（物理化学专业论文）两种染料与dna作用的电化学和光谱研究.pdf

两种染料与d n a 作用的电化学和光谱研究 摘要 本论文以电化学和紫外一可见光谱方法研究了两种有机染料小分子孔雀石绿 和吡哕红b 与d s d n a 的相互作用。 论文分为四个部分。第一章综述了电化学方法研究有机染料以及抗癌药物等 与d n a 作用的研究进展。第二、三章分别使用玻碳电极和滴汞电极研究了孔雀 石绿与d n a 的相互作用。实验证明孔雀石绿与d s d n a 可形成复合物，复合物的 电位在玻碳电极上发生负移，呈现静电作用的特征。d s d n a 修饰电极的结果显示 孔雀石绿与d n a 通过静电和嵌插作用两种模式相结合，但主要通过嵌插作用相 结合。由于d n a 在玻碳电极上没有吸附，结合与d n a 外部骨架的孔雀石绿更易 于在玻碳电极上反应，所以玻碳电极的结果反映静电模式。孔雀石绿与d n a 形 成复合物后会导致电流减小，可以此建立d s d n a 的电分析方法。线性范围为 1 0 0 。1 0 0 0m g l ，检出限为6 0m g l 。使用滴汞电极对玻碳电极的结果进行验证， 在存在d s d n a 时，孔雀石绿在滴汞电极上的还原峰峰电位正移，证明d n a 与孔 雀石绿以嵌插作用结合。在滴汞电极上，以孔雀石绿为探针的d n a 定量分析线 性范围o 8 1 2 0m g l ，检出限为o 4 6m g l ( 3 。第四部分研究了吡哕红b 电化 学性质及与d s d n a 的相互作用。在玻碳电极上研究了吡哕红b 的电化学行为并 推导了吡罗红b 的电氧化机理。毗哕红b 与d n a 通过嵌插作用相结合，结合 d n a 后吡哕红b 峰电流明显增大。研究发现吡哆红b 的峰电位与d n a 鸟嘌呤的 峰电位基本重合，因此推测峰电流增大的原因是由于吡哕红b 的氧化引起与吡罗 红b 接触的鸟嘌岭的氧化。 关键词：d n a ，孔雀石绿，吡哕红b ，玻碳电极，滴汞电极，相互作用，电化 学 e l e c t r o c h e m i c a l a n ds p e c t r o s c o p i c s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no ft w o d y e sw i t h d n a a b s t r a c t t h ee l e c t r o c h e m i c a la n ds p e c t r o m e t r i cs t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o n so ft w oo r g a n i cd y e m o l e c u l e s ，m a l a c h i t eg r e e n ( m g ) a n dp y r o n i n ebo b ) ，w i t h d n ah a v e b e e n d e s c r i b e di nt h i sp a p e r t h e r ea r ef o u r p a r t s i n t h i s p a p e r i n t h ef i r s t p a r t ，t h ed e v e l o p m e n t o f e l e c t r o c h e m i c a ls t u d i e so fo r g a n i cm o l e c u l e si n t e r a c t i o n sw i t hd n a , s u c ha so r g a n i c d y e sa n da n t i c a n c e rd r u g s h a v eb e e nr e v i e w e d i nt h es e c o n da n d 血et l l i r dp a r t s ，t h e i n t e r a c t i o n so fm a l a c h i t eg r e e nw i t hd n ah a v eb e e ni n v e s t i g a t e db yc a r b o n 酉a s s y e l e c t r o d e ( g c e ) a n dd r o pm e r c u r ye l e c t r o d e m e ) ，r e s p e c t i v e l y mm a l a c h i t eg r e e n c a nb i n dd n aa n df 0 h nd n a - m gc o m p l e x 1 1 ”f o r m a lp o t e n t i a lo fd n a - m g c o m p l e xs h i f t sn e g a t i v e l ya tt h eg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ，w h i c hi st h ec h a r a c t e ro fa n e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n t