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浙江大学硕士论文乳酸菌冻干保活关键技术研究 摘要 随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展，积极研究并大力开发高效浓缩型酸奶 发酵剂，对于推动我国乳酸菌发酵剂产业化进程、促进我国发酵乳制品工业的发 展，具有重要意义。本文介绍了乳酸菌的众多功能，阐述了冷冻干燥机理和影响 因素，在实验过程中对优良乳酸菌种进行了高密度发酵，研究了乳酸菌细胞浓缩 收集、真空冷冻干燥的工艺技术；初步探索了乳酸菌在冷冻干燥过程中存活的适 宜条件；分析了冷冻干燥后保藏及复活的有利因素。 发酵剂的制备是酸奶生产中的关键技术，而发酵液中菌体细胞的分离技术则 是制备乳酸菌冻干制剂重要的中间工艺。本实验通过研究离心力、离心时间对乳 酸菌离心损失的影响，确定了菌体细胞浓缩分离的最适离心条件：离心力5 1 0 0 9 ， 离心转速6 0 0 0 r m i n ，离心时间1 0 r a i n 。 本文采用冷冻干燥技术，研究了冻干厚度、干燥时间等冻干工艺参数，在预 冻上采用液氮预冻的创新方法，发现液氮预冻效果要比普通预冻效果要好，而且 当预冻时菌液液滴表面积越大活菌数越高，由此确定了冻干的工艺。 在保护剂筛选中，针对乳酸菌的特性选取多种保护剂进行实验，筛选出4 种 优良冻干复合保护剂配方，脱脂乳1 5 ，海藻糖4 ，维生素c 1 ，谷氨酸 钠1 5 ( 均为质量分数) ，此保护剂使嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球 菌的冻干存活率达到8 9 1 0 、8 7 9 6 和8 8 1 3 。 最后比较了乳酸菌冷冻干燥后保藏及复活的影响因素，得出生理盐水为较好 复水介质，而在操作过程中要控制氧气的含量、水活度等条件，以便得到更高的 乳酸菌活菌数。 关键词：乳酸菌；真空冷冻干燥；保护剂；存活率；液氮预冻；活菌数 i i 浙江人学硕士论文 乳酸菌冻干保活关键技术研究 a b s t r a c t w i t ht h er a p i d l yd e v e l o p m e n to ff e r m e n t e dd a i r yp r o d u c ti n d u s t r y , i t ss i g n i f i c a n tf o rp r o m o t i n gt h ei n d u s t r i a lp r o c e s so fl a c t i ca c i db a c t e r i as t a r t e rc u l t u r e ，i m p r o v i n gd e v e l o p m e n t o ff e r m e n t e dd a i r yp r o d u c t i nt h i sp a p e r , i th a si n t r o d u c e dm a n yr u n e t i o n so fl a c t i ca c i db a c t e r i a ( l a b ) ，e x p o u n d e dt h em e c h a n i s ma n di n f l u e n c ef a c t o r so ff r e e z e d r y i n g a f t e rh i g hd e n s i t yf e r m e n t i n gl a b ，i tr e s e a r c h e dt h ee r i e c to fc e n t r i f u g i n gf o r c ea n dt i m eo nt h el o s sr a t e so fl a c t i ca c i db a c t e r i a ；q u e s t e dt h et e c h n i q u e so ff r e e z e d r y i n gt e c h n o l o g y a n dg o o dc o n d i t i o n sf o rl a c t i ca c i db a c t e r i a ；a l i a l y z e dt h ea d v a n t a g e df a c t o r sd u r i n gp r e s e r v ea n d r e s u r r e c t i o n t h ep r e p a r a t i o no fs t a r t e ri st h ek e yt e c h n o l o g yo fy o g h u r tp r o d u c t i o n ，a n dt h es t e po fs e p a r a t i n gc e l li st h ei m p o r t a n tp r o c e s sf o rl a bs t a r t e r t h r o u g h r e s e a r c h i n gt h ee f f e c to fc e n t r i f u g i n gf o r c ea n dt i m e ，w eo b t a i n e dt h eo p t i m u mc