（分析化学专业论文）木槿叶中氨基酸的提取、纯化、测定和应用.pdf

摘要 木槿是集药用、食用、观赏、绿化价值、纤维原料于一身的木本 植物。木槿叶中营养成分与无机元素含量丰富，特别是氨基酸的含量， 占木槿干粉的1 3 左右，可以作为氨基酸生产的来源之一，而木槿叶 中含有的天然活性成分，可作为天然去污剂，成为洗发香波的主要原 料之一。 本论文由三部分组成：第一部分为木槿叶中复合氨基酸的提取纯 化方法研究，探索一条适合于工业化生产的工艺路线；第二部分为氨 基酸测定方法的研究；第三部分为木槿中草药洗发水的研制。 1 、对木槿叶中氨基酸的提取工艺进行研究。在提取工艺中对提 取各因素进行了单因素、正交和二次回归正交旋转实验，建立了氨基 酸提取效果与提取温度、盐酸浓度、提取时间和液料比之间关系的数 学模型。 2 、分析讨论脱色溶液p h 、活性炭用量、脱色时间、脱色温度对 木槿叶提取液脱色效果和氨基酸损失率的影响，得到最佳的脱色工艺 为：脱色p h 3 0 ，活性炭用量l g 1 0 0 m l ，脱色温度8 0 。c ，脱色时间 4 0 m i n 。在此工艺条件下，氨基酸损失率只有9 0 7 ，而脱色率一次可 以达到9 8 2 1 。 3 、利用7 3 2 阳离子树脂对氨基酸进行纯化，实验表明：以2 b v h 的速度上柱，上柱完成后吸附6 小时，用3 的氨水洗脱，收集洗脱 液，浓缩结晶后可得到白色氨基酸晶体。 4 、氨基酸对壳聚糖茚三酮荧光体系的荧光猝灭效果，建立了一 套荧光法测定氨基酸的新方法。线性回归方程么f = 6 1 6 + 6 3 5 c ( m m o l l ) ，氨基酸浓度在0 5 3 0 m m o l l 范围内线性关系较好。 利用该方法测定不同月份木槿叶中复合氨基酸的含量，回收率在 9 7 5 1 0 1 9 之间，变异系数为0 6 5 ， 5 、用交替惩罚三线性分解算法( a p t l d ) 结合三维荧光光谱法给 出的二维数据对酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸进行同时定性定量分析， 其测定相关系数分别为0 9 9 8 7 、0 9 9 9 5 和0 9 9 9 3 。利用a p t l d 法对 木槿提取液中氨基酸进行定量测定，测定相对标准偏差分别为o 8 4 ，0 3 6 ，1 5 9 ，回收率分别在1 0 1 0 9 2 7 ，1 0 6 5 9 3 0 ，1 0 3 0 9 5 o 之间，方法简洁、快速、准确可靠，结果令人满意。 6 、木槿叶水浸泡后搓出粘汁，作为洗发香波的表面活性剂和营 养添加剂成分，加以皂荚、茶籽麸、何首乌、芦荟、当归等中草药营 养成分和a e s 、k 1 2 、b s 1 2 等表面活性剂成分，复配成木槿中草药 洗发水。 关键词：木槿，氨基酸，荧光猝灭，三线性分解算法，洗发香波 a b s t r a c t t i i b i s e u ss y r i a c u sli saw o o d y p l a n t , w h i c hi so fv a l u et ou s i n gi n d r u g s ，f o o d ，a n dl a n d s c a p ee n g i n e e r i n ga n da sa no r n a m e n t a lp l a n to r f i b e rm a t e r i a l t h eh i b i s c u ss y r i a c n sl 1 e a v e sc o n s i s to fm a n yn u t r i t i o u s c o m p o n e n t sa n dm i n e r a l s s u c h 豁a m i n oa c i d sc o n t e n t so fw h i c hf o r a b o u t1 3 o fh i b s c u ss y r i a c u sl l e a v e so fd r i e dp o w d e r s oi tc a nb e o n eo f t h es o u r c e so f t h ea m i n oa c i d sp r o d u c e s ，a n di tc a nb e c o m eo n eo f m a i nh a i r d r e s s i n gs h a m p o or a wm a t e r i a la tt h es a m et i m es i n c ei t p o s s e s s e sm a n ys u r f a c ea c t i v ea g e n t s t m s p a p e rc o n s i s t so f t h r e ep a r t s t h ef i r s ta n ds e c o n dp a r td e a lw i t h s t u d i e so nt h ee x t r a c t i o n , p u r i f i c a t i o na n dd e t e r m i n a t t o no fa m i n oa c i d s f r o mh i b i s c u ss y r i a c u sl 1 e a v e s ；t h