h er e s u l t so fd s d n a - m o d i f i e de l e c t r o d es u g g e s tt h a tt h e m a l a c h i t eg r e e nc a nb i n dd n ab yt w om o d e sa n dt h ep r e d o m i n a n ti n t e r a c t i o ni s i n t e r c a l a t i o ni n t e r a c t i o n b e c a u s et h ed n ah a sn os i g n i f i c a n ta d s o r p t i o na tt h eg c e ， t h ee l e c t r o r e a c t i o no fm a l a c h i t eg r e e nb i n d i n gw i t ht h eo u t e rn e g a t i v e l yc l u t r g e ad n a p h o s p h a t eo c c u r sm o r ee a s i l ya tt h es u r f a c eo fg c e 血a n t h ei n t e r c a l a t i o nm o d e s ot h e r e s u l t so fe x p e r i m e n t sa tt h eg c ea p p e a ra ne l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o no fd y ew i t l ld n a t h ed e c r e a s eo ft h ep e a kc u r r e n to fm ga f t e ra d d i n gd s d n aw a sf u r t h e ru s e df o rt h e q u a n t i f i c a t i o no fd s d n a t h el i n e a rr a n g ef o rd s d n a i si nt h er a n g eo f1 0 0 1 0 0 0 m g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i to f6 0m g lp o ) f u r t h e rs t u d i e so fm gb i n d i n g 谢t l l d n ah a v eb e e nd o n eb yd r o pm e r c u r ye l e c t r o d e a f t e rt h ea d d i t i o no fd s d n ai n t o m gs o l u t i o n ，t h er e d u c t i v ep e a kc u r r e n td e c r e a s e dw i t hap o s i t i v es h i f to ft h ep e a k p o t e n t i a l ，w h i c hw a st h et y p i c a lc h a r a c t e r i s t i co fi n t e r c a l a t i o n t h ed e c r e a s eo ft h e p e a kc u r r e n tw a sl i n e a rw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fd s d n a o v e rt h er a n g eo f0 8 1 2 0 m g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i to f0 4 6r a g l ( 3 曲 耽ef o u r t hp a r tf o c u s e so nt h ee l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so fp y r o n i n eb ( p b ) a n di t s i n t e r a c t i o nw i t hd n a r 1 1 帕i r r e v e r s i b l ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fp bi ss t u d i e db y c y c l i cv o l t a m m e t r ya tg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e 羽嚣p o s s i b l em e c h a n i s mo fp b e l e c t m c h e m i c a lo x i d a t i o ni si n f e r r e di n t h i sp a r t p bc a nb i n dw i t hd s d n ab y i n t e r c a l a t i o nm o d e 。