（无机化学专业论文）八肋游仆虫中心蛋白片段分子与金属离子作用的光谱研究.pdf

摘要 摘要 中心蛋白( c e n t r i n s ) 是一种约2 0k d a 的酸性钙结合蛋白，属于钙调蛋 白大家族。中心蛋白广泛存在于真核生物中，如藻类、酵母、原生动物、 高等植物、哺乳动物等。中心蛋白在中心粒的复制和中心基体纤维的收 缩中起重要的作用，与细胞中纤维的收缩、细胞的分裂等密切相关。到 目前为止，关于中心蛋白的研究主要集中在其生物功能和结构上。 近年来，稀土资源的不断开发和利用增加了稀土元素进入生命体的途 径和机会，这使得稀土元素长期使用的安全性和对生物功能的影响受到 人们的普遍重视。钙离子与稀土离子具有相近的配位环境和配位结构， 因此，稀土元素进入食物链必将影响钙离子作用的发挥。中心蛋白含有 四个e f h a n d 结构域，每个结构域均可结合一个钙离子，所以它可能是 稀土离子在生物体内实现其生物效应的载体。 原生动物八肋游仆虫( e u p l o t e so c t o c a r i n a t u s ) 是一种进化上处于特殊 地位的单细胞真核生物，对该生物的中心蛋白的研究，有助于阐明低等 真核生物的细胞分裂、细胞运动等重要生命活动过程的本质。本文应用 分子生物学的方法表达、纯化得到了纯度较高( 9 0 以上) 的中心蛋白分子 片段p 。2 ( 含i 、2 两个e f 手结构域，也简称为n - e o c e n ) 和p 2 3 ( 含2 、3 两 个e f 手结构域) 。并运用g e n e p r o 给出了它们的一些参数，诸如分子量、 等电点、净电荷量、摩尔消光系数等。以期对后续研究起到理论性指导 作用。 应用铽敏化荧光法我们得到了t b 3 + 与p 1 2 的条件结合常数，而后应用 铽的条件结合常数和离子竞争法，分别求得了c a 2 + 和m 9 2 + 与p ：的相对 结合常数。并得到了铽与p 。：的反应热力学数据，反应的彳。g 0 ，说明 铽与p 1 2 的结合反应能够自发进行，而由4 h 0 说明铽与p 1 2 的结合作用力主要为静电作用力。 最后以t n s 作为疏水荧光探针，研究了p l ：、p ：，结合几种金属后构 象变化的情况。结果表明，金属的离子势越大，对蛋白的构象变化影响 八肋游仆虫中心蛋白片段分子与金属离子作用的光谱研究 也越大。并计算得到了几种金属结合形式下与t n s 的条件结合常数。共 振光散射研究表明，p 1 2 由于含有全分子的氨基端，故而更容易聚合，推 测p 。：在蛋白的聚合过程中起重要作用。 关键词：中心蛋白片段分子；荧光；t n s ；金属离子 a b s t r a c t a b s t r a c t c e n t r i n sa r ea na c i d i cp r o t e i no f 2 0k d a ，w h i c hb e l o n g st ot h eh i g h l y c o n s e r v e de f h a n dc a ms u p e rf a m i l yo fc a ”b i n d i n gp r o t e i n s i ti sa u b i q u i t o u sh i g h l y c o n s e r v e dp r o t e i ni nd i v e r s ee v o l u t i o n a r y l i n e a g e s ， i n c l u d i n ga l g a l ，h i g h e rp l a n t s ，i n v e r t e b r a t ea n dm a m m a l i a nc e l l s c e n t r i n s p l a yaf u n d a m e n t a lr o l e i nc e n t r i o l ed u p l i c a t i o na n dc o n t r a c t i o no fc e n t e r b a s a lb o d yf i b r o u s u pt on o w , t h es t u d i e so nt h ec e n t r i n sh a v es t i l lb e e n c o n c e n t r a t e do nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o n i nr e c e n ty e a r s ，w i t ht h ee x p l o i t a t i o no fr a r ee a r t hr e s o u r c e s ，r a r ee a r t h i o n sa r eb e c o m i n gc l o s e l yr e l a t e dw i t hp e o p l e sd a i l yl i f e s o ，i ti si m p e r a t i v e f o ru st ou n d e r s t a n dt h es a f e t ya n db i o l o g i c a le f f e c t so no r g a n i s m s