e n t r i f u g a lc o n d i t i o n sf o rl a c t i ca c i d sb a c t e r i a ：c e n t r i f u g a lf o r c e i s510 0 9 ，r o t a t es p e e di s 6 0 0 0 r m i n ，c e n t r i f u g a lt i m ei s1 0 m i n w er e s e a r c h e dt e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r so ff r e e z e - - d r y i n gt e c h n o l o g y ：f r e e z e d r y i n gt h i c k n e s s ，d r y i n gt i m ea n ds oo n ，s c r e e n e do u tf o u re x c e l l e n tc o m b i n ep r o t e c t i v em a t e r i a l s ：s k i mm i l k15 ，t r e h a l o s e4 ，v i t a m i nc1 ，m s g1 5 w i t ht h i sp r o t e c t i v em a t e r i a l s t h es u r v i v a lr a t eo f l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 、l a a c i l l u sb u l g a r i c u sa n d & t h e r m o p h i l u sc a nr e a c h8 9 1 0 、8 7 9 6 a n d8 8 13 i na d d i t i o n w er e s e a r c h e dt h ee f f e c tu n d e rd i f f e r e n tw a y so f p r e f r e e z i n g ，g o tt h ec o n c l u s i o nt h a tt h ep r e f r e e z i n gw i t hl i q u i dn i t r o g e ni sb e t t e rt h a nn o r m a lw a y a n dt h es m a l l e rt h es u r f a c ea r e ao fb a c t e r i ad r o p s ，t h eb e t t e rt h ev i a b l ec o u n ti s f i n a l l y , c o m p a r e dt h ee f f e c tf a c t o r so fp r e s e r v ea n dr e s u r r e c t i o na f t e rf r e e z e - d r y i n gt e c h n o l o g y , w ef i n e dt h ep h y s i o l o g i c a ls a l i n ei sag o o dm e d i u mo fr e h y d r a t i o n ，w h a t sm o r e ，c o n t r o l l i n gt h ec o n t e n to fo x y g e na n dw a t e ra c t i v i t yi si m p o r t a n tw a yt og e t h i g h e r1 a c t i ca c i db a c t e r i av i a b l ec o u n t k e y w o r d s ：l a c t i ca c i db a c t e r i a ；f r e e z e d r y i n gt e c h n o l o g y ；p r o t e c t i v em a t e r i a l ；s u r v i v a 1r a t e ；p r e f r e e z i n gw i t hl i q u i dn i t r o g e n ；v i a b l e i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝婆太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙婆太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月 日 签字日期： 年月日 致谢 本论文是在导师何国庆教授的悉心指导下完成的。无论在工作中还是生活上 何老师都给我了无微不至的关怀和帮助。整篇论文，从选题，方案设计、实验跟 进到论文的最终成形，每个细节无一不凝聚着导师的心血和汗水。何老师为人宽 厚谦逊、治学严谨、视野开阔，对待学生更是既热心又耐心，不仅在科研上给我 了很大的帮助和启发，还教会了我如何为人处世、如何面对人生中的困难与挫折， 使我受益匪浅。在此，谨向导师致以崇高的敬意和衷心的感谢! 感谢何老师的知 遇之恩，栽培之情! 