羽p e a kc u r r e n to fp bi n c r e a s e so b v i o u s l yi nt h ep r e s e n c eo f d n a t h ee x p e r i m e n t a lm s l l l t ss h o wt h a tt h ep e a kp o t e n t i a lo fp bi sr e p e t i t i v ew i t h t h ep e a kp o t e n t i a lo fg u a n i n eb a s eo f 蠢s ai np 嚣5 0b rb u f f e rs o l u t i o n 翔e e v i d e n c es u g g e s t st h a tt h eo x i d m n ep m c e s so fp bc a nc a u s et h ed n ag u a n i n e o x i d a t i v ed a m a g e ，w h i c hl e a d st ot h ei n c r e a s eo fp bc u r r e l l t k e y w o r d s ：d n a , m a l a c h i t eg r e e n ，p y r o n i n e 琶g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ，d r o p m e m u r ye l e c t r o d e ，i n t e r a c t i o n ，e l e c t r o c h e m i s t r y n l 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 分子遗传学是我们当今时代的一个非常有生命力的科技前沿领域，自2 0 世纪 9 0 年代人类基因组计划启动以来，各国投入了大量的人力物力来研究d n a 和r n a 序列。除了少数r n a 病毒外，脱氧核糖核酸( d n a ) 是绝大多数生命体的遗传信 息物质承担者，所以d n a 在生物大分子中占据中心位置，而有关d n a 的研究也就 成为分子生物学和生物化学的重要课题。 d n a 的研究通常包括：对生物样品中d n a 的含量进行测定，确定d n a 结构 和碱基对序列，研究环境中污染物质对d n a 损伤机理，对p c r 产物进行检测，以 及研究各种小分子包括有机小分子和金属配合物，与d n a 相互作用等等许 多方面。小分子与d n a 的相互作用是近年来的一个研究热点，对小分子和 d n a 的结合研究有助于我们了解d n a 的结构性质，基因突变，疾病的起因， 以及抗癌药物和抗病毒药物的作用机理，从而设计出行之有效的d n a 靶向 药物来治疗基因疾病【1j 。 1 1d n a 的组成、结构和电化学性质 1 1 1d n a 的组成 d n a 是核酸的一种，是大量脱氧核苷酸的聚合体。脱氧核糖核苷酸由碱基、 脱氧核糖和磷酸构成。d n a 的碱基有四种，即腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胞嘧啶 ( c ) 和胸腺嘧啶( d 。d n a 在碱基组成上遵从c h a r g a f f 规则，即腺嘌呤和胸腺嘧啶 的物质的量相等，鸟嘌呤和胞嘧啶的物质的量相等，嘌呤的总数等于嘧啶的总数。 1 1 2d n a 的结构”1 d n a 由多条脱氧核糖核苷酸链构成，每条链均以磷酸基( 磷酸酯键) 为桥， 从一个核苷的3 。连接到相邻核糖的5 位置上。这就是d n a 的一级结构。1 9 5 3 年 j a m e sw a t s o n 和f r a n c i sc r i c k 确定了d n a 的双螺旋结构，也就是d n a 的二级结 构。这是现代生物学诞生的标志。w a t s o n - - c r i c kd n a 双螺旋有如下主要特点： ( 1 ) 两条多聚核苷酸链围绕着一根共同轴形成一个双螺旋( d o u b l eh e l i x ) 。d n a 的两条链是反向平行的，但每条均为右手螺旋。 两种染料与d n a 作用的电化学和光谱研究 ( 2 ) 由于磷酸糖链是亲水的、碱基是疏水的，所以碱綦位于螺旋的中心，而磷酸 耱链溺绕在终嘲，这群蘩魄磷酸基透润豹蓐力降型最小，双螺旋豹袭嚣有两条涤 浅不一的沟：大沟( m a j o rg r o o v e ) 和小沟( m i n o rg r o o v e ) 。 ( 3 )条链上的每个碱慕与其互补链上对应碱基依靠氢键形成平面的碱基对。 每个艨嘌呤必缀号鹅腺嘧嚏瓣对，鸟嘌呤只配胞嘧碇。这些氢键相互作用现象被 称为碱基互李 辩黠，获两导致双裸藤申豹秘条链发生特舜结台。 ( 4 ) 双螺旋的直径为2 n m 同一条链上相邻碱基之问的轴向距离为0 3 4 n m ，每隔 1 0 个碱基对，脱氧多核苷酸就绕一圈，旋距为3 4 n m ，旋角3 6 0 ，轴向相邻的碱 慕_ j c 重之闽戒叛拔塔辍。 d n a 取螺旋结构十分稳定，分予闽的碱基堆积可以使碱基缔合，这种力称为 碱基堆积力，怒维系d n a 双螺旋结构稳定的蕾要作用力。 