（生物化学与分子生物学专业论文）洋葱转脂蛋白的钙调素结合活性及抗真菌活性分析.pdf

ab s t r a c t ab s t r a c t c a l m o d u l i n ( c a m ) i n i t i a t e s s i g n a l p a t h w a y s a n d u l t i m a t e l y r e g u l a t e s p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s b y i t s i n t e r a c t i o n w it h a v a r i e t y o f p r o t e i n s c a l l e d c a m b i n d i n g p r o t e i n s ( c a mb p s ) . c a m b i n i n g p r o t e i n 1 0 ( d e s i g n a t e d c a mb p - 1 0 ) , p u r i f i e d fr o m c h i n e s e c a b b a g e , i s a n o v e l p l a n t e n d o g e n o u s c a mb p w i t h i mp o r t a n t p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s . b a s e d o n s e q u e n c e a n d b i o c h e mi c a l p r o p e r t y c o m p a r i s o n s , c a mb p - 1 0 i s b e l i e v e d t o b e a n e w me m b e r o f n s l t p f a m i l y . t h i s i s t h e f i r s t r e p o r t t h a t a s s o c i a t e s a c a mb p w i t h n s l t p f a m i l y . r e c e n t r e s e a r c h s h o w e d t h a t b e s i d e c a mb p - 1 0 , b o t h a r a b i d o p s i s n s l t p l a n d z m - n s l t p c a n b i n d t o c a m. t h i s i n d i c a t e d t h a t n s l t p s mi g h t b e a n e w k i n d o f c a m b i n d in g p r o t e i n s . t o u n c o v e r t h e i n t e r a c t i o n o f n s l t p s a n d c a l mo d u l i n , w e c o n s t r u c t e d a n d e x p r e s s e d a s e r i a l o f s i n g l e - s i t e a n d m u l t y - s i t e m u t a n t s o f c a mb p - 1 0 a n d d e t e r m i n e d t h e a f fi n i t y o f t h e s e m u t a n t s w i t h c a m. t h e r e s u lt s h o w e d t h a t t h e a ff init y o f c a mb p - 1 0 t o c a m d e p e n d s o n f o u r b a s i c a mi n o a c i d s i n c a m b i n d i n g d o m a i n a t c - t e r mi n a l o f c a mb p - i o .b e s i d e s , w e a l s o c l o n e d a n d e x p r e s s e d a c e - a mp a n d b y g e l - o v e r l a y a n a l y z e w e f o u n d t h a t a c e - a m p 1 h a s t h e s a m e s t y l e o f c a m b i n d i n g t o c a mb p - 1 0 . f u r t h e r a n a l y z e i n d i c a t e d t h a t t h e c a m- b i n d i n g d o m a i n o f a c e - a mp i l o c a t e d b e t w e e n t h e 4 3 a n d 6 2， a n d t h e c a m- b i n d i n g a c t i v i t y o f a c e - a mp i w a