c a l c i u m h a st h es i m i l a r i t yi nc o o r d i n a t i o nc h e m i s t r yw i t hr a r ee a r t he l e m e n t s t h u s ， t h eb i o l o g i c a le f f e c t so fc a l c i u mm u s tb ei n f l u e n c e do w i n gt ot h em o r ea n d m o r er a r ee a r t he l e m e n t sc o m i n gi n t of o o dc y c l e c e n t r i n sa r eas u b f a m i l y w i t h i nt h es u p e r f a m i l yo fc a 2 + _ m o d u l a t e dp r o t e i n s s t r u c t u r a l l y , i tc o n t a i n s f o u rh e l i x - l o o p - h e l i xm o t i f so re f h a n d s ，e a c ho fw h i c hh a st h ep o t e n t i a lt o b i n do n ec a l c i u ma t o m s ow ei n f e rt h a tc e n t r i n sw i l lb et h ec a r r i e rb yw h i c h r a r ee a r t hi o n sa c h i e v et h e i rb i o l o g i c a le f f e c ti no r g a n i s m s e u p l o t e s o c t o c a r i n a t u s ，au n i c e l l u l a rp r o t o z o a ，l o c a t ei na s p e c i a l p h y l o g e n i cd e g r e es h o w i n gan u m b e ro fe x c e p t i o n a lf e a t u r e s i tc a nh e l pt o c l a r i f yt h en a t u r a lo ft h ep r o g r e s s o fl i f e i nt h i ss t u d y , f i r s t l y , w eh a v e e x p r e s s e da n dp u r i f i e dt h ef r a g m e n t so ft h ee u p l o t e so c t o c a r i n a t u s c e n t r i n p 1 2 ( n e o c e n ) a n dp 2 3b yb i o l o g i c a le n g i n e e r i n g s o m ep a r a m e t e r so f p l 2a n d p 2 3w e r ep r e d i c t e db yg e n e p r o ，s u c ha sm o l e c u l a rw e i g h t ，i s o e l e c t r i cp o i n t ， n e tc h a r g e ，t h ee x t r a c t i o nc o e f f i c i e n t ，e t a 1 ，w h i c ha i mt op r o v i d es o m e t h e o r e t i c a lg u i d a n c ef o rt h es u c c e e d i n ge x p e r i e n t i a lr e s e a r c h s e c o n d l y , t h eb i n d i n gp r o p e r t i e so fp 1 2 f o rt b 3 + ，c a 2 + a n dm 9 2 + w e r e s t u d i e d b yt e r b i u mf l u o r e s c e n c ep r o b e a n di o n i cc o m p e t i t i o n ，a n dt h e c o n d i t i o n b i n d i n gc o n s t a n t o ft b 2 - p 1 2 ，t h er e l a t i v eb i n d i n gc o n s t a n t so f 1 1 八肋辩仆虫中心蛋白片段分子与金属离子作用的光谱研究 c a 2 一p 1 2 ，m 9 2 一p 1 2w e r eo b t a i n e d t od e e p l yi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no f t b ” a n dp t 2 ，t