在二级结构的基础t ，d n a 还可扭曲或卷曲形成兰缴结构。 1 。1 3d n a 的电化学性质 d n a 的电化学性质研究始于上个世纪5 0 年代，p a b c e k 使用示波极谱发现 d n a 具有邀活憋。在d n a 的组分中，核糖帮孩磷酸均不其有电滔瞧，鸟礤砖、 骤礤岭和脆嘧蹿殇可在汞亳檄上还原产堡还原蜂，匠鹞嗓岭在汞毫裰。1 6 0v 下还 原的产物还可在o 3v 产生“个氧化峰。岛嘌呤和腺嘌呤可在碳电极上氧化，腺 嘿呤的氧化峰约在+ 1 2v ，岛嘌呤的氧化蜂约在1 0v 【剐。 1 2d n a 与有机小分子的作用“1 ， 1 。2 d n a 与纛羧辔分子豹稼羯模式 d n a 分予中平行堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架和两条核苻酸链螺旋形 成的大沟和小沟构成了有机小分子与d n a 相互结合的位点，作用的方式主要有 共价结合、剪切传用、长鼹镪装及j # 共价结台等四秘炎型，另外还有氢键、范德 肇力、巯隶 窜掰等弱相互俸髑。绝大多数黪小分子与d n a 的俸溺澎式为菲共徐 结合，它又包括静电作用、嵌入结合和沟面结合，而且通常不是一种力的单独作 用，而是多种作用力的协同作用。 t 2 1 1 共价络合 共价结合戆指有机小分子与d n a 的各种碱基以欺价键结合生成稳定的配合 物，辛要有核酸的烷基化反波，d n a 盼镳内交联、链澜交联反应等，虽然狩合条 2 童鱼壁堇查堂她塞尘兰壁堡塞 传的有机小分子不多，但与非共徐结合嬲比，其特异性识别能力瑟强得多，而且 反应不可逆。 1 2 1 2 剪切作用 有瓤，l 、分予遗过与d n a 分子双链瓣特异性结合瑟导致d n a 键翡断裂，这秘 赘切作用导致d n a 的损伤，也是导致藩因突变的藤阕 1 2 1 3 长躐绲装 豢正电翁骞税，l 、分予露d n a 有凝聚俸蔫，当箕与d n a 终蠲时，会诱罢d n a 超螺旋结构的形成。有机小分子在d n a 表面进行排列或堆积称为有机小分子在 d n a 分子表丽的长距组装( l o n gr a n g ea s s e m b l y ) 。 2 。4 嚣鬟价作用 n ) 静电作用( e l e c t r o s t a t i c b i n d i n g ) 。指小分予与d n a 分子的带负电荷的核糖 磷酸基骨架之间通过静电作用而结合。该作用没有选择性，是非特异性的。 国嵌入缝合( i n t e r c a l a t i o nb i n d i n g ) 。楚接平嚣芳环夔枣分子聚入d n a 努子双 螺旋的碱基对之间。结合的作用力来自游环的离域7 1 ：体系与碱基的“体系间形成 孺牡相互作用殷疏水相互作用。大部分金腾配合物和抗癌药物与d n a 的相互作用 都存在插入方式。 ( 3 ) 海露缭合( g r o o v eb i n d i n g ) 。瑟小分子与疑链d n a 斡大沟或小沟的碱墓逸 缘直接发生相互作用。小分子与d n a 的小沟壁紧密作用，作用形式主要是氢键 作用和范德华力。小分子主鼹在小沟区发生结合，这怒由于小沟区为艮t 富集区， 瓣显存在承会缝秘，其鸯芳霉环缝季每豹参分子易予囊囊整转寒适食小沟嚣，嗣辩 取代沟内的水分子进入小沟区。大沟结合的药物和d n a 主要以氨键结合。 1 ，2 2d n a 与小分子作用的吾辩究方法 建柬疆究小分子与d n a 鳃裙互终溺技本多耱多榉，圭要有綮辨。爵凳蔽浚必 港法( u 、，一v i ss p e c t r a ) 、核磁共振o 州r ) 光谱法、荧光光谱法、x - r a y 晶体衍射法、 圆二色谱( c d ) 和线二色谱( l d ) 法、红外光谱和共振拉曼光谱法( r r ) 、序列凝 胶邀泳、足翻遽分辑技零、表嚣等离子俸共振技寒p 麓帮电纯学方法等。 1 3 电化学研究d n a 与有机小分子相互作用 3 两种染料与d n a 作用的电化学和光谱研究 电化学分析法在研究d n a 的结构形态，d n a 的损伤，基因诊断等方面具有 重要的意义。它可以获得其他方法难以得到的信息。与其他方法相比，电化学在 d n a 研究方面相对较少，起步也较晚。c a t e r 和b a r d 8 l 在1 9 8 7 年采用电化学方法 研究金属配合物三邻菲哕啉合钴( c o ( p h e n ) 3 2 + 3 + ) 与d n a 的相互作用。当溶液中 的c o ( p h e n ) 3 2 + 3 + 与d n a 作用后，c o ( p h e n ) a 2 + 3 + 在玻碳电极的电流减小。b a r d 证 明这种减小不是由于体系内引入d n a 后溶液粘度增大引起的，而是由于配合物 和d n a 结合引起的，并发展了根据配合物的峰电流和峰电位在加入d n a 后的变 化计算二者的表观结合常数和结合位点的方法。自此之后，电化学方法在药物分 子与d n a 相互作用的研究中使用较多。 1 9 8 9 年，b a r d 9 】等更为详尽的研究了钴0 n ) 、铁离子( ) 的邻菲眵啉( p h e n ) 和联 吡啶( b p y ) 配合物与d n a 的相互作用，发现金属配合物与d n 触匣过嵌插作用结合 时式电位j f 移，会属配合物与d n a 通过静电结合时式电位负移，因此可通过式电 位的移动方向来判断结合模式。