s d i r e c t l y r e l a t e d w i t h t h e f o u r b a s i c a m i n o a c i d s w i t h i n t h i s d o m a i n . we a l s o d e t e r m i n e d t h e i n v i t r o a n t i - f u n g i a c t iv i t y o f a c e - a mp 1 , t h e r e s u l t s h o w e d t h a t t h i s p r o t e i n c a n s i g n i f i c a n t l y r e p r e s s t h e g r o w t h o f f u n g i s u c h a s c o l l e t o t r i c h u m m u s a e . t h e h a l f r e p r e s s e d c o n c e n t r a t i o n c a n r e a c h t o 1 . 5 u g / m 1 . t o f i g u r e o u t t h e a n t i - f u n g i a c t i v i ty s i t e , w e c o n s t r u c t e d t w o - s i t e m u t a t e d a c e - a mp 1 , a n d t h i s m u t a n t s h o we d l e s s a n t i - f u n g i a c t i v i t y t h e r e s u l t s w e h a v e d e s c r i b e d a b o v e h a v e s a t a s o l i d f o u n d a t i o n f o r f u r th e r s t u d y o f t h e f u n c t i o n o f n s l t p s a n d i t s i n t e r a c t i o n w i t h c a m b y t r a n s g e n i c m e t h o d . k e y w o r d s : p l a n t n o n - s p e c i fi c l i p i d t r a n s f e r p r o t e i n , c a l m o d u l i n - b i n d i n g a c t i v i ty , c a l m o d u l i n - b i n d i n g p o s i t i o n , a it i - f u n g i a c t i v i t y 1 1 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了 解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印 刷本和电 子版，并采用影印、缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文; 学校有权提供目 录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务; 学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印 件和电子版; 在不以赢利为目 的的前 提下，学校可以 适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名: * i w o 卑 尹阵 了 丫日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名: 舞 风 学位论文作者签名: 解 密时 间: l 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 内 部 5 年 ( 最长5 年， 可少于5 年) : 秘密1 0 年 ( 最长1 0 年， 可少于1 0 年) 机密*2 0 年 ( 最长2 0 年， 可少于2 0 年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的成果。 除文中已经注明引用的内容外， 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、 己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体， 均已 在文中以明确方式标明。 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名: ) 年 了 月 l 日 引言 第一章 引言 第一节 c a z / c a m信号转导系统 钙 ( c a z + ) 作为细胞中 第二信号分子， 在生物细胞中起着关键作用已 经得到 广泛的 认可p , z . 3 . 4 。 