h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r sw e r eg o t t e n b yt h ev a n th o f f e q u a t i o n t h er e s u l ts h o w st h a t 么r g 0 ，d e m o n s t r a t e dt h a tt h er e a c t i o ni s s p o n t a n e o u s ，w h i l e 么r h 0i n d i c a t e dt h a tt h eb i n d i n gf o r c ea c to f t b 3 + a n dp 1 2i sm a j o re l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n l a s t l y , t n si s o n eo fac l a s so fc o m p o u n d sw h i c hd on o tf l u o r e s c ei n w a t e rb u tf l u o r e s c es t r o n g l yb o t hi no r g a n i cs o l v e n t sa n dw h e nb o u n d st o c e r t a i nn a t i v ep r o t e i n s t h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g eo f t h epj 2 ，p 2 3i n d u c e db y t h ed i f f e r e n tm e t a li o n sw e r es t u d i e du s i n gt n sa sap r o b e t h er e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tt h ee x t e n to ft h ec o n f o r m a t i o n a lc h a n g eb yb i n d i n gt h e m e t a li o n si s p r o p o r t i o n a lt ot h e i o np o t e n t i a l t h ec o n d i t i o n a lb i n d i n g c o n s t a n t so ft n sb i n d i n gm 2 一p 1 2o rm 2 一p 2 3w e r ec a l c u l a t e db yt h es a m e m e t h o dd e s c r i b e da b o v e r e s o n a n c el i g h t s c a t t e r i n g ( r l s ) e x p e r i m e n t ss h o w t h a tp i2p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei np r o t e i np o l y m e r i z a t i o n k e y w o r d s ：f r a g m e n t so fc e n t r i n ；f l u o r e s c e n c e ；t n s ；m e t a li o n s 第一章中心蛋白简介 第一章中心蛋白简介 1 1 引言 微管组织中心( m i c r o t u b u l e o r g a n i z i n gc e n t r e ，m t o c ) 是组织真核细胞中微管的 数量、方向和极性的部位】。它在形态上可以分为两种：一种有特殊的结构，由一些 无定形或纤维状物质聚集而成，如哺乳动物的中心体，酵母中的纺锤极体( s p i n d l e p o l eb o d y ，s p b ) 和藻类中的基体等。另一类无特殊的结构，如高等植物细胞一般缺 少中心粒和中心体，其中微管的自组织可能主要是通过微管相关蛋白的活性来完成 的【2 】。它们的形态各不相同，但行使类似的功能，可能是由于它们拥有一些类似的组 成成分。近年来对微管组织中心的7 一微管蛋白( 7 - t u b u l i n ) 和中心蛋i 刍( c e n t r i n ) 研究比 较深入，已有可供参考的功能和分子结构等数据。 中心蛋白是真核细胞中的一种重要的蛋白质，普遍存在于各种生物体中，如绿 藻、酵母和人的微管组织中心口】，中心蛋白在中心粒的复制和中心基体纤维的收缩中 起重要的作用，与细胞中纤维的收缩、细胞的分裂等密切相关。 大量研究表明，中心蛋白具有复杂的同源基因。双向电泳结果显示在人类细胞 中，中心蛋白至少有1 0 个同源基因，而有9 0 的中心蛋白不定位于中心粒上。这些游 离的中心蛋白可能为中心体的形成或为中心粒上的中心蛋白更新提供必要的物资 库，也有可能这些蛋白在中心体以外的细胞结构上发挥重要功能。尽管中心蛋白在 细胞中表达量不多，但它对中心体行使正常的功能至关重要，它的正常与否关系到 整个细胞是否能正常繁殖。