2 ) 。 表1 - 2 传统发酵食品中纤溶酶的性质比较 t a b l el - 2c o m p a 巾o o f 肋r i n o i y t i ce 巧m ef r o mt r a d i t j o lf e 珊e n t e d 加d s 此外，学者还研究了纤溶酶在模拟胃环境中的稳定性，结果表明：在酸性条件下胃蛋 白酶对该酶有抑制作用，但是，当p h 恢复到中性时，该酶活恢复9 0 ；在胃环境中，即 使有其它内容物存在，对该酶酶活的影响也极小，说明该酶在模拟胃环境中比较稳定陋59 1 。 扛南大学硕士学位论文 1 2 双水相的研究进展 l 。2 1 双水相体系简介 早在1 8 9 6 年，b e i er i n c k 发现，当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时，得到一 个混浊不透明的溶液，随之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂( 或淀粉) ，这种现象 被称为聚合物的不相溶性( i n c o m p a i i b i l i t y ) ，从而产生了双水相体系( a q u e o u st w op h a s e s y s t e m ，a t p s ) 。例如将22 ( 质量分数) 的葡聚糖水溶液与o 7 2 甲基纤维素的水溶液等体 积混合静置后，可以得到两个液层，下层含有7 1 8 的葡聚糖，上层含有9 0 3 的甲基纤维 素，两相的主要成分都是水扣。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性，即 高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一 定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混合时就可 发生相分离，且憎水程度相差越大，相分离的倾向也就越大【6 1 1 。可形成双水相体系的聚合 物有很多，典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，略作p e g ) 葡聚糖 ( d e x t m n ) ，聚丙二醇( p o l y p r o p y l e n eg l y c o i ) 聚乙二醇和甲基纤维素( m e t h y l c e l l u l o s e ) 葡聚 糖等。另一类双水相体系是由聚合物盐构成的。此类双水相体系一般采用聚乙二醇作为 其中一相成相物质，而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。各种成相系统见表l 一3 。 表1 3 各种双水相成相系统i 。“1 t a b l e l 3 c o m p o s i t i o no f y a r i o u s “d so f a q u e o u s 押o p h a s es ”t e m s 第一章绪论 1 2 2 双水相体系的相图 在双水相体系组成成分确定以后，首先要配制双水相体系，而双水相体系的配制依据 是体系的相图，所以，在配制双水相体系以前应先把该体系的相图( 包括系线) 制作出来。 以p e g ( n h 4 ) 2 s 0 4 体系为例：从p e g 和( n h 4 ) 2 s 0 4 的加入量可得出体系组成的质量分数，混 合分相后，分别测出上相和下相中p e g 、( n h 4 ) 2 s 0 4 的含量，由此可得到3 个点即加料点、 上相点和下相点，然后调整p e g 或( n h 4 ) 2 s 0 4 的量，重复上述步骤，得到一系列的加料点、 上相点和下相点，最后将得到的所有的上相点和下相点在坐标图上用光滑曲线连接起来组 成双节曲线，而每一次的加料点、上相点和下相点的连线则为系线。图中的曲线t k b 称为 双节线( b i n o d a l ) ，双节线以下的区域为均相区，以上的区域为两相区。连接双节线上两点 的直线t m b 称为系线( t i el i n e ) ，在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体 积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即： 坼一丽 ：一! = = yh m 1 其中，v 。和v b 分别为上相和下相体积，删和l 仃分别为b 点与m 点和m 点与t 点之间 的距离。系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大， 反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图1 一l 的双节线上k 点，两相的差别消失，任何 溶质在两相中的分配系数均为1 ，因此k 点称为临界点，也称为云点( c r i t i c a lp o i n t ) 。 