植物 体内 的 许多 生 理活动都与c a z + 有着密切的 联系， 如离 子平衡、细胞质流动、器官极性发育、花粉管生长、碳水化合物代谢、有丝分 裂、 基因表达以 及对生长素和损伤的反应。 在静息条件下， 植物细胞质中的c a z + 浓度在1 0 -z m o l / l r 1 0 71 m o 1 / l 之间; 细胞受到刺 激后， 导致细胞中c a 十 浓度迅 速 上升， 从 而引 发一系列生 理生 化反 应 z . 4 。 真核生 物中c a z + 浓 度的 瞬间 升高刺激 一系列钙感受 器( 钙结合蛋白 ) a 。 在植 物中 大 量的 钙结合蛋白己 经发 现， 钙结 合蛋白 分为四类，包括: 钙调素 ( c a m) ,类似钙调素和其他含 e f手性结构的 钙结合蛋白、 钙依赖蛋白 激酶和无e f 手性结构的钙结合蛋白。 其中， 前三类钙 结 合蛋白 含有h e l i x - l o o p - h e l i x 结构域， 即e f 手 性结构， 此结构对钙有高亲和性。 不同的钙结合蛋白e f手性结构域数量不同，因此对钙离子的亲和能力也不同。 钙结合蛋白 结合c a z + 以 后， 结构发生 变化， 暴露出 结合位点， 通过与各种靶蛋 白的结合，参与众多的 细胞生长过程和生理功能调节 s 1 1 9 6 7 年c h e u n g 发 现的 钙调 素( c a l m o d u l i n , c a m) 具有最广泛、 最重要的 调节功能，它作为主要的钙受体蛋白 参与多种酶和众多细胞过程的调节，是钙 信号转导系统中的 基本 组成 部分2 a c a m是一 种耐热的酸 性小 分子蛋白 ， 由1 4 8 个氨基酸组成。对不同来源的c a m分析表明，其氨基酸组成具有高度保守性。 钙调素晶体结构表明，c a m 具有两个球形结构域，分别为:氨基末端结构域和 狡基 末端结构域。 每个球形结构 域含 有 两个e f 手性结构， 结合两个c a 2 + ， 由 中 间一段松散的a - 螺旋连接 两 个球状结 构域， 整个分子呈哑 铃形状 1 。 两 端球形结 构 域不 与c a z + 结 合时 形 成 一 较 浅的 疏 水 穴 ( 图1 . 1 a ) ， 周围 是 一 些带负电 荷的 酸 性氨基酸残基， 如g lu ， 同时 在其表面常分布有几个甲 硫氨酸残基， c a z + 与c a m 的结合能诱导c a m的构像发生较大变化， 主要表现为疏水穴的扩大与加深， 分 子延长 ( 图1 . 1 b ) e 引言 分别为9 . 8 %. 1 . 1 % 和2 6 . 1 % 1 c a t g g a c t g a a g g a g t a g a a a a t c a t t c a t c a m c a c a c t t c t c atm g c a a a c a a t c 6 1 。a a a a c t a a g a * 回 g c t w t c t a a t g a a a t t g g c a t x t t g g t c t t g 。 1 2 1 2 1 c c t g c a t g a t t g t g g c c g g t c c a a t c a c a a c g a a c g c g . g c t c t a a g c t g t g g a a c c g t t a a c 翻i v a g p i t t n a a l s c g t v 3 2 1 8 1 g c . g g t a a c竹g g c a g c a t g c a t t g g c t a c t t a a c c c a a a a t g g g c c c c 竹 c c c a g a g g g t s g n l a a c i g y l t q n g p l p r g 5 2 2 4 1 g c t g c a c c g g c g t t a c t从t c t a a a c a a c a t g g c c c g t a c a a c c c o g g a c c g t c a g c a a g c c t g v t n l n n n a r t t p d r q q 7 2 3 0 1 c t t g c c g t t g t c t t g t a g g a g c c g c t a a c t c c竹c wt a c t c t c a a c g c t g o c c g a g c t g a c r c l v g a a n s f p t l n a a r a 9 2 3 6 1 c t g g a c t t o c t a a g g c a t g t g g a g t c a a t a t t o c t t a c a a a a t a g c a 从 a g c a c c a a c t a g l p k a c g v n i p y k i s k s t n 1 1 2 4 2 1 g c a a c a g c g t t a g g c n s v r g c g g c . g g t c g . g a t g a a g a a a c t c a a g c g g a c g t