有实验表明，中心蛋白过表达或中心蛋白磷酸化增加可 能会引起中心体复制异常从而导致恶性肿瘤的产生。由此可见，深入研究中心蛋白 的结构、性质、功能，以及它与细胞其它成分的关系，可以了解中心体的自身复制 以及中心体周期与细胞周期的关系，并且可以揭示肿瘤的发生机制，研究有针对性 的癌症治疗手段。 到目前为止，关于中心蛋白的研究主要集中在其生物功能和结构上。生物功能 的研究主要从以下三方面展开：一是通过基因的定点突变、侧链修饰进步研究中 心蛋白活性功能区域；二是通过设计特定的引物，构建得到截短蛋白进而研究其对 整个蛋白的作用：三是通过中心蛋白在细胞中的定位进而研究其作用机制。前两者 在体外进行，而第三者是在体内研究。 本文主要围绕中心蛋白的一些研究进展来做一介绍。 八肋游仆虫中心蛋白片段分子与盒属离子作用的光谱研究 1 2 中心蛋白的分类及功能 c e n t r i n s 是普遍存在于中心体和有丝分裂纺锤体极体上的蛋白成分，它最初是从 绿藻t e t r a s e l m i ss t r i a t a 中鉴定的1 4 ，分子量约为2 0 k d ，含有四个保守e f h a n d 结构域 ( h e l i x 1 0 0 p h e l i x ) ，每个结构域均可结合一个钙离子。后来在酵母 5 l 、高等植物们、 无脊椎动物w ，以及哺乳动物 8 , 9 , 1 0 , 1 1 1 中均克隆, q 4 , c e n t r i n 的同源基因。 1 2 1 中心蛋白的分类 根据基因同源性比较，可以将c e n t r i n 分为两大支：一支是以芽殖酵母的c d c 3 1 为 代表，包括m m c e n 3 ( 鼠源c e n g i n 3 ) 、h s c e n 3 ( 人类c e n t r i n 3 ) 等，其主要功能可能与 中心粒复制有关；另一支则以双鞭毛绿藻( c h l a m y d o m o n sr e i n h a r d t i i ) 为代表，包括 h s c e n l ( 人类c e n t r i n l ) 、h s c e n 2 ( 人类c e n t r i n 2 ) 、m m 2 c e n l ( 鼠源c e n t r i n l ) 、 m m c e n 2 ( 鼠源c e n t r i n 2 ) 等。其主要功能可能是与中心体的分离以及鞭毛的切除反 应有关。其中脊椎动物间c e n t r i n 氨基酸序列的同源性达8 0 9 0 ，脊椎动物和低等 生物之间的同源性为5 0 ，- - 7 0 。最近，o l i v i e r 等发现了新的鼠c e n t r i n 基因( c e n t r i n 4 ) 该基因编码的蛋白与鼠c e n t f i n 2 蛋白同源，可能与纤毛细胞中的基体组装以及纤毛形 成有关l i “。 根据系统发育学分析，中心蛋白按氨基酸序列可分为四个主要的分支( 图1 1 ) 1 3 】。 高等植物的中心蛋白代表独立的一支，如烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 的中心蛋白l 和 2 、滨藻叫t r i p l e x n u m m u l a r i a ) 的中心蛋白、拟南芥口r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) 的中心蛋白。 他们内部约有7 7 7 8 的同源性，与非植物中心蛋白相比，同源性下 s p 3 图1 1根据氨基醢序列绘制的中心蛋白系统 进化图”“。 f i g 1 1u n m o t e dp h y l o g e n e t i ct r e eo fc e n t r i n a m i n oa c i ds e q u e n c e sb r a n c hl e a i 昏h ss h o w na r e p r o p o r t i o n a l t ot h ec a l c u l a t e d e v o l u t i o n a r y d i s t a n c e st h ef o u rm a i ns e q u e n c eg r o u p sa r e ( 1 ) p h a n e r o g a m e s ：n i c o t i a n at a b a e u m 。n t i ，n t 2 ； a t r i p l e xn u m m u l a r i a ，a n ；a r a b i d o p s i st h a l l i a m , a t ；( 2 ) a n i m a l s ：m u sm u s c u l u s , m m l ：h o m o s a p i e n s ，h s l ，h s 2 ；x e n o p u sl a e v i s x i ；( 3 ) c d c 3 l pa n dh o m o l o g s ：g i a r d i ai n t e s t i n a l i s g i 3 ； h o m os a p i e n s h s 3 ；m u sm u s e u l u s m n d ： s 0 c c h a r o m