图l l 典型的双水相体系相图 1 2 3 萃取原理 双水相萃取与水一有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配。当 萃取体系的性质不同时，物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力( 如 憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。物 江南大学硕士学位论文 质在双水相体系中分配系数k 可用下式表示： k = c cf 其中k 为分配系数，c t 和c t 分别为被分离物质在上、下相的浓度。 分配系数k 等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的k 值不同，可利用双水相萃取体 系对物质进行分离1 6 2 】。其分配情况服从分配定律，即“在一定温度一定压强下，如果一个 物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于 常数”，分离效果由分配系数来表征，对双水相系统中溶质的分配系数b r o w n s t e d t 提出如下 公式： r j w k = 善= p 丌 l 6 k 一被分配物质在双水相系统中的分配系数； c b 一被分配物质在双水相系统下相中的浓度，g m l ； c 。被分配物质在双水相系统上相中的浓度，n 1 l ； m 一一被分配物质分子量； 一与被分配物质分子量以外的各个性质相关的因子； t - 系统的绝对温度，k ； k 一波尔兹曼常数，其值为1 3 8 x l o 2 3 j 依。 由于溶质在双水相系统两相间的分配时至少有四类物质在两个不同相系统共存，要分 配的物质和各相组分之间的相互作用是个复杂的现象，它涉及到氢键、电荷相互作用、范 德华力、疏水性相互作用以及空间效应等，因此，可以预料到溶质在双水相系统中两相间 的分配取决于许多因素，它既与构成双水相系统组成化合物的分子量和化学特性有关，也 与要分配物质的大小、化学特性和生物特性相关。 大量研究表明，生物分子在双水相系统中的实际分配是生物分子与双水相系统间静电 作用、疏水作用、生物亲和作用等共同作用的结果，形式上可以将分配系数的对数值分解 为几项： l n k = l n k 。，+ l n k 。+ l n k + l n k + l n k ，+ 1 n k 。 式中，k 。一静电作用对溶质分配系数的贡献； k h - _ 疏水作用对溶质分配系数的贡献； k b 一生物亲和作用对溶质分配系数的贡献； k 。一分子大小对溶质分配系数的贡献： k 。分子构型影响对溶质分配系数的贡献； k 。除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。 值得指出的是，这些因素中虽然没有一个因素完全独立于其它因素，但一般来说，这些不 同的因素或多或少是独立存在的。 影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合 第一章绪论 物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、p h 值、温度等。通过溶质在两水相之间分 配系数的差异而进行萃取的技术称为双水相萃取技术( a q u e o u st w op h a s ee x t m c t i o n ， a t p e ) ，双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领 域，并取得了许多成功的范例，具有广阔的工业应用前景。 1 2 4 双水相的优势 a t p e 作为一种新型的分离技术，对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现 出以下优势： ( 1 ) 含水量高( 7 0 9 0 ) ，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物 质失活或变性； ( 2 ) 可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质( 或者酶) ，还能不 经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤； ( 3 ) 分相时间短，自然分相时间般为5 m i n 1 5 m i n ； ( 4 ) 界面张力小( 1 0 1 0 4 m n m ) ，有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的 接触角几乎是直角； ( 5 ) 不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害： ( 6 ) 大量杂质可与固体物质一同除去： ( 7 ) 易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理： ( 8 ) 操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行： ( 9 ) 亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。 虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展，但几乎都是建立在实验的基础上，到 目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中 的分配机理，还有以下问题亟待解决： ( 1 ) 对双水相体系的化学物理性质缺乏了解，一些基本的物理数据有待研究。 ( 2 ) 对双水相体系的相平衡研究不多，未能完全搞清楚双水相体系分相的基本机理。 ( 3 ) 缺乏较完整的被分离物在双水相体系中分配系数推算的模型。 ( 4 ) 对双水相体系的流体力学和传质问题的研究极少。 相信随着研究的不断深入，双水相萃取技术将会愈加成熟并成为一种重要的分离纯化 方法。 1 2 5 应用 双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域， 并取得了许多成功的范例，详细内容参见表1 4 。 江南大学硕士学位论文 表1 _ 4 双水相萃取技术的应用 t a b l e l 4a p p c a t i o so f a q u e o u st w 0 _ p h a s es y s t e m s 此外双水相还可用于稀有金属贵金属分离，传统的稀有金属贵金属溶剂萃取方 第一章绪论 法存在着溶剂污染环境，对人体有害，运行成本高，工艺复杂等缺点。双水相技术萃取技 术引入到该领域，无疑是金属分离的一种新技术。在聚乙二醇2 0 0 0 硫酸铵偶氮肿( i i i ) 双水相体系中，可以实现t i ( i v ) 与z r ( i v ) 的分离 6 5 l ：在聚乙二醇p e g 2 0 0 0 一硫酸钠硫氰 酸钾双水相体系中，实现了c o ( i i ) 、n i ( i i ) 、m o ( v i ) 等金属离子的定量分离【6 6 】。在聚乙 二醇( p e g ) 硫酸钠( n a 2 s 0 4 ) 双水相体系中，能从碱性氰化液中萃取分离金【5 7 】。 目前，用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，i h o m gp a n 等 人利用p e g l 5 0 0 烈a h 2 p 0 4 体系从打f c a d 沈r m 口肋行啦f f 发酵液中分离纯化b 一木糖苷酶，该酶 主要分配在下相，下相酶活回收率9 6 3 ，纯化倍数3 3 ；m a r i a 等人【6 9 】利用p e g l o o o n a h ，p 0 。 体系从如馏r 泐”5 0 如”印f 5 泼酵液中分离纯化角质酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率 9 1 ，纯化倍数4 1 ；m 蜘a n a 【7 u j 利用聚乙二醇4 0 0 0 葡聚糖体系从p d o p d r “s 阳“d o 蹦s 发酵 液中分离果胶酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率8 0 2 2 ，纯化倍数2 4 5 ；m 积i n h a 【7 【i 利用聚乙二醇8 0 0 0 ( n h 4 ) 2 s 0 4 体系从同m p r d ，哆弦p s 口h 胁月淞发酵液中分离胞外多聚半乳 糖醛酸酶，该酶主要分配在上相，酶活回收率9 1 ，纯化倍数1 9 ；j o h a n s s o n 等用聚乙二 醇4 0 0 0 葡聚糖体系来浓缩和纯化黑曲霉b 一葡萄糖苷酶，酶分配在体积较小的下相d e x 中， 回收率达8 5 9 5 ，酶纯化了2 3 倍；周晓云等人【7 3 】研究了真菌脂肪酶在p e g 硫酸按双 水相体系中的分配行为，并研究了p e g 分子量、p e g 浓度、( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度、n a c l 等因素 对脂肪酶和总蛋白分配系数、酶活回收率、相体积比的影响，并得到较好的分离条件，在 室温下对脂肪酶的提取率可达7 1 ，分配系数可达17 ，纯化倍数为l5 0 。但是，目前还未 见利用双水相萃取技术分离纯化豆豉纤溶酶的研究报道。 1 3 立题目的和意义 血栓性疾病严重危害人类健康和生命，对个人家庭和社会都造成了巨大的物质和精神 损失。目前临床治疗血栓性疾病的常用溶栓药物效果都不尽人意，普遍存在着特异性差， 副作用大，作用时间短，溶栓效果差，价格昂贵等缺点。纤溶酶由于其安全性高、特异性 强、作用温和持久、易被人体消化吸收等优点，其作为新一代溶栓产品越来越受到广大学 者的重视。 