衷心感谢陈启和副教授、阮晖副教授和科技楼王华老师给我的帮助，在实验 的思路和操作上都给了我很多的指导和帮助，在此，对他们表示诚挚的感谢。同 时，感谢食品系郑晓冬老师、冯凤琴老师、陈忠明老师、冯谰老师、尹源明老师， 应铁进老师，在实验上给予的帮助和指导。 感谢刘彩琴博士、张强博士、王金玲博士、王伟博士、张洪波博士、郭钦博 士、傅伟硕士、王凤平硕士等已经毕业的师兄师姐对我的帮助和鼓励。感谢课题 组的同学们：张伟博士、陈继承博士、李青青博士、刘佩博士! 卢小风博士、苏 忠锐博士、鲁建章博士、陈美玲博士、邹平博士、马颀博士、章海锋硕士、张佳 佳硕士、陈路清硕士、刘虹硕士、陈凡硕士、林吉恒硕士、周倩硕士、吴晶晶硕 士、姚超硕士在平时实验过程中的帮助。 特别要感谢乳酸菌组的李青青博士、穆林硕士、叶雪飞硕士、朱承亮硕士在 实验和生活中给我的支持和鼓励，不仅让我的实验能够顺利地完成，也让我学会 了统筹规划和团队协作。 最好感谢所有关心和帮助过我的老师、同学、朋友和亲人们! 朱东升 2 0 10 年1 月 浙江大学硕士论文乳酸菌冻千保活关键技术研究 1 1 乳酸茵的功能与应用 第1 章绪论 乳酸菌在人，畜、禽的肠道和许多食品、物料以及少数j 胳床样品中广泛存在。 乳酸菌能提高食品的营养价值，改善人体肠道功能、增强免疫力等作用。近年来 乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，不断被人们所重视。大量研究表明，乳酸菌 有纵多有益与人体的功能，其生理功能与机体的生命活动息息相关。如有日本学 者研究发现，乳酸茵具有对龋齿和牙周病的预防效果。其多次实验证明，从健康 人口腔中分离出的乳酸菌l s l 有抑制龋齿菌活动、阻碍牙周病菌增殖的作用【1 】。 另有研究表明，乳酸菌在肠道中通过代谢产生乳酸，能抑制有害细菌的生长和繁 殖，维持肠内生态平衡和肠道的正常机能，还能刺激肠道蠕动，增加粪便含水量， 润肠通便，这一功能正符合清除肠中垃圾之所需，而且它对溃疡、下痢、腹泻、 便秘也有显著治疗效果，其作用温和自然，不同于市面上的轻泻剂【2 1 。 乳酸菌一般不会运动，在自然界中种类多，分布广。到目前为止，这类细菌 共发现了5 9 种，分别归属于乳链球菌及乳杆菌两大家族。随着高新技术的不断发 展和人类社会的日益进步，乳酸茵对人体健康的有益作用，越来越受到社会各界 特别是研究领域和生产企业的广泛关注。因此，乳酸菌的开发利用具有了重要的 意义。 1 1 1 乳酸菌的功能 乳酸菌具有强抗酸能力，如在含糖丰富的食物制作中，虽然其他很多的菌类 也能生长，但因乳酸菌不断地产生乳酸使得环境变酸而杀死多种不耐酸的细菌。 大部分乳酸菌具有很强的抗盐性，都能耐5 以上的n a c l 浓度。如嗜盐链球菌甚 至能在浓度为1 5 1 8 的盐水中生存。这样在腌制品中其他不抗盐的有害菌不能生 存而独有乳酸菌能正常生长，增加了食物的风味。据最近几年研究资料表明乳酸 菌作为定居肠道中的有益菌群具有以下几种功能3 。1 们。 1 1 1 1 具有营养作用 乳酸菌利用可发酵糖，产生酸味柔和的乳酸、醋酸、丙酸等有机酸及醇、醛、 酮多种风味物质。它们在赋予制品酸味的同时，使制品具有更佳的风味。食品原 料经乳酸菌发酵后，能使其蛋白质、脂肪和糖类改善性质或分解为人体所更易消 浙江大学硕上论文乳酸菌冻干保活关键技术研究 化吸收的状态，同时还能增加可溶性钙、磷、铁和某些b 族维生素的含量，提 高它们的消化吸收性能和营养价值。 1 1 1 2 改善肠道的作用 乳酸菌进入人体消化道后，可在肠道内繁殖，产生乳酸、乙酸和一些抗菌物 质，使肠道的p h 值和氧化还原电位降低，从而能抑制致病菌和有害于人体健康 的有害菌的生长繁殖，可起到抗菌防病的作用。同时，乳酸菌的大量生长繁殖也 维持了肠道菌群的平衡，起到了整肠作用。 1 1 1 3 抗肿瘤作用 一些乳酸菌如双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等能耐受胃部不利的酸性条件而到达肠 道，这些菌能抑制一些结肠中的细菌酶，特别是那些能促进前体致癌物向致癌物 转化的酶。另外，致癌作用是通过致癌物诱导动物细胞突变开始的，一些乳酸菌 可抑制动物细胞的突变。其作用的方式是抑制致突变的酶的活性及对一些致癌物 本身的抑制。活性的降低就意味着致癌物形成机率的减少。如前所述，到达肠道 的乳酸菌在肠道内进行发酵，降低了肠内p h 值，增加了肠的蠕动，使肠道内的 致癌物及其前体能尽早排出体外，降低其发病可能性。 1 1 1 4 降低胆固醇作用 乳酸菌菌体成分或菌体外代谢物有抗胆固醇因子。乳酸菌的代谢能显著减少 肠管对胆固醇的吸收，同时，乳酸菌吸收部分胆固醇并将其转变为胆酸盐排出体 外。实验证明，用乳酸菌发酵的乳清饲养老鼠6 周后，与对照组相比，血清胆固 醇值最低，且有较高的g s h p x 活性。红细胞中的抗氧化酶( s o d 和c a t a l a s e ) 活 性最高。 1 1 1 5 增强免疫力的作用 摄入特定的乳杆菌可以增强机体的免疫反应，增强宿主对肠道感染的抗性。 研究认为摄入的乳杆菌可以激活巨噬细胞，巨噬细胞可破坏机体中的病原微生 物。免疫系统的增强增加了宿主的防御能力，这是益生菌用于保健食品控制肠道 感染的主要理论依据。 1 1 2 乳酸菌的应用 在食品工业上，主要利用乳酸菌的发酵作用来生产发酵食品，经过乳酸菌发 酵的食品具有货架期长、风味独特、营养丰富、易消化吸收等特点。 