y c e sc e m v i s i a e ，s c ；s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e , s p ；( 4 ) c r y p t o g a m si n c l u d i n g g r e e na l g a e ：m a r s i l e av e s t i t a ，m y ；s c h e r f f e l i a d u b i a ，s d ；c m a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i ，c r ； d u n a l i e l l as a l i n a , d s ；s e q u e n c e sf r o mt h e p r o t o z o a ，p a r a m e c i u mt e t r a u r e l i n , p t l ，p t 2 ； g i a r d i ai n t e s t i n a l i s ，g i l ；a n dn a e g l e r i ag r u b e r i ， n g ；a r ef o u n d o ns e p a r a t eb r a n c h e s 第一章中心蛋白简介 降至4 0 6 3 【1 3 】。第二分支为动物类的中心蛋白，包括人( h o m os a p i e n s ) 的中心蛋 白1 和2 、非洲爪蟮( x e n o p u sl a e v i s ) 的中心蛋白、鼠( m u sm u s c u l u s ) 的中心蛋白1 。第 三分支为酵母类的中心蛋白及其与之同源性较高的中心蛋白，包括酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 的中心蛋白c d c 3 1 p 、贾第虫( g i a r d i ai n t e s t i n a l i s ) 中心蛋白、 人的中心蛋白3 和鼠的中心蛋白3 。第四分支为藻类中心蛋白，藻类中心蛋白与酵母 中心蛋白c d c 3 1 p 的同源性只有5 0 5 l 】。原生动物草履虫( p a r a m e c i u m t e t r a u r e l i a ) 的中心蛋白1 和2 与上述四个类型同源性都比较低，被认为是独立的一个 分支1 1 3 o 晟近在网柄菌属d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m 中又发现了一种中心蛋白( d d c r p ) ， 它只有两个e f h a n d 结构，缺少了其它中心蛋白四个e f h a n d 结构中的前两个【1 4 】。 1 2 2 中心蛋白的功能 1 2 2 1 双鞭毛绿藻c e n t r i n ( c r c e n ) 功能 在双鞭毛绿藻c h l a m y d o m o n a sr e i n h a r d t i i 中，c e n t f i n 参与核一基体连接子纤维的收 缩( 图12 ) 。c e n t r i n 定位在三种不同区域，它们分别是核一基体连接子纤维( n u c l e a r b a s a lb o d yc o n n e c t o r s ) 、基体末端连接纤毛( t h ed i s t a lc o n n e c t i n g f i b e r s ) 与鞭毛穿越区 ( t h e f l a g e l l a r t r a n s i t i o n a l r e g i o n s ) t s o 中心蛋白是这些纤维的主要成分。 c o p m e m 图1 2c 。r e i n h a r d t i i 的核机体 连接器及鞭毛示意图”1 f i g 1 2s c h e m a t i cd i a g r a m so i ： t h em u e l e u s b a s a l b o d ya d p a r a i l l sa n df l a g e l l ao fc h l a m y d o - m o f l a st h ea r r o wh e a d si n d i c a t e t h el o c a l i o no f c e n t r i n c e n t r i n 与钙离子结合可导致纤维发生不依赖a t p 的收缩功能，这与肌肉纤维收 缩的滑动机制不同，c e n t r i n 结合纤维收缩时发生扭曲变形而形成一个电子密度体。 在功能上可使鞭毛重定向或移动基体，对穿越区纤维而言，可导致鞭毛切除反应1 6 1 。 在c h l a m y d o m o n a s 中鉴定了一个c e n t r i n 突变体v f l 2 ，它导致基体异常定向、鞭毛数不 一以及不能产生有效的鞭毛切除反应，但突变体仍可存活 1 7 , 1 8 。免疫荧光发现v f l 2 八肋游仆虫中心蛋白片段分子与金属离子作用的光谱研究 c e n t r i n 在核基体连接子纤维以及相邻基体间连接纤维的定位缺失，但在基体处存 有定位，洗明种突变表型导致c e n t r i n 不能组装到相应的纤维系统中，从而使纤维相 关功能不能发挥，但这并不影响细胞的生存，而相对来说，c e n t r i n 在基体处的定位 可能对细胞的生存更重要。 