近年来，纳豆激酶被开发成各种剂型( 粉剂、软硬胶囊、片剂、液体剂、浓缩剂等) 的产品，作为食品、食品添加剂、食品补充剂、功能性食品用于补充营养和保健，其发展 十分迅速。日本是纳豆激酶产品最大的生产国，拥有4 0 0 多家企业生产以纳豆激酶为主要 成分的产品，在世界各地设有销售服务机构。此外，韩国和朝鲜也都有类似的纤溶酶产品。 我国对纤溶酶也进行了多方面的研究，已完成了豆豉纤溶酶高产菌株的筛选、液体发酵条 件的优化、豆豉纤溶酶溶栓的功能实验，豆豉纤溶酶的纯化等工作，然而我国的纤溶酶市 场几乎还是空白，产品仍然依赖国外进口，我国对此类功能性食品的开发势在必行。 纤溶酶产业化的瓶颈在于产量的提高和分离纯化工艺的改进，即如何获得高产率、高 纯度的豆豉纤溶酶。高产率可以通过对野生菌种的筛选、诱变：优化豆豉纤溶酶的发酵条 件；通过基因工程技术改造纤溶酶产生菌的基因，得到产酶量高的工程菌这三种方法来实 江南大学硕士学位论文 现。然而基因工程技术开发的新菌株产酶量虽然可以提高几倍，但这些改良的菌株，往往 容易受到产物的反馈抑制，从而影响到整体的产量。因此优化豆豉纤溶酶的发酵条件就变 得尤为重要，因此，本文在通过响应面优化传统发酵条件的同时，还对新兴的发酵技术一 一双水相发酵进行了初步探索，希望可以对提高豆豉纤溶酶产量有所帮助。现有的纤溶酶 的纯化分离方法有盐析、层析等技术，传统柱层析分离方法在豆豉纤溶酶分离纯化中虽然 得到了广泛应用，但是其处理量小，无法连续操作，且收率低，工艺复杂，造成分离成本 高，很难进行扩大生产。为了获得高纯度、高产率的豆豉纤溶酶酶，探讨适合于豆豉纤溶 酶分离纯化的新方法，尤其是适合工业化生产的方法，将有助于促进我国纤溶酶的产业化 进程。 1 4 本课题的研究内容 1 首先通过单因素试验、p l a c k e t t b u m a l l 实验和响应面分析法，优化豆豉纤溶酶产生菌 u y d 8 的最优培养基组成； 2 通过发酵条件的单因素试验和正交试验，确定较佳的发酵条件； 3 为了消除代谢产物对豆豉纤溶酶生产过程的抑制作用，探索双水相发酵法。选择适宜 的成相组分，并对相关的操作参数进行优化； 4 考察大孔吸附树脂、反胶束萃取以及双水相萃取三种方法对豆豉纤溶酶的分离纯化效 果，确立并优化双水相萃取技术工艺参数。 第二章豆豉纤溶酶发酵条件的优化 第二章豆豉纤溶酶发酵条件的优化 2 1 引言 绪论中提到纤溶酶产业化的瓶颈在于产量的提高和分离纯化工艺，即如何获得高产 率、高纯度的豆豉纤溶酶。因此论文就这两个方面作一系统研究。本章主要考察了如何提 高纤溶酶的产量。常用的提高纤溶酶产量的途径有三种：通过对野生菌种的筛选、诱变， 挑选出产酶量高的菌种：优化豆豉纤溶酶的发酵条件；通过基因工程技术改造纤溶酶产生 菌的基因，得到产酶量高的工程菌。基因工程技术开发的新菌株产酶量可以提高几倍，但 这些改良的菌株，往往容易受到产物的反馈抑制，从而影响到整体的产量。因此优化豆豉 纤溶酶的发酵条件就变得尤为重要。发酵条件的优化主要包括培养基组分的优化和培养条 件的优化两部分。培养基是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合 养料。培养基的组成和配比是否恰当对微生物的生长、产物的形成、提取工艺的选择以及 产品的产量和质量都有很大的影响。培养基营养成分主要考虑含有合成细胞组成的原料和 满足一般生化反应的基本条件如：碳源、氮源、无机盐等等。另一方面，培养基所用原材 料还需要来源丰富、价格低廉、质量稳定。培养条件主要考虑发酵培养的温度、时间及培 养基的p h 等因素。本章在优化传统发酵条件的同时，还对新兴的发酵技术双水相发 酵进行了初步探索。 双水相发酵( e x t r a c t i v ef e m e n t a t i o nu s i n ga q u e o u st w o p h a s es y s t e m s ，a t p s ) 能进行 高效的生物转化，该体系将发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第一步骤分离相 结合，即可以将菌体和底物限于一相而将产物连续萃取到另一相。该技术已经成功应用于 d 一淀粉酶、6 - a p a 、丙烯酰胺、丙酮、丁醇、碱性蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、纤维素酶、 乙醇、胞外几丁质酶、胞外木聚糖酶、氢气、乳酸、左旋天冬醯胺、乳酸链球菌肽、果胶 酶、6 一烷基廿吡喃酮、生物表面活性剂、枯草菌素、毒素等 7 4 _ 9 0 】。产物的产量都有明显 的提高，而且产物可以达到很好的分离效果，例如胞外几丁质酶产量比传统发酵技术高 3 1 倍，细胞分布在上相，产物在下相。由于豆豉纤溶酶的发酵与分离萃取合为一体，因 此该技术易于连续操作，使之与传统的发酵分离手段有着明显的优势。豆豉纤溶酶传统的 深层液态发酵法容易引起发酵终产物即酶的反馈抑制，从而导致发酵产物产量不高。