2 浙江大学硕： 二论文乳酸菌冻干保活关键技术研究 1 1 2 1 用于食品保藏、防腐 乳酸菌发酵产生的主要代谢产物乳酸，对食品有防腐的作用。此外，在发酵 过程中还产生一些抑菌物质如乳链球菌肽、乳杆菌素、嗜酸菌素等，可抑制引起 食品腐败的微生物的生长，因而提高了产品的可保藏性，延长了货架期。研究表 明，许多乳酸菌在食物基质中可产细菌素 i 1 - 1 3 】，可抑制腐败菌或致病菌，是由于 细菌素是低分子量的肽或蛋白质，它们可抑制有较近亲缘关系的革兰氏阳性菌。 在食物基质中原位产生细菌素可增加产生菌的竞争力并有助于食品防腐【1 4 】。例 如，产细菌素乳酸菌作为硝酸钾的替代物用于防止由于梭菌污染而造成的奶酪后 损失 1 5 】此外，许多细菌素对于食物中的病原体也能起抑制作用。 1 1 2 2 改善食品的风味 乳酸菌在发酵中产生的乳酸、醋酸、丙酸等有机酸，赋予食品柔和的酸味， 同时还可与发酵中产生的醇、醛、酮等物质相互作用，形成多种新的呈味物质。 此外，乳酸菌还能分解蛋白质( 乳酸菌含蛋白分解酶) 产生呈味物质肽与氨基酸， 兼可消除某些原料带来的异味和怪味。因而经乳酸发酵的食品都具有其独特的风 味。 1 1 2 - 3 加工乳制品 传统的食品如酸奶、奶酪是通过乳酸菌发酵产生的。利用乳酸菌发酵牛奶等 乳制品，其历史悠久。但是，近几年国外( 俄罗斯、波兰和日本等) 利用双歧乳杆 菌生产乳制品甚为活跃1 6 1 ，利用双歧乳杆菌发酵乳制品具有醇美的酸味，无苦味， 含有生理价值的左旋乳酸，使食用者肠道具有有益菌的特点，但有一定的醋酸味、 酸生成缓慢、p h 低、双歧乳杆菌易死亡等缺点。因此，在牛乳发酵中采用双歧 乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌混合发酵。改用此种乳制品可以治疗消化不良、 胃肠炎、便秘等。乳酸菌在干酪的生产中，通过产酸有凝乳作用，乳酸菌的自溶 也可以使大量的胞内酶得以释放，加速干酪的成熟过程，缩短成熟周期，降低成 本，提高生产效益。 1 1 2 4 腌制菜类食品 酸菜的酸味是由乳酸菡产生的。在制酸菜的过程中，乳酸的产生菌主要是黄 瓜发酵乳酸茵、胚芽乳杆菌和短乳杆菌等，若接入适量优良的乳酸菌，能提高腌 菜的芳香味，改善酸菜的风味及保藏性，低盐渍物含食盐1 以下时，用0 1 2 的 浙江大学硕上论文乳酸菌冻千保活关键技术研究 乳酸进行补充，能防止产膜酵母及醋酸菡的异常增加，抑制异臭的发生。最近， 日本在应用乳酸菌开发一种新产品k m ，是以乳酸菌为主体的微生物发酵后急速 冷冻干燥的成品。k m 对渍物有p h 缓冲作用，保持食品p h 稳定；防嫌气性有害细 菌的增殖，改善溃物香味、风味、除去原料生成的生臭味，保持食品色与新鲜度， 还可防止由有机酸造成的食品中蛋白质、维生素、胡萝卜素、叶绿素的损耗，能 使腌渍物色、香、味、体综合质量明显提高【1 7 】。 1 1 2 5 发酵制作酒类 在白酒的酿造过程中，有部分乳酸菌( 链球菌和乳杆菌) 参与。乳酸菌利用糖 类生成乳酸，在酶的参与下，乳酸与乙醇酯化，形成乳酸乙酯，丰富白酒风味， 提高白酒的品质。在葡萄酒的贮存过程中，由于明串珠菌等乳酸菌的生长繁殖， 使葡萄酒中的主要酸之一苹果酸，发生脱羧基作用，生成乳酸，这种发酵可降低 葡萄酒的酸度，特别是在低温地区酿制葡萄酒，这种发酵更为必要，由于经过苹 果酸乳酸发酵，风味更好。 在啤酒的酿造过程中，乳酸菌产乳酸可以用来生产酸化麦芽和酸化麦汁，经 过生物酸化处理的啤酒具有较浅的色度，较多的含氮物质和非常适宜的多酚组 成。这些多酚与含量较高的还原物质共同作用而使啤酒具有良好的抗氧化性能， 并且会使啤酒的口味柔和，具有杀口感。而且经生物酸化可以提高酿造用水的酸 度、淀粉酶的活性和啤酒的最终发酵度，有利于蛋白质的酶解，改善麦汁的过滤 性能，提高啤酒的非生物稳定性和生物稳定性【1 8 】。米酒是低度饮料酒，口感醇和， 富含多种氨基酸及其营养成分。发酵米酒的细菌以乳酸菌为主，米酒中的酸味主 要来源于乳酸菌所产生的乳酸，另外乳酸与乙醇反应生成酯类是米酒重要的风味 物质，同时乳酸菌代谢过程中也产生乙醛和双乙酰，赋予米酒特殊的风味。控制 乳酸菌的数量不但能够缩短米酒发酵周期，同时也能控制米酒生产中质量的稳定 牲【1 9 】 1 - l 1 1 2 6 酿制酱油、醋等调味品 在酿制酱油过程中，人工接种乳酸菌能使酱油香气浓、风味佳、质地好。据 日本研究，酱醪中细菌主要是乳酸菌，不仅能在曲中生长繁殖，而且能促进酱醪 成熟，能分解葡萄糖生成乳酸，生成的乳酸再与酵母生成的乙醇反应生成酱油的 特殊香味物质乳酸乙酯。乳酸菌与鲁氏酵母加入酱醪中能增加酱醪中的正丙醇、 4 浙江大学硕士论文乳酸菌冻干保活关键技术研究 异丁醇、氨基酸含量提高酱味香。近年来，国内对提高酱油风味的研究表明，添 加乳酸菌的途径，归纳起来有：一是利用混合曲；二是利用糖液培养耐盐产酯酵 母和乳酸菌，最后配人低盐固态发酵的酱油内，以提高其香味；三是在发酵后期 温度降至t j 3 5 c 左右，把耐盐酵母和乳酸菌均匀地接入酱醅中，继续发酵。结果以 上途径都取得了不同程度的增香效果。醋的酿造主要以淀粉为原料，液体深层发 酵制酷时，加入乳酸菌和酵母菌提高风味。乳酸菌代谢产生的有机酸、双乙酰及 其衍生物是食醋中主要的风味物质。