在该文中，作者对使用电化学参数计算结合常数 结合比作了进一步的说明，并计算了c o h e n ) 3 2 + 3 + 、f e ( p h e n ) 3 2 + 肼、c o ( b p y ) 3 2 + 斛 并1 1 f e ( b p y ) 3 2 + 3 + 与d n a 的结合常数与结合比。 p a n g 年：h a b r t m a 10 】使用吸附法制备d n a 修饰金电极研究c o ( p h e n ) 3 2 们+ - 与d n a 的作用。作者除了获得和b a r d 的溶液方法一致的结果外，还发现c o ( p h e ) 3 2 们+ 与 d n a 的主要结合模式随离子强度的增大从静电模式向嵌插模式转变现象。在离子 强度= 0 4 0 m m o l l 时，c o ( p h e n ) 3 2 + 3 + 与d n a 主要通过静电作用结合，在1 j f 4 0 m m o l l 时主要通过嵌插作用结合。在= 4 0m m o l l 时，静电作用和嵌插作用程度 相同，该浓度即为临界离子强度( c r i t i c a li o n i cs t r e n g t h ) 。该方法简便、可靠，d n a 用量少，具有很大的优点。 因为电化学方法具有快速、灵敏、样品消耗量少和仪器简单的优点，其在 d n a 结构分析、药理分析及d n a 传感方面的应用越来越受重视，而且显示出了 惊人的发展速度。电化学对有机小分子的研究主要集中在有机染料和抗癌药物方 面，也有其他的一些有机物，本文就这几方面进行综述。 1 3 1 有机染料与d n a 的相互作用 早在一个世纪以前，人们就发现微生物的细胞核可与碱性染料结合显色，便 于在显微镜下观察。由于染料往往具有氧化还原活性，有机染料与d n a 的作用 便成为电化学研究的一个重要课题。 1 3 1 1 蒽醌类染料 l i 1 1 , 12 】等使用了悬汞电极和化学修饰的玻碳电极研究了9 ，1 0 氨基蒽醌 4 青岛科技大学研究生学位论文 ( a n t h r a q u i 。0 n 。，a q ) 与d n a 的相互作用。在悬汞电极【1 1 】上的研究表明中性和酸性 环境中，a q 与d n a 作用后生成非电活性的的配合物，导致a q 的电流减小，l i 等使用计算金属配合物结合常数结合比的公式，求出d n a 与a q 的结合比为2 。 但在碱性环境中，a q 与d n a 作用后电流增大，电流增大与试剂的加入顺序有关， 呈现明显的催化电流的特征，因此作者推测电流增大的原因是d n a 催化了a o 的还原引起的。在a q 修饰的玻碳电极【1 2 】上，d n a 与a o 在中性和酸性环境作用 后导致化学修饰电极的氧化峰和还原峰的电流均减小，峰电位不变，在碱性环境 中，化学修饰电极的峰电位负移了2 0 0m v ，且氧化峰和还原峰电流均增大，对 照静汞电极的研究，说明d n a 对a q 的还原具有双向的催化活性。 1 31 2 吩噻嗪类染料 吩噻嗪类染料包括亚 。阵( m e t h y l e n eb l u e ，m s ) 、甲苯胺蓝( t o l u l d i n eb l u e ，t b ) 和 硫堇f h i o n i n e ) 等。m b 是一种常用的核酸染色剂。早期对m b 与d n a 作用的光度法 研究认为m b 与d n a i 恿过嵌插作用结合【1 3 j 。k e l l e y 1 4 】等采用含有1 5 个碱基的巯基 衍生化寡聚核苷酸固定在金电极表面研究m b 与d n a 的嵌入作用。通过计时库仑 数据计算得到m b 和表面固定的d n a 亲合常数为3 8 x 1 0 6 ( m o l l ) ，结合位点数为 每1 5 碱基的d n a 链结合1 5 个m b 。z h a o 1 5 】等使用循环伏安和光谱法研究了环糊精 存在条件下m b 与d n a 的相互作用。m b 可能与d n a 形成的1 ：1 的结合物，且其结 合常数为1 3 x 1 0 5 ( m o l l ) 。亚甲蓝与环糊精之间形成了1 ：1 的包络物，且其包络常 数k 为4 4 x 1 0 5f m o l l ) 。包络物仍能与d n a 形成1 ：1 的结合物，其结合常数为 7 2 x 1 0 4 ( m o l l ) ，略小于m b 单独与d n a 作用时的结合常数。该实验证明了d n a 与m b 主要通过静电作用模式结合。 e r d e m 1 6 】等发现m b 在单链d n a 修饰碳糊电极( s s d n a c p 勘上的电流要比杂 交后电极大。y a n g 1 7 1 等用含有不同数目的鸟嘌呤( g ) 碱基的2 l 链的寡聚核苷酸研 究了m b 与d n a 的相互作用。他们发现m b 在探针修饰电极上的电流与g 碱基的数 量成正比，推测m b 主要与d n a 的g 碱基结合。m b 可以有效的区分单双链d n a ， 因此常被用作d n a 杂交指示剂i 幡1 9 1 。 由于m b 具有良好的电化学活性，赵发琼【2 0 】等以m b 为探针，研究了阴离子、 阳离子和非离子表面活性剂与电极表面固定的巯基化d n a 的相互作用。