a c g a a t c t a a 481 ta t a at g t a t g a g a g a g t a c t a a a t a a ga t gt t gtt t tt c t a g tg t t t t a a aat t t ca t g 5 41 tt t ct ct t c t gt t g tg t cg t t cc t t t a ct t tg g t tg t at g t a c aa t g tt c g t aat caa c g 6 0 1 t c c g c t a t a t g a a g t t c g t a a a a a a a a a a a a a a a a a mm a a a a a a c g a t c m 图1 . 5 b p - 1 0 全长c d n a核昔酸序列 方框标出 起始密码子和终止密码子， 横线标出 信号肤氨基酸序列 通过核昔酸序列和氨基酸序列比对和结构的比较，我们初步认定， c a m b p - 1 0 可能 是一 种新的 非 特异 性 转脂蛋白 5 5 1 . 通过 对c a m b p - 1 0 m r n a全 序列的分析发现， c a mb p - 1 0 与转脂蛋白 有相似的信号肤结构， 说明它们可能在 体内 会经历相同 或相 似的 前体加 工 过程， 并 有着相同 的 细胞定位。 c a m b p - 1 0 不 引言 仅在分子量，等电点，热稳定性等理化性质上与植物n s - l t ?极其相似，近期研 究还表明， 在生物学功能上， c a mb p - 1 0 也具有与植物n s - l t p相似的脂结合活 性和抗真菌活性， 这进一步证明b p - 1 0 为植物n s l t p s 家族中的新成员。此外我 们发现不仅只有b p - 1 0 ， 其它转脂蛋白家族的 成员如拟南芥非特异性转脂蛋白i 和玉米非特异性转脂蛋白，均表现出c a m结合活性，从反正两方面证明了植物 非特异性转脂蛋白是一种新的c a m结合蛋白。 为了寻找c a m b p - 1 0 与c a m的结合结构域， 我们通过p c r方法对b p - 1 0 成 熟蛋白 进行了 缺失和删除 ， 先后构建了 缺失c段1 2 个氨基酸， 缺失c端2 4 个氨 基酸， 以 及删除第6 9 位到第8位氨基酸的三种突变体蛋白 ， 并对这些突变体蛋白 进行了 凝胶覆盖分析， 发现缺失c 端1 2 个氨基酸的c a m b p - 1 0 突变体蛋白 与c a m 结合能力减弱， 而缺失c端2 4 个氨基酸以及删除第6 9 位到第8 5 位氨基酸的突 变体蛋白则失去了与钙调素结合活性。这样的结果表明 ，, b p - 1 0与钙调素的结合 结构域不是常见的b a a结构， 而是 其靠近c 端的 一段序列( 第6 9 位到第8 5 位氨 基酸 ) ， 同时 ， 这段序列在植 物转 脂蛋白 中 非常保守， 被广泛认为是转脂蛋白 结 合 脂的部位。 第四节选题背景 钙调素结合蛋白b p - 1 0是植物转脂蛋白 家族的一员，而拟南芥非特异性转 脂蛋白i 和玉米非特异性转脂蛋白均表现出c a m结合活性。那么，是不是所有 的植物非特异性转脂蛋白 都具有c a m结合活性呢，而所有这些转脂蛋白的钙调 素结合特性是否相同呢?它们的钙调素结合位点又在哪里呢?另外，目 前已 知 转脂蛋白具有转脂功能和防御功能，而对其发挥生物功能的机制还没有明确的 报道。 为了解决这些问题，本文首先在以前研究的基础上克隆表达了一系列 c a mb p - 1 0 的单点及多点突变体蛋白， 并对其进行了钙调素结合活性分析， 以期 找到 c a m b p - 1 0与钙调素结合的具体位点。 这将为确定其它植物非特异性转脂 蛋白的钙调素结合位点起到指导作用，也为通过转基因的方法对 c a mb p - 1 0进 行体内活性分析打下基础。 引言 另外， 我们克隆并表达了洋葱非 特异性转脂蛋白a c e - a n t i 。 这是一个非常 特殊的转脂蛋白， 它的等电点为1 1 . 7 7 ， 大大超出了一般转脂蛋白的等电点范畴。 并且， a c e - a n t i 被报道并不具有转脂活性， 同时它又是现有报道中抗真菌活性 最强的植物非特异性转脂蛋白。 本文将用凝胶覆盖的方法验证a c e - a nt i 的c a m 结合活性并用缺失突变及点突变的方法确定其钙调素结合结构域及结合位点。 本文还将验证重组 a c e - a m p i的体外抗真菌活性，并且构建并表达 a c e - a m p i 的一个突变体 ( 两个色氨酸w突变成丙氨酸a ) , 验证a c e - a n t i 一级结构中 的两个色氨酸对其抗真菌活性的影响。 实验材料与方法 第二章实验材料与方法 第一节实验材料与试剂 2 . 1 . 1 实验材料 洋葱幼苗为市售洋葱室温种植所得 牛脑钙调素为本实验室制备 真菌香蕉炭疽菌种为本校生测室提供 2 . 1 . 