另外乳酸菌产生的低级脂肪酸、羰基化合物 两者的香气成分成为一体，形成较复杂的香气，所以利用乳酸菌和酵母菌协同发 酵，醋的风味好，营养价值较高。 总之，利用乳酸菌提高酿造和发酵食品的风味越来越引起了国内外人们的重 视。乳酸菌的应用也随着研究技术的不断进步涉足领域越来越广泛。相信今后乳 酸菌的应用将更上一台阶。 1 2 乳酸菌的冷冻干燥 1 2 1 冷冻干燥原理 物质中所含水分以两种方式存在：( 1 ) 游离水即机械结合水和物化结合水；( 2 ) 结构水，即以化学结合方式存在于物料的组织中。冷冻干燥主要是升华游离水， 而不是结构水。升华游离水是先将它冻结成冰，然后在真空中加热升华。当压力 增加时，冰的熔点降低。三相平衡点时表示在这个温度和压力时，冰、水、汽三 相同时共存。此时它的精确温度是0 0 0 98 c ( 近似0 0 1 ) ，压强为6 1 0 5p a 。显 然，当压强低于6 1 0 5p a 时，不管温度如何变化，只有固态和气态。压力和温度 低于三相点时，物质可由固相不经液相直接变为气相，这个过程即为升华。例如 将- 4 0 c 冰面上的压力降低到1 3 3p a ，则水即从固态的冰直接变为水蒸汽。同理， 如将- 4 0 c 的冰在1 3 3 3p a 时加热到2 0 c 。也能发生升华现象。所以在此条件下 升高温度或降低压力都可打破两相平衡，使整个系统朝着冰转交为水蒸汽的方向 进行。冷冻干燥就是根据这个原理，使冰不断变成水蒸汽，将水蒸汽抽走最后达 到干燥的目的。 1 2 2 真空冷冻干燥步骤 产品的预冻：预冻必须在升华干燥前把所有产品冻实。预冻温度低于共晶点 i o c 左右即可，对于无条件检测共熔点的企业可将最低温度定为3 5 c 左右，预 浙江大学硕上论文 乳酸菌冻干保活关键技术研究 冻时间一般在2 4 h 之闻这一阶段要考虑到冻干产品的质量和冻干的经济性，需要 对降温速率进行控制，因为产品冻干后的外观与预冻过程中降温快慢有关。如慢 冻后晶格较大，冰晶呈六角对称型，有利于提高冻干效率；而速冻则呈树枝不规 则成型或呈球型，间隙小，升华时阻力大，不利于冻干。因此这一阶段所形成的 晶型结构要合理，易升华，并且确保冷冻的产品温度在共熔点温度以下，产品完 全冻实，否则真空升华时，会发生沸腾或鼓泡现象。 升华干燥：即第一阶段干燥。升华前必须在3 0 r a i n 使冷凝器温度达n - 4 0 c 以下( 一般在5 0 c 最为经济) 。开启真空泵，然后将冻干箱与冷凝器之间的大蝶 阀缓缓打开，待冻干箱内真空度达到1 0p a 左右转入加热升华干燥。真空度太低会 影响升华速率，一般可控制在2 0 - 4 0p a 。开启油加热器，后开循环油泵，使油液 在搁板内循环加热。这一阶段要注意：产品冷冻的温度应低于产品共晶点温度并 确保产品冻牢。超过共晶点，将会造成融化降解，色级加深，含量减低，如氨苄 西林钠在冻干过程的主干燥阶段一直保持低温状态，二期干燥阶段由于真空度降 低，可升高搁板温度使产品温度升高，但必须低于其崩解温度，这样有利于减低 残留的少量水分。 解析干燥：即第二阶段干燥。该阶段的干燥温度上升到设定的最高温度，各 板层制品温度达到加热最高温度，其曲线基本一致，继续保温干燥一段时间，干 燥过程即可结束。冻干结束时，以冻干箱内真空度变化幅度，决定产品水分的高 低，找出压力升高值和水分的对应关系，即可自动控制产品水分达到要求。若选 用冻干机一定，冻干不同产品设定的压力升值相同，产品的水分不同：同一产品 加入的料液量不同，要想使产品水分控制相同，压力升值不同。 1 2 3 乳酸菌冷冻干燥保护剂 冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使样品交性，如低温应力、冻 结应力和干燥应力。冷冻干燥过程会造成乳酸菌的细胞膜通透性改变、蛋白质变 性失活、p h 的动态平衡被破坏、d n a 损伤和膜脂肪酸组成发生改变等【2 0 1 。在发 酵剂的生产过程中，不适当的冷冻干燥处理过程会造成产品发酵活力降低，产品 质量不稳定：因此，为了保护产品的活性，通常在冻干过程中采取保护措施。 1 2 3 1 冷冻干燥对细胞的损伤机理 冷冻干燥对蛋白质的影响。蛋白质的折叠与展开状态的平衡受周围物理环境 6 浙江大学硕士论文乳酸菌冻千保活关键技术研究 ( 如温度、溶剂组成、水合水平等) 的影响很大。干燥过程中蛋白质失水，使原来 与水形成的分子问氢键断开，多肽链展开，造成蛋白质变性而失去生物活性。冷 冻干燥分为冷冻和干燥两步，其中冷冻与干燥引起的蛋白质变性的机理各不相同 【2 。在冷冻过程中蛋白质的变性机理包括低温变性和冷冻变性两类 2 甜。s h i k a m a 和y a m a z a k i 于2 0 0 0 年首先开始定量研究低温对蛋白质模型的影响，他们研究发现 牛肝过氧化氢酶在不同的低温条件下活性保留程度不同。低温能够引起变性的原 因是：非极性基团在水中的溶解度随温度的降低而增加，从而导致蛋白质中的疏 水作用减弱 2 3 1 。冷冻变性主要受浓缩影响、冰水界面的影响、p h 值变化的影响 和相分离的影响。对不同蛋白质来说，这些影响可能同时起作用，或只有部分因 素起作用。 冷冻干燥对细胞膜的影响。一冷冻干燥会造成微生物细胞膜的损伤( 其中包括 机械损伤、溶质损伤、细胞膜渗透性损伤、d n a 损伤导致蛋白质变性失活) ，p h 的动态平衡被破坏，以及细胞膜脂肪酸组成的变化。这些损伤多是通过膜脂性质、 结构的变化使膜的流动性或完整性发生改变，从而导致膜的功能失调。