1 2 2 2 芽殖酵母c e n t r i n ( c d c 3 1 ) 功能 芽殖酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) c d c 31 是c r c e n 的同源基因。通过酵母突变 系统研究发现c d c 3 l 作用纺锤体极体的复制中【1 9 , 2 0 , 2 1 。c d c 3 l 定位在纺锤体极体的半 桥胞质位置( t h eb r i d g eo f t h es p b ) ( 图1 3 ) 【ij ，c d c 3 1 突变体在纺锤体极体复制的第一 步中发生异常，导致细胞纺锤体极体增大，并且没有初始的星体出现，由单个s p b 形 成单极体，细胞周期阻断在g 2 m 期。说明c d c 3 1 在细胞周期依赖的纺锤体极体复制 中起重要作用。研究发现c d c 3 1 突变体在结束分裂时可以进行一次或多次的分裂。由 此可以推断，c d c 3 l 蛋白或s p b 在调节开始分裂和退出分裂期中是不可缺少的【2 2 】。 c y t 。9 b s m c m f c r o t u b u l e s n u c l e 毫f m ；c m t u b u t e s 图1 3s c e r e v i s i a e 的s p b 结构示意图”1 f i g 1 3s c h e m a t i cd i a g r a m so f t h es p bo f y e a s tsc e r e v i s i a et h ea r r o w h e a d si n d i c a t et h ei o c a t i o no f c e n t f i n i v a n o v s k a 等人在2 0 0 1 年通过构建了一系列温度敏感型c d c 3 l 突变体，将c d c 3 1 蛋 白具有的多种功能进行逐个研究，发现有些突变体被阻断在g 2 m 期，它们的a c t i n 都呈 现同样的散乱分布，因此这些c d c 3 1 突变可能改变了细胞骨架，从而导致细胞周期的 阻断。在c d c 3 1 基因c 末端出现的突变常常引起细胞株的死亡或生长停滞，则说明这 段区域可能在s p b 的复制中起了关键性作用。 2 0 0 4 年，f i s c h e r 等【2 3 】又发现t c d e 3 l p 的一个新的功能。s a c 3 t h p l s u s l 复合物定 位在核孔，参与转录过程中m r n a 的输出。c d c 3l p 结合其中s a c 3 的c 端结构域c i d ， 4 第一章中心蛋白简介 当c i d 过量复制，会将本来在s p b 定位的c d c 3 1 p 拉到核内，引起s p b 复制终止和显性 致死现象，高拷贝的c d c 3 1 p 表达会抑制这一现象的发生。c i d 结合s u s l 年1 c d c 3 1 p ， 再结合s a c 3 一t h p l 复合物，在m r n a 输出中发挥作用。 裂殖酵母sp o m b e 的c d c 3 1 p 也是s p b 半桥结构的成分之一，控制着s p b 的复制， 它的突变体导致单极纺锤体的形成。它与s p b 的另一成分s a d l p s h 互作用，帮助s a d l p 定位 2 2 】。 1 2 2 3 哺乳动物中心蛋白功能 对哺乳动物中心蛋白的研究主要集中在人类和实验鼠的细胞上。对人细胞中心 蛋白基因的克隆己鉴定了三个同源基因：h s c e n l l 8 ，h s c e n 2 ( c a l t m c t i n ) 【9 】，h s c e n 3 1 ”： 而鼠细胞中心蛋白基因克隆已鉴定了四个同源基因m m c e n l l l0 j ，m m c e n 2 ，m m c e n 3 和m m c e n 4 “ 。下面就哺乳动物中心蛋白的功能进行大致的介绍。 ( 1 1 哺乳动物c e n t r i n l c e n t r i n l 基因是从睾丸c d n a 文库中筛选分离出来的口j 。c e n t r i n l 基因没有内含 子，而具有转座子的特征【2 4 】，可能是由c e n t r i n 2 反转录后转座而来的。h s c e n l 位于 人类染色体1 8 上( 1 8 p 1 1 3 2 ) ，而m m c e n l 位于鼠染色体1 81 - ( 1 8 a 2 ) 。 c e n t r i n l 基因的表达具有组织特异性，主要在睾丸组织中和少数细胞中表达。h a r t 等f 2 4 】在睾丸组织中检测到c e n t r i n l 特异性的扩增，他们同时观察至l j c e n t r i n 2 在睾丸组 织中的转录水平有明显减少，因此推测在该组织中，由于x 染色体的活性降低，从而 导致位于x 染色体上的c e n t r i n 2 的表达大大减少。为了补偿c e n t r i n 2 对细胞周期的重要 作用，在1 8 号染色体的c e n t r i n l 的表达被激活。