2质粒与菌种 e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) t r x b 公司) 困o v a g e n 公司) ( t a k a r a ( t a k a r a 月jr诬了 1通戈奴 2入无 毛 d n a l i g a s e 公司) 公司) ( t a k a r a 公司 ) d n t p ( t a k a r a 公司 ) d l 2 0 0 0 d n a m a r k e r ( 天为时 代) p f u d n a p o l y m e r a s e ( 天为时 代) r n a s e ( 加拿大s a n g o n 公司) 异硫氰酸肌( 加拿大s a n g o n 公司 ) c a p s ( 加拿大s a n g o n 公司 ) 氨节青霉素 ( a m p i c i ll i n )( 普 博欣生 物公司 ) 卡那霉素( 普博欣生物公司 ) i p t g( 普博 欣生 物公 司 ) 胶体金溶液 ( 1 5 n m )( 华美生物工程公司) 0 . 4 5 1a m过滤器( 联星生物) 实验材料与方法 肠激酶( 杭州远东生物有限公司) h i s - b a n d p r i fi c a t i o n k i t ( n o v a g e n 公司) 第二节实验方法 2 . 2 . 1洋葱n s l t p的克隆与表达质粒的构建 2 . 2 . 1 . 1洋葱总r n a的 提取及鉴定 取洋葱幼 苗。 . 1 g ， 液 氮研磨后， 加 入1 .5 m 变性液( 4 m o l / l异硫氰酸肌， 0 . 5 % 十二烷基肌氨 酸钠， 0 .0 3 6 m o u l柠檬酸 钠， o . l m o l / l 卜 疏 基乙 醇， d e p c - h 2 0配 制) ， 剧烈震荡1 5 秒， 依次加 入n a a c ( 2 m o l/ l , p h 4 , d e p c - h 2 0 配制) 1 5 0 1 1 , 抓仿7 5 0 1 1 ， 酸性酚( p h 4 . 5 f 0 .2 ) 7 5 0 1 1 , 震荡 混匀， 冰浴1 0 分钟( 每隔2 分钟 震荡混匀一次，以 防分 层) ， 4 1c 1 2 ,0 0 0 g 离心巧分钟， 吸上 清， 加入同 体积氛 仿， 混匀， 冰浴5 分钟， 4 c 1 2 , 0 0 0 g 离心1 5 分 钟， 取上 清， 加入同 体积异丙醇， 震荡混匀， - 7 0 放置5 分钟， 4 0c 1 2 , 0 0 0 g 离心1 0 分钟， 弃上清， 加入0 .5 m 1 7 5 % 乙醉， 5 0 0 0 r p m离 心， 弃上清， 沉淀溶于d e p c - h 2 0中。 取5 匹 进行1 % 琼脂糖凝胶电 泳， 观察其中的r r n a带， 尤其是2 8 s 和1 8 s 的亮度比 例是否2 : 1 ，以 此来检测r n a的完整性。另取5 匹 溶于3 m 1 水中测 定其o d 2 s o , o d 2 6 0 和o d 2 3 0 ， 确保0 d 2 6 0 a s 0 的 值位于1 . 7 - 2 . 0之间， 而o d 2 3 0 /2 6 0 的值大于2 .0 。同时可以估测总r n a的含量。 2 . 2 . 1 . 2反转录合成c d n a 以总r n a为模板， o l i g o d t 为引 物， 反转录合成c d n a第一条链。总反应 体系为2 0 p 1 。 首先在d e p c - h 2 。中 加入0 .8 p 8 的o l i g o d t 和t u g 的r n a , 6 5 0c 温 浴5 分钟后， 冰浴3 分钟， 离心后加 入m 9 c 1 2 ( 终 浓度为5 m m o 1 / l ) , 2 川1 0 、 的r t 缓冲溶液， d n t p( 终浓度为l m m o l / l ) , 2 0 u的r n a s i n , 3 7 温浴1 0 分钟，加入 2 0 u的a mv r t a s e ,4 2 反应1 小时后， 于9 8 加热5 分钟终止反应， 冰浴3 分 钟， 最后以1 0 m m o l/ l t ri s - h c i 缓冲液 ( p h 7 .4 ) 稀释， 分装后7 0 保存，以 此 合成的c d n a作为p c r反应的模板. 实验材料与方法 2 .2 . 1 . 3 p o r 扩增反应 以洋葱总r n a 反转录所得的c d n a 为模板， 性转脂蛋白 a c e - a mp i 的核昔酸序列 ( g e n b a n k : 设计上游、 下游引物。 根据表达载体的酶切位点 和x h a 2 酶切位点。 进行p c r 反应， 根据洋葱非特异 a c c e s s i o n no . a f 0 0 4 9 4 6 ) 分别 ， 在两引物的5 端分别引入n c o i 上游引物p 1 : 5 下游引物p 2 : 5 ) 3 ， 9吸边通t c a a c t g tta a t c c t g c c g c a ttg g a t c 壑退皿迫c t c a g a a c ga t cct cgag 3 ， 以1 川 反转录c d n a 为模板， 使用上述引物进行梯度p c r 反应。p c r 条 件为: 首次循环:9 4 1c 4 m i n , 5 0 1c 1 . 5 循环体: 9 4 1c 4 5 s , 4 8 c - 5 5 1c 末次循环:7 2 c i o m in , 4 c f o r m i n , 7 2 0c 1 . 