几种表面 活性剂均可通过疏水和静电作用与固定在电极表面的d n a 分子结合，改变电极表 面d n a 的状态，进而影响电活性小分子的电化学行为。阴离子表面活性剂与d n a 之间以静电排斥为主，也有部分疏水性结合，它使m b 的氧化还原峰峰电流减小。 阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵均在一定浓度 范围内对m b 的电化学响应有增敏作用，而溴代十六烷基吡啶、溴代十八烷基吡 两种染料与d n a 作用的电化学和光谱研究 啶表现出抑制效应，它们与d n a 间既有疏水性作用，也有静电吸引。非离子表面 活性剂与d n a 的结合较弱，其主要是通过改变溶液的性质( 如粘度、极性和介电 常数等、影响d n a 的构象，从而导致m b 电化学参数的微弱变化。此外，表面活性 剂疏水链的长短及极性头基的大小对作用过程也有一定影响。 焦奄等【2 1 】用循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了在p h6 0 的b r 缓冲溶液中 t b 与d n a 的相互作用。t b 在玻碳电极上有一对可逆性良好的氧化还原峰。加入 d n a 后氧化还原峰电流明显降低，氧化峰电位负移。t b d n a 结合反应前后的电 化学参数如电极反应电子数、电子转移系数和电极反应标准速率常数基本没有发 生变化，说明t b 与d n a 结合反应生成了一种非电活性的复合物，而使t b 的峰电 流下降。求得了两者的结合比为n ( t b l ：n ( d n a ) = 1 ：1 ，结合常数为7 5 0 x 1 0 4 。 冶保献1 2 2 】等用光谱电化学和电化学技术研究了硫堇与d n a 相互作用的电化 学和光谱电化学性质，发现d n a 与硫堇作用后电流减小，而通过卵磷酯同定于 电极表面的硫堇也可与d n a 作用，但是电流减小的比例远小于硫堇与溶液中 d n a 的结合，说明硫堇能插入d n a 双螺旋结构内部。杜江燕1 2 3 l 等用电化学和光 谱方法研究了溶液p h 对硫堇与小牛胸腺d n a 的相互作用的方式的影响。电化学 测量结果表明，在p h7 2 的磷酸盐缓冲溶液中，硫堇与d n a 的作用方式以嵌插 作用为主，在p h6 5 的磷酸盐溶液中，硫堇与d n a 之间的作用方式既存在嵌插 结合也存在静电作用。 从以上研究可看出，本类染料与d n a 主要通过静电作用和嵌插作用两种方 式结合，亚甲蓝与s s d n a 的g 碱基还可能存在结合作用。 1 3 1 3 罪啶和吖啶类 吖啶类和菲啶类染料均与d n a 通过嵌插作用结合。溴化乙锭仰1 属于菲啶类 染料，它可能是最典型的与d n a 通过嵌插作用结合的染料，已经有光谱、粘度等 方法对e b 和d n a 结合的性质进行过研究。吖啶类染料中研究较多的是吖啶橙 ( a 0 ) 。t a n g 2 4 1 等采用柱端射壁( w a l l j e t ) 电化学检测系统研究了e b 和d n a 的相互作 用。在即与不同浓度的d n a 结合后，用孔径0 4 5p a n 聚四氟乙烯( p a t e ) 膜将e b 与 d n a 、e b d n a 分离。他们以在n a o h 溶液中预活化的玻碳电极为工作电极，检 测e b 的平衡浓度。e b 初始浓度在1 0 0 2 5 肛m o l 几之间时，测得d n a 与e b 的表观 结合常数为1 7 x 1 0 5 ( m o l l 1 ) ，该结果与其他方法所测结合常数一致。而徐春【2 5 l 等以l 一( 3 一二甲氨基丙基) 一3 一乙基碳二贬胺( e d c ) 为偶联活化剂，将e b 标记于探针 d n a a ，成功实现对靶序列d n a 片段进行识别和测定。 g h e r g h i 2 6 1 等使用悬汞电极研究了双链d n a ( d s 瑚叮a ) 、单链d n a ( s s d n a ) 和超 螺旋d n a ( s c d n a ) 与e b 、a o 的作用。e b 与d s d n a 通过嵌插作用结合后，d s d n a 6 帮岛科技大学研究生学位论文 的链的局部变憔，导致d s d n a 在1 2v 峰辍微增大，而d s d n a 在一1 4v 的峰电流减 夺。e b 与s s d n a 终耀螽，虽然没有嵌搔佟蠲，但会导致s s d n a 的磷黢二酝嚣絮豹 熏定向。e b 与s c d n a 作用后，s c d n a 在，1 4v 出现一个新峰，这是出于缠绕紧密 的s c d n a 出现一个易还原“自由端”引熬的。低浓度a o 与d s d n a 作用结果和e b 类似，高浓度的a o 嵌插入d s d n a 后会在o 4 4v 出现一个耨峰。a o s s d n a 通过 静魄终焉结合在。0 3 9v 密瑷一个赣漳。a o 与s c d n a 佟鲻嚣稷在0 4 4v 密瑷一令 新峰。 1 。3 。 4 殊建炎染料 w r 雒g 鳓等综合使用循环铰安法、计瓣律仑法、整体电解法霸扛摇电纯学显微 镜研究了h o e s t 3 3 2 5 8 不可逆电化学行为及与d n a 的相互作用，并首次推导了适 用于研究不可逆电活性分子与d n a 相互作用的电化学公式。