et h i r dp a r ts t u d i e so nt h ep r e p a r a t i o n o f h i b i s c u ss y r i a c u sl s h a m p o o ( 1 ) 田1 ee x t r a c t i o no fa m i n oa c i d sw a ss t u d i e di nd e t a i l t h es i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s ，o r t h o g o n a ld e s i g n a n d s e c o n d a r yo r t h o g o n a l r e g r e s s i o nr e v o l u t i o nm e t h o dh a v eb e e nu s e dt oo p t i m i z et h ep r o c e s s e so f e x t r a c t i n ga m i n oa c i d sf r o mh i b i s c u sl 1 e a v e s 。a n dt h em a t h e m a t i c m o d e lb c t w e e nt h ee x t r a c t i n gr e s u l ta n de x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e ，t i m e ， c h l o r h y d r i ca c i dc o n c e n t r a t i o n , t h er a t i oo f l i q u i dt os o l i dh a v eb e e nb u i l t ( 2 ) b ya n a l y z i n ga ni m p a c to fp h , q u a n t i t yo fa c t i v ec a r b o n , s t i r r i n gt i m e ，s t i r r i n gt e m p e r a t u r eo v e rt h ed e c o l o r a t i o ne f f e c ta n da m i n o a c i dl o s sr a t e ，g o to p t i m u md e c o l o r a t i o nh a n d i c r a f ta sf o l l o w ：p h3 0 ， a c t i v ec a r b o nq u a n t i t yl g 1 0 0 m l ，t e m p e r a t u r e8 0 c ，t i m e4 0 m i n s h e r e ， t h ea m i n oa c i dl o s sr a t eo n l yh a d9 0 7 b u tf a d i n gr a t ec a nr e a c h e d 9 8 2 1 u n d e rt e c h n o l o g i l c a lc o n d i t i o n s ( 3 ) 1 ka m i n oa c i d sw e r ep u r i f i e db y7 3 2p o s i t i v ei o n se x c h a n g e r e s i n n l eo p t i m a lt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sw e r ef o u n da sf o l l o w ：f l o w r a t e2 b v h , a b s o r b i n gt i m e6h o u r s p h2 。3a n d3 a m m o n i as o l u t i o n w a su s e d 舔e l u t i n ga g e n t w h i t ea m i n oa c i dc r y s t a lw a sg o tb yt h e c r y s t a l l i z a t i o na n dr e c r y s t a l l i z a t i o np r o c e d u r e ( 4 ) an e wm e t h o dd e t e r m i n i n ga m i n oa c i db yf l u o r e s c e n c eh a v e b e e nb u i l tw h i c hw a sb a s e do nf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n ge f f e c tb ya d d i n g a m i n oa c i di n t ot h er e a c t i o ns y s t e mo f c h i t o s a na n d n i n h y d r i n l i n e a rf i t l l i e q u a t i o nw a sa f = 6 1 6 + 6 3 5 c ( m m o l l ) ，a n dt h el i n e a