5 m i n ; l m i n , 7 2 c l m i n , 3 0 c y c l e s ever 取l o p l 反应产物，1 % 琼脂糖凝胶电 泳， 紫外灯下观察结果。 采用冻融法对p c r 扩增片段进行回收，主要过程如下:p c r 产物进行1 % 琼 脂糖凝胶电泳，切下目 的片断，-2 0 冻存2 0 分钟，将液体挤出，加入1 l 9 体积 乙 酸钠， 2 倍体积乙 醇，- 2 0 沉淀2 0 分钟，1 2 0 0 0 转离心5 分钟，弃上清， 7 5 乙醇洗一次，扣干，溶于2 0 u l 双蒸水中，电泳检测回收情况。 2 . 2 . 1 . 4 表达质粒p e t n s l t t 的 构建及转化 碱法小提表达载体 p e t 3 2 a ( + ) ， 分别 加入1 5 u 的内 切酶 ,n c o i 和x h o i 于6 0 p i 反应体系中，3 7 消化3 小时， 用冻融法对酶切后线性化表达载体进行回收。 将p c r 扩增片段与线性 化的 p e t 3 2 a ( + ) 按摩尔比 1 0 . 1 混 合， l o x 反应缓冲 液 1 g 1 和 2 u t 4 d n a l i g a s e 加入1 0 川 连接体 系中 ，1 6 连接过夜。 c a c 1 2 法制备宿主菌e . c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) tr x b 撼受态细胞。 取全部连接产物加 入 2 0 0 8 1 感受态 细胞， 轻微混匀， 冰浴1 小时， 4 2 热 激9 0 秒， 加入 4 0 0 川l b 培 养 基， 3 7 0c 震荡培养4 5 分 钟， 离心， 弃上清， 沉淀重 悬于 5 卿 l b 培养基中， 铺于 含有o . l m g / m l 氨节青霉素和0 .0 2 5 m g / m l 卡那霉素的 l b 平板培养基上， 3 7 培养 过夜。 2 . 2 . 1 . 5 ，组质粒的鉴定 挑取转化所得的 l b 培养 基上的 菌落， 分别置于 含有0 . 1 m g / m l 的 氨节青霉素， 0 .0 2 5 m g / m l 卡那霉素的l b 试管培养基中， 3 7 1c 震荡培养1 0 小时。以碱法小提质 实验材料与方法 粒. ，用上下游引物进行p c r , 电 泳检测p c r 产物中是否含有目的插入片段。将筛 选出的阳性克隆送测序，核对序列是否正确。 2 .2 . 2洋葱n s l t p 的表达与纯化 2 .2 .2 . 1洋葱n s l t p 的小量表达 将测序正 确的菌 株3 7 1c 振荡 培养 过夜， 取5 0 0 川转 接于5 0 m 1 新鲜l b培养 基( l 0 0 g g i m 1 氨节青 霉素， 2 5 1x g / m l 卡那霉素 ) ， 3 7 0c 振荡培养至o d 6o o = 0 .6 ， 加 入i p t g 3 0 诱导5 h .离心收集菌体， 肠激酶缓冲液 ( e k b u ff e r ) 洗一次，2 m 1 e k b u ff e r 重悬菌体，超声波破壁，离心，上清加入肠激酶 ( e k )室温酶切 1 6 小时。 2 .2 . 2 . 2洋葱n s l t p 的大最表达 将上述测序正 确的 菌株3 7 振荡培 养过夜， 取 5 0 0 闪 转接于 5 0 m l 新鲜l b 培养 基( l 0 0 p g / m l 氨节青霉素， 2 5 w g / m l 卡那霉素) ， 3 7 c 振荡培养至o d 6m= 0 . 6 ， 加入 i p t g 3 0 诱导5 h .渗透休克法破壁， 方法如下:将菌体离心后溶于3 0 m l 高渗液 2 0 m m o l/ l t r i s -h c i ( p h 8 . 0 ) ， 2 . 5 m m o l / l e d t a , 2 0 0 g / l蔗糖1 ， 4 c放2 2 0 后， 1 0 0 0 0 r / m i n离心1 0 m i n , 弃 上清， 加入8 0 m 1 的 4 0 c 预冷的 低渗液 2 0 m m o l/ l t ri s -h c i ( p h 8 . 0 ) ， 2 . 5 m m o l/ l e d t a ) , 冰上放w3 0 m i n ， 1 2 0 0 0 r / m i n 离心2 0 m i n ， 上清即为渗 透休克释放的蛋白 质溶液， 电 泳鉴定。 2 .2 . 2 . 3 t r z - n s l t p 融合蛋白的 酶切与纯化 用 2 m l c h e l a t i n g s e p h a r o s e 层析介 质装柱， 依次用 3 倍体积去离子水、 5 倍体 积c h a r g e b u ff e r ( 5 0 m m n i s o , ) 和 3 倍体 积的 b i n d i n g b u ff e r ( 1 0 0 m m o l/ l t r i s - h c i , p h 7 .9 , 5 0 m m o l / l i m i d a z o l e , 2 . 