通过对该公式对实 验数据夔霾翔分舔，实验发壤h o e e h s t 3 3 2 5 8 与d n a 鳃合后豹扩散系数藏小，露 电檄反应标准速率常数k 也减小，导致电流减小。求褥h o e c h s t 3 3 2 5 8 与天然鱼精 的结合常数为2 1 x 1 0 8 ( m o l l ) 一，每个h o e c h s t 3 3 2 5 8 可以结合4 个d n a 的碱基对。 该文还对h o e c h s t3 3 2 5 8 的分子结构进行了模拟诗算，发理该染料可熊与d n a 小 沟紧密结合。 1 3 1 5 盼嗪类、吩嗯嗪类幂口略嗪类 逮诬学对遮滔类染辩与d n a 稷互臻瓣磋究不是缀多，其孛跨嚷类嚣中毪红 ( n e u t r a lr e d ，n r ) _ 乖1 】一一一一a 2 ( n i l eb l u e ，n b ) 以及光色素( 1 u m i c h r o m e ，l 固 是其中代表性的物质。 周家宏f 2 8 】等使用紫乡 和可见光谱和电化学方法研究t n r 与小牛瀚腺d n a ( c t d n a ) 裾互俸糟穰理。随蓉溶液p 壬王蕊豹改变，n r 与c t d n a 之闻稳互作用戆方 式也随之改变。 在p h7 0 时，二者的作用方式主要为嵌插作用，当p h ：6 0 时， 二者主要的作用方式改变为静电作用。其原因是由于n r 在p h = 7 0 的溶液中以 中蛙分子形式存在，瑟在p h6 0 熬溶渡中，掩t 激震子豫懿正裹子形式存在。宴l 簸 骏f 嚣l 等用光谱法和电化学法研究了温度对n r 与c 国n a 糟互作用的影响，在低温下 和在低浓度下，n p 嵌入到c t d n a 碱基内部，n r 的生色i 霸嵌入g c 碱潦对并与核酸 双螺旋的对称轴难直，当温度升高时，部分n r 从d i 渔双螺旋中脱出，嵌入豹n r 发凭滔懿长辘转变为与援妊双薅藤兹对称辍藏豁。囊。 j u l 刈等研究了n b 与金电檄表面固定的s s d n a 和d s d n a 的作用。n 8 与d s d n a 可通过静电作用和嵌插作用相结合，而与s s d n a j i 匿过静电作用结合，结合常数分 别为4 + 2 x 1 0 5 ( t o o l l ) 一，1 6 x i 妒( t o o l l ) ，囱予n b 与d s d n a 结舍得更必紧密，可 7 两种染料与d n a 作片j 的电化学和光谱研究 以用作d n a 杂交指示剂。z h a o 3 1 】等使用光谱和光谱电化学研究t d n a 和n b 的相 互作用。低浓度d s d n a 主要与n b 静电结合，生成1 ：1 的配合物，结合常数为7 x 1 0 4 ( t o o l l ) 1 。高浓度的d s d n a 与n b 主要通过嵌插作用相结合。在高浓的d s d n a - n b 体系中加入环糊精( d c d ) ，引起通过嵌插作用相结合d n a n - b 配合物解体，因此 推测是n b 的萘环嵌插入d n a 的双链之间。 i b r a h i m 3 2 1 等以玻碳电极和汞电极研究了l c 与d n a 作用，并对比了这两种 电极的结果的异同。l c 与d n a 形成电活性较低的复合物，导致l c - d n a 在两 个电极上的电流均比l c 要小，通过d n a 滴定l c 实验，可计算出l c 与d n a 的结合常数。汞电极上求得l c d n a 的结合常数为4 x 1 0 5 ( m o l l ) 一，而在玻碳电 极上求出的结合常数为l x l 0 4 ( m o l l ) 一。同时，作者还发现汞电极上，l c 与d n a 结合导致式电位正移，而在玻碳电极上的式电位负移。该实验显示不同电极对同 一种物质与d n a 作用的研究结果有差异。 1 3 1 6 三苯甲烷类和咕吨类 由于这两类染料的电化学反应大多是不可逆的，电化学方法对这两类染料与 d n a 相互作用的研究不多。焦奎p 3 】等使用光谱和电化学方法研究了罗丹明b ( r h o d a m i n eb ，r b ) 对d n a 的识别作用。r b 在+ 0 9 2v 有一个不可逆的氧化峰，加 入d n a 后由于r b 与d n a 发生识别作用，导致r b 的峰电流降低，而峰电位基本没 有发生改变。通过对该体系的电化学行为的研究，电荷转移系数旺，电极反应标 准速率常数j ( s 等电化学参数的变化，在加入d n a 后这些参数基本上不发生变化， 说明r b 与d n a 识别后形成了一种非电活性的复合物，导致溶液中游离的r b 浓度 降低，相应峰电流下降，计算得结合比n ( r b ) ：n 础) = 2 ：1 ，结合常数为2 6 6 x 1 0 9 。 s u n l 3 4 】等用线性扫描极谱研究了在p h1 5 的b r 缓冲溶液中甲基紫( m e t h y l v i o l e t , m y ) 与d n a 的相互作用。在p h1 5 的b - r 缓冲溶液中，m v 在m 6 5v 处有一 还原峰，它与d n a 的相互作用可以导致该还原峰的降低。