rr a n g ef o r d e t e r m i n a t i o no f a m i n oa c i dw a s0 5 3 0 m m o i l t h el i m i to f d e t e c t i o n w a s0 1m n l 0 1 l t h et o t a lc o n t e n to ff r e ea m i n oa c i di nh i b i s c u s l 1 e a v e sh a v eb e e nd e t e r m i n e d c o e m c i e n to f v a r i a t i o nw a s0 6 5 a n d t h er e c o v e r yo f g l u t a m i ca c i dw a si nt h er a n g eo f 9 7 5 1 0 1 9 ( 5 ) an e w m e t h o du s i n ga l t e r n a t i n gp e n a l t yt r i l i n e a rd e c o m p o s i t i o n a l g o r i t h mc o u p l e dw i t he x c i t a t i o n - e m i s s i o nm a t r i xf l u o r o m e t r yh a sb e e n d e v e l o p e df o rs i m u l t a n e o u sr e s o l u t i o na n dd e t e r m i n a t i o no ft y r o s i n e ， p h e n y l a l a n i n ea n dt r y t o p h a n t h e i rc o r r e l m i o nc o e 伍c i e n t sw e r e0 9 9 8 7 0 9 9 9 5 a n d0 9 9 9 3r e s p e c t i v e l v n ec o n t e n t so ft y r o s i n e ，p h e n y l a l a n i n e a n dt r y t o p h a ni nh i b i s c u ss y r i a c u sl 1 e a v e sa l s ob ed e t e r m i n e db vt h i s m e t h o da f t e rb e i n ge x t r a c t e db yu l t r a s o n i c t h ec o e m c i e n to fv a r i a t i o n a n dt h er e c o v e r i e so ft h et h r e ea m i n oa c i d sw e r e0 8 4 0 3 6 1 5 9 a n d1 0 1 0 9 2 7 ，1 0 6 5 9 3 0 ，1 0 3 0 9 5 0 r e s p e c t i v e l y 灿1t l l a t s h o w si t sas i m p l e ，f a s ta n dc r e d i b i l i t ym e t h o d ( 6 ) u s i n gc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n es u c ha sg l e d i t s h 7s i n e n s i s ，t e a s e e db r a n , t u b e rf l e e c e f l o w e rr o o t , a f o e , r a d i xa n g e l i c a es i n e n s 妇，a n d s u r f a c ea c t i v e c o m p o n e n t s s u c ha sa e s ，b s 一1 2 ，k 1 2 ，t oc o m p o u n d h i b i s c u ss y r i a c u sl c h i n e s eh e r b a lm e d i c i n es h a m p o o k e yw o r d s ：h i b i s c u ss y r i a c u sl ，a m i n oa c i d ， f l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g ，s h a m p o o ，a l t e r n a t i n gp e n a l t y t r i l i n e a r d e c o m p o s i t i o na l g o r i t h m ( a p t l d ) w 原创性声明 本人声明，所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我f | 孵知，除了论文中特别加以标注和致谢 静地方辫，论文中不毽含其 | 麓入已经发表残撰写过的研究成栗，瞧不 包含为获得中南犬学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。