通常细胞 膜中磷脂的极性端常以水合形式存在，而且每个磷脂的极性端与其它磷脂分子的 极性端被水分子隔开。当磷脂干燥脱水时，极性端除去水合氢键，迫使酰基聚集 在一起，使极性端的密度增加，范德华力增强，平时处于液晶态的脂膜变成凝胶 态；复水时细胞膜的通透性增加，胞内一些可溶性物质发生渗漏，细胞膜内外失 去离子平衡，从而导致细胞死亡。冻干过程中，细胞膜脂肪酸的不饱和度、脂肪 酸链的长度、链的分支状态或环绕状态都存在着动态变化，脂肪酸的这些动态变 化与膜的流动性密切相关【冽。 1 2 3 2 保护剂的作用 对于细胞在冻干过程中的低温保护，目前被广为接受的液体状态下蛋白质稳 定的机理之一是优先作用原理，指蛋白质优先与水或水溶液中的保护剂作用。在 有起稳定作用的保护剂存在的条件下，细胞膜蛋白优先与水作用( 优先水合) ，而 保护剂优先被排斥在蛋白质区域外( 优先排斥) ，在这种情况下，膜蛋白表面就比 其内部有较多的水分子和较少的保护剂分子。优先作用原理同样适用于冷冻一融 解过程，蛋白质保护剂在溶液中被从蛋白质表面排斥，在冻结过程中能够稳定蛋 白质。但是优先作用机理不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋 浙江大学硕十论文 乳酸菌冻干保活关键技术研究 白质的现象；在冻干过程中，由于蛋白质的水合层被除去，优先作用机理不再适 用。对于冻干保护机理，仍在研究探讨之中。目前主要有两种假说：1 、水替代 假说许多研究者认为。由于蛋白质分子中存在大量氢键。结合水通过氢键与蛋白 质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替代蛋白 质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，这样可保护氢键的联 结位置不直接暴露在周围环境中。从而稳定蛋白质的高级结构，防止蛋白质因冻 干而变性，使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持蛋白质结构与功能 的完整性。2 、玻璃态假说玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种固体状态， 粘度极大，一般为( 1 0 1 2 1 0 1 4 ) p a s ，是固化了的液体，但由于粘度大，分子运 动受到限制，流动性差；液体被固化成玻璃态时的温度l g p t g 。如果初始浓度较高， 且降温速率很高，溶液来不及析出冰，冻结过程中，溶质不出现结晶析出现象， 而是趋向一种由液态一橡胶态一玻璃态的转变。研究者认为，在含保护剂溶液的干 燥过程中，当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂一水混合物就会玻 璃化。研究发现在玻璃态下，物质兼有固体和流体的行为，粘度极高。不容易形 成结晶，且分子扩散系数很低。因而具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围， 形成一种在结构上与玻璃状的冰相似的碳水化合物玻璃体，使大分子物质的运动 受阻，阻止膜蛋白的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定。从而起到保 护作用目前大部分学者赞同“水替代假说”，因为可以通过实验检测到膜蛋白和 保护剂之间的氢键作用。为理论提供证据。事实上，无论是“水替代假说”还是 “玻璃态假说”，它们的基础都是基于细胞实现了部分或全部玻璃化冻结。 1 2 3 3 冷冻干燥保护剂种类 保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干 燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性【2 5 1 。冻 干保护剂不仅影响冻干过程中的细胞存活率，还影响到保藏期间蛋白质及细胞的 稳定性。冻干保护剂可按照不同的方式进行分类。按其是否能渗到细胞内部，可 分为渗透型和非渗透型两种。按其是否能通过细胞壁或细胞膜，又可细分为：( 1 ) 既能透过细胞壁又能透过细胞膜的保护剂( 如甘油) ；( 2 ) f i g 透过细胞壁但不能透 过细胞膜的保护剂( 如单糖、部分双糖、氨基酸) ；( 3 ) 不能透过细胞壁和细胞膜 的保护剂( 如海藻糖、多糖、聚乙二醇等) 1 2 6 。渗透型保护剂在溶液中易结合水分 浙江大学硕i ：论文乳酸菌冻干保活关键技术研究 子，通过水合作用使溶液的粘性增加，弱化了水的结晶过程，从而达到了保护细 胞的目的。各种保护剂的使用浓度、渗入细胞的能力，以及对水分子活性的影响 等各不相同。非渗透型保护剂不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，即可在特定 温度下降低溶质浓度，从而起到保护作用【2 7 1 。根据其化学性质，保护剂又可分为 多羟基化合物、糖类、氨基酸、聚合物、蛋白质等几大类。 1 3 影响乳酸茵冻干发酵剂活力及储藏稳定性的主要因素 1 3 1 菌种悬液的浓度 在冻干技术中，为了保证在长期保藏后有足够数量的活细胞，通常采用浓度 较大的菌悬液，细菌和放线菌浓度一般要大于1 0 8 c f u m l ，酵母菌细胞和霉菌 孢子的浓度大于1 0 7 c f u m l ，这样在菌种复活时只要能保证有0 1 的细胞仍然 有活力就可以完成菌种传代过程。