利用 双水相进行发酵不仅解决了发酵产物反馈抑制的问题，而且发酵产物特别是酶等大分子物 质在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳定，故能最大程度地保证所产生的纤溶酶的活力，而 且操作简单、成本低廉，适用于工业化连续生产，具有广泛的研究价值和良好的发展前景。 s a s ( s t a t i s t i c a l a n a l y s i ss y s t e m ) 软件是包括数据的统计分析、运筹问题的科学计算等大 量模块的集成软件系统。p l a c k e t t b u n l l a n 设计法是一种近饱和的2 水平试验设计方法。它基 于非完全平衡块原理，能用最少的试验次数考察2 4 7 个因素，估计出因素的主效应，从 众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究。该方法数据处理 简单，与目前常用的部分因子试验和随机平衡试验相比，该法筛选重要因素最为高效、准 确。响应面法( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d 0 1 0 9 y ，r s m ) 可同时对影响生物产量的各因子水平及 1 1 江南大学硕士学位论文 其交互作用进行优化与评价。因此它可快速有效地确定多因子系统的最佳条件。该法已经 广泛地应用于各类培养基以及发酵条件的优化。两种设计的先后应用，既经济省力，优化 效率又高，且处理数据由计算机完成。数据中隐含的规律用立体图直观表示出来，并用数 学模型描述，从而揭示深层次的规律。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌种 豆豉纤溶酶高产突变株u d 8 为本实验室从豆豉中筛选得到的芽孢杆菌属b 日c 川淞 印，经过紫外线、”c o 、硫酸二乙酯( d e s ) 诱变处理，产酶能力为2 1 3 5 6 i u m l ；2 0 0 5 年1 0 月，实验室搬迁，因保藏条件不善导致菌种退化，因此，在双水相发酵试验中不得 不采用初筛时获得的菌种d c 2 ，产酶能力为2 3 55i u m l 。 2 2 2 培养基 2 2 2 1 菌种传代保藏培养基( g l ) 麦芽糖1 5 ，豆浆5 0 0 m l ，酵母膏1 5 ，k h 2 p 0 4l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 02 5 ，m g s 0 4 - 7 h 2 05 ， c a c 0 14 ，琼脂2 5 。 2 2 2 2 种子培养基( g l ) 蔗糖2 0 ，蛋白胨2 0 ，k h 2 p 0 4l ，k 2 h p 0 4 3 h 2 06 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ，c a c l 2o 4 ，培 养基配制、分装后1 2 l 下灭菌2 0 m i n ，下同。 2 2 2 3 发酵培养基( 2 l ) 蔗糖2 0 ，蛋白胨2 0 ，k h 2 p 0 4 1 ，k 2 h p 0 4 3 h 2 04 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ，c a c l 2o2 2 2 3 主要试剂及仪器 蔗糖 葡萄糖 磷酸二氢钾 硫酸镁 氢氧化钠 盐酸 麦芽糖 乳糖 糊精 可溶性淀粉 磷酸氢二钾 琼脂糖 酒石酸钾钠 玉米浆( 工业级) 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海化学试剂总厂 上海试剂二厂 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 本实验室提供 第二章豆豉纤溶酶发酵条件的优化 十二烷基磺酸钠( s d s ) ( 分析纯) 胰蛋白胨 聚乙二醇p e g 4 0 0 ，1 0 0 0 ， 2 0 0 0 ，4 0 0 0 ，6 0 0 0 ，1 0 0 0 0 t w e e n 4 0 t w e e n - 8 0 s p a l l 蛋白胨 酵母浸膏 中国上海青浦县新产品研究所 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 l s b 5 0 l 立式圆形压力蒸汽灭菌器 p y x d h s 隔水式电热恒温培养箱 回转式恒温调速摇瓶柜 干热灭菌箱 s w c j 一1 0 型洁净工作台 离心机 h 1 微型混合器 f a l l 0 4 分析天平 2 2 4 培养方法 上海医用核子仪器厂 上海跃进医疗器械厂 上海欣蕊自动化设备有限公司 上海市仪器厂 苏州净化设备厂 上海安亭科学仪器厂 上海沪西仪器厂 上海天平仪器厂 2 2 4 1 种子培养方法 挑一环菌体于5 0 m l 种子培养基2 5 0 m l 三角瓶中，3 0 、1 5 0r m i n ，。培养2 4 h 。 2 2 4 2 发酵用培养方法 发酵