姆我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 箬者签名： 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保窝学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文酶全部或部分蠹容，霹以采耀复印、缝窜或其宅手段保存学像论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名：导繇签名霾期： 年 箕一西 硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 术糍( h i b i s c u ss y r i a c u sl ) ，照锦葵科木槿属落叶灌术，其花又名白檬花、 丈琬芯、鑫玉花等，添产东亚，麦瑟分毒于我嚣长汪流域、焚涎滚壤、珠泼淀域 及赣鲜、丑本等国，现在全球温带和亚热带恁隧均有栽培，慧集药用、食翔、观 赏、绿化、纤维原料价值于一身的术本植物l b 2 。 1 。1 零罐戆侩毽冀应用 1 1 1 观赏及绿化 拳穰花虽然赣努罄落，毽稳麓缀长，予爱、歇炎热辩苓嚣兹，历嚣莓遮4 个 月，且花繁叶茂，对环境要求不严，是点缀庭园的好材料。由于木槿的生命力很 强，成长快，叶细小，人们多用它制作小型桩头艋景，是我国传统的桩景和舷栽 秘静。戴终，基于本攥檀纺适应经强，易于裁壤，显对氯气、筑诧氢、二襞纯硫 等有害气体抗性强，辨能吸收，惫净化空气的穰物。同时，它还具有滞尘、晦噪 功能，可作为工厂、矿区和城市衡遒的优良绿化树种【3 l ，在园林中常用作花篱、 绿篱。 1 1 2 菊用价值 本横时的医药作用在我国阜脊记载。医办篡甍云：术攫，肺热咳痰l 莰血 者宣之。品江耩要栽：主瑟风，痢嚣熬渴。攥本苹江富载：能除海热， 滑利能臀积滞，善治赤白积痢，干激不通，下坠欲解而不解，捣汁和生白酒瀛饮。 可见，我国的劳动人民很早就利用本槿叶入药了。 本穰鬏疫入药，零药孛黎秀蠲穰皮，迄今海壹，莰本槿鬏皮孛势褰缮戮瓣荸 体纯合物类垄有木脂索、萜类、m a l 啪o 类、环肷、有机酸、黄酮、鞣质粘 液质等。l e e 等从木横根皮中分离出松脂醇和一个新的木脂豢化合物( + ) - 松脂素 - 4 - 0 - 【一d - 麓萄糖毗髓糖( 1 - 2 ) - ( d 一疑李糖营) 】铆蜒璐i d c ) 嘲。b e l l 等从木攘中分 离密m a n s o no n ee 、埒。y u n 等获零槿穰皮中分离餐弱2 个掰三菇类纯会耪3 彗， 2 3 2 8 t r i h y d r o x y - 1 2 o l e a n e n e3b - c a f f e a t e 7 l 。张恩娟等从川槿皮中分离得到自桦 脂醇1 3 l 。另外还得到倍半萜邻醌( s e s q u i t e r p e n o i dq u i n o n e ) f 阳其他相似化合物，被 鑫名秀瀚( h i b i s c o n e ) a 、d 【9 】。等获本毽皮孛分囊窭2 今毅戆嚣获a 静8 ( h i b i s p e p t i n a 、b ) ，鼹有独特的环氯基酸单元加油p a 【2 凄【基3 - ( 2 一羟基一5 - 笨酰氨 硕士学位论文 第一章绪论 基戊酸) 】【1 0 1 ”。y o o 等从木槿根皮中分离出t - - 个新石脑油精化合物s y r i a c u s i n s a c 1 2 。 另外，张恩娟掣8 1 从川槿皮中分离得到7 个单体化合物，确定其结构分别是 壬二酸、辛二酸、二十八醇一l 、t 3 一谷蕾醇、二十二炭二醇、白桦脂醇、古柯 三醇。k i m 等从木槿中分离到皂草苷( s a p o n a r i n ) 、紫杉叶素3 - ( ) b 一葡萄吡喃糖、 芹菜素7 ( ) b 葡萄吡喃糖和个结构已知的异黄酮6 ”一( ) - a c e t y l g e n i s t i n 、6 ”( ) - a c e t y l d a i d a i z e i n 和3 ( ) h y d r o x y d a i d z e i n ，这三个异黄酮能显著抑制鼠肝微粒体 脂质过氧化i l ”。 木槿花中含有肥皂草苷( s a p o n a d n , c 2 7 b z o l 5 5 h 2 0 ) ，并含有异牡荆素( i s o x i t e x - m 、皂甙、反丁烯二酸等，此外，还含有多量粘液质。k i m 等从木槿花蕾中分离 得到飞燕草甙元( d e l p h i n i d i n ) 、矢车菊甙元( c y a n i d i n g ) 、矮牵牛花色素( p c m n i d i n ) 、 天竺葵色素( p e l a r g o n i d i n ) 、芍药花青素( p e o n i d i a ) 、( m a l c i d i n ) ”。 木槿种子中含有锦葵酸( m a l v a l i ca c i d ) 、频婆酸( s t e r c u l i ca c i d ) 、二氢频婆酸 ( d i h y d r o s t e r c u l i ca c i d ) 。 