但是c o s t a 等也有报道冻干培养物的最佳浓度 与保护性培养基相关，例如当保护培养基中加入蔗糖时，冻干培养物浓度以 1 0 1 0 c f u m l 最佳，而保护性培养基中加入脱脂乳时，培养物最佳浓度为1 0 8c f u m l 2 8 1 。p a l m f e l d t 等也报道了当在保护培养基中增加蔗糖浓度时，可以降低茵 悬液的浓度，以达到最高的细胞存活率【2 9 】。 1 3 2 冻干菌种材料的菌龄 冻干菌种材料的菌龄对其在长期真空冷冻干燥保藏后的细胞存活率有重要 影响，例如鼠李糖乳杆菌在生长稳定期进行冷冻干燥，其菌株细胞存活率最高为 3 1 5 0 ，而在对数生长期为1 4 ，在延滞期仅有2 【3 0 1 。相反对s i n o r h i z o b i u m 和b r a d y r h i z o b i u m 在延滞期进行冻干，其存活率较高。研究表明：处于稳定期的 细胞或成熟的孢子对不良环境具有较强的抗性，因而，保藏非芽孢细菌、酵母菌， 应采用对数末期或稳定初期的细胞；而保藏芽孢细菌、放线菌和霉菌，要用成熟 的孢子。 1 3 3 培养基的影响 实践证明，由于各类食品微生物菌种之间生物学特性存在较大差异，要对其 进行冻干保藏，往往需根据菌种的特性对冻干培养基进行优化，提高微生物细胞 的存活率，延长菌种保藏期；如h u a n g 等在对l b u l g a r i c u s 进行冻干保藏时，在保 护培养基中加入山梨醇、脱脂乳等抗冻剂，细胞存活率提高到了8 6 5 3 【3 l 】。 c a a m o 等的研究表明，选择不同的生长培养基对保藏菌种的存活率也有重要的 浙江大学硕士论文乳酸菌冻干保活关键技术研究 影响，3 l o l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s 菌株的生长培养基中加入甘露糖时，其经冻干后 细胞存活率比加入果糖，乳糖以及葡萄糖要高，同时也显示了在培养基中添加4 种碳水化合物，均可以提高对冻干菌株的保护作用【3 2 1 。但同一菌种在相同成分的 培养基中培养，其为液体或固体培养对微生物的存活率影响不大。 1 3 4 冻结速度 在真空冷冻干燥保藏菌种的过程中，冻结速度是影响微生物存活率的重要因 素，不同微生物最佳冷冻速度不同，其主要原因是冻结速度必须与微生物细胞对 水分的渗透率相平衡，而细胞对水分的渗透率取决于细胞表面积与体积的比率以 及细胞膜的渗透率。当冷冻速度过慢时，细胞严重脱水，细胞体积严重收缩，超 过一定程度时细胞将失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结 冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度过高，产生溶质损害；当冷冻速度过 快时，细胞内的水分来不及外渗，会形成较大冰晶，使细胞膜及细胞器遭到破坏， 造成细胞内冰晶机械损伤。另也有研究报道，冷冻速度在5 。c r a i n 1 8 0 。c m i n 之间 时，冷冻过程中胞内水分会完全渗出细胞，胞内不会出现结晶，细胞存活率较高； 当冷冻速度大于5 0 0 0 。c m i n 时，胞内水分迅速形成结晶，不发生外渗，细胞存活 率也比较高；但是如果冷冻速度在1 8 0 。c m i n 5 0 0 0 。c m i n 之间时，细胞内水分 容易在外渗过程中形成结晶对细胞造成机械损伤。但是也有人认为真核微生物菌 种适宜慢速冻结；而原核微生物菌种经慢速冻结和快速冻结后，细胞存活率差异 并不显著。 1 3 5 保护剂 保护剂对于微生物菌株冷冻干燥保藏的存活率有较大的影响，选择得当的保 护剂是提高微生物冷冻干燥保藏存活率、延长菌种保藏期的关键因素。保护剂可 分为小分子保护剂( 如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类) 和大分子 保护剂( 如蛋白质，多肽类和多糖类) 。作为小分子保护剂，一般具有很强的亲水 性，分子结构含有3 个以上氢键，在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中 的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的 完整性。而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂 发挥作用。保护剂类型的选择主要取决于菌株的生物学特性，如海藻糖对乳酸菌 的冻干保藏效果显著。但也有一些保护剂可以用于多种微生物，如脱脂牛乳、血 i o 浙江大学硕士论文乳酸菌冻千保活关键技术研究 清、甘油、甜菜碱、阿东糖、蔗糖、葡萄糖和乳糖等很多研究表明利用海藻糖 作为冷冻保护剂可以使微生物的存活率比蔗糖更高，其中一个重要原因是海藻糖 的玻璃化温度( 即由玻璃态变为高弹态所需温度) 较高，而玻璃化温度越高，冻干 物在温度升高时更容易保持稳定。由于蛋白的玻璃化温度相对更高，所以其稳定 性较糖类更好，因此蛋白在菌种保藏中的作用比糖类更重要。另外，对于经常 需要反复冻融的样品，加入甘油有助于保持细胞活力。 