研究了缓冲溶液的用量， 反应时间，m v 的最佳浓度，反应温度以及干扰离子对反应体系的影响。在最佳 实验条件下，m v 还原峰电流的降低与一定范围内d n a 的浓度成正比，线性范围 为0 9 0 - 2 0 0m g l ，检测限为0 2 5m g l ，相对标准偏差为4 0 0 。应用于合成样品 的测定，结果令人满意。求得甲基紫与d n a 的结合比为n ( m v ) ：n ( d n a ) = 2 ：1 ，结 合常数为7 3 6 x 1 0 8 。 1 3 2 药物与d n a 的相互作用 对抗癌药物与d n a 作用的电化学研究是近年来电化学研究的一个热点。由于 常用的抗癌药物如道诺霉素、米托蒽醌等均具有氧化还原活性，与d n a 结合后会 8 青岛科技大学研究生学位论文 引起自身电活性的变化，斌自身没有电活性，但可引起d n a 的电信号变化，来揭 示蓊秘与d n a 缝合兹淫臻，阕释莰癌蓊魏终建兹狡理。 3 2 。 毙蕙憨 米托蒽醌( m i t o x a n t r o n e ，m x ) x 名丝裂葸醌，璃于蒽醌类合成抗肿瘤药物。刘 蹙辉拶】等磐醴s s d n a 分予修镪熬石墨电极磺究了m x 嵌入俸用。s s d n a 与互於序 列杂交后，具有电化学活性的m x 嵌入d s d n a 分子双螺旋结构的碱基对中，在电 投上形成d s d n a - m x 层，通过伏安法研究d n a 分予和m x 桷互作用的电化学 亍为， 根据嵌入剂m x 的氧化峰电流计算出d s d n a 分子与m x 的农观缔合常数k ；8 4 x 1 0 4 ( m o l l ) ，结合位点的大d , n = 5 。邋过外加嵌插试刹溴化乙锭导致m x 的电流减小， 避一步证实了m x 与d n a 通过嵌插作用相结合。 离子注入是一种新的树料表馘改性技术，是材料科学中颇具生命力的研究领 域。将这种技术用于翎备修饰电裰其有稳定往商、藿现瞧掰帮催化活住强麓特点， 用于分析测定，尤其是有机药物及其与d n a 和蛋白质作用的研究舆有重袋的理论 意义帮广泛酶应螽i 翦景。麓劲渡l 蚓等使惹镣离子注入修镄奄稷磅究y m x 与d n a 作用。在37 c 恒温，p h7 1 条件下，m x 与d n a 形成一种非电活性的结合物，使 m x 蕊峰亳渡降低，萁缝合滋黼冷：n ( d n a ) = 2 ：l ，结合鬻鼗为1 6 x 1 0 控，邀予转 移系数为0 4 1 ，电极反应速率常数0 3 3s 1 。 w a n g 37 j 等在生理条黪t ( p h = 7 4 ) 使磷孝蓦骂茯发法磅突了鑫联与魏姨戆稳互终 用。实验发现，m x 与小牛胸腺d n a 的结合以葸醌母核的嵌插作用为主，同时，氨 基铡链与嚣架磷酸基圜之阕数静魄吸雩| 对母棱起稳定终惩，使化台物易予嵌入 d n a 的平面结构。m x 与d n a 嵌插结合届，m x 扩散系数极大降低，从而引起电 流降低。实验求缮结合位点数为3 ，结合常数为8 7 x 1 0 8 ( t o o l l ) 。 3 2 ，2 漾诺霉紊 道诺霉素( d a u n o m y c i n , d n m ) 又称柔红霉索( d a t m o r u b i e i n , d n r ) 或正窳霉素， 移张摇慈黼一群毽疆予慧貔类菰黪癯药耱。在李帮分中一律采瘸簿写d n m 柬妖 表。 c h u 3 8 1 等搜蠲旋转圜纛邀投磷究了d n m 与d n a 的掇互终殿。d n m 嵌捶入 d n a 双镳形成d n a - d n m 复合物，该复合物的扩散系数比d n m 小，从而导致 d n m 电浚的减小。通过对d n m d n a 滂定趁线躲非线链强归分毒厅获得的结合位 点为6 ，结合常数为2 3 5 x 1 0 5 ( t o o l l ) 。d n m 的阳极蜂电流的降低值与d n a 的加入量分段呈线性关系，可以用来分拶予d n a 的浓度，检出限稠重现燃均比较 9 两种染料与d n a 作用的电化学和光谱研究 好。而王静1 3 9 】等在钴离子注入修饰电极研究了d n m 与d n a 的相互作用，用非 线性拟合得到d n m 与d n a 的结合常数1 0 9 1 0 8 ( t o o l l ) ，结合位点数s 锄，即 d n a 分子结构中的1 个螺旋结合2 个d n r 。 j w a n g 等i 帅1 使用碳糊电极以计时电位溶出分析研究了d n m 与d n a 相互作 用。该小组研究了d n a 与d n m 在溶液中的作用( 溶液方法) 、d n a 修饰电极与 d n m 的作用、以及d n m 修饰电极和d n a 的作用。d n m 在+ o 5 v 有一个计时 电位溶出峰，和d n a 作用后，该峰峰高降低，且出现一个肩峰，该肩峰有可能 是嵌插入d n a 的d n m 产生的，在同样的条件下，d n a 鸟嘌呤的残基在+ 1 0 4 v 氧化产生的峰无变化。d n m 修饰电极与溶液中的d n a 作用结果和溶液方法所得 结果类似，但在溶液方法中发现的肩峰在d n m 修饰电极上形成一个独立的峰。 d n a 修饰电极浸入低浓度的d n m 溶液后，电极表面d n a 鸟嘌呤残基的氧化峰 随着d n m 的浓度和作用时间的延长而增大。d n m 在d n a 修饰