1 1 3 食用价值 木槿花中富含大量人体所需的营养成分，据测定，每1 0 0g 鲜花可食部分含 水分9 2g 、蛋白质2 5g 、脂肪0 3g 、糖类3 2g 、灰分1 2g 、粗纤维0 8g 、钙1 4m g 、 磷5 6m g 、铁1 2m g ，热量1 3 3 9 8k j ，以及胡萝b 素、氨基酸和多种维生素等【2 ， 可食用。木槿嫩叶可食，做汤味鲜美，也可代茶饮，在明代李时珍本草纲目 中有记载：木槿，种之易生，嫩叶可茹，作引代茶。木槿叶中的营养成分与无机 元素的含量丰富。据李朝阳【”】测定，木槿叶中蛋白质含量高达3 7 2 ，脂肪含量 达0 7 9 ，粗纤维含量达9 8 3 ，糖类含量达6 2 7 ，还富含人体必需的微量元 素，如钙、镁、铁、锌等。 1 1 4 保健价值 利用木槿花制成的木槿花汁，具有止渴醒脑的保健作用。高血压病患者常食 素木槿花汤菜有良好的食疗作用。此外，木槿叶还有一定的去污能力，我国古代 妇女每逢七巧节就有用木槿叶洗发的习惯，可以说木槿叶是一种很好的纯植物性 且具保健作用的洗发剂。 研究发现，天然植物原料木槿提取液中含有具有天然表面活性成分的物质， 可作为天然去污剂，可减少洗发用品对人体皮肤的刺激性；同时，此提取液中含 有丰富的对人体有益的物质，如：多种氨基酸、维生素、糖类，还含有多量的鞣 2 硕士学位论文第一章绪论 质和粘液质，对头发有营养、调理和保湿的作用。 陈素文、何科埔埠在1 9 9 0 年就报道了他们对木槿叶水溶性提取物在发用化 妆品中的应用研究。他们在2 5 3 0 的条件下，浸提得到木槿的水溶性提取物， 并对提取液中的有效成分进行了分析。经系统预测实验，定性主要是蛋白质和氨 基酸。由于头发蛋白质中氨基酸的组分与动植物蛋白质中氨基酸组分相似，遵循 “相似相溶”规律，头发与动植物蛋白质、氨基酸亲和性强，安全性高，吸附量 大，因而，软化、调理、提高光泽、养发、护发等功能早已定论。但木槿叶中水 溶性蛋白质、氨基酸组分分析更具有独特的性能，并优于一般的动植物蛋白质， 是一种较理想的天然调理剂。陈素文等采用b a c k m a n1 2 1 m b 氨基酸自动分析仪对 木槿水溶性提取物中氨基酸进行了测定，结果发现： 人类所需的氨基酸如：苏、缬、蛋、异亮、亮、苯丙、赖氨酸等都存在，而 人体生长头发所必需的胱氨酸及对头发黑色素的形成极有关系的酪氨酸也存在， 这是最重要的，如表1 1 所示。另外，木槿叶中的氨基酸含量虽然不是最高的， 但从氨基酸的分子结构特性分析，木槿水溶液中的氨基酸种类较合理，有独特的 性质。木槿叶水溶液提取物中氨基酸中以不带电荷的极性氨基酸和带正电的氨基 酸为主，前者极易溶与水，与头发的亲和性强，后者抗静电性强。 表1 1 木槿叶中氨基酸的组分和含量 硕士学位论文第一章绪论 1 1 5 经济价值 据统计，每株6 年生木槿平均产鲜花3k g 4 k g ，市场价值3 元k g 5 元k g 。 平均每株收入达9 元1 5 元。按2 5 0 0 株h a s t 算鲜木槿花收入达2 万元1 1 a ，经 济效益较好。 目前，相关木槿植物化学成分的研究报道相应太少。正是由于木槿植物可利 用的价值较高，涉及面较广，因此，应加大对其生物活性物质的提取、分析和研 究力度，为木槿的综合开发利用提供参考。 1 2 氨基酸的性质睁”1 融f c 。h = ：兰= 旷+ 卜f c 。m 二：! ：h r + r c o 。 氨基酸的氨基和羧基的解离情况以及氨基酸本身带电取决于它所处环境的 酸碱性。当它处于酸性环境时，由于羧基结合质子而使氨基酸带正电荷；当它处 于碱性环境时，由于氨基的解离而使氨基酸带负电荷；当它处于某一个p h 值时， 氨基酸所带正电荷和负电荷相等，即静电荷为零，此时的p h 值称为氨基酸的等 电点( i s o e l e t f i cp o i n t ) ，用p i 表示。 4 硕士学位论文第一章绪论 由于静电作用，在等电点时，氨基酸的溶解度最小，容易沉淀。利用这一性 质可以分离制备某些氨基酸。例如，谷氨酸的生产，就是将微生物发酵液的p h 值调节到3 2 2 ( 谷氨酸的等电点) 而使谷氨酸沉淀析出。 1 3 氨基酸的应用价值和现状 氨基酸是构成生物体蛋白质的基本单位，人体体液中缺少某种氨基酸就会发 生不同的疾病。因此，氨基酸对维持和补充病人的营养，抢救垂危病人的生命起 到了重要的作用。蛋白质氨基酸有2 0 种，非蛋白质氨基酸有4 0 0 多种，其衍生物 和合成的多肽品种达数千种之多。氨基酸广泛应用于医药、食品、保健、饲料、 化妆品、农药、肥料、制革、科学研究等领域。 1 3 1 氨基酸在医药行业的应用【l 9 2 0 1 氨基酸作为蛋白质的基本组成单位，直接参与生物体内的新陈代谢和其他生 理活动，在医药方面可用作营养剂、代谢改善剂、抗溃疡、防辐射、抗菌、治癌、 催眠、镇痛以及为特殊病人配制人工合成膳食等。以氨基酸为原料的激素、抗菌 素、酶抑制剂、抗癌药等生物活性多肽也不断出现，已在工业上生产的多肽有谷 胱甘肽、促胃液素、催产素、降钙素等。 1 3 2 氨基酸在食品行业的应用口1 之3 1 人类应用的第一个氨基酸是谷氨酸的钠盐( 味精) ，从1 9 0 8 年日本投人工业化 生产到现在已有近百年历史。以后人们又发现甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、 天冬氨酸也有调味功能，于是陆续将其应用在食品中。现有8 种氨基酸被用作食 品调味剂。植物蛋白的氨基酸不平衡影响其蛋白效价，因此在大米、面粉、高梁 等粮食中添加氨基酸成为联合国粮农组织和世界卫生组织最关心的问题之一。