此外，在人类视网膜的光受体细胞中 发现有c e n t r i n i 的表达，可能定位于连接光受体细胞之间的纤毛上。最近的研究表明 c e n t r i n l 被c a 2 + 活化后与视觉g 蛋白结合，可能起信号转导作用【2 5 】。l a o u k i l i 等2 6 】 在研究鼻腔表皮细胞在体外分化过程中也观察到了c e n t r i n l 的表达。他们在分化前没 有纤毛的细胞中未观察至f j c e n t r i n l 的转录，而在该细胞的分化过程中，在纤毛开始出 现时，c e m r m l 的转录水平逐渐增加。 研究发现c e n t r i n l 的同源基因在单环刺蜢( u r e c h i su n i c i n c t u sv o nd r a s c h e ) 的受精 作用及早期发育过程中，可能参与了合子中心体的重建，也可能在其后的极快的早期 卵裂中发挥重要作用。用r t p c r 法检测单环刺蜢体壁、消化道粘膜、卵母细胞 中既无c e n t r i n l 的表达又无c e n t r i n 2 、c e n t r i n 3 的表达。但受精后，二细胞期、多细胞 期、有纤毛的担轮幼虫中有c e n t r i n l 的表达。另外卵母细胞用a 2 3 1 8 刺激孤雌生殖则 引起c e n t r i n l 的表达，表明受精起到刺激作用，c e n t r i n l 是卵本身表达的。c e n t r i n 的 八肋游仆虫中心蛋白片段分子与盘属离子作用的光谱研究 抗体免疫荧光染色可见精子细胞中心体中有一对c e n t r i n 颗粒染色，但在成熟精子阶 段远端c e n t r i n 颗粒消失，可能c e n t r i n l 和精子鞭毛生成有关。担轮幼虫中免疫荧光染 色，除了中心体染色以外，还有散在单点荧光存在。这与担轮幼虫纤毛基粒着色有 关。在小鼠精细胞发育研究中，发现c e n t r i n l 可能和减数分裂及鞭毛生成有关【2 8 】。 由此可见，c e n t r i n l 基因在不同细胞中可能行使不同的功能，而其调控表达的机制需 进一步研究。 ( 2 1 哺乳动物c e n t r i n 2 c e n t r i n 2 基因最初是从脐带血管内皮细胞m r n a 文库和白血病t 淋巴母细胞的 m r n a 文库中筛选获得的。h a r t 掣2 9 研究m m c e n 2 基因发现c e n t r i n 2 含有5 个外显子 和4 个内含子，并且其几个e f h a n d 功能区被内含子打断，c e n t r i n 2 位于x 染色体上。 c e n t r i n 2 在细胞中主要定位于中心体和纤毛基体上。它在多种组织中普遍存在， 但发现在卵巢中c e m r i n 2 的转录水平提高而在睾丸中它的转录水平明显下降。同时， l e d i z e t 等 3 0 1 发现在气管表皮细胞生成纤毛的过程中，c e n t r i n 2 基因的转录水平在不断 上升，而间接免疫荧光实验说明有c e n t r i n 蛋白定位在数目不断增加的基体上。因此 可以推钡u c e n t r i n 2 基因不断增加的表达产物聚集在纤毛基体上。运用r n a 干扰的方法 敲除h e l a 细胞中c e n t r i n 2 的作用，发现中心粒的复制受到严重的抑制。在第一代的子 细胞中只有一个中心粒，而二代、三代子细胞中发现没有中心粒的细胞。这些细胞 微管分散，最终产生多核或死亡。这些结果说明c e n t r i n 2 在中心粒复制中是必须的而 中心粒在胞质分裂中起重要作用【3 ”。构建的反义c e n t r i n 2 质粒转染可选择性表达的 t e t 2 0 f f 的h e l a 细胞( 它无c e n t r i n l 的表达，只有c e n t r i n 2 牙f i c e n t r i n 3 的表达) ，获得h a c 细 胞，它显示c e n t r i n 的表达抑制可使细胞增殖变慢，g 2 m 期受阻。免疫沉淀法发现 c d k l 的1 5 位酪氨酸去磷酸化受阻，c y c l i n 降解受阻，软琼脂密度变小。同时出现多 极细胞增多，多核细胞也增多。表明c e n t r i n 蛋白的组成及中心体结构变化和细胞的 癌化有一定的关系。但c e n t r i n 2 蛋白在中心体以及细胞分裂周期上作用机制还有待进 一步深入研究，该基因表达调控机理也尚未清楚。 有实验表明c e n t r i n 2 除了定位在中心体以及其类似结构上以外，它还存在于细胞 核中。2 0 0 1 年，a r a k i 等【3 2 】研究发现c e n t r i n 2 蛋白是着色性干皮病g r o u pc 仪e r o d e r m a p i g m e n t o s c e ng r o u pc ，x p c ) 复合体的成分之一，参与基因组核酸切割性损伤的修 复。此外，这种游离的c e n t r i n 2 在细胞中可能还有其它未知的功能。 ( 3 ) 哺乳动物c e n t r i n 3 c e n t r i n 3 基因是从t 淋巴母细胞系的c d n a 文库中筛选得到的1 3 ”，定位在5 号染色 第一章中心蛋白简介 体上。