1 3 6 复活处理 保藏的菌种在使用时往往需要复活处理。对于液氮冷冻状态的菌种，通常采 用3 8 c - 4 0 c 水浴快速升温解冻，因为慢速升温解冻有可能造成胞内冰晶增大而 损伤细胞。对于真空干燥和冻干菌种复活培养时，复水介质产生的渗透压和复水 条件铺i 度、p t i ) 都有叮能对细胞膜以及酶蛋白分子的结构和性质产生影响，造 成细胞损伤死亡。因此，一般采用最适该菌株生长的培养液或生理盐水并在适合 其培养的温度下进行复水。研究表明，冻干固定化胚芽乳杆菌在p h 4 5 的无菌水 中活化后，菌株的存活率接近1 0 0 ，游离胚芽乳杆菌菌株的存活率为7 5 左右。 其原因可能是在复水处理的过程中复水溶液的流速及用量对微生物细胞存在渗 透冲击。乍用，固定化微生物细胞因受同定化材料的保护而几乎不受复水溶液的渗 透冲击作用，其存活率明显高于游离微生物细胞。 1 4 本课题研究的意义与内容 l 。4 1 课题来源与研究意义 太课题来源于高活性食品发酵剂生产核心研究与示范 2 0 0 6 c 1 2 0 9 5 ，浙江省 重大科技攻关( 招标) 项目。 乳酸菌是生产发酵乳制品( 包括酸乳、发酵乳饮料、酸奶、发酵奶油和干酪) 必不可少的菌种。乳酸菌发酵剂生产性能及功能特性直接关系到最终发酵乳制品 的性能，同时也是影响产品质量的一个重要因素。 尽穆我国发酵乳制品发展迅速，但到目前我国大型乳品企业几乎全部采用国 外的发酵剂，不仅产品成本高，更关键的是长期下去必将制约我国乳酸菌发酵剂 和发酵乳制品的健康发展，而解决这一问题的根本在于研究和开发具有自主知识 产权的暑j l t 咎乳酸簦菌种衣商，是，f e 发酵刹。 1 8 7 3 年，l i s t e r 最先从酸乳中分离并研究了乳酸链球菌，将分离制得的纯乳 浙江大学硕士论文乳酸菌冻干保活关键技术研究 酸菌作为发酵剂生产酸乳制品，从此开始了乳酸菌发酵剂的研究和应用。国际上 发酵剂的研究始于十九世纪至二十世纪初，但真正商业化则经历了一个漫长时 期，大约在上世纪5 0 。6 0 年代后才逐步开始用于规模化生产。在国外，发酵乳制 品的生产普遍采用直投式发酵剂。直投式发酵剂则是相对传统发酵剂直接应用于 生产的发酵剂，克服了传统发酵剂的不足，具有以下优点：( 1 ) 活力高，活菌数 高达l o 1 0 1 2 c v t j g 或c f u m l ；( 2 ) 不必反复传代扩培，节省空间、减少投资、 微生物污染几率低，简化了生产工艺过程；( 3 ) 避免了由于发酵剂传代的原因造 成的产品质量不稳定，利于产品标准化和产品质量稳定。从世界发达国家对发酵 剂研究现状来看，具有以下特点和发展趋势：首先是建立专业化菌种资源库，如 丹麦汉森公司就有近上万株乳酸菌菌株资源库，用语菌种筛选和改良的遗传种质 资源十分丰富；其次是采用现代生化技术、分子生物学技术对菌种进行系统深入 的研究，包括菌种分类、重要生物学特性研究，菌体蛋白质组学、基因组学和代 谢组学的研究，以确定乳酸菌的功能特性和功能基因的定位；最后是在发酵剂制 备技术上，优化了高效增菌和高密度培养技术，筛选出适宜的菌体保护剂，开发 出深冻浓缩、冻干、低温真空喷雾干燥等技术，制成了单一菌株、混合菌株、复 合菌株的深冻浓缩和干粉状发酵剂。通过不同菌株的合理搭配，开发出具有不同 益生特性、产酸特性、产粘特性、产香和蛋白质水解性能、自溶速度的适合于不 同特征产品的优质发酵剂，而且通过菌株复合搭配和轮作，可以减少发酵乳生产 中噬菌体的污染。此外，除了优质发酵剂的研究开发外，具有特定功能性的乳酸 菌开发为乳制品行业的高水平发展提供了更大的科技推动力。 因此，真正具有自主知识产权的菌种资源库的建设、高活性发酵剂的高效筛 选、功能性发酵剂的选育、利用现代分子生物学技术对菌种功能基因的定位和定 向选育、代谢调控与高效发酵剂生产技术的研究和开发亟待深入系统的进行，产 业化技术需待配套、集成，这是我国乳酸菌发酵剂今后的发展重点方向和我国、 省乳品行业发展的需要，引起我国科学界高层的重视，2 0 0 5 2 0 0 6 年成为我国科 技部“8 6 3 ”现代农业技术领域的重点研究课题( 其中高活性酸奶发酵剂被立题) ， 也可以填丰i 、我国工业化生产乳酸菌发酵剂的空白，推动我国发酵乳制品的发展和 产品质量的提供，缩短我国与发达国家在发酵乳制品上的差距，促进乳业的可持 续发展，培育高技术产业增长点。同时能极大推动我国生物活性因子的发酵技术 浙江大学硕士论文乳酸菌冻干保活关键技术研究 和食品发酵行业的发展。因此，针对上述现状发展具有我国自主知识产权的高效、 优良发酵剂具有极为重要的意义。同时对于我省乳品产业的健康、高效发展和人 民生活健康具有重要影响，为传统农产品的现代化技术改造提供强有力的支撑， 以促进我省特色产业结构调整和农业与农村经济的发展。 1 4 2 课题研究内容 ( 1 ) 乳酸菌菌体细胞收集 乳酸菌高密度发酵后，菌体细胞的浓缩分离技术是制备高效浓缩型冻干发酵 剂重要的中间工艺环节。分离方法有超滤和离心，离心比超滤操作简便、设备清 洗和消毒方便、不易污染，其应用较超滤普遍。本项目通过研究离心力、离心时 间等因素对乳酸菌的离心损失率影响，寻求获得最高菌体收得率的合适离心条 件。 ( 2 ) 高效浓缩型酸奶乳酸菌保护剂的筛选优化及其制备工艺研究 ( a ) 不同冷冻干燥预冻技术研究：保护剂设计完成后，研究其不同的冷冻干 燥预冻技术对乳酸菌发酵剂活性的影响，获得合