添 加氨基酸方法可使粮食的蛋白质利用率提高1 - 3 倍，对解决世界人口与粮食不足 的矛盾将具有深远意义。 1 3 3 氨基酸在饲料工业上的应用【2 抛5 】 氨基酸的添加对于提高饲料效率、改善肉质和促进发育效果显著。除蛋氨酸 和赖氨酸已大量用作饲料添加剂外，甘氨酸、谷氨酸、色氨酸和苏氨酸等也被指 定为饲料添加剂。 硕士学位论文第一章绪论 1 3 4 氨基酸在日用化妆品上的应用【埘7 1 氨基酸在日用化工上的应用已有取代化工原料的趋势。氨基酸和高级脂肪酸 制成的表面活性剂、抗菌剂已成为最高效的添加剂而被广泛使用。精氨酸或甘、 丙、缬氨酸的碳酸盐、聚天门冬氨酸或聚谷氨酸盐、肽氨基盐或半胱氨酸盐等制 成的护发剂、染发剂、永久型烫发剂已成为时兴商品供应市场。添加丝氨酸、酰 基谷氨酸钠或酰基一丙氨酸钠及月桂酰基氨酸钠、焦谷氨酸、碱性氨基酸制成的 护肤用品，人们已从各类商业广告宣传中了解到氨基酸的各种功能。 1 3 5 氨基酸在轻工业方面的应用口司 聚谷氨酸和聚丙氨酸正被研制成有良好保温和透气性能的人造皮革和高级 人造纤维；亮氨酸、脱氨酸等正作为发酵工业中多种氨基酸生产菌的添加物而被 开发应用；n 一脂酰氨基酸作为抗噬菌体污染的优良抑制剂在发酵工业中被应用； 在贵金属提取和电镀工业方面，已开发了天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸在熔金培 养液中应用，使熔金能力比对照提高1 0 0 2 0 0 倍；谷氨酸等用于电镀工业的电解 溶液；胱氨酸用于铜矿探测；氨基酸烷基酯用于海上流油回收。 1 3 6 氨基酸在农业中的应用 农药对环境的污染已构成严重的社会问题，人们一致希望能有不会构成公害 的农药问世。氨基酸农药即是无害农药，其易被微生物分解，无毒性、不污染环 境，增强植物抗菌能力。主要品种有：杀虫剂、杀菌剂、除草剂、农药稳定剂、 植物生长促进剂、脱叶剂等。 1 3 7 氨基酸的生产现状 据统计全世界氨基酸的年需求量以每年1 0 的速度增长，年总产量3 0 0 万吨 以上。作为食品添加剂占4 0 ，饲料添加剂占4 0 ，医疗保健等占2 0 2 9 1 。饲料 工业氨基酸应用量较大的有蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、苏氨酸。国际氨基酸生产 厂家主要有日本味之素、协和发酵、田边制药以及德国d e g u s s a 公司。日本在氨 基酸产量品种和技术水平均居世界领先地位 3 0 l 。 我国已成为氨基酸原料生产的大国。其中味精( 谷氨酸) 年产量1 2 0 多万吨， 产销量居世界第一位，胱氨酸和半胱氨酸产销量也居世界第一位，赖氨酸生产居 世界前列。但我国氨基酸生产技术总体水平距国际先进水平较大，尤其表现在菌 种产酸率低，生产效益差，高质量、高价值的氨基酸少。目前有生产企业2 0 0 多 家，规模较大的有天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司，但目前无论生产规模 6 硕士学位论文第一章绪论 及产品质量还难与国外抗衡。临床用氨基酸输液的l o 多种原料，大多数依赖进口。 我国药用氨基酸占世界总产量的1 左右，但销售额占氨基酸产品总额的1 8 一 2 0 。1 9 9 9 年我国仍有四种氨基酸未国产化：色氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸。 目前，上海a j i n o m o t o 氨基酸有限公司、湖北八峰药业股份公司等已能生产精氨 酸、组氨酸、环丝氨酸等国内氨基酸工业缺口产品，但产量不高，不能满足国内 市场的需要】。 1 4 氨基酸的提取、纯化和分离方法 1 4 1 蛋白质水解方法的选择【1 7 1 木槿叶中含有丰富的蛋白质和游离态氨基酸，蛋白质可通过酸、碱和酶等方 法，使肽链断裂，然后水解成氨基酸。 1 4 1 1 酸水解 通常用6 m o f l 盐酸长时间煮沸( 1 0 0 1 1 5 ) 后，所得水解产物即为氨基酸 的混合液，可加热蒸发除去盐酸。酸水解的优点是水解彻底，氨基酸都是l 一型， 没有旋光异构体产生：缺点是色氨酸几乎全部被破坏，而且水解液因色氨酸与醛 基化合物作用生成的腐黑质而呈黑色，需脱色去除。此法也是目前氨基酸工业生 产的主要方法之一，也可用于蛋白质的分析口2 - 3 5 】。 1 4 1 2 碱水解 蛋白质用6 m o l i n a o h 煮沸6 h 即可完全水解得到氨基酸混合液。此法优点 是不破坏色氨酸，但是半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸、精氨酸和赖氨酸等被大部分 破坏；而且部分氨基酸转变为d - 型，d 氨基酸的实用价值大大降低。 1 4 1 3 酶法水解 蛋白质水解酶能水解肽键，所需的条件温和，一般在常温常压下、p h 2 8 下 进行。任何氨基酸都不被破坏，也不发生旋光异构现象。但是此法水解不彻底， 中间产物( 短肽等) 较多【娴研。 1 4 2 脱色方法的选择 在木槿叶中蛋白质水解转化为氨基酸的过程中，往往伴随着大量色素的形 成，使生成的氨基酸混合液呈现出深褐色乃至黑褐色；这些色素的存在，使其应 用受到了限制，不适合直接用来分离提取氨基酸，因而必须先除去那些有色有气 味的杂质。 