c e n t r i n 3 基因与酵母c d c 3 1 基因同源性更高，它与c e n t r i n l j n c e n t r i n 2 基因的同源 性都只有5 4 。尽管c e n t r i n 3 蛋白可在不同的组织中和不同类型的细胞中发挥作用， 但是c e n t r i n 3 基因在不同的细胞中的表达水平各不相同。l e d i z e t 等人p 0 1 发现c e n t r i n 3 在气管表皮细胞纤毛生成过程中转录水平保挣叵定， 可l a o u k i l i 等2 6 1 观察到在鼻腔表 皮细胞的分化过程中，c e n t r i n 3 的转录水平是上升的。 m i d d e n d o r p 等【3 4 j 研究发现，在人类培养细胞中野生型h s c e n 3 蛋白和突变型 h s c e n 3 蛋白的暂时性过表达不能影响到中心体复制周期。他们随后对非洲爪蛙细胞 的胚胎进行微注射h s c e n 3 重组蛋白或其r n a 时发现，这种处理搅乱了中心体的复制 从而阻挠卵裂继续进行。对h s c e n 3 的研究中发现，c e n t r i n 3 的表达异常可以影响其 它c e n t r i n 基因的表达，同时它与细胞恶化有一定的联系【3 5 1 。 h s c e n 3 与c d c 3 1 p 有很高的同源性，在酵母的野生型中大量表达h s c e n 3 ，做功 能互补，发现在g 2 后期细胞循环终止，且出现了大的芽状物质，而过量表达h s c e n i 和2 则没有这种现象，表明h s c e n 3 是和c d c 3 1 功能近似的 3 6 。 f 4 1 哺乳动物c e n t r i n 4 2 0 0 3 年，哺乳动物鼠中心蛋白的第四个同源基因c e n t r i n 4 从完整的鼠胎、乳腺 c d n a 文库中筛选得到【i “。从序列分析，c e n t r i m 与c e n t r i n l ，2 ，3 的同源性分别为 7 2 ，7 4 和5 3 ，更接近于c e n t r i n 2 ，而且他们有相同的内含子、外显子组成。但 与c e n t r i n 2 不同，c e n t r i n 4 是组织特异性表达的，c e n t r i n 4 的m r n a 在脑、肺、肾 及卵巢高度表达，在脾的表达量极低，在其他器官中则未检测到表达。c e n t r i n 4 p 特 异性的在成鼠脑纤毛细胞中表达，定位在纤毛轴丝起始的基体上【”l ，而c e n t r i n 2 p ， 3 p 则在脑细胞中广泛表达，定位在基体和中心体，推测c e n t r i n 4 p 可能特异性的参与 了一些纤毛细胞的分化过程。 c e n t r i n 4 p 的正确定位需要蛋白的n 端和c 端同时作用，而c e n t r i n 2 p 和3 p 只需 要c 端即可。体外结合实验证实钙调蛋白是通过n 端c 端两个结构域的与靶肽相互 作用，c e n t r i n 4 p 就有着类似的肽结合机制，这与其他中心蛋白不同。从序列上看 c e n t r i n 4 p 只有一个即第四个e f 手性结构是有钙结合能力的，实验证据也证明了这 个结论。 1 2 2 4 高等植物中心蛋白功能 目前对高等植物的中心蛋白研究比较少，迄今为止克隆到的中心蛋白基因有一 种盐沼植物滨藻a t r i p l e xt h a l i a n a 的a t c e n 【3 7 j ，拟南芥a r a b i d o p s i st h a l i a n a 的 a t c e n 3 8 i ，烟草n i c o t i a n a t a b a c u m 的两个同源基因n t c e n l 和n t c e n 2 13 1 ，水蕨m a r s i l e a 八肋游仆虫中心蛋白片段分子与金属离子作用的光谱研究 v e s t i t a 的m v c e n 3 9 】等。他们内部约有7 7 - - 一7 8 的同源性，与非植物中心蛋白相比， 同源性下降至4 0 6 3 。高等植物没有特殊结构的m t o c ，只能靠其他一些含微管 相关蛋白的细胞器来行使类似的功能。中心蛋白定位在植物细胞的细胞板，核表面 和分裂纺锤极 4 0 , 4 1 i ，在胞间连丝中也有发现【4 ”，但是这些中心蛋白并不存在于所有 的细胞类型中。烟草的中心蛋白主要与微粒体相连，小部分在胞质的多聚蛋白复台 物中，它在胞质分裂时参与细胞板的形成，也参与c a ”调节的胞内运输吲。另外， 在整个细胞周期中，中心蛋白的m r n a 和蛋白水平都没有明显的变化，也许是由于 在进化过程中，与m t o c 相关的中心蛋白的特殊功能在无中心粒的高等植物中丢失 t i ”。在拟南芥中，a t c e n 2 也存在于核中，参与核酸的切除修复h 3 1 。 水蕨mv e s l i l a 的干孢子浸入液体培养基时会激活精子发生，这是由于孢子中含 大量储存的m r n a 或极少的新转录的m r n a 翻译出新的蛋白。中心蛋白只在精子发 生的起始由储存的m r n a 翻