5 m m o l/ l n a c l ) 洗柱，流速l n il / 3 m i n o 将渗透休克释放出的蛋白溶液对e k b u ff e r 透析后上柱。 依次用1 0 倍柱 床体 积的 b i n d in g b u ff e r 和6 倍体 积的 w as h b u ff e 叹 2 0 m m o l/ l t r i s - h c i , 0 . 5 m m o l / l n a c l , 6 0 m m o l / l i m i d a z o l e , p h 7 . 9 ) 洗去杂蛋白 ， 直至 o d 2 g o c c g c t c g a g t c a a a c a a a g g t g t t g c g a c c c g c t c g a g t c a g t ttc g t c t c a g a c c g c c g c t ca g t c a t a g g t t t c t a g t a t t c a c gc t gc t gc t gc a t gc gc tt gcc t c g t aggggt ag ag c gc a t gc ag c ag c a gc t ag gi 1 1 c t ag t a tt c ac gt gaacgct aaccccggt ct gagacg g ggg tt ag c g tt c ac t ac c c c t ac g ag ggac gt gc agc g aaggg acgaac aaagg c c t t c gc t g c ac gt c c a ag aa tt c a a t g c 3 按2 .2 .4 方法构建表达质粒， 表达突变体蛋白并进行凝胶覆盖分析， 按2 .2 . 6 . 方法进行抗真菌活性分析。 2 . 2 . 7 c a mb p - 1 0 的c a m的结合位点分析 利用2 .2 .5 点突变及2 .2 .4 缺失突变的方法分别构建了l r 7 0 - r ( 7 0 位l 突变为r , 下同) 、 v - 7 6 - r , i - 7 8 - r , y - 8 0 - r , y - 8 0 - a , ol p k a ( 删除l p k a 四个氨基酸， 下 同 ) 、 al p y k , a l p k a 十 i p y k ( 加号 表示同时 突变， 下同 ) 、 k - 7 2 - a 十 k - 8 1 - a , k- 8 1 - t、k- 8 1 - t + k- 8 4 - t、k- 7 2 - a+ k- 8 1 - t 十 k- 8 4 - t r - 6 6 - a 十 k - 7 2 - a + k - 8 1 - a + k - 8 4 - a 等多个突变体，并对突变体蛋白进行了c a m凝 胶覆盖分析。 实验结果 第七节 洋葱n s l t t与c a mb p - 1 0 的c a m的结合位点比 较 利用多步p c r 的方法，成功构建了c a m b p - 1 0 的多个突变体，并对这些突变 体进行了c a m 结合活性的分析，结果表明c a m b p - 1 0 的c a m 结合结构域中的疏水 氨基酸对其c a m 结合活性影响不大， 而碱性氨基酸的突变则会显著影响c a m b p - 1 0 的c a m 结合活性。 r - 6 6 - a + k - 7 2 - a 十 k - 8 1 - a + k - 8 4 - a突变体彻底失去了与钙调素 的结合活性 ( 表 3 .3 ) 。洋葱n s l t p的c a m结合结构域与c a m b p - 1 0虽然明显不 同， 但其与c a m 的结合位点却与c a m b p - 1 0 类似。 表3 . 3 c a m b p - 1 0 突变体的钙调素结合活性分析 ( c a m b p - 1 0 正常蛋白的c a m 结合活性以十 +表示) 突变体结合活性 v - 7 6 - r 于十+ l- 7 0 - r +十+ 1 - 7 8 - r 叫 干 十 y - 8 0 - r +十 y 8 0 - a + al p k a ( 7 0 - 7 3 ) 咔 ai p y k ( 7 8 - 8 1 ) 月. al p k a ( 7 0 - 7 3 ) + ai p y k ( 7 8 - 8 1 ) + k- 7 2 - a十k- 8 1 - a + k- 8 1 - t + k- 8 1 - t 十 k- 8 4 - t + k - 7 2 - a + k - 8 1 - t + k - 8 4 - t , 十 r- 6 6 - a十 k- 7 2 - a+ k- 8 1 - a十 k- 8 4 - a 讨论 第四章 讨论 第一节 洋葱非特异性转脂蛋白a c e - a mp 1 的钙调素结合活性 a c e - a m p i是一个非常特殊的 植物转脂蛋白，其成熟蛋白 分子中含有多达 1 9个精氨酸，等电点为 1 1 . 7 7 ，大大超出了一般转脂蛋白的等电点范畴。 a c e - a mp 1 虽然具有植物转脂蛋白 共有的八个半耽氨酸的结构模序， 以及类似的 空间结构， 但它与其它转脂蛋白同源性较低 ( 图4 . 1 ) a a c e -a mp i 并不具有转脂 活性，这可能与其初级结构上含有的两个色氨酸残基有关，折叠的蛋白的空穴 中的芳香族氨基酸的存在阻止了 其与脂类的结合。 a c e - a m p i c a m b p - 1 0 q n i a l s * g t * s g n l a a * i g * l t q r a p i a p -cc r n g * l p r g * * t 1 1 2 1 c p r v n r i v t p c v a y g l ga l n d l r - f v n g v t n * n n m a r t r n l r r a a c r . * t p d * q q * * * 5 1 6 1 7 1 8 1 9 1 o n i o n - l t p c l v g v v n r n p g l r r n p r f q n i p r d c r n t f v k v t i w w k p r i q c g r i n r. g m s p - 1 0 * * * * a a * s f * t * n - a a * a a g l * k a * g -v n i * y k i s k s t n * n s v r 图4 . 1 a c e - a mp 1 与c a mb p - 1 0 氨基酸序列比对 植物非特异性转脂蛋白具有繁多的功能并参与植物多种生命生理过程，但 目 前对于它的作用机制和调控机理仍旧 鲜为人知。 此前，本研究室已经验证了c a mb p - 1 0( 白 菜转脂蛋白) ，拟南芥转脂蛋白 a t - n s l t p i 的钙调素结合活性。而玉米转脂蛋白z m - n s l t p的钙调素结合活性也 在本文研究的同时被验证。本文对 a c e - a m t i 这一特殊的植物转脂蛋白的钙调 素结合活性的验证，进一步证明了 我们的推断，即植物非特异性转脂蛋白是一 类新的钙调素结合蛋白。 这为我们研究植物非特异性转脂蛋白 繁多生物功能的 作用机制和调控机理提供了一把钥匙。 讨论 第二节a c e - a mp 1 的钙调素结合结构域及结合位点 钙调素本身并没有任何酶活性，它在生物体内的众多调节功能都是通过与 其结合蛋白 相互作用而实现的。不同 钙调素结合蛋白 的 c a m b d的氨基酸序列 并 不 保守。 其中 最 普 遍的 是 依 赖 于c a t + 的 碱 性 双 亲a - 螺 旋( h_ a s i c a- rn p h i p h il i c a_ - h e l i x , b a a ) 结构， 以 及不依赖于钙离子的i q结构域。 一先期研究表明， c a m b p - 1 0以及拟南芥脂转移蛋白a t - n s l t p l 的钙调素结合 结构域均位于 c 一 末端2 4个氨基酸序列内，这一区域也正是 up分子中高度保 守的脂类结合部位。 然而，本文研究的洋葱非特异性转脂蛋白的钙调素结合结构域却位于其 4 4 - 5 7 位氨基酸处的b a a 结构 ( 图4 . 2 ) ，这与我们预期的截然不同。 在本文研 究的同时， 发现单子叶植物玉米的转脂蛋白z m - n s l t p的钙调素结合结构域与洋 葱类似，同样位于分子中 部的b a a结构。 这可能与c a m b p - 1 0 及a t - n s l t p l 属 于双子叶植物， 而a c e - a nt i 与z m - n s l t p 属于单子叶植物有关。 这一规律有待 对烟草，小麦，水稻等植物转脂蛋白的钙调素结合结构域分析来进一步验证。 图4 .2 a c e - a n t i 分子中4 4 - 5 7 位氨基酸形成的b a a结构 通过对c a m b p - 1 0 钙调素结合结构域内 氨基酸的点突变研究，我们发现， 当疏水氨基酸突变为碱性氨基酸时， b p - 1 0 与c a m的结合能力不受影响，但当 部分碱性氨基酸突变为疏水氨基酸时，b p - 1 0 与c a m的结合能力明显降低。说 明碱性氨基酸在b p - 1 0 与c a m的结合中起主要作用。当结构域中的全部4 个碱 讨论 性氨基酸同时突变为疏水氨基酸时， b p - 1 0 与c a m的结合能力几乎完全丧失。 充分证明b p - 1 0 与c a m的结合取决于结构域中四 个碱性氨基酸，是碱性氨基 酸贡献的正电荷与 c a m相互作用的结果。 进一步研究表明， a c e - a mp i 以及z m - n s l t p 也具有相似的钙调素结合位点。 将它们钙调素结合结构域中的4 个碱性氨基酸突变成疏水氨基酸后，它们同样 丧失了钙调素结合能力。据此我们推测， 植物转脂蛋白与钙调素的结合依赖于 其结合结构域中的多个碱性氨基酸提供的静电作用。 第三节 植物n s l t p的抗真菌作用 近年来，来自 多方面的研究结果一致认为 n s l t p在植物防御机制中 起重要 作用。 病原微生物的 侵染能够诱导n s l t p 过表达。 而且， n s l t p 能不同程度的特 异性抑制各种病原体的生长并诱导植物系统抗性的产生，也因此命名为病程相 关蛋白 一 1 4 ( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e d p r o t e