溶液可以经过脱色吸附剂来达到此目的。脱色方法有物理脱色 3 9 - 4 n 、化学脱 色 4 2 - 4 4 1 和微生物脱色【4 5 - 4 6 1 。 7 硕士学位论文 第一章绪论 物理脱色，即采取吸附的方法，脱除一部分色素物质。常用物理脱色物质有 高岭土、活性白土【4 - 5 1 l 、活性炭【5 引、硫酸铝、氧化钙【5 吼删等，其中活性炭在氨 基酸工业上最为常用。 化学脱色一般是氧化脱色，常用的氧化脱色剂有过氧化氢、过氧化苯甲酰、 高锰酸钾等。过氧化氢和过氧化苯甲酰均有强氧化性。在加热、光照条件下，放 出初生态氧，从而氧化有机色素，断裂色素的双键，破坏生色基团，但不同的氧 化物对色素的作用点不同，如过氧化氢对短波长( 4 0 0 r i m 以下) 的色素脱色有较好 效果，而过氧化苯甲酰对红色素较为有效。 微生物脱色，主要是生物降解脱色，利用微生物的生理活动将有机大分子色 素降解。已有研究的微生物如：p c h r y s o s p o r i u n , p h l e b i ar a d i a t a , p y c n o p o r u s ， r h i z o p u sa r r h i z u s ，t v e r s i c o l o r ，t v i l l o s a , x e r o m y e e sb i s p o r u s 等。 作为木槿叶提取液，因为其高分子有机色素含量不大，因而不需要氧化或降 解脱色，因而一般都选用物理脱色。本文是选择常用的活性碳进行脱色。 1 4 3 氨基酸分离方法的选择【6 1 - 6 2 1 1 4 3 1 沉淀剂分离法 沉淀法分离氨基酸主要有特殊试剂沉淀法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀 法。 特殊试剂沉淀法是最早应用于混合氨基酸分离的方法之一。某些氨基酸可以 与一些有机化合物或无机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，达到与其它氨基 酸分离的目的，但是，特殊沉淀法的沉淀剂回收困难，排放废液中参杂有沉淀剂， 加重了污染，残留在氨基酸产品中的沉淀剂还会影响纯度。 等电点沉淀法是根据氨基酸的等电点不同，在等电点时，氨基酸分子的净电 荷为零，有利于氨基酸分子的彼此吸引而形成结晶体沉淀下来。 有机溶剂沉淀法是利用某种有机溶剂使需要提取的物质在溶液中的溶解度 降低而形成沉淀。 。 沉淀法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点，广泛应用于氨基酸工业 提取中。目前较成熟的工艺有：苯甲醛缩合提取精氨酸睇】；邻一二甲苯一4 一磺酸沉 淀提取亮氨酸：氯化汞沉淀提取组氨酸；从生产半胱氨酸的废母液中回收胱氨酸 6 4 1 ；此外目前国内味精厂也都采用等电点沉淀法提取谷氨酸。 1 4 3 2 离子交换法 离子交换法是利用离子交换树脂对不同的氨基酸吸附能力的差异对氨基酸 混合物进行分组或实现单一成分的分离。离子交换法是氨基酸工业中应用最广泛 的分离与纯化方法之一【6 5 4 9 1 。 8 硕士学位论文第一章绪论 氨簇酸是一种两蚀电解质，在酸溶液中，氨撼酸以阳离予状态存在，因而能 簸疆凌予交换挺驻交换啜辫；奁碱瞧滚滚孛，氨蒸酸戆浚霞糍子戆妖态存凌，嚣 而能被阴离子交换树脂吸附。由予氨基酸的性质，如酸碱度、极性和相对分子量 的大小彼此不同，离子交换树脂对备种氨基酸的交换吸附能力也不同。其一般的 规律如- f ： 强酸性或强碱馁离子交狡辩瓣，对曩或o 鞲豹亲霰力院较夺，郄使在较低或 较高的p h 值下，也不抑制其解离。 强黢性阳离子交换树脂的游离酸型能交换吸附全部的氨熬酸，氨基酸的等电 熹篷越大，亲窝力越大，交换啜瓣戆秀越强。纛氮基酸溶滚戆姆在孛佳鬣蒸酸 的等电点范围内时，强酸性阳离予交换橱脂的游离酸型优先地交换吸附碱蚀氨基 酸；强酸性阴离子交换树脂的盐型只吸附碱性氨基酸。 强娥健阴离子交换树脂的游离碱型对等电焱p 珏值大于1 0 0 的糖氨酸交换吸 辩能力溺；对等电煮德小于l o o 静氮基酸交换嗷酣戆力较强，等电赢值越小，交 换吸附熊力越强。当氨基酸溶液的p h 值在中性氮基酸的等电点范围内时，强碱 性阴离予交换树脂的游离碱型优先地交换吸附酸性氨基酸；羰碱性阴离子交换树 嚣豹簸黧廷交换啜辫羧毪氨基酸。 弱酸性或弱碱饿离子交换树脂，对h + k - 戈o h - 的亲和力大，即使在微酸愀威微 碱性环境，也会抑制其解离。因此一般用其盐型，但是，在特殊情况下，例如， 酸碱中和瞬，赋霉用其游离酸型或辍型。 各种氨基酸的等电点班篷和解离常数p k d 茎翔下表【1 7 1 ； 袁1 - 2各种氯基酸的p k 7 值及p 9 硕士学位论文第一章绪论 续上表l - 2 总之，根据氨基酸分子中既有氨基又有氢基的两性电离特性，分子中侧链基 团( r ) 的性质和等电点的范围，调节氨基酸混合液的p h 值，选择恰当的离子交换 树脂，配合相应的交换基团，可以从混合氨基酸中分离出酸性、碱性和中性氨基 酸。 1 4 3 3 膜分离法 7 0 - 7 2 】 膜过滤法可以实现混合溶液的分离是因为在膜和溶液的界面处在以下机理： 由于亲水性等原因所引起的选择性透过；筛分效应一待分离物质分子的直径大于 膜孔的直径，将被截留，反之则透过；电荷效应( d o n n a n 效应) 一若膜表面带有与 待分离物质同种电荷，则会产生静电排斥作用，反之则会产生吸引作用。 国外膜分离工艺已应用于乳制品工业。采用反渗透浓缩乳清，使用超滤法从 乳清中制备浓缩蛋白质，使用微米膜分离乳清中的蛋白质，去除脱脂乳中的细菌， 使用纳滤膜去除乳清中的矿物质。近些年，又开始研究膜过滤分离蛋白质、肽和 氨基酸的可行性。在人体的新陈代谢过程中存在大量生物膜渗透现象。研究氨基 酸的膜分离不仅可以找出有效的生物分离技术，而且有助于加深对这些新陈代谢 过程的了解。 1 4 3 4 吸附法 吸附法是利用恰当的吸附剂，在一定的p h 条件下，使混合液中氨基酸被吸 附剂吸附，然后再以适当的洗脱剂将吸附的氨基酸从吸附剂上解吸下来，达到浓 缩和提纯的目的。常用的吸附剂有活性炭、高岭土、氧化铝、酸型白土等无机吸 附剂。吸附法一般具有以下优点： a 、不用或少用有机溶剂； b 、操作简便、安全，设备简单； c 、吸附过程p h 变化小。 但是吸附法的选择性差，收率低，特别是一些无机吸附剂性能不稳定，不能 1 0 硕士学位论文第一章绪论 连续操作，劳动强度大，尤其活性炭影响环境卫生。所以吸附法曾有一段时间很 少采用，几乎被其它方法所代替。但随着大孔网状聚合物吸附剂的合成和不断发 展，吸附法又重新被人们重视。 1 4 3 5 萃取法 氨基酸的萃取分离方法主要有：溶剂萃取法1 7 3 1 、反向微胶团萃取法f 7 4 - 7 6 、乳 状液膜萃取法【7 7 - 7 5 。 溶剂萃取法是用一种溶剂将某种物质从另一种溶剂中提取出来的方法，这两 种溶剂不能互溶或只部分互溶，能形成便于分裂的两相。溶剂萃取法可分为物理 萃取和化学萃取。物理萃取法的理论是基础是分配定律，而化学萃取服从相律及 一般化学反应的平衡规律。近些年来先后开发了化学萃取法分离提取氨基酸，其 中有机胺类和磷酸应用最多。 反向微胶团是溶在有机溶剂中的表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚体， 表面活性剂的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触，而极性头则排列在内形成极 性核，极性核溶于水后形成了“水池”。当含有氨基酸的水溶液与反向微胶团的 有机溶剂相混合时，氨基酸以带电离子状态进人反向微胶团的“水池”内或微胶 团球粒的界面分子膜内而被分离。国外关于反胶团萃取氨基酸的研究主要集中在 萃取机理方面，而且主要是对于单一氨基酸。 乳状液膜是一种双重乳状体系。它是用第三相( 膜相) 将能够互溶的内外两 相隔离开，利用液膜的选择性迁移作用，使外相料液中的被分离组分能够逆浓度 梯度转移到内相中，从而实现被分离组分在内相中的富集。在乳状液膜的外相和 内相界面上，溶质的萃取和反萃取同时完成。由于乳状液膜分离过程通常在较温 和的条件下进行，因此具有活性损失小、传质速率高和分离步骤少的特点，不仅可 用于物质的分离提纯，还可用于化学和生物反应，尤其适合于对生物活性物质和 热敏性物质的分离。 1 4 3 6 结晶 结晶是纯化物质的有效手段。提取液采用上述方法进行初步的分离提取之 后，要得到具有一定粒度分布和晶体形状的成品还必须对其进行浓缩结晶和重结 晶。 1 4 3 7 电泳 电泳是指带电质点在电场中向与本身所带电荷相反的电极移动的现象。由于 不同氨基酸具有不同的等电点，在一定p h 条件下，不同氨基酸就带有不同性质 的电荷，从而在外电场的作用下被分离开。电泳的方向和速度主要取决于所带电 荷性质、数目及相对分子质量的大小。 硕士学位论文第一章绪论 1 5 氨基酸的分析方法 氨基酸是构成蛋白质的基本单元，因此，氨基酸分析在蛋白质化学、临床医 学、生理研究以及食品、饲料的分析中，有着广泛的应用。 1 5 1 化学分析法 1 5 1 1 甲醛滴定法 甲醛滴定法m 1 用于氨基氮的测定，可以测出样品中总氨基酸的含量，其原 理是在中性或弱碱性水溶液中，氨基酸的氨基与醛类反应生成s c h i f 碱，生成的 亚甲基甲氨基衍生物用碱滴定，从而得到样品中总氨基酸的含量。甲醛法准确度 差，终点较难掌握。 1 5 1 2 凯氏定氮法 凯氏定氮法【8 0 1 是用于测定样品中总氮的含量然后根据蛋白质和氨基酸中 的氮含量，从而得知含氮的氨基酸、蛋白质的总量。该方法准确度高，但操作步 骤复杂，试剂耗量多，测定周期长。 1 5 2 电化学分析法 采用适用于不同氨基酸的选择电极，可对各种氨基酸进行测赳7 9 1 ，电导检 测和安培检测的方法也被人们广泛应用于氨基酸的分析 s l , s z l 。电化学分析的最大 优点在于无需衍生反应，操作简便，它与各种现代化的分离方法相结合可以大大 简化操作过程，节约分析时间。 1 5 3 可见光分光光度法 由于氨基酸本身缺乏用于检测的物理性质，如光吸收、光发射或电化学活性， 因而需要使用各种衍生技术。即利用显色剂和氨基酸的反应能够使氨基酸显现出 颜色，有些显色剂同氨基酸所生成的颜色深浅与氨基酸的含量成正比，定性定量 测定氨基酸。显色剂种类很多，灵敏度也各不同，有的适用于纸上显色，有的适 于溶液显色。有些显色剂对各种氨基酸都有作用，如茚三酮、蚓哚醌等；而某些 显色剂对个别氨基酸有显色作用【1 。7 】( 表1 3 ) 。 茚三酮显色法已广泛用于可见光对氨基酸的测定，同时也是色谱定量分离 和分析